KR20120084466A - 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법 - Google Patents

동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120084466A
KR20120084466A KR1020110005843A KR20110005843A KR20120084466A KR 20120084466 A KR20120084466 A KR 20120084466A KR 1020110005843 A KR1020110005843 A KR 1020110005843A KR 20110005843 A KR20110005843 A KR 20110005843A KR 20120084466 A KR20120084466 A KR 20120084466A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
imaging
nanoparticles
atherosclerotic plaque
crgd
Prior art date
Application number
KR1020110005843A
Other languages
English (en)
Inventor
최규실
서영주
임현철
김영선
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단 filed Critical 성균관대학교산학협력단
Priority to KR1020110005843A priority Critical patent/KR20120084466A/ko
Publication of KR20120084466A publication Critical patent/KR20120084466A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1806—Suspensions, emulsions, colloids, dispersions
    • A61K49/1809—Micelles, e.g. phospholipidic or polymeric micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions

Abstract

본 발명은 영상소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조영제는 동맥경화반을 조기에 진단할 수 있는 능동적 조영제이며, 인지질 나노입자의 크기를 조절함으로써 혈관 내에 잔류시간을 연장시켜 동맥경화반 특이적 MR 영상을 효과적으로 실현할 수 있다. 또한 기존의 수동적 조영제보다 적은 양을 이용하여 MR 영상을 얻을 수 있으며, 동맥경화를 수반하는 질병을 쉽게 진단할 수 있다.

