KR20120086664A - A novel method for isolating aggregates of mononuclear cells using adipose tissue of bone marrow, the aggregates of mononuclear cells derived from bone marrow isolated by the same, and the uses thereof - Google Patents

A novel method for isolating aggregates of mononuclear cells using adipose tissue of bone marrow, the aggregates of mononuclear cells derived from bone marrow isolated by the same, and the uses thereof Download PDF

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Abstract

PURPOSE: A method for isolating monocyte aggregates from adipose of bone marrow aspirate is provided to collect a large amount of stem cells with high efficiency. CONSTITUTION: A method for isolating monocyte aggregates from adipose of bone marrow aspirate comprises: a step of treating collagenase to bone marrow aspirate to release stem cells from the adipose; a step of treating the stem cells with trypsin; and a step of isolating monocytes. The collagenase includes type I collagenase, type II collagenase, type III collagenase, type IV collaganese, collagenase D, or acutase. A cell therapeutic agent contains the monocyte aggregates.

Description

골수 지방조직을 활용하는 신규한 단핵구 세포 집합물 분리 방법, 이로써 분리된 골수 유래 단핵구 세포 집합물 및 그의 용도{A novel method for isolating aggregates of mononuclear cells using adipose tissue of bone marrow, the aggregates of mononuclear cells derived from bone marrow isolated by the same, and the uses thereof}Novel method for isolating aggregates of mononuclear cells using adipose tissue of bone marrow, the aggregates of mononuclear cells derived from bone marrow isolated by the same, and the uses approximately}

본 발명은 골수로부터의 단핵구 세포 집합물 분리방법 및 이로써 분리된 단핵구 세포 집합물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for isolating monocyte cell aggregates from bone marrow and thus to isolated monocyte cell aggregates.

골수는 다양한 줄기세포를 얻기 위한 세포원으로써, 골수에는 대표적으로 조혈모세포(HSC: hematopoietic stem cell), 중배엽유래 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cell), 혈관내피전구세포 (EPC: endothelial progenitor cell) 등과 같은 줄기세포가 포함되어 있다. 현재 골수로부터 얻어진 줄기세포들을 이용한 다양한 세포치료법이 연구 및 시행되고 있다.Bone marrow is a cell source for obtaining various stem cells, and hematopoietic stem cells (HSC), mesenchymal stem cells (MSC), endothelial progenitor cells (EPC), etc. The same stem cells are included. Currently, various cell therapies using stem cells obtained from bone marrow have been researched and implemented.

조혈모세포는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 여러 가지 혈액세포를 만들어 낼 수 있는 세포로서 줄기세포의 특징인 자가복제능력, 다세포분열능, 다분화잠재능 등을 지니고 있다(van der Kooy D 등 2000, science, 287 ; 1439-1441). 현재 조혈모세포 이식을 통하여 다양한 질환들이 치료되고 있으며, 그 예로서 급?만성 백혈병, 선천적 또는 유전적으로 결정된 조혈 이상, 빈혈증, 재생불량성 빈혈, 골수이형성 증후군, 골화석증, 다발성 골수종, 악성 림프종 등 혈액암 관련 질환 내지 혈액학적 질환, 유방암, 난소암, 신장암, 소세포성폐암 등 고형암과 불응성 전신성 홍반성 낭창, 불응성 류마티스 관절염 등 악성 자가면역질환(Lennard 등, 2000, BMJ, 321, 433-437 ; Ikehara, 2001, Experimental Hematology, 29 ; 661-669), 중증 합병 면역 결핍증 등이 있다. Hematopoietic stem cells are cells capable of producing various blood cells such as erythrocytes, white blood cells, and platelets, and have stem cell characteristics such as self-replicating ability, multicellular division, and multipotent potential (van der Kooy D et al. 2000, science, 287; 1439-1441). Currently, various diseases are treated through hematopoietic stem cell transplantation.For example, acute and chronic leukemia, congenital or genetically determined hematopoietic abnormalities, anemia, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, osteoporosis, multiple myeloma, malignant lymphoma, etc. Cancer-related diseases, hematologic diseases, breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, small cell lung cancer, solid cancers, and refractory systemic lupus erythematosus, refractory rheumatoid arthritis, and other autoimmune diseases (Lennard et al., 2000, BMJ, 321, 433-). 437 Ikehara, 2001, Experimental Hematology, 29; 661-669), and severe complications of immunodeficiency.

중배엽유래 줄기세포는 골수에 존재하는 비조혈모세포로써, 조혈모세포의 성장을 보조하거나 조절한다고 알려져 있으며, 골모세포, 근육세포, 연골세포, 및 지방세포 등 다양한 근골격계 기관의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 다능성 줄기세포로써, 세포 이식 등을 통해 손상조직의 기능적 회복을 유도하기 위한 줄기세포치료에 이용될 수 있다. 또한, 중간엽 줄기세포가 간세포 (hepatocyte), 심근세포, 신경 및 뇌세포로 분화될 수 있음이 알려져 있으며(Theise, N.D. et al., Hepatology. 32: 11-16, 2000; Alison, M.R. et al., Nature. 406: 257, 2000; Orlic, D. et al., Nature. 410: 701-705, 2001; Jackson, K.A. et al., J. Clin. Invest. 107: 1395-1402,　2001; Kopen, G.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 10711-10716, 1999; Woodbury, D. et al, J. Neurosci. Res. 61:364-370, 2000), 현재 골절, 건손상, 연골손상, 간부전 (hepatic failure), 심근경색, 신경손상, 뇌손상, 뇌졸중, 파킨슨병, 기타뇌신경퇴행성 질환 등의 치료를 위한 활발한 연구가 진행 중이다(Horwitz, E.M. et al., Nat. Med. 5: 309-313, 1999; Pittenger, M.F. et al., Circ. Res. 95: 9-20, 2004). Mesoderm-derived stem cells are non-hematopoietic stem cells present in the bone marrow and are known to assist or regulate the growth of hematopoietic stem cells, and are capable of differentiating into cells of various musculoskeletal organs such as osteoblasts, muscle cells, chondrocytes, and adipocytes. As a pluripotent stem cell having a, it can be used for stem cell therapy to induce functional recovery of damaged tissues through cell transplantation. It is also known that mesenchymal stem cells can be differentiated into hepatocytes, cardiomyocytes, neurons and brain cells (Theise, ND et al., Hepatology. 32: 11-16, 2000; Alison, MR et al. ., Nature.406: 257, 2000; Orlic, D. et al., Nature.410: 701-705, 2001; Jackson, KA et al., J. Clin.Invest.107: 1395-1402, 2001; Kopen , GC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 10711-10716, 1999; Woodbury, D. et al, J. Neurosci. Res. 61: 364-370, 2000), current fracture, tendon injury, cartilage Active research is underway to treat injuries, hepatic failure, myocardial infarction, nerve damage, brain damage, stroke, Parkinson's disease, and other neurodegenerative diseases (Horwitz, EM et al., Nat. Med. 5: 309-313, 1999; Pittenger, MF et al., Circ.Res. 95: 9-20, 2004).

혈관내피전구세포는 혈관신생 및 혈관의 재생에 기여하는 세포로써, 현재 심근경색, 관상동맥이상, 뇌졸중, 당뇨성 족부궤양 및 버거씨병 등과 같은 많은 허혈성 질환의 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대되고 있다. Endothelial progenitor cells are cells that contribute to angiogenesis and regeneration of blood vessels, and are expected to be used for the treatment of many ischemic diseases such as myocardial infarction, coronary artery disease, stroke, diabetic foot ulcer and Burger's disease.

그러므로 상기 세포들을 이용하기 위하여 골수로부터 단핵구세포를 효과적으로 분리하기 위한 기술들이 개발되고 있다. 대표적으로, 피콜 농도구배(Ficoll gradient)를 이용하여 단핵구세포를 분리하는 방법과 세팍스(Sepax)를 이용하여 단핵구세포를 분리하는 방법이 현재 임상에 이용되고 있다. 이러한 방법들은 모두 골수 내 덩어리와 지방층을 제거한 후 세포를 농축하는 방법으로, 회수한 단핵구세포군에 조혈세포와 중배엽줄기세포, 혈관내피전구세포 등 유효한 세포군이 포함되어 있으나, 세포의 회수율이 높지 않다는 단점이 있으며 이러한 회수율은 노령 환자의 경우 더욱 현저히 떨어짐을 알 수 있다. 상기 줄기세포들을 골수로부터 얻어내어 치료하는 기술들이 발전하고 있으며 특히 골수 이식에 있어서 골수 천자액로부터 얻어지는 세포의 질이 이식 후 세포의 생착률에 영향을 미치는 가장 큰 요인으로 알려져 있으나, 나이를 먹음에 따라 골수 내 지방량이 크게 증가하여 같은 양의 골수양으로부터 획득되는 세포수가 크게 감소하게 되며, 이식 후 생착률도 크게 떨어지고, 세포의 활성 역시 연령에 따라 크게 감소한다. Therefore, techniques for effectively separating monocytes from bone marrow have been developed to utilize the cells. Typically, a method of separating monocytes using Ficoll gradient and a method of separating monocytes using Sepax are currently used in clinical practice. All these methods are to concentrate the cells after removing the lumps and fat layer in the bone marrow. The collected mononuclear cell group includes effective cell groups such as hematopoietic cells, mesodermal stem cells, and vascular endothelial progenitor cells, but the recovery rate of the cells is not high. This recovery rate is noticeably lower in older patients. Techniques for the treatment of stem cells from the bone marrow have been developed. In particular, the quality of cells obtained from bone marrow puncture fluid in bone marrow transplantation is known as the biggest factor affecting the engraftment rate of cells after transplantation. The amount of fat in the bone marrow increases greatly, and the number of cells obtained from the same amount of bone marrow is greatly reduced.

대한민국 공개특허공보 10-2005-0093759 (2005. 9. 23 공개)Republic of Korea Patent Application Publication No. 10-2005-0093759 (published Sep. 23, 2005)

Rosalinda Madonna 등, Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2009, 29:1723-1729Rosalinda Madonna et al., Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2009, 29: 1723-1729 Jeffrey M. Gimble 등, Circulation Research 2007, 100:1249-1260Jeffrey M. Gimble et al., Circulation Research 2007, 100: 1249-1260

본 발명은 골수로부터 양질의 단핵구세포를 다량 분리하는 신규한 방법을 제공하고자 한다. The present invention seeks to provide a novel method for separating large quantities of high quality monocytes from bone marrow.

본 발명은 또한 상기 방법으로 분리한 단핵구 세포 집합물을 제공하고자 한다. The present invention also provides a monocyte cell aggregate isolated by the above method.

본 발명은 또한 상기 방법으로 분리한 단핵구 세포 집합물의 다양한 세포치료제로써 용도를 제공하고자 한다. The present invention also provides a use as a variety of cell therapy for monocyte cell aggregates isolated by the above method.

지금까지 알려진 방법으로 골수 천자액(穿刺液) (bone marrow aspirate)으로부터 단핵구 세포를 분리하는 경우, 개체의 연령이 높으면 세포 회수율이 매우 낮아 세포치료제로 사용되기에 충분하지 못하였으며, 골수 천자액 중 원심분리 후 얻어지는 지방층은 버려지고 있었다. 이에, 본 발명은 골수 천자액 원심분리 후 종래 버려지던 지방층 내 포함된 단핵구 세포들을 회수하고, 또한 세포치료제로 사용하기에 충분한 양의 단핵구 세포 집합물을 얻는 방법을 제공한다. When monocytes are isolated from bone marrow aspirate by a known method, the age of the subject is very low and the cell recovery rate is not sufficient to be used as a cell therapy. The fat layer obtained after centrifugation was discarded. Accordingly, the present invention provides a method for recovering monocyte cells contained in a fat layer discarded after bone marrow puncture centrifugation and obtaining a sufficient amount of monocyte cell aggregates for use as a cell therapy.

지금까지 골수 줄기세포를 치료 목적으로 이용하는 경우, 골수 천자액 (BMA: bone marrow aspirate)을 밀도 구배를 이용하여 원심분리한 후, 단핵구세포 층(MNC (mononuclear cell) layer)만을 분리하여 세포치료제로 바로 이식하거나, 이를 세포배양한 후 세포치료제로 활용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있는데, 이러한 방법에서는 밀도 구배 원심분리 후 통상 MNC층만 채취되고 맨 위층의 지방층(fat layer)은 버려지고 있었다. Until now, when bone marrow stem cells are used for therapeutic purposes, bone marrow aspirate (BMA) is centrifuged using a density gradient, and only a mononuclear cell layer (MNC (mononuclear cell) layer) is separated as a cell therapeutic agent. In general, a method of directly transplanting or culturing the cells and using them as a cell therapeutic agent is generally used. In this method, only the MNC layer is usually collected after the density gradient centrifugation, and the fat layer of the top layer is discarded.

이에 본 발명자들은, 종래 골수로부터 단핵구 세포 분리시 버려지던 지방층 내에 다량의 단핵구 세포들이 다량 존재함을 확인하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors have completed the present invention by confirming that a large amount of monocyte cells is present in the fat layer which was discarded when the monocyte cells were separated from the bone marrow.

즉, 본 발명은 골수 천자액의 지방조직으로부터 단핵구 세포 집합물을 분리하는 방법을 제공한다. That is, the present invention provides a method for separating monocyte cell aggregates from adipose tissue of bone marrow aspirate.

또한, 상기 방법에 의하여 분리된 골수 유래 단핵구 세포 집합물을 제공한다. Also provided is a bone marrow-derived monocyte cell aggregate isolated by the above method.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 분리된 골수 유래 단핵구 세포 집합물의 용도를 제공한다. The present invention also provides the use of a bone marrow-derived monocyte cell aggregate isolated by the above method.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 단핵구 세포 집합물의 분리방법은 종래 버려지던 골수 천자액의 지방층 내 단핵구 세포들을 회수하는 방법에 관한 것이다. The method for separating monocyte cell aggregates of the present invention relates to a method for recovering monocyte cells in the fat layer of bone marrow puncture fluid which has been conventionally discarded.

본 발명의 한 모습으로써, 본 발명의 단핵구 세포 집합물의 분리 방법은 하기의 단계를 포함한다: In one aspect of the present invention, a method for separating monocyte cell aggregates of the present invention comprises the following steps:

(a) 골수 천자액을 원심분리하여 지방층을 얻는 단계; 및 (a) centrifuging the bone marrow puncture to obtain a fat layer; And

(b) 상기 분리된 지방층으로부터 단핵구 세포를 분리하는 단계.(b) isolating monocyte cells from the isolated fat layer.

상기 골수 천자액으로부터 지방층을 분리하여 얻는 단계는 골수 천자액로부터 단핵구 세포를 분리하는 통상의 방법, 예컨대, 밀도-구배 원심분리법에 의하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 종래 단핵구 세포층만 취해지고 지방층은 버려지던 것과 달리, 골수 천자액의 원심 분리 후 지방층을 취하여 이로부터 단핵구 세포를 분리한다. The step of separating the fat layer from the bone marrow puncture fluid may be performed by a conventional method of separating monocyte cells from the bone marrow puncture fluid, for example, by density-gradient centrifugation. However, in the present invention, unlike the conventional mononuclear cell layer and the adipose layer was discarded, the mononuclear cell is separated from the adipose layer after centrifugation of bone marrow puncture fluid.

이렇게 얻어진 지방층으로부터 단핵구 세포의 분리는 당 분야에서 통상적인 방법, 예컨대, 시료로부터 지방성분들을 세척용액을 이용하여 제거하거나, 추가의 원심분리 과정을 거쳐 수행될 수 있다. Separation of monocyte cells from the adipose layer thus obtained may be carried out by methods conventional in the art, such as removing fatty components from a sample using a washing solution or by further centrifugation.

상기한 단핵구 세포 집합물의 분리 방법은 지방층 내 단핵구 세포들의 회수율을 높이기 위하여 상기 (b) 단계의 단핵구 세포의 분리에 앞서 콜라겐분해효소(collagen-degrading enzyme)를 처리하여 지방조직 내 함유된 줄기세포를 유리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이에 의하여, 종래 폐기되는 조직이었던 골수천자액의 지방조직으로부터 다량의 줄기세포를 수득할 수 있다. In the method for separating monocyte cell aggregates, stem cells contained in adipose tissue are treated with a collagen-degrading enzyme prior to separation of monocyte cells in step (b) to increase the recovery rate of monocyte cells in the fat layer. It may further comprise the step of liberating. As a result, a large amount of stem cells can be obtained from adipose tissue of bone marrow aspirate which has been conventionally discarded tissue.

본 발명의 특별한 모습으로써, 본 발명의 단핵구 세포 집합물은 하기의 단계를 포함한다: In a particular aspect of the invention, the monocyte cell aggregates of the invention comprise the following steps:

(a) 골수 천자액에 콜라겐 분해효소(collagen-degrading enzyme)를 처리하여 골수 천자액에 포함된 지방조직에 포함된 줄기세포를 유리시키는 단계, 및 (a) treating the bone marrow puncture with collagen-degrading enzyme to release stem cells contained in the adipose tissue contained in the bone marrow puncture;

(b) 상기 (a) 단계 후 단핵구 세포를 분리하는 단계.(b) isolating monocyte cells after step (a).

골수 천자액에 콜라겐 분해효소를 처리한 후 단핵구 세포층을 분리함으로써 골수 천자액의 지방조직 내 함유된 단핵구 세포들을 다량으로 유리시킬 수 있으며, 이에 의하여 간단한 방법으로 종래 행하여지던 분리방법과 비교하여 훨씬 다량의 단핵구 세포들을 얻을 수 있다. By treating collagen degrading enzyme with bone marrow puncture solution, the monocyte cell layer can be separated to release a large amount of monocyte cells contained in the adipose tissue of bone marrow puncture solution. Of monocytes can be obtained.

상기한 단핵구 세포 집합물의 분리방법에서는, 종래의 단핵구 세포 분리방법과는 달리, 골수 천자액로부터 단핵구 세포를 분리하는 단계를 수행하기 앞서 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계를 수행한다. 이에 의하여, 종래의 분리 방법에서는 버려지던 골수 지방층 내 단핵구 세포들이 수집될 수 있다. In the above-described method for separating monocyte cell aggregates, unlike the conventional method for separating monocytes, a step of treating collagenase is performed prior to the step of separating the monocytes from the bone marrow puncture. Thereby, monocyte cells in the myeloid fat layer which have been discarded in the conventional separation method can be collected.

골수천자액의 지방조직은 골수천자액 채취시 함께 채취되는 조직으로써 다량의 줄기세포를 함유하고 있는 고형조직이나, 기존 골수천자액로부터 세포를 분리하는 방법에서는 폐기되는 조직이었다. 따라서, 본 발명에서는 골수천자액로부터 단핵구 세포를 분리하는 단계(예컨대, 농도 구배 원심분리)의 전단계로써 콜라겐 분해효소를 처리하는 단계를 거침으로써 많은 양의 단핵구 세포를 손쉬운 방법으로 회수할 수 있다. The adipose tissue of bone marrow aspirate fluid is a tissue that is collected at the time of bone marrow aspirate fluid collection, which is a solid tissue containing a large amount of stem cells, or a tissue that is discarded by a method of separating cells from the bone marrow aspirate fluid. Therefore, in the present invention, a large amount of monocyte cells can be recovered by an easy method by going through the step of treating collagenase as a step prior to the step of separating monocytes from the bone marrow aspirate (eg, concentration gradient centrifugation).

따라서, 본 발명의 단핵구 세포 분리 방법에 의하면 종래의 방법과 비교하여 훨씬 많은 양의 단핵구 세포를 손쉽게 얻을 수 있다. 특히, 노령인 대상체의 경우, 많은 양의 단핵구 세포가 지방층에 존재하므로, 노령의 대상체 골수로부터 얻어진 골수 천자액로부터도 충분한 양의 단핵구 세포를 얻을 수 있다는 이점이 있다. Therefore, the monocyte cell separation method of the present invention can easily obtain a much larger amount of monocyte cells as compared to the conventional method. In particular, in the elderly subjects, since a large amount of monocytes are present in the fat layer, there is an advantage that a sufficient amount of monocytes can be obtained even from the bone marrow puncture fluid obtained from the elderly subject bone marrow.

본원에서 사용되는 골수 천자액로는 목적에 따라 사람 골수 및 소, 돼지, 말, 개, 토끼, 쥐 등을 포함한 모든 동물로부터 채취한 골수를 사용할 수 있다. As the bone marrow puncture fluid used herein, bone marrow collected from all animals including human bone marrow and cattle, pigs, horses, dogs, rabbits, mice, etc. may be used depending on the purpose.

바람직하게는, 인간 골수가 사용된다. Preferably, human bone marrow is used.

대상체로부터 골수 천자액을 채취하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.Methods of harvesting bone marrow puncture from a subject are well known in the art.

예컨대, 마취 후 엉덩이 뼈 또는 대퇴골에 헤파린을 넣은 채취용 주사기를 이용하여 적정량, 예컨대, 약 10ml 가량 채취할 수 있다. 채취된 골수 천자액은 응고를 막기 위해 헤파린을 첨가하여 보관하며, 시료의 손상을 막기 위해 얼음을 채운 통 또는 약 4℃ 냉장 장치를 이용하여 보관하거나 운반할 수 있다. For example, after anesthesia, an appropriate amount, for example, about 10 ml may be collected using a sampling syringe in which heparin is added to the hip bone or the femur. The harvested bone marrow puncture solution is stored with heparin added to prevent coagulation and can be stored or transported using an ice-filled container or a refrigerator at approximately 4 ° C to prevent damage to the sample.

본원에서 사용되는 콜라겐분해효소는 당업계에 알려진 콜라겐 성분을 분해할 수 있는 효소, 예컨대, I형 콜라겐분해효소, II형 콜라겐분해효소, III형 콜라겐분해효소, IV형 콜라겐분해효소, 콜라게네이즈 D, 아큐타제(acutase) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 I형 콜라겐 분해효소가 사용된다. 콜라겐분해효소와 골수천자액의 반응 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 골수로부터 채취한 골수 천자액에 대해 300-2000 Unit/ml시료 콜라겐분해효소를 20분~1시간 동안 선택된 콜라겐분해효소에 적합한 pH 에서 처리할 수 있다. As used herein, collagenase is an enzyme capable of breaking down collagen components known in the art, such as type I collagenase, type II collagenase, type III collagenase, type IV collagenase, collagenase D, accutase and the like can be used, and type I collagen degrading enzyme is preferably used. Reaction conditions of collagenase and bone marrow puncture are well known in the art, for example, a collagenase selected from 300-2000 Unit / ml sample collagenase for 20 minutes to 1 hour for bone marrow puncture fluid obtained from bone marrow. It may be treated at a pH suitable for.

골수 천자액로부터 단핵구 세포층을 분리하기 앞서 콜라겐분해효소를 처리함으로써 종래의 단핵구 세포 분리방법에서는 버려지던 골수 덩어리와 지방층 내에 포함된 단핵구 세포들까지 회수된다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하여 단핵구 세포의 회수율이 크게 향상될 수 있으며, 이렇게 분리된 단핵구 세포 집합물은 공지의 방법으로 분리된 단핵구 세포 집합물과는 상이한 세포 조성을 가지며, 세포 치료제로써 보다 유리하게 이용될 수 있다. The collagenase is treated prior to separating the monocyte cell layer from the bone marrow puncture to recover mononuclear cells contained in the bone marrow mass and fat layer which were discarded in the conventional monocyte cell separation method. Accordingly, the recovery rate of monocyte cells can be greatly improved by the method of the present invention, and the mononuclear cell aggregates thus separated have a different cell composition than the monocyte cell aggregates separated by a known method, and more advantageously as a cell therapeutic agent. Can be used.

즉, 콜라겐분해효소가 처리된 골수 천자액을 밀도-구배 원심분리한 후 단핵구 세포층을 회수하여 단핵구 세포 집합물을 얻을 수 있다. 밀도-구배 원심분리는 골수 천자액로부터 단핵구 세포층을 분리하기 위하여 가장 일반적으로 사용되는 방법으로써, 예컨대, 먼저 나일론 매쉬에 골수 천자액을 걸러 덩어리를 제거한 다음, 2-3배의 PBS를 이용하여 골수 천자액을 희석하고, 희석한 골수 천자액을 피콜(Ficoll), 퍼콜(Percoll) 등 밀도-구배 원심분리를 위한 용액 위에 올려 밀도차에 의해 세포가 분리되도록 하여 지방층을 제거하고 단핵구 세포층을 회수할 수 있다. 이렇게 분리된 단핵구 세포 집합물은 조혈모세포, 중배엽유래 줄기세포, 혈관내피전구세포, 혈관주위세포(pericyte) 등을 포함한다. That is, the monocyte puncture fluid treated with collagenase can be subjected to density-gradient centrifugation and the monocyte cell layer can be recovered to obtain monocyte cell aggregates. Density-gradient centrifugation is the most commonly used method to separate monocyte cell layers from bone marrow puncture, for example, first by filtering out bone marrow puncture in a nylon mesh and then removing bone marrow using 2-3 times PBS. Dilute the puncture solution and place the diluted bone marrow puncture on a solution for density-gradient centrifugation such as Ficoll, Percoll, etc. to separate the cells by density difference to remove the fat layer and recover the monocyte cell layer. Can be. Such isolated monocyte cell aggregates include hematopoietic stem cells, mesoderm derived stem cells, vascular endothelial progenitor cells, pericytes, and the like.

한편, 본 발명의 단핵구 세포 집합물 분리방법은 콜라겐 분해효소 처리 후 단핵구 세포를 최종 분리하기에 앞서, 트립신을 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 골수 천자액 또는 골수 천자액의 원심분리 후 얻어진 지방층과, 콜라겐분해효소의 반응물에 트립신을 처리하는 적정한 양과 조건은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대, 37℃에서 10분 동안 0.25%로 트립신을 처리할 수 있다. 트립신이 과도하게 처리되면 세포의 생존력을 떨어뜨리므로, 10분 이내로 처리하는 것이 바람직하다. 이러한 트립신 처리에 의하여 골수 천자액 내 세포들 간 분리가 최적화될 수 있다. On the other hand, the monocyte cell aggregate separation method of the present invention may further comprise the step of treating trypsin after the final separation of monocytes after collagenase treatment. Appropriate amounts and conditions for treating trypsin to the fat layer obtained after centrifugation of bone marrow puncture fluid or bone marrow puncture fluid and the reaction of collagenase are known in the art, for example, to treat trypsin at 0.25% for 10 minutes at 37 ° C. Can be. If trypsin is excessively treated, the viability of the cells is lowered. Therefore, it is preferable to treat the cells within 10 minutes. Such trypsin treatment can optimize the separation between cells in the bone marrow puncture.

상기한 방법에 의하여 골수 천자액로부터 분리된 단핵구 세포 집합물은 종래 행하여지던 방법으로 분리된 단핵구 세포 집합물과 비교하여 훨씬 더 많은 양의 단핵구 세포를 포함한다. The monocyte cell aggregates isolated from the bone marrow puncture by the method described above contain much larger amounts of monocyte cells as compared to the monocyte cell aggregates isolated by conventional methods.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물을 제공한다. 본 발명의 단핵구 세포 집합물은 종래 분리법에서는 버려지던 골수 덩어리와 지방층에 포함된 단핵구 세포들을 포함한다. 따라서, 공지의 단핵구 세포층 분리법으로부터 얻은 단핵구 세포 집합물 보다 훨씬 더 많은 줄기세포를 포함하며, 또한 상이한 줄기세포 조성을 가진다. 증가한 줄기세포의 종류로는 조혈모세포, 중배엽유래 줄기세포, 혈관내피전구세포, 혈관주위세포(pericyte) 등을 포함한다.The invention also provides monocyte cell aggregates isolated by the methods described above. The monocyte cell aggregates of the present invention comprise monocyte cells contained in the bone marrow mass and fat layer which have been discarded in the conventional separation method. Thus, it contains much more stem cells than the monocyte cell aggregates obtained from known monocyte cell layer separation methods and also has different stem cell compositions. Types of increased stem cells include hematopoietic stem cells, mesoderm derived stem cells, vascular endothelial progenitor cells, pericytes, and the like.

따라서, 본 발명의 단핵구 세포 집합물은 종래의 방법으로 골수로부터 분리된 단핵구 세포 집합물과 비교하여 더 큰 세포치료제로써의 유용성을 가진다. Thus, the monocyte cell aggregates of the present invention have greater utility as cell therapy agents compared to monocyte cell aggregates isolated from bone marrow by conventional methods.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물을 포함하는 세포치료제를 제공한다. The present invention also provides a cell therapy comprising monocyte cell aggregates isolated by the method described above.

본 발명의 세포치료제는 유효성분으로서 단핵구 세포 집합물 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. The cell therapeutic agent of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive in addition to monocyte cell aggregates as an active ingredient, and may be in a unit dosage form suitable for administration in the body of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field. Can be formulated.

이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 바람직하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 증류수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다. 바람직하게는 세포치료제는 주사에 적당한 제형으로 조제된다. 이를 위해서는, 본 발명의 단핵구 세포 집합물은 약학적으로 허용되는 수용액 중에 용해되어 있거나 또는 용액상태에서 동결된 것이 바람직하다. Formulations suitable for this purpose are preferably parenteral administration preparations for injection or topical administration. For example, it can be used parenterally in the form of injections of sterile solutions or suspensions using water or other pharmaceutically acceptable solvents as necessary. For example, pharmaceutically acceptable carriers or media such as distilled water, saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders and the like, in general It can be formulated by admixing into a unit dosage form that is recognized as. Preferably the cell therapy is formulated in a formulation suitable for injection. For this purpose, the monocyte cell aggregates of the present invention are preferably dissolved in a pharmaceutically acceptable aqueous solution or frozen in solution.

본 발명의 단핵구 세포 집합물의 1일 투여량은 1x104 내지 1x107 세포/kg 체중, 바람직하게는 5x105 내지 5x106 세포/kg 체중이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 간엽 줄기세포, 예를 들면 제대혈 유래간엽 줄기세포의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.The daily dose monocytes set of water of the present invention is 1x10 4 to 1x10 7 cells and / kg body weight, preferably 5x10 5 to 5x10 6 cells / kg body weight, may be administered once or several dividing circuit. However, the actual dosage of the mesenchymal stem cells of the present invention, for example, cord blood-derived mesenchymal stem cells, is increased or decreased in consideration of various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, and the weight, age, and sex of the patient. This is possible.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 투여될 대상체에 대해 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 약학적으로 허용되는 희석제의 예로는 이에 한정되는지는 않으나, 염수, 수용성 버퍼, 용매, 분산제 등을 들 수 있다.The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising monocyte cell aggregates isolated by the method described above. The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and diluent. The pharmaceutically acceptable carrier and diluent may be biologically and physiologically friendly to the subject to be administered. Examples of pharmaceutically acceptable diluents include, but are not limited to, saline, aqueous buffers, solvents, dispersants, and the like.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물로 채워진 용기를 하나 이상 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 주사기구를 포함할 수 있다. The present invention also provides a kit comprising one or more containers filled with monocyte cell aggregates isolated by the methods described above. Kits of the invention may comprise a syringe bulb.

본 발명은 또한 상기한 방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물의 용도를 제공한다. The invention also provides for the use of monocyte cell aggregates isolated by the above methods.

본 발명의 단핵구 세포 집합물은 그 자체로서 세포 치료제로써 유리하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 특정 줄기세포를 분리 내지 분화 유도하기 위한 재료로써 사용될 수 있다. The monocyte cell aggregates of the present invention can be used not only advantageously as cell therapeutics per se, but also as materials for isolating or inducing specific stem cells.

본 발명의 단핵구 세포 집합물은 중배엽유래 줄기세포, 조혈모세포, 혈관내피세포, 혈관주위세포 등 다양한 줄기세포를 포함하고 있으며, 그 자체로서 퇴행성 관절염, 척수손상, 뇌출혈, 급성 뇌경색, 급성 심근경색, 만성 척수손상, 척수 손상, 당뇨성 급성 또는 아토피성 피부염, 만성 궤양, 제 1형 당뇨병, 크론병 등 면역관련 질환에 대한 세포치료제로 사용가능하며, 연골 손상, 뼈 손상, 근육 손상, 신경 손상, 혈관 손상 관련 질환, 예컨대, 척수신경손상, 뇌경색, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 만성궤양, 급성 궤양, 허혈성 뇌질환에 대한 세포치료제로 사용가능하다. 그밖에 골수 유래 단핵구 세포에 의해 치료가능한 질환 또는 상태의 치료를 위한 세포 치료제로 이용가능하다. 본 발명의 단핵구 세포 집합물 내에 포함된 중배엽 줄기세포, 조혈모세포, 혈관주위세포 등이 상기 기재된 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료에 효과적임은 당 분야에 잘 알려져 있다. Monocyte cell aggregates of the present invention include a variety of stem cells, such as mesodermal stem cells, hematopoietic stem cells, vascular endothelial cells, perivascular cells, such as degenerative arthritis, spinal cord injury, cerebral hemorrhage, acute cerebral infarction, acute myocardial infarction, It can be used as a cell therapy for immune related diseases such as chronic spinal cord injury, spinal cord injury, diabetic acute or atopic dermatitis, chronic ulcer, type 1 diabetes, Crohn's disease, cartilage damage, bone damage, muscle damage, nerve damage, It can be used as cell therapy for vascular injury related diseases such as spinal nerve injury, cerebral infarction, diabetic foot ulcer, diabetic chronic ulcer, acute ulcer, ischemic brain disease. It is also available as a cell therapy for the treatment of diseases or conditions treatable by bone marrow-derived monocyte cells. It is well known in the art that mesodermal stem cells, hematopoietic stem cells, perivascular cells, etc. contained in the monocyte cell aggregates of the present invention are effective in the prevention and / or treatment of the diseases or conditions described above.

또한, 본 발명의 단핵구 세포 집합물은 중간엽유래줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈세포 또는 조혈모세포를 분리하기 위한 재료로서 사용될 수 있다. 본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 중간엽유래줄기세포, 혈관내피줄기세포, 조혈세포 또는 조혈모세포의 분리는 당 업계에 공지된 통상의 방법, 예컨대, 발현 형질 마커를 이용하여 자석 또는 FACS를 이용하여 분리할 수 있다. 이렇게 분리된 특정 줄기세포는 각각의 용도에 따라 세포치료제로써 이용할 수 있다.In addition, the monocyte cell aggregate of the present invention can be used as a material for separating mesenchymal derived stem cells, vascular endothelial stem cells, hematopoietic cells or hematopoietic stem cells. Separation of mesenchymal-derived stem cells, vascular endothelial stem cells, hematopoietic cells or hematopoietic stem cells from the monocyte cell aggregates of the present invention can be performed using conventional methods known in the art, for example, using a magnetic marker or FACS using an expression marker. Can be separated. Specific stem cells isolated in this way can be used as a cell therapy according to each use.

본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 중간엽유래 줄기세포, 혈관내피줄기세포, 또는 조혈모세포의 분리는 특정 줄기세포의 분리에 관한 당 업계에 알려진 일반적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단핵구 세포 집합물에 특정 항체를 처리하여 FACS 또는 MACS를 이용하여 특정 줄기세포를 분리할 수 있다. Separation of mesenchymal-derived stem cells, vascular endothelial stem cells, or hematopoietic stem cells from the monocyte cell aggregates of the present invention can be performed using general methods known in the art for the isolation of specific stem cells. For example, specific stem cells may be isolated by treating specific monocyte cell aggregates of the present invention using FACS or MACS.

본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 중간엽유래 줄기세포를 분리하는 방법으로써, 본 발명의 단핵구 세포 집합물을 배양접시에 중간엽유래 줄기세포 배양 배지 (예; a-MEM+20% 우혈청+L-glutamin+항생제) 상에서 접종하여 골수기질세포 및 중배엽유래줄기세포의 특성인 부착성 세포를 배양하여 중간엽유래 줄기세포를 분리, 배양하거나, 본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 CD29+, Stro-1+ 세포를 FACS 또는 MACS로 분리하여 중간엽유래 줄기세포 배양배지에서 배양할 수 있다. 배양한 중간엽유래 줄기세포는 근골격계 세포로 분화시킬 수 있으며 특히 연골, 뼈, 지방, 근육, 인대 및 신경으로의 분화가 가능하므로 분화 후 세포치료제로 사용할 수 있다. 분리한 중간엽유래 줄기세포를 신경세포로 분리한 후 척수신경손상, 뇌경색에 세포치료제로 가능하며, 연골세포로 분화시킨 후 관절연골손상, 턱관절연골손상, 연골보형물 삽입에 이용할 수 있으며, 지방세포로 분화 시 함몰부위 복원 등에 이용가능하다. 또한 중배엽유래 줄기세포의 면역억제기전을 통한 알레르기성 질환, 염증 억제에 이용가능하다.As a method for separating mesenchymal-derived stem cells from the monocyte cell aggregate of the present invention, the mesenchymal-derived stem cell culture medium (e.g., a-MEM + 20% bovine serum + L) -glutamin + antibiotics) to inoculate adherent cells characteristic of bone marrow stromal cells and mesodermal derived stem cells to isolate and culture mesenchymal stem cells, or CD29 + , Stro-1 + from the monocyte cell aggregates of the present invention. The cells can be isolated by FACS or MACS and cultured in mesenchymal-derived stem cell culture media. Cultured mesenchymal-derived stem cells can be differentiated into musculoskeletal cells, and in particular, can be differentiated into cartilage, bone, fat, muscle, ligaments and nerves, and thus can be used as a cell therapy after differentiation. The isolated mesenchymal-derived stem cells can be divided into neurons and used as cell therapy for spinal nerve injury and cerebral infarction. It can be used for restoring recessed part when differentiating into cells. In addition, it is possible to suppress allergic diseases and inflammation through the immunosuppressive mechanism of mesenchymal derived stem cells.

본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 혈관내피줄기세포를 분리하는 방법으로써, 본 발명의 골수 단핵구 세포를 인간 피브로넥틴(human fibronectin)으로 코팅한 배양접시에 내피전구세포 배양액에서 배양하여, 부착성 세포인 혈관내피전구세포를 얻을 수 있다. 얻어낸 혈관내피전구세포는 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 만성궤양 및 급성 궤양, 허혈성 뇌질환 등 손상 조직의 혈관 형성 촉진을 통한 치료효과가 기대되는 질환에 세포치료제로 이용 가능하다.As a method for separating vascular endothelial stem cells from the monocyte cell aggregate of the present invention, the bone marrow monocyte cells of the present invention are cultured in an endothelial progenitor cell culture in a culture plate coated with human fibronectin, and the blood vessels as adherent cells. Endothelial progenitor cells can be obtained. The obtained vascular endothelial progenitor cells can be used as cell therapy for diseases in which diabetic foot ulcers, diabetic chronic ulcers and acute ulcers, and ischemic brain diseases are expected to have therapeutic effects by promoting the formation of damaged tissues.

본 발명의 단핵구 세포 집합물로부터 조혈모세포를 분리하는 방법으로써, 항체를 이용하여 특정 마커를 발현하는 조혈모세포를 분리하여 골수치환술 등에 이용할 수 있다.As a method for isolating hematopoietic stem cells from the monocyte cell aggregate of the present invention, hematopoietic stem cells expressing specific markers can be isolated using an antibody and used for bone marrow replacement.

본 발명의 분리방법에 의하면 종래 단핵구세포 분리 시 불필요한 것으로 여겨져 버리던 골수 내 지방조직에서 많은 단핵구를 회수할 수 있으며, 특히 중간엽유래 줄기세포, 조혈모세포, 혈관내피전구세포 등 유효세포의 수를 크게 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 분리방법에 의하여 분리된 단핵구 세포 집합물은 그 자체로 세포치료제로 사용될 수 있으며, 특정 줄기세포의 분리, 배양, 분화를 통해 다양한 질환의 치료제로 이용 가능하므로 경제적, 기술적 이점을 가진다.According to the separation method of the present invention, a large number of monocytes can be recovered from the adipose tissue in bone marrow, which has been considered unnecessary in the conventional mononuclear cell separation. Can be increased. In addition, the monocyte cell aggregate isolated by the isolation method of the present invention can be used as a cell therapy itself, and can be used as a therapeutic agent for various diseases through isolation, culture and differentiation of specific stem cells. Have

도1은 랫트의 골수 단핵구세포층과 지방층에서 얻은 세포들 중 줄기세포 특성 (side population)을 보이는 세포의 함유량을 측정한 도로써, 도1-가)는 랫트 골수의 MNC층의 단핵구 세포수를, 도1-나)는 랫트 골수 지방층의 단핵수 세포수를 표시하고 있으며, 도1-다)는 랫트 골수 단핵구층 세포의 side population 분석결과를 나타내고, 도1-라)는 랫트 골수 지방층 세포의 side population 분석 결과를 나타내고, 도1-마)는 랫트 골수 단핵구층 세포의 side population 함유율(%)을 나타내고, 도1-바)는 랫트 골수 지방층 세포의 side population 함유율(%)을 나타낸다. 도1-사)는 랫트 골수 단핵구와 지방층에 포함된 side population의 세포수를 나타낸다.
도2는 인간골수천자액에 포함되어있는 지방조직의 구조를 분석한 도로써, 도2-가)는 H&E 염색 결과이고, 도2-나)는 오일 레드 오 염색 결과이고, 도2-다) 및 라)는 제1형 콜라겐과 혈관내피전구세포의 마커인 렉틴에 대한 형광염색 후 컨포칼 레이져 스캐닝 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도3은 인간 골수천자액의 지방층과 단핵구층에서 얻어낸 세포들을 각 특정 세포의 마커로 형광염색한 후 유세포분석을 한 도로써, 도3-가)는 지방층과 단핵구층에서 얻은 세포 내에 각 마커를 발현하는 세포의 함유율 (%)을 분석한 도이고, 도3-나)는 지방층과 단핵구층 각각에서 얻어낸 세포수에 비율을 곱하여 얻어낸 전체 세포수를 나타낸 도이다.
도4는 골수 천자액로부터 단핵구 세포를 분리하는 단계를 나타낸 도로써, 도4- 가)는 종래의 단핵구 세포 분리 방법을 나타낸 도이고, 도4-나)는 본 발명의 한 구현 형태인 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법을 나타낸 도이다.
도5는 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 MNC(단핵구세포)층과 지방층에서 나타난 세포 덩어리를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도6은 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 단핵구 세포의 회수율을 MNC(단핵구세포)층과 지방층에서 비교한 도이다.
도7은 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 단핵구 세포를 중배엽유래 줄기세포 배양배지에서 배양한 후의 세포수를 비교한 도이다.
도8은 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 단핵구 세포를 중배엽유래 줄기세포 배양배지에서 배양한 후 표면형질마커 CD29, α-평활근 액틴 (α-SMA), CD105 (이상, 중배엽유래줄기세포 발현 마커), UEA-1 렉틴 (혈관내피전구세포 마커), CD45, CD117(이상, 혈구세포 마커)로 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도9는 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 MNC층의 단핵구세포를 중배엽유래 줄기세포 배양배지에서 배양한 후 다분화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (도9A:골분화, 도9B:지방분화, 도9C: 연골분화).
도10은 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 단핵구 세포를 혈관내피전구세포 배양배지에서 배양한 후의 세포수를 비교한 도이다.
도11은 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 MNC층의 단핵구 세포를 혈관내피전구세포 배양액에서 배양한 후 혈구내피전구세포 (EPC)의 특성인 튜브 형성능을 평가한 결과를 나타낸 도이다 (가): 효소처리 전 지방층에서 얻은 EPC의 결과, 나) 효소처리 전 MNC층에서 얻은 EPC의 결과, 다) 효소처리 후 MNC층에서 얻은 EPC의 결과, 라) 비교군인 중배엽유래줄기세포의 튜브 형성능 실험 결과).
도12는 종래의 단핵구 세포 분리방법과 본 발명의 효소전처리를 포함하는 단핵구 세포 분리방법으로 분리한 MNC층의 단핵구 세포로 HSC-CFU 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다 (도12-(가): 각 콜로니 판독 기준, 도12-(나) 전체 MNC의 HSC-CFU 결과).
도13은 인간 골수 천자액으로부터 분리한 지방층 및 단핵구층 유래 세포의 콜로니 형성능을 비교한 그래프이다.
도14는 인간 골수 천자액으로부터 분리한 지방층 및 단핵구층 유래 세포의 side population 을 비교한 도이다.
도15는 인간 골수 천자액으로부터 분리한 지방층 및 단핵구층 유래 세포의 side population 분석 시 FACS를 이용해 얻어낸 side population과 major population으로 HSC-CFU 실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다.Figure 1 is a measure of the content of the cells showing the stem cell (side population) of the cells obtained from the bone marrow monocyte layer and fat layer of the rat, Figure 1-a) shows the number of monocytes in the MNC layer of rat bone marrow, Fig. 1-B) shows the number of mononuclear cells in the rat bone marrow adipose layer, and Fig. 1-D shows the results of the side population analysis of the rat bone marrow adipose layer. The results of the population analysis are shown, Fig. 1-M) shows the side population content (%) of the rat bone marrow monocyte layer cells, and Fig. 1-bar) shows the side population content (%) of the rat bone marrow adipose layer cells. Figure 1-4) shows the number of cells of the side population contained in the rat bone marrow monocytes and fat layer.
Figure 2 is a diagram analyzing the structure of adipose tissue contained in human bone marrow aspirate fluid, Figure 2-A) is the result of H & E staining, Figure 2-B) is the oil red o staining result, Figure 2-C) And d) is the result of fluorescence staining for lectin, a marker of type 1 collagen and vascular endothelial progenitor cells, followed by a confocal laser scanning microscope.
Figure 3 is a flow cytometric analysis of cells obtained from the adipose layer and monocyte layer of human bone marrow aspirate with markers of each specific cell. Figure 3-A) shows each marker in cells obtained from the adipose layer and monocyte layer. Fig. 3B) shows the total number of cells obtained by multiplying the number of cells obtained in each of the adipose layer and the monocyte layer.
Figure 4 is a diagram showing the step of separating the monocytes from the bone marrow puncture solution, Figure 4-a) is a diagram showing a conventional monocyte cell separation method, Figure 4-b) is an enzyme pretreatment that is an embodiment of the present invention Figure showing a monocyte cell separation method comprising a.
Figure 5 is a view showing the result of comparing the cell mass shown in the MNC (monocyte cell) layer and fat layer separated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention.
6 is a diagram comparing the recovery rate of monocytes separated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention in the MNC (monocyte cell) layer and fat layer.
Figure 7 is a comparison of the number of cells after culturing the monocyte-derived stem cell culture medium for monocytes isolated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention.
8 is a surface morphology markers CD29, α-smooth muscle actin (α-SMA), CD105 (above, after culturing monocyte cells isolated by monocyte cell separation method including enzyme pretreatment of the present invention in mesoderm-derived stem cell culture medium) Mesoderm derived stem cell expression marker), UEA-1 lectin (vascular endothelial progenitor cell marker), CD45, CD117 (above, hematopoietic cell marker) is a diagram showing the results of staining.
9 is a diagram showing the results of confirming multipotency after culturing monocyte cells of the MNC layer isolated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention in a mesoderm-derived stem cell culture medium. (FIG. 9A: Bone differentiation, FIG. 9B: Fat differentiation, FIG. 9C: Cartilage differentiation).
Figure 10 is a comparison of the number of cells after culturing in the vascular endothelial progenitor cell culture medium mononuclear cells separated by a conventional monocyte cell separation method and a monocyte cell separation method comprising the enzyme pretreatment of the present invention.
11 is a characteristic of hemocytic endothelial progenitor cells (EPC) after culturing the monocyte cells of the MNC layer separated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention in vascular endothelial progenitor cell culture medium. (A): Result of EPC obtained from fat layer before enzyme treatment, b) Result of EPC obtained from MNC layer before enzyme treatment, c) Result of EPC obtained from MNC layer after enzyme treatment, D) Results of tube formation ability of mesenchymal derived stem cells in comparison group).
Figure 12 is a diagram showing the results of performing the HSC-CFU experiment with the monocyte cells of the MNC layer separated by the conventional monocyte cell separation method and the monocyte cell separation method including the enzyme pretreatment of the present invention (Fig. 12- (a)) : Each colony reading criteria, Figure 12- (b) HSC-CFU results of the entire MNC).
Figure 13 is a graph comparing the colony forming ability of the adipose layer and monocyte layer-derived cells isolated from human bone marrow puncture fluid.
FIG. 14 is a diagram comparing side populations of adipose layer and monocyte layer-derived cells isolated from human bone marrow puncture fluid. FIG.
FIG. 15 is a diagram showing the results of HSC-CFU experiments performed with side and major populations obtained using FACS when analyzing side populations of adipose layer and monocyte layer-derived cells isolated from human bone marrow aspirate.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명의 구현 모습을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. Hereinafter, the embodiment of the present invention will be described in more detail with reference to examples to help understand the present invention, but these examples are provided to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

<< 실시예Example 1> 젊은  1> young 랫트와Rat 늙은  old 랫트의Rat 골수의 지방층과  Fat layer of bone marrow 단핵구층으로부터From monocyte layer 줄기세포의 한 특성인  One characteristic of stem cells sideside populationpopulation 을 보이는 세포의 분석Analysis of cells

줄기세포는 세포독성을 가지고 있는 화학물질에 대한 세포 손상을 막고 생존력을 높이기 위해 ABCG2와 같은 세포막 단백질을 갖고 있는 것으로 알려져 있으며 그 특성을 이용하여 Hoechst33342를 염색하여 major population과 구분되는 side population 세포를 분리할 수 있다(Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806). 이 side population은 ABSG2 효소의 저해제인 베라파밀을 처리했을 때 사라지는 것으로 확인할 수 있다. 이 side population 세포들은 골수 이식 시 이식 후 골수줄기세포의 장기간 재군집화에 중요한 요소로써 현재 보고된 바로는 골수 내 단핵구 세포의 0.05?0.1%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있으며 이 줄기세포를 많은 양 얻어내는 것이 골수 이식 및 골수 세포 이용에 중요한 요소가 된다. 골수 내 지방조직과 단핵구층에서 얻은 세포 내에 side population의 양을 확인하기 위해 16주령과 52주령 랫트를 이용하여 대퇴부 골수의 지방층과 단핵구층 세포를 분석하였다. 랫트는 12주령 이상이 되면 대퇴부 골수가 노령화로 인해 지방조직이 생기게 되며 52주령의 랫트는 인간의 나이로 30세경이 되므로 현재 골수채취를 하는 환자의 나이를 대변할 수 있으므로 52주령 랫트를 이용하였다. 비교군으로는 16주령의 랫트를 이용하여 52주령이 되었을 시 노령화에 따라 골수의 노화로 인해 증가한 골수 내 지방조직의 특성을 비교하고자 하였다.Stem cells are known to have cell membrane proteins such as ABCG2 to prevent cellular damage to chemicals that have cytotoxicity and to enhance their viability.These stem cells are stained with Hoechst33342 to isolate side population cells from major populations. (Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806). This side population disappears when treated with verapamil, an inhibitor of the ABSG2 enzyme. These side population cells are important factors for long-term repopulation of bone marrow stem cells after transplantation, and currently reported to account for 0.05 ~ 0.1% of monocyte cells in bone marrow. It is an important factor in bone marrow transplantation and bone marrow cell utilization. The fat and monocyte cells of the femoral bone marrow were analyzed in 16-week-old and 52-week-old rats to determine the amount of side population in the cells obtained from adipose tissue and monocyte layer in bone marrow. Rats were 12 weeks old or older, and femoral bone marrow developed adipose tissue due to aging. 52-week-old rats were about 30 years old in human age, so 52-week-old rats were used because they represent the age of bone marrow patients. . To compare the characteristics of adipose tissue in bone marrow, which was increased due to aging of bone marrow at aging at the age of 52 weeks using 16-week-old rats.

요약하면, 16주령 랫트와 52주령 랫트 대퇴골을 채취하여 PBS로 2회 이상 세척한 후 대퇴골의 상, 하단의 뼈를 제거하고 주사기를 이용하여 5ml 배지를 이용하여 골수를 채취한 다음, 밀도-구배 원심분리를 위해 15ml 튜브에 5ml 피콜-파큐 플러스를 담고 그 위에 시료를 피콜-파큐 플러스와 섞이지 않도록 조심스럽게 올린 다음, 2200rpm에서 20분간 원심분리하였다.In summary, 16-week-old rats and 52-week-old rat femurs were collected and washed two or more times with PBS, bones from the top and bottom of the femur were removed, and bone marrow was collected using a 5 ml medium using a syringe. 5 ml Ficoll-Pacque Plus was placed in a 15 ml tube for centrifugation, and the sample was carefully placed thereon so as not to mix with Ficol-Pacque Plus, and then centrifuged at 2200 rpm for 20 minutes.

분리된 층은 위로부터 지방, 혈청, 단핵구세포, 적혈구로 구분된다. The separated layer is divided into fat, serum, monocytes and red blood cells from the stomach.

이 중 최상층의 지방층과, 혈청층과 피콜-파큐 층 사이의 MNC 층을 분리하여 최종 농도 1000 U/ml시료 콜라게네이즈(I형)가 되도록 한 후, 이를 37℃ 배양기에서 30분간 배양하였다. 2.5% 트립신 (GibcoTM) 를 전체 양의 1/10 을 처리하여 최종 농도 0.25% 트립신이 되도록 첨가한 후 37oC 배양기에서 10분간 배양한 다음, PBS로 1회 세척하고 단핵구 세포 숫자를 측정하였다. Among them, the fat layer of the top layer and the MNC layer between the serum layer and the picol-paque layer were separated to a final concentration of 1000 U / ml sample collagenase (type I), and then incubated for 30 minutes in a 37 ° C. incubator. 2.5% trypsin (Gibco TM ) was added to a final concentration of 0.25% trypsin after 1/10 of the total amount, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 10 minutes, washed once with PBS, and the number of monocytes was measured. .

DMEM:F12=3:1 배지에 2% FBS, 10mM HEPES 버퍼를 첨가한 배지로 1*106/ml로 세포를 희석하여 Hoechst33342 염료를 4ug/ml 처리하고 37oC 수조에서 80분간 배양한 다음, PI로 5분간 염색한 후 UV파장대에서 유세포분석기를 통해 분석하였다(도1).Dilute the cells to 1 * 10 6 / ml with 2% FBS, 10mM HEPES buffer in DMEM: F12 = 3: 1 medium, 4ug / ml of Hoechst33342 dye, and incubate in 37 o C water for 80 minutes. , After staining for 5 minutes with PI was analyzed by flow cytometry at UV wavelength band (Fig. 1).

그 결과 노화가 진행될수록, 즉 단핵구 세포층 (도1-사))의 side population(SP)의 수는 16주령에 비해 52주령이 감소하였으나, 지방조직에 포함된 side population의 수는 16주령에 비해 52주령에서 크게 증가하였으며, 이를 전체 단핵구세포수에 대비해 계산한 결과 지방조직에 포함된 side population이 16주령에 비해 52주령에서 18.4배 증가하여 골수의 노화에 따라 줄기세포가 지방조직에서 증가함을 알 수 있었다. As the aging progressed, that is, the number of side populations (SP) of the monocyte cell layer (FIG. 1-sa) decreased by 52 weeks compared to 16 weeks, but the number of side populations contained in adipose tissue was lower than that of 16 weeks. It was increased significantly at 52 weeks of age, and calculated from the total number of monocytes, the side population contained in adipose tissue increased by 18.4 times at 52 weeks compared to 16 weeks of age. Could know.

따라서, 지방층이 버려지는 종래 줄기세포 분리방법에 의하여는 (특히 노령 개체의 경우) 그 줄기세포가 지방조직 근처에 있어 골수 이용 시 충분히 활용되지 못했음을 알 수 있었다. 또한 단핵구 세포층의 세포수는 노령화에 따라 감소하고, 지방층의 세포수는 증가함을 확인하였다(도1-가) 및 나)). 그러므로 본 발명에 따라 노령 골수로부터 줄기세포를 충분히 회수하여 이용할 수 있을 것으로 기대된다. Therefore, the conventional stem cell separation method in which the fat layer was discarded (particularly in the case of elderly individuals) showed that the stem cells were near the adipose tissue and thus were not sufficiently utilized when using the bone marrow. In addition, it was confirmed that the number of cells in the monocyte cell layer decreases with aging, and the number of cells in the fat layer increases (Fig. 1A) and B)). Therefore, according to the present invention, it is expected that stem cells can be sufficiently recovered and used from old bone marrow.

<< 실시예Example 2> 인간 골수  2> human bone marrow 천자액의Puncture 지방층 구조 분석 및 지방층과  Fat layer structure analysis and fat layer 단핵구층Monocyte layer 세포의  Cell 유세포분석기를Flow cytometer 통한  through 마커Marker 분석 analysis

(1) 인간 골수 내 지방층의 구조 분석 (1) structural analysis of fat layer in human bone marrow

인간 골수 천자액 내 지방 조직을 채취하여 3.7% 포름알데히드로 상온에서 20분간 고정한 다음, 6um 두께로 동결절편을 제작하였다. 구조 분석을 위해 H & E 염색을 하고, 지방구 분포를 확인하기 위해 오일 레드 오(Oil red O) 염색을 실시하였다. 또한 세포외기질의 하나인 제1형 콜라겐과 혈관내피전구세포의 마커인 렉틴으로 형광면역염색을 하여 관찰하였다. H&E 염색은 동결미세절편을 붙인 슬라이드를 PBS로 세척한 후 해리스 헤마톡실린으로 5분 염색한 다음, 흐르는 물로 5분 이상 세척하였다. 1% HCl 용액으로 1회 헹군 후 흐르는 수돗물로 세척하여 핵을 청화시킨 다음, 70%, 80%, 90% 에탄올을 거쳐 에오신에서 5분 염색하였다. 95%, 100% 에탄올로 세척한 후 자일렌으로 탈수시켜 마운팅한 후 광학현미경에서 관찰하였다. Adipose tissue in human bone marrow puncture fluid was collected and fixed for 20 minutes at room temperature at 3.7% formaldehyde, and then frozen sections were prepared to a thickness of 6 μm. H & E staining was performed for structural analysis, and oil red O staining was performed to confirm the distribution of fat globules. In addition, fluorescence immunostaining was performed with type 1 collagen, one of extracellular matrix, and lectin, a marker of vascular endothelial progenitor cells. For H & E staining, the slides with frozen microfractions were washed with PBS, stained with Harris hematoxylin for 5 minutes, and then washed with running water for at least 5 minutes. After rinsing once with 1% HCl solution and washing with running tap water, the nuclei were clarified and then stained for 5 minutes in eosin via 70%, 80%, 90% ethanol. After washing with 95%, 100% ethanol, dehydrated with xylene and mounted, and observed under an optical microscope.

오일 레드 오 염색은 동결미세절편을 붙인 슬라이드를 PBS로 세척한 후 0.18% 오일 레드 오 용액에 15분간 염색한 후 60% 이소프로판올로 3분간 헹군 후 해리스 헤마톡실린으로 5분간 염색한 다음 헹군 후 수용성 마운턴트로 마운팅하여 광학현미경에서 관찰하였다. 형광염색은 동결미세절편을 붙인 슬라이드를 PBS로 세척한 다음, 0.3% PBS-T로 5분간 침투시킨 후 20% 정상 염소 혈청으로 30분간 블록킹하였다. 항 제1형 콜라겐 항체 (Biodesign) 를 1:100으로 처리하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 텍사스-레드 접합 항 토끼 IgG (1:100)로 30분간 반응시켰다.For oil red o staining, slides with frozen microfractions were washed with PBS, stained with 0.18% oil red o solution for 15 minutes, rinsed with 60% isopropanol for 3 minutes, stained with Harris hematoxylin for 5 minutes, and then soluble in water. Mounted with a mount and observed on an optical microscope. Fluorescent staining was performed by washing PBS-suspended slides with PBS, infiltrating with 0.3% PBS-T for 5 minutes, and blocking with 20% normal goat serum for 30 minutes. Anti-type collagen antibody (Biodesign) was treated with 1: 100 and reacted at room temperature for 1 hour, and then reacted with Texas-red conjugated anti-rabbit IgG (1: 100) for 30 minutes.

같은 슬라이드에 바이오틴 접합 항-렉틴(Sigma) 항체를 1:100으로 처리한 후 FITC-접합 스트렙트아비딘(1:100)으로 반응시킨 다음 형광염색용 마운턴트로 마운팅하여 컨포칼 레이져 스캐닝 마이크로스코프로 관찰하였다(도2).Biotin-conjugated anti-lectin (Sigma) antibodies were treated 1: 100 on the same slide, then reacted with FITC-conjugated streptavidin (1: 100) and then mounted with a fluorescence staining mount with a confocal laser scanning microscope. Observation was made (FIG. 2).

관찰 결과, 지방 조직 주변에 기질조직 및 많은 세포가 존재함을 확인하였고 특히 혈관구조 및 혈관전구체세포가 지방구 사이로 많이 분포하고 있음을 확인하였다. As a result, it was confirmed that stromal tissue and many cells exist around adipose tissue, and in particular, vascular structure and vascular progenitor cells are widely distributed among fat spheres.

(2) 인간 골수 내 지방층과 (2) the fat layer in human bone marrow 단핵구층Monocyte layer 세포의  Cell 마커Marker 분석  analysis

인간 골수 천자액 내 지방층과 단핵구층의 세포의 유세포분석기를 통한 마커 분석을 위해 환자의 엉덩이뼈로부터 골수 천자액 10ml을 취하였다. 환자는 강남베드로병원 척추손상환자로써 환자의 골수 천자액의 연구목적으로의 기증을 동의 받아 회수하였다 (KPH IRB 2009-003). 환자의 엉덩이뼈 (골반뼈) 피부와 근육 부위에 국소마취를 실시한 후 골수채취용구를 이용하여 엉덩이뼈로부터 골수를 채취하였다. 채취시 혈액응고를 방지하기 위해 헤파린을 1000U을 첨가하였다. 밀도-구배 원심분리를 위해 15ml 튜브에 5ml 피콜-파큐 플러스(Ficoll-paque plus)를 담고 그 위에 시료를 피콜-파큐 플러스와 섞이지 않도록 조심스럽게 올린 다음, 2200rpm에서 20분간 원심분리하였다.10 ml of bone marrow puncture fluid was taken from the hip bone of the patient for marker analysis by flow cytometry of the cells of the adipose layer and monocyte layer in the human bone marrow puncture fluid. A patient with spinal cord injury at Gangnam Peter Hospital was collected with consent for donation of the patient's bone marrow puncture fluid (KPH IRB 2009-003). Local anesthesia was performed on the hip and pelvic bones of the patient, and bone marrow was collected from the hip bone using a bone marrow collecting tool. 1000 U was added to heparin to prevent blood coagulation during collection. 5 ml Ficoll-paque plus was placed in a 15 ml tube for density-gradient centrifugation, and the sample was carefully raised so as not to mix with Ficoll-Pacque Plus, and then centrifuged at 2200 rpm for 20 minutes.

분리된 층은 위로부터 지방, 혈청, 단핵구세포, 적혈구로 구분된다. The separated layer is divided into fat, serum, monocytes and red blood cells from the stomach.

이 중 최상층의 지방층과, 혈청층과 피콜-파큐 층 사이의 MNC 층을 분리하여 회수하였다. 혈청 프리 배지로 2000U/ml 콜라게네이즈 원액 용액(Warthington Biochemical Cop. in USA)을 만든 다음, 환자로부터 얻은 골수천자액에 동일 양 (5ml)을 처리하여 최종 농도 1000 U/ml 콜라게네이즈(I형)가 되도록 한 후, 이를 37℃ 배양기에서 30분간 배양하였다. 2.5% 트립신 (GibcoTM) 를 전체 양의 1/10 (2ml)을 처리하여 최종 농도 0.25% 트립신이 되도록 첨가한 후 37oC 배양기에서 10분간 배양한 다음, PBS로 1회 세척하고 3.7% 포름알데히드로 상온에서 20분간 세포를 고정하였다. PBS로 3회 이상 세척한 다음, 0.1% 트리톤 X-100을 포함하고 있는 5% BSA 용액으로 희석하여 혈관주위세포 마커인 CD146(+)/a-SMA(+), 기질세포 마커인 CD105(+), 혈구전구세포마커인 CD34(+)/Lin(-), 다분화능세포 마커인 CD133(+), 단핵구마커인 CD11b(+) 항체를 이용하여 형광염색을 한 후 유세포분석기 Caliber를 이용해 분석하였다(도3).Among them, the fat layer of the uppermost layer and the MNC layer between the serum layer and the Piccol-Pacque layer were separated and recovered. Prepare 2000 U / ml collagenase stock solution (Warthington Biochemical Cop. In USA) with serum-free medium, and then treat the same amount (5 ml) in the bone marrow aspirate obtained from the patient to obtain a final concentration of 1000 U / ml collagenase (I Type), and then incubated for 30 minutes in a 37 ℃ incubator. 2.5% Trypsin (Gibco TM ) was added to a final amount of 0.25% trypsin, treated with 1/10 (2ml) of the total amount, incubated in a 37 ° C. incubator for 10 minutes, then washed once with PBS and 3.7% form The cells were fixed for 20 minutes at aldehyde at room temperature. After washing three times or more with PBS, diluted with 5% BSA solution containing 0.1% Triton X-100, the perivascular marker CD146 (+) / a-SMA (+), the stromal cell marker CD105 (+ ), Fluorescence staining using CD34 (+) / Lin (-), a hematopoietic cell marker, CD133 (+), a multipotent cell marker, and CD11b (+), a monocyte marker, and analyzed using a flow cytometer Caliber. (Figure 3).

얻어낸 단핵세포 중 차지하고 있는 퍼센트를 확인한 결과 (도3), 혈구전구세포는 단핵구세포층에 더 많이 존재하였고, 혈관주위세포의 마커인 CD146(+)/α-SMA(+)세포는 지방조직에 현저히 많이 존재하고 있음을 확인하여 지방조직 내 세포군이 단핵구세포군과는 다른 구성을 가지고 있음을 확인하였다. 이 결과를 통해 제1형 콜라게네이즈 처리를 함으로써 더 많은 전구세포들을 얻을 수 있으며, 특히 혈관주위세포를 많이 얻어낼 수 있을 것으로 기대된다. As a result of confirming the percentage of mononuclear cells obtained (Fig. 3), hematopoietic progenitor cells were more present in the mononuclear cell layer, and CD146 (+) / α-SMA (+) cells, which are markers of perivascular cells, were remarkable in adipose tissue. The presence of a large number of cells in the adipose tissue confirmed that the monocyte cell group has a different configuration. Through this result, it is expected that more progenitor cells can be obtained by treating type 1 collagenase, and in particular, many perivascular cells can be obtained.

<실시예 3> 골수 천자액로부터 단핵구 세포의 분리 Example 3 Isolation of Monocyte Cells from Bone Marrow Perforated Fluid

환자의 엉덩이뼈로부터 골수 천자액 5ml을 취하였다. 환자는 강남베드로병원 척추손상환자로써 환자의 골수 천자액의 연구목적으로의 기증을 동의 받아 회수하였다 (KPH IRB 2009-003). 환자의 엉덩이뼈 (골반뼈) 피부와 근육 부위에 국소마취를 실시한 후 골수채취용구를 이용하여 엉덩이뼈로부터 골수를 채취하였다. 채취 시 혈액응고를 방지하기 위해 헤파린을 1000U을 첨가하였다. 5 ml of bone marrow puncture was taken from the hip bone of the patient. A patient with spinal cord injury at Gangnam Peter Hospital was collected with consent for donation of the patient's bone marrow puncture fluid (KPH IRB 2009-003). Local anesthesia was performed on the hip and pelvic bones of the patient, and bone marrow was collected from the hip bone using a bone marrow collecting tool. 1000 U was added to heparin to prevent blood coagulation during collection.

혈청 프리 배지로 2000 U/ml 콜라게네이즈 원액 용액(Warthington Biochemical Cop. in USA)을 만든 다음, 환자로부터 얻은 골수천자액에 동일 양 (5ml)을 처리하여 최종 농도 1000 U/ml 콜라게네이즈가 되도록 한 후, 이를 37℃ 배양기에서 30분간 배양하였다.Prepare 2000 U / ml collagenase stock solution (Warthington Biochemical Cop. In USA) with serum-free medium, and then treat the same amount (5 ml) in the bone marrow aspirate obtained from the patient to obtain a final concentration of 1000 U / ml collagenase. After this, it was incubated for 30 minutes in a 37 ℃ incubator.

2.5% 트립신(GibcoTM) 을 전체 양의 1/10 (2ml)을 처리하여 최종 농도 0.25% 트립신이 되도록 첨가한 후 37oC 배양기에서 10분간 배양하였다.2.5% trypsin (Gibco ™ ) was added to the final amount of 1/10 (2ml) to a final concentration of 0.25% trypsin and incubated for 10 minutes in a 37 ° C incubator.

콜라게네이즈 및 트립신을 제거하기 위해 PBS로 처리 시료를 2배 희석한 후 밀도-구배 원심분리를 이용하여 세포 분리하였다. 이 때 여기서는 피콜-파큐 플러스(Ficoll-paque plus, Armersham Biosciences) 를 이용하여 분리하였다. Treatment samples were diluted 2-fold with PBS to remove collagenase and trypsin and then cells were separated using density-gradient centrifugation. At this time, it was separated using Ficoll-paque plus (Arcersham Biosciences).

밀도-구배 원심분리를 위해 15ml 튜브에 5ml 피콜-파큐 플러스를 담고 그 위에 시료를 피콜-파큐 플러스와 섞이지 않도록 조심스럽게 올린 다음, 2200rpm에서 20분간 원심분리하였다.5 ml Picol-Pacque Plus was placed in a 15 ml tube for density-gradient centrifugation, and the sample was carefully placed thereon so as not to mix with Picol-Pacque Plus, followed by centrifugation at 2200 rpm for 20 minutes.

분리된 층은 위로부터 지방, 혈청, 단핵구세포, 적혈구로 구분된다. The separated layer is divided into fat, serum, monocytes and red blood cells from the stomach.

이 중 혈청층과 피콜-파큐 층 사이의 MNC 층만을 분리하여 PBS로 1회 세척한 다음, 단핵구 세포 숫자를 측정하고 줄기세포 활성 및 분화실험을 수행하였다.Among them, only the MNC layer between the serum layer and the Picol-Pacque layer was separated and washed once with PBS, followed by measuring the number of monocyte cells and performing stem cell activity and differentiation experiments.

<< 실시예Example 4> 4>

인간에서 얻어낸 골수천자액 5ml를 PBS를 이용하여 2배 희석한 다음, 밀도-구배 원심분리를 통해 (2200rpm, 20분간 원심분리) 지방층, 단핵구세포층, 적혈구층으로 분리하였다. 밀도-구배 원심분리는 위 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 5 ml of bone marrow aspirate obtained from humans was diluted twice with PBS, and then separated into adipose layer, monocyte layer, and erythrocyte layer by density-gradient centrifugation (2200 rpm, centrifugation for 20 minutes). Density-gradient centrifugation was performed in the same manner as in Example 1 above.

단핵구세포층과 지방층을 따로 분리 회수한 다음 세포를 5ml PBS에 희석한 다음 최종 농도 1000 U/ml 콜라게네이즈가 되도록 2000 U/ml 콜라게네이즈를 5ml 첨가하고 37℃ 배양기에서 30분간 각각 배양하였다. 최종농도 0.25% 트립신이 되도록 2.5% 트립신을 첨가하고 10분 더 배양한 다음 PBS로 세척하여 분석하였다. 이렇게 얻은 단핵구 세포 집합물을 이하의 실험에서 효소 처리 단계를 기준으로 실시예 3에 대하여 비교군으로 사용하였다. The monocyte cell layer and the fat layer were separated and recovered, and the cells were diluted in 5 ml PBS, and then, 5 ml of 2000 U / ml collagenase was added to the final concentration of 1000 U / ml collagenase, and incubated for 30 minutes at 37 ° C. incubator. 2.5% trypsin was added to a final concentration of 0.25% trypsin, incubated for another 10 minutes, and washed with PBS for analysis. The mononuclear cell aggregates thus obtained were used as comparative groups for Example 3 based on the enzyme treatment steps in the following experiments.

<< 실험예Experimental Example 1>  1> 실시예3Example 3 및  And 실시예4의Example 4 지방층과  Fatty layer MNCMNC 층의 현미경 관찰Microscopic observation of layers

위 실시예3 및 실시예4에서 얻은 단핵구 세포 집합물을 세척한 후 배양접시에 접종하여 1일째에 현미경으로 관찰했다. 효소처리 전 지방층에서 보이던 세포 덩어리가 효소처리 후 MNC층에서 회수되는 것을 확인하였다(도 5). 효소처리 후 지방층의 조직 덩어리의 MNC층으로의 이동을 확인한 것이다. The monocyte cell aggregates obtained in Example 3 and Example 4 were washed and then inoculated in a culture dish and observed under a microscope on the first day. It was confirmed that the cell mass seen in the fat layer before the enzyme treatment was recovered in the MNC layer after the enzyme treatment (FIG. 5). After enzymatic treatment, the migration of the fat mass into the MNC layer was confirmed.

<실험예 2> 실시예3 및 실시예4의 지방층과 MNC층의 단핵구 세포수 측정 < Experimental Example 2> Measurement of Monocyte Cell Counts in the Adipose and MNC Layers of Examples 3 and 4

위 실시예3과 실시예4의 지방층 및 MNC 층 내 단핵구 세포의 세포수를 세포계수기를 이용하여 계수하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 본 발명의 분리방법으로 분리한 단핵구 세포의 회수율이 실시예 4(비교군)에 비해 2-2.5 배 높은 것을 확인할 수 있었다.The cell numbers of monocyte cells in the adipose layer and the MNC layer of Example 3 and Example 4 were counted using a cell counter, and the results are shown in FIG. 6. It was confirmed that the recovery rate of the monocyte cells separated by the separation method of the present invention is 2-2.5 times higher than in Example 4 (comparative group).

<실험예 3> 중배엽유래 줄기세포 존재 확인Experimental Example 3 Confirmation of Mesoderm-Derived Stem Cells

(1) 중배엽유래 줄기세포 배양배지에서 배양(1) Cultivation in mesoderm-derived stem cell culture medium

위 실시예3 및 실시예4의 MNC층과 지방층에서 얻은 단핵구 세포를 각각 배양접시에 접종하여 중배엽유래줄기세포 배양액(α-MEM, 20% 우혈청 첨가배지)에서 9 일간 배양한 후 PBS로 한 번 세척한 후 0.25% 트립신/EDTA를 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 세포를 회수하여, 세포계수기로 세포 수를 측정하였다. 실시예4(비교군)에 비해 실시예3의 세포수가 2.5-3 배 높음을 확인할 수 있었다(도 7).Monocytes obtained from the MNC layer and the adipose layer of Example 3 and Example 4 were inoculated in a culture dish, respectively, and cultured in mesenchymal-derived stem cell culture medium (α-MEM, 20% bovine serum added medium) for 9 days. After washing twice, the cells were treated with 0.25% trypsin / EDTA for 5 minutes at 37 ° C., and the cells were collected, and the number of cells was measured by a counter. It was confirmed that the number of cells of Example 3 was 2.5-3 times higher than that of Example 4 (comparative group) (FIG. 7).

(2) 면역형광염색법에 의한 중배엽유래 줄기세포 확인(2) Identification of mesoderm derived stem cells by immunofluorescence staining

위(1) 에서 배양한 세포를 원형 커버슬라이드에 접종하여 3일간 배양한 다음 3.7% 포르말린용액으로 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 후 표면형질마커 항체를 이용하여 면역형광염색을 실시하였다. 면역형광염색은 PBS로 희석한 20% 정상 염소 혈청으로 30분간 인큐베이션하여 블록킹한 다음 중배엽유래줄기세포 발현 마커인 CD29, α-평활근 액틴, CD105와 혈관내피전구세포 마커인 UEA-1 렉틴과 조혈모세포 마커인 CD45, CD117을 세포에 처리하여 상온에서 2 시간동안 반응시킨 후 형광물질을 표지한 2차 항체를 처리하여 형광현미경으로 발현양상을 관찰하였다. 그 결과 CD29, α-평활근 액틴(α-SMA), CD105는 양성이고 UEA-1 렉틴과 CD45, CD117은 음성으로 나타났다. (도 8)Cells cultured in the stomach (1) were inoculated in a circular cover slide and incubated for 3 days, and then fixed with 3.7% formalin solution. The immobilized cells were washed three times with PBS and subjected to immunofluorescence staining using a surface marker marker antibody. Immunofluorescence staining was blocked by incubation with 20% normal goat serum diluted with PBS for 30 minutes, followed by CD29, α-smooth muscle actin, CD105, markers of mesodermal derived stem cells, and UEA-1 lectin and hematopoietic stem cells, vascular endothelial progenitor cell markers. Markers CD45 and CD117 were treated with the cells and reacted at room temperature for 2 hours, and then treated with a secondary antibody labeled with fluorescent material to observe the expression pattern by fluorescence microscope. As a result, CD29, α-smooth muscle actin (α-SMA), CD105 were positive, and UEA-1 lectin, CD45, CD117 were negative. (Fig. 8)

(3) 다분화능 확인(3) Multi-potency Check

위 실시예3 및 실시예4의 지방층과 MNC층에서 얻은 단핵구세포를 중간엽유래줄기세포 배양배지 (α-MEM, 20% 우혈청 첨가배지)에서 배양하여 중간엽유래줄기세포를 얻어낸 다음, 다음의 분화실험을 실시하여 얻어낸 세포의 분화능을 확인하였다.Monocytes obtained from the adipose layer and the MNC layer of Example 3 and Example 4 above were cultured in a mesenchymal-derived stem cell culture medium (α-MEM, 20% bovine serum) to obtain mesenchymal-derived stem cells. The differentiation experiment of the obtained cell was confirmed.

A) 골분화능 확인A) Confirmation of bone differentiation capacity

골분화 실험을 위해 각각의 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2x104의 세포를 접종한 후 1 주일에 2 번씩 골분화 유도배지 (α-MEM, 20% 우혈청, 10-8M 덱사메타손, 0.2mM 아스코르브산, 10mM β-글리세로포스페이트 첨가 배지)를 제공하여 3 주간 분화시켰다. 분화실험이 종료된 후 3.7% 포르말린 용액으로 고정한 다음, 증류수로 3회 세척한 후 아리자린 레드 에스 용액 (DW 내 2% Alizarin red S, pH4.2)으로 20분간 염색하고 증류수로 수차례 세척하여 염료의 침착 정도를 관찰하여 칼슘 침착을 확인하였다. For bone differentiation experiments, each cell was inoculated with 2 × 10 4 cells per well in a 6-well plate, followed by osteoblast differentiation media twice a week (α-MEM, 20% bovine serum, 10 −8 M dexamethasone, 0.2 mM ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate addition medium) was provided and differentiated for 3 weeks. After the differentiation experiment was completed, it was fixed with 3.7% formalin solution, washed three times with distilled water, dyed with Arizarin red S solution (2% Alizarin red S, pH4.2 in DW) for 20 minutes and washed several times with distilled water. The deposition of the dye was observed to confirm calcium deposition.

B) 지방분화B) fat differentiation

지방분화 실험을 위해 각각의 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 2x105의 세포를 접종한 후 1 주일에 2 번씩 지방분화 유도배지 (고농도 글루코스 DMEM, 10% 우혈청, 10 μg/ml 인슐린, 10-7M 덱사메타손, 0.2mM 인도메타신, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 첨가배지)를 제공하여 4 주간 분화시켰다. 분화실험이 종료된 후 3.7% 포르말린 용액으로 고정한 다음, PBS로 3회 세척한 후 오일 레드 오 용액 (60% 이소프로판올 내 0.13% Oil red O)으로 15분간 염색하고 60% 이소프로판올로 3분간 분화시켰다. 핵염색을 위해 해리스 헤마톡실린 용액에 2 분간 염색한 후 수돗물로 세척하여 빨간색으로 지방구가 염색된 정도를 관찰하여 지방분화된 정도를 확인하였다. Local differentiation of individual cells for the experiment was inoculated in 6 well per well the plate 2x10 5 cells after fat differentiation inducing medium twice a week (high concentrations of glucose DMEM, 10% bovine serum, 10 μg / ml insulin, 10 7 M dexamethasone, 0.2 mM indomethacin, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine supplemented medium) was provided and differentiated for 4 weeks. After completion of the differentiation experiment, the cells were fixed with 3.7% formalin solution, washed three times with PBS, dyed for 15 minutes with an oil red o solution (0.13% Oil red O in 60% isopropanol), and differentiated with 60% isopropanol for 3 minutes. For nuclear staining, Harris Hematoxylin solution was stained for 2 minutes and washed with tap water to determine the degree of fat differentiation by observing the degree of fat globules stained in red.

C) 연골분화C) cartilage differentiation

연골분화 실험을 위해 각각의 세포를 트랜스웰에 웰 당 1x106의 세포를 접종한 후 1 주일에 2 번씩 연골분화 유도배지 (고농도 글루코스 DMEM, 100 μg/ml 피루브산 나트륨, 10ng/ml TGF-β3, 1X ITS3, 0.35 mM 프롤린, 0.3mM 아스코르브산 첨가배지)를 제공하여 4 주간 분화시켰다. 분화실험이 종료된 후 3.7% 포르말린 용액으로 고정한 다음, PBS로 3회 세척한 후 동결미세절편을 제작하여 사프라닌 오 염색 (0.1% saffranin O 용액)을 실시하여 연골의 세포외 기질인 GAG 성분의 합성 정도를 현미경으로 관찰하였다. To induce cartilage differentiation, each cell was inoculated with 1 × 10 6 cells per well in a transwell, followed by induction of cartilage differentiation twice a week (high glucose DMEM, 100 μg / ml sodium pyruvate, 10 ng / ml TGF-β3, 1 × ITS3, 0.35 mM proline, 0.3 mM ascorbic acid medium) were provided and differentiated for 4 weeks. After the differentiation experiment was completed, fixed with 3.7% formalin solution, washed three times with PBS, and then made frozen microfractions and subjected to safranin O staining (0.1% saffranin O solution) to obtain GAG component, an extracellular matrix of cartilage. The degree of synthesis was observed under a microscope.

효소처리 전?후 얻어낸 MNC층의 단핵구세포를 중배엽유래줄기세포 배양액에서 배양한 후 다분화능을 확인한 결과, 효소처리 전?후 얻어낸 MNC층에서 중배엽유래줄기세포를 배양한 다음 시험관 내(in vitro) 골분화, 지방분화, 연골분화를 시행한 결과 다분화능을 확인하였다. 그 결과 차이가 없었음을 확인하였다(도 9).After culturing the monocytes of the MNC layer obtained before and after the enzyme treatment in the mesoderm-derived stem cell culture medium, the multipotency was confirmed. Bone differentiation, adipose differentiation and cartilage differentiation were performed to confirm the multipotent ability. As a result, it was confirmed that there was no difference (Fig. 9).

<실험예 4> 혈관내피전구세포 존재 확인Experimental Example 4 Confirmation of Endothelial Progenitor Cells

(1) 혈관내피전구세포 배양 배지에서 배양(1) Culture in vascular endothelial progenitor cell culture medium

위 실시예1과 실시예4의 지방층 및 MNC 층 내 단핵구 세포를 각각 인간 피브로넥틴(human fibronectin)으로 코팅한 배양접시에 접종하여 혈관내피전구세포 배양액 (EGM2, Lonza에서 구매)에서 9 일간 배양한 후 PBS로 한 번 세척한 후 0.25% 트립신/EDTA를 처리하여 37℃에서 5분간 반응시켜 세포를 회수하여 세포계수기를 이용하여 수 측정, 비교한 결과, 비교군(실시예 4)에 비해 효소처리군이 세포수가 2.5-3 배 높음을 확인하여 더 많은 혈관내피세포를 얻었음을 확인하였다(도 10).Monocytes in the adipose layer and MNC layer of Example 1 and Example 4 were inoculated in a culture plate coated with human fibronectin, respectively, and cultured in vascular endothelial progenitor cell culture (EGM2, purchased from Lonza) for 9 days. Washed once with PBS, treated with 0.25% trypsin / EDTA, and reacted at 37 ° C. for 5 minutes to recover cells, and then using a cell counter to measure and compare the results. The enzyme treatment group compared to the comparison group (Example 4). Confirming that the cell number was 2.5-3 times higher, it was confirmed that more vascular endothelial cells were obtained (FIG. 10).

(2) 튜브 형성능 평가 (2) evaluation of tube forming ability

위에서 배양한 세포의 혈구내피전구세포 (EPC)의 가장 중요한 특성인 튜브 형성능을 평가하기 위해 매트리젤(Matrigel, BD science)을 이용하여 튜브 형성 실험을 실시하였다. 24웰에 매트리젤 200ul를 깔고 37℃에서 1시간동안 굳힌 다음, 5x104 세포를 EGM2 배지 500ul로 매트리젤에 접종하였다. 37℃에서 20시간동안 배양하여 세포가 부착하여 튜브를 형성하는지 현미경 상에서 관찰하였다. 그 결과, 효소처리 전후 얻은 단핵구 세포에서 키운 세포가 혈관내피세포임을 확인하였으며, 효소 처리 후 얻은 세포는 튜브 형성에 있어 튜브의 굵기가 더 굵으며 길이도 더 긴 것을 확인하였다(도 11-가). 효소처리 전 지방층에서 얻은 EPC의 결과, 나) 효소처리 전 MNC층에서 얻은 EPC의 결과, 다) 효소처리 후 MNC층에서 얻은 EPC의 결과, 라) 비교군인 중배엽유래줄기세포의 튜브 형성능 실험 결과). 이로써 효소처리에 의해 증가된 혈관내피전구세포와 기질세포의 회수율로 인해 혈관형성을 촉진할 수 있을 것으로 기대된다.In order to evaluate tube formation ability, which is the most important characteristic of hematopoietic endothelial progenitor cells (EPC) of the cultured cells, tube formation experiments were performed using Matrigel (BD science). 200ul of Matrigel was placed in 24 wells and solidified at 37 ° C for 1 hour, and then 5x10 4 cells were inoculated on Matrigel with 500ul of EGM2 medium. The cells were incubated at 37 ° C. for 20 hours to observe whether the cells adhered and formed tubes. As a result, it was confirmed that the cells grown in monocytes obtained before and after the enzyme treatment were vascular endothelial cells, and the cells obtained after the enzyme treatment were found to have a thicker tube and a longer length in tube formation (FIG. 11-A). . Results of EPC obtained from fat layer before enzyme treatment, b) Results of EPC obtained from MNC layer before enzyme treatment, c) Results of EPC obtained from MNC layer after enzyme treatment, d) Results of tube formation ability of mesenchymal derived stem cells . This is expected to be able to promote angiogenesis due to the increased recovery of vascular endothelial progenitor cells and stromal cells by enzyme treatment.

<실험예 5> 조혈모세포-콜로니 생성 확인Experimental Example 5 Confirmation of Hematopoietic Stem Cell- Colony Production

조혈모세포 및 조혈전구세포는 세포의 분화 정도에 따라 만들어낼 수 있는 혈구세포의 종류가 다르므로, 효소처리 후 얻은 단핵구 세포를 HSC-CFU EPO 배지 (Millteny Biotech) 1.1ml에 1x105 세포를 접종하여 37℃에서 14일간 배양하여 콜로니를 형성시킨 다음, 현미경 상에서 콜로니의 형태를 관찰하여 BFU-E, CFU-E, CFU-M, CFU-G, CFU-GM, CFU-GEMM을 구분하여 계수하였다. 도12의 가)의 예처럼 CFU-E는 BFU-E와 함께 적혈구를 형성하는 콜로니를 말하며 빨간 색소를 가지고 있으며 작은 크기의 세포군이 덩어리를 이루고 있는 형태로 알 수 있다. CFU-M은 단핵백혈구를 만들어낼 수 있는 전구세포로부터 형성된 세포이며 세포의 크기가 크며 평평한 콜로니 형태를 가진다. CFU-G는 과립구로 구성된 콜로니로써 작은 크기의 세포군이 계란후라이 모양의 콜로니를 형성한다. CFU-GEMM은 가장 많은 종류의 세포로 구성되어있는 콜로니로써 빨간 색소를 가지고 있는 적혈구 세포와 단핵백혈구, 과립구로 구성되어있는 콜로니를 말한다. 같은 양의 골수 천자액로부터 효소처리 전?후 밀도-구배 원심분리하여 얻어낸 단핵구세포 1x105을 HSC-CFU EPO 배지에 접종하여 형성된 콜로니를 계수한 다음, 전체 단핵구 세포수로 계산한 결과, 같은 양의 골수 천자액로부터 효소처리를 통해 더 많은 조혈모세포와 조혈세포를 얻어낼 수 있었다(도12-나)).Since hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells differ in the type of hematopoietic cells that can be produced according to the differentiation of cells, monocytes obtained after enzymatic treatment were inoculated with 1x10 5 cells in 1.1 ml of HSC-CFU EPO medium (Millteny Biotech). After culturing at 37 ° C. for 14 days to form colonies, the colony morphology was observed under a microscope to count BFU-E, CFU-E, CFU-M, CFU-G, CFU-GM, and CFU-GEMM. As in the example of Fig. 12A, CFU-E refers to a colony that forms red blood cells together with BFU-E, and has a red pigment and can be seen in a form in which a small group of cells form a lump. CFU-M is a cell formed from progenitor cells capable of producing mononuclear leukocytes and is large in size and has a flat colony form. CFU-G is a colony composed of granulocytes, and small cell populations form egg-fry colonies. CFU-GEMM is a colony composed of the largest number of cells, and refers to a colony composed of red blood cells with red pigment, monocytes and granulocytes. The number of colonies formed by inoculating HSC-CFU EPO medium with 1 × 10 5 mononuclear cells obtained by density-gradient centrifugation before and after enzyme treatment from the same amount of bone marrow aspirate was counted and counted as the total number of monocyte cells. More hematopoietic stem cells and hematopoietic cells could be obtained through enzyme treatment from bone marrow puncture solution (Fig. 12-b)).

<실시예 5><Example 5>

인간에서 얻어낸 골수 천자액 5ml를 PBS를 이용하여 2배 희석한 다음, 밀도-구배 원심분리를 통해 (2200rpm, 20분간 원심분리) 지방층, 단핵구세포층, 적혈구층으로 분리하였다. 밀도-구배 원심분리는 위 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 5 ml of bone marrow puncture fluid obtained from humans was diluted twice with PBS, and then separated into adipose layer, monocyte layer, and erythrocyte layer by density-gradient centrifugation (2200 rpm, centrifugation for 20 minutes). Density-gradient centrifugation was performed in the same manner as in Example 1 above.

단핵구세포층과 지방층을 따로 분리 회수한 다음 세포를 5ml PBS에 희석한 다음 최종 농도 1000 U/ml 콜라게네이즈가 되도록 2000 U/ml 콜라게네이즈를 5ml 첨가하고 37oC 배양기에서 30분간 각각 배양하였다. 최종농도 0.25% 트립신이 되도록 2.5% 트립신을 첨가하고 10분 더 배양한 다음 PBS로 세척하여 분석하였다. The mononuclear cell layer and fat layer were separated and recovered, and the cells were diluted in 5 ml PBS, and then, 5 ml of 2000 U / ml collagenase was added to a final concentration of 1000 U / ml collagenase, and incubated for 30 minutes in a 37 ° C. incubator. . 2.5% trypsin was added to a final concentration of 0.25% trypsin, incubated for another 10 minutes, and washed with PBS for analysis.

<실험예 6> 지방층 및 단핵구층 유래 줄기세포의 콜로니 형성능 비교Experimental Example 6 Comparison of Colony Formability of Adipose and Monocyte-Derived Stem Cells

위 실시예 5에서 얻은 골수 천자액의 지방층과 단핵구층에서 얻은 세포의 콜로니 형성능을 비교하기 위해 세포계수기를 이용하여 계수한 다음, 각각 25cm2 T flask 배양접시에 1*107 세포씩 접종하여 중배엽유래줄기세포 배양액 (α-MEM, 20% 우혈청 첨가배지)과 혈관내피전구세포 배양액 (EGM2, Lonza에서 구매)에서 7 일간 배양한 후 PBS로 한 번 세척한 후 100% 메탄올로 고정한 다음, methyl violet으로 염색하여 콜로니를 계수하였다. 지방층과 단핵구층에서 얻어낸 세포수에 반영하여 골수 천자액 10ml당 콜로니갯수로 산정하였다. 지방층에서 얻은 세포수가 4 배 이상 높음을 확인할 수 있었다 (도 13).In order to compare the colony forming ability of the cells obtained in the adipose layer and monocyte layer of the bone marrow puncture solution obtained in Example 5, the cells were counted using a cell counter, and then inoculated by 1 * 10 7 cells in a 25 cm 2 T flask culture dish. After culturing for 7 days in stem cell culture (α-MEM, 20% bovine serum) and vascular endothelial progenitor cell culture (EGM2, purchased from Lonza), washed once with PBS and fixed with 100% methanol Colonies were counted by staining with violet. The number of colonies per 10 ml of bone marrow puncture was calculated by reflecting the number of cells obtained from adipose layer and monocyte layer. It was confirmed that the number of cells obtained in the fat layer was four times higher (FIG. 13).

<실험예 7> 지방층 및 단핵구층 유래 줄기세포의 side population을 나타내는 세포 분석Experimental Example 7 Analysis of Cells Showing Side Populations of Adipose and Monocyte-Derived Stem Cells

골수 내 지방조직과 단핵구층에서 얻은 세포 내에 side population의 양을 확인하기 위해 위 실시예 5에서 얻은 골수 천자액으로부터 분리한 지방층과 단핵구층으로부터 세포를 분리하여 분석하였다. In order to confirm the amount of side population in the cells obtained from the adipose tissue and monocyte layer in the bone marrow, cells were separated and analyzed from the adipose layer and the monocyte layer isolated from the bone marrow puncture solution obtained in Example 5 above.

DMEM:F12=3:1 배지에 2% FBS, 10mM HEPES 버퍼를 첨가한 배지로 1*106/ml로 세포를 희석하여 Hoechst33342 염료를 4ug/ml 처리하고 37oC 수조에서 80분간 배양한 다음, PI로 5분간 염색한 후 UV파장대에서 유세포분석기를 통해 분석하였다. side population 분석시, side population과 major population의 세포를 유세포분석기를 이용하여 분리한 다음 HSC-CFU EPO 배지 (Millteny Biotech) 1.1ml에 각각 세포를 접종하여 37oC에서 14일간 배양하여 콜로니를 형성시킨 다음, 현미경 상에서 콜로니의 형태를 관찰하여 BFU-E, CFU-E, CFU-M, CFU-G, CFU-GM, CFU-GEMM을 구분하여 계수하였다.Dilute the cells to 1 * 10 6 / ml with 2% FBS, 10mM HEPES buffer in DMEM: F12 = 3: 1 medium, 4ug / ml of Hoechst33342 dye, and incubate in 37 o C water for 80 minutes. After staining with PI for 5 minutes, it was analyzed by flow cytometry at UV wavelength band. In the side population analysis, the cells of the side population and the major population were separated by flow cytometry, and then inoculated with 1.1 ml of HSC-CFU EPO medium (Millteny Biotech), and then cultured at 37 ° C. for 14 days to form colonies. Next, the morphology of colonies was observed on a microscope, and BFU-E, CFU-E, CFU-M, CFU-G, CFU-GM, and CFU-GEMM were separately counted.

그 결과 지방조직에 포함된 side population의 수는 공여자에 따라 단핵구층에 비해 2-10배 더 많이 함유하고 있으며(도 14), major population 세포보다 side population의 세포가 HSC-CFU가 높고 단핵구층보다 지방층에서 얻은 세포가 HSC-CFU가 높았다(도 15).As a result, the number of side populations contained in the adipose tissue contained 2-10 times more than the monocyte layer depending on the donor (Fig. 14), and the cells of the side population had higher HSC-CFU than the major population cells, Cells obtained from the fat layer had high HSC-CFU (FIG. 15).

Claims (13)

골수 천자액의 지방 조직으로부터 단핵구 세포 집합물을 분리하는 방법.A method for separating monocyte cell aggregates from adipose tissue of bone marrow aspirate. 제1항에 있어서,
(a) 골수 천자액에 콜라겐 분해효소를 처리하여 골수 천자액에 함유된 지방조직에 포함된 줄기세포를 유리시키는 단계, 및
(b) 상기 (a) 단계 후 단핵구 세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법. The method of claim 1,
(a) treating collagen degrading enzyme with bone marrow puncture to release stem cells contained in adipose tissue contained in bone marrow puncture;
(b) separating monocytes after step (a). 제2항에 있어서,
콜라겐 분해효소는 I형 콜라겐분해효소, II형 콜라겐분해효소, III형 콜라겐분해효소, IV형 콜라겐분해효소, 콜라겐분해효소 D 또는 아큐타제(acutase) 인 방법.The method of claim 2,
Collagen degrading enzymes are type I collagenase, type II collagenase, type III collagenase, type IV collagenase, collagenase D or accutase. 제2항에 있어서,
상기 (b) 단계는 밀도-구배 원심분리법에 의하여 수행되는 방법.The method of claim 2,
The step (b) is performed by density-gradient centrifugation. 제2항에 있어서,
상기 (a) 단계와 (b) 단계 사이에 트립신을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.The method of claim 2,
Further comprising the step of treating trypsin between steps (a) and (b). 제1항에 있어서,
(a) 골수 천자액을 원심분리하여 지방층을 얻는 단계, 및
(b) 상기 분리된 지방층으로부터 단핵구 세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법. The method of claim 1,
(a) centrifuging the bone marrow puncture to obtain a fat layer, and
(b) separating monocytes from the isolated fat layer. 제6항에 있어서,
상기 (a) 단계는 밀도-구배 원심분리법에 의하여 수행되는 방법.The method of claim 6,
The step (a) is performed by density-gradient centrifugation. 제6항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 분리된 지방층에 I형 콜라겐분해효소, II형 콜라겐분해효소, III형 콜라겐분해효소, IV형 콜라겐분해효소, 콜라겐분해효소 D 또는 아큐타제(acutase)로부터 선택되는 콜라겐 분해효소를 처리하는 것을 포함하는 방법.The method of claim 6,
Collagen degrading enzyme selected from type I collagenase, type II collagenase, type III collagenase, type IV collagenase, collagenase D, or accutase in the fat layer separated in step (b) Method comprising processing. 제8항에 있어서,
상기 콜라겐 분해효소 처리 후 트립신을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.The method of claim 8,
And further treating the trypsin after the collagenase treatment. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나에 기재된 방법으로 분리된 단핵구 세포 집합물.A monocyte cell aggregate isolated by the method of any one of claims 1 to 9. 제10항에 기재된 단핵구 세포 집합물을 포함하는 세포 치료제.A cell therapeutic agent comprising the monocyte cell aggregate of claim 10. 제11항에 있어서,
퇴행성 관절염, 척수손상, 뇌출혈, 급성 뇌경색, 급성 심근경색, 만성 척수손상, 척수 손상, 당뇨성 급성 또는 아토피성 피부염, 만성 궤양, 제 1형 당뇨병, 크론병, 연골 손상, 뼈 손상, 근육 손상, 신경 손상, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 만성궤양, 급성 궤양, 또는 허혈성 뇌질환 중에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제.The method of claim 11,
Degenerative arthritis, spinal cord injury, cerebral hemorrhage, acute cerebral infarction, acute myocardial infarction, chronic spinal cord injury, spinal cord injury, diabetic acute or atopic dermatitis, chronic ulcers, type 1 diabetes, Crohn's disease, cartilage damage, bone damage, muscle damage, Cell therapy for the prevention or treatment of a disease selected from nerve damage, diabetic foot ulcer, diabetic chronic ulcer, acute ulcer, or ischemic brain disease. 제10항에 기재된 단핵구 세포 집합물을 포함하는,
퇴행성 관절염, 척수손상, 뇌출혈, 급성 뇌경색, 급성 심근경색, 만성 척수손상, 척수 손상, 당뇨성 급성 또는 아토피성 피부염, 만성 궤양, 제 1형 당뇨병, 크론병, 연골 손상, 뼈 손상, 근육 손상, 신경 손상, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 만성궤양, 급성 궤양, 또는 허혈성 뇌질환 중에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.Including the monocyte cell aggregate of claim 10,
Degenerative arthritis, spinal cord injury, cerebral hemorrhage, acute cerebral infarction, acute myocardial infarction, chronic spinal cord injury, spinal cord injury, diabetic acute or atopic dermatitis, chronic ulcers, type 1 diabetes, Crohn's disease, cartilage damage, bone damage, muscle damage, A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a disease selected from among nerve damage, diabetic foot ulcer, diabetic chronic ulcer, acute ulcer, or ischemic brain disease.
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