Description

동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법 {Atherosclerotic plaque-specific molecular imaging media for magnetic resonance imaging and method for preparing thereof}
본 발명은 영상소재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
MRI 조영제는 조영 증강효과가 나타나는 조직의 신호에 따라 양성 (positive)/음성 (negative) 또는 T1/T2 조영제로 분류되며 ‘positive’ 조영제로 상자성 (paramagnetic) 화합물과 ‘negative’ 조영제로 초상자성 (superparamagnetic) 나노입자가 사용되고 있다. ‘positive’ 조영제인 상자성 화합물은 보통 가돌리늄 이온 (Gd3+) 이나 망간 이온 (Mn2+)의 킬레이트 화합물이며, 물의 양자의 이완을 가속하여 조영제 주위에서 밝은 대조 영상을 얻게 한다.
초상자기성 산화철 나노입자와 상자기성 킬레이트 화합물 및 거대분자와 결합한 화합물들 중 전자를 T2 조영제라 하고 후자를 T1 조영제라 하며, T1 조영제로 상용화 되어있는 것이 가돌리니움 킬레이트이다.
그런데, 가돌리늄 이온의 경우 독성이 아주 높아 이를 방지하기 위해 킬레이트 화합물이나 고분자 물질과 결합된 화합물의 형태로 사용되고 있다. 이중 Gd-DTPA는 가장 널리 쓰이고 있으며, 이의 주요 의학적 활용처는 혈액-뇌 격막 (BBB)의 손상여부나 혈관시스템의 변화, 혈액의 유동이나 관류 상태의 진단이다.
그러나, Gd-DTPA (gadolinium-diethylenetriaminepenta acetic acid) 화합물은 생체 내에서 안정적이며 독성을 가지지 않으나, 작은 분자량으로 인해 쉽게 혈관조직으로부터 소실되어 그 활용범위에 한계가 있다.
이를 극복하기 위해 다양한 종류의 탄수화물을 이용하여 그 크기를 증가시킨 조영제가 시도되고 있으나, 이 또한 명백한 병변조직 특이적 영상을 제공하지 못한다.
현재 상용화되어 있는 조영제는 혈관내외 또는 위장관의 공간에 머물러 있음으로 인하여 조직과 공간 간의 조영 효과를 제공함으로써, 진단에 도움을 주는 수동적 조영이라 할 수 있다.
분자영상의 핵심기술은 일정시간 동안 표적조직에 충분한 농도의 영상소재를 전달할 수 있는 전략과 분자영상소재의 생체적합성이다. 이를 위하여 질병 특이적 표적자를 고안하여 이를 조영제와 적절히 결합시키고 혈관에 주사되었을 때 혈류를 통해 일차적으로 표적조직에 전달될 수 있으며 타겟에 결합할 수 있는 충분한 시간 동안 혈류 내에 존재하도록 적절한 크기를 조절하여 신장으로 빨리 배출되거나 간과 지라의 세망내피계에 의한 과도한 포획을 피할 수 있도록 디자인되어야 한다.
또한, 기존의 단일 타겟팅 분자영상의 영상소재는 분자영상의 가장 본질적인 한계로 판단이 되고 있다. 따라서 영상소재의 표적지향적 타겟팅 능력을 개선하기 위해서 다중특이적 타겟팅 전략이 필요하다.
본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해서 질병 특이적 다중 표적자를 고안하여 조영제와 결합을 시켰고, 입자의 크기를 조절하여 체내 머무르는 시간을 연장시킬 수 있는 엠알 영상소재 및 이의 제조방법을 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 동맥경화반 특이적 엠알 영상소재 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 두 개 이상의 동맥경화반 특이적 표적자를 조영제와 결합하고 입자의 크기를 조절한 동맥경화반 특이적 엠알 영상소재 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 동맥경화반 특이적 엠알 영상소재를 제공한다. 보다 구체적으로,
인지질 나노입자 (phospholipid nanoparticles, PLN)에 동맥경화반 특이적 표적자 및 엠알 조영제가 결합된 것을 포함하는 영상소재를 제공한다.
상기 나노입자의 평균 크기가 Φ=5-100nm 인 것을 포함할 수 있다.
상기 조영제는 가돌리늄 착화합물 또는 산화철나노입자인 것을 포함할 수 있다.
상기 조영제는 T1 또는 T2 인 것을 포함할 수 있다.
상기 동맥경화반 특이적 표적자는 pIL-4 펩티드 (LQRLFRAFRCLK) 및 cRGD(RGDfK)을 포함할 수 있다.
상기 영상소재는 신생혈관 및 염증조직에 특이적으로 결합하는 것을 포함할 수 있다.
상기 영상소재는 염증 및 반 (plaque)을 수반하는 혈관내피세포의 MR 영상, 국소병변의 감별진단, 염증 및 반 (plaque)성 병변의 범위 결정 및 심각성 판단, 동맥경화성 병변의 초기진단을 수반하는 병변 조직의 초기 진단에 사용되는 것을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 동맥경화반 특이적 엠알 영상소재의 제조방법을 제공한다. 보다 구체적으로,
(a) 비오틴 (biotin) 및 DTPA (Diethylene triamine pentaacetic acid)를 결합시킨 인지질 나노입자를 형성하는 단계;
(b) 상기 (a)에 가돌리늄 용액과 아비딘을 첨가하는 단계;
(c) 상기 (b)에 동맥경화반 특이적 표적자를 첨가한 후 교반 및 여과하는 단계; 를 포함하는 영상소재의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 인지질 나노입자의 내부는 지방산과 폴리소르베이트80 (polysorbate 80) 의 소수성 친화력으로 결합된 것이 바람직하다.
상기 지방산은 올레산 (oleic acid), 미리스토일산 (myristoyl acid), 팔미트산 (palmitic acid) 또는 스테아르산 (stearic acid)인 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계의 나노입자의 평균 크기가 Φ=5-100 nm인 것을 포함할 수 있다.
상기 (c) 단계의 동맥경화반 특이적 표적자는pIL-4 펩티드(LQRLFRAFRCLK) 및cRGD(RGDfK)인 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 영상소재는 동맥경화반을 조기에 진단할 수 있는 능동적 조영제이며, 인지질 나노입자의 크기를 조절함으로써 혈관 내에 잔류시간을 연장시켜 동맥경화반 특이적 MR 영상을 효과적으로 실현할 수 있다. 또한 기존의 조영제인 Gd-DTPA의 Gd에 대한 사용양보다 적은 양을 이용하여 MR 영상을 얻을 수 있으며, 동맥경화를 수반하는 질병을 쉽게 진단할 수 있다.
또한, 신생혈관의 혈관내피세포와 염증조직에 특이적으로 결합함으로써, 염증 및 plaque를 수반하는 혈관내피세포의 MR 영상, 국소 병변의 감별진단, 염증 및 plaque성 병변의 범위결정 및 심각성판단, 동맥경화성 병변의 초기진단 등의 병변조직을 특이적으로 조영하여 진단에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 동맥경화반 특이적 ＭＲ 분자영상소재 (Gd-PLN-cRGD-pIL-4) 제조방법을 통해 합성된 조영제 모식도이다.
도 2는 본 발명의 제조방법 의해 합성된 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 수용액상 크기를 DLS (Dynamic light scattering)로 측정한 결과이다.
도 3은 Gd-PLN-cRGD-pIL-4가 분열이 왕성한 혈관내피 세포주로써 αvβ3 integrin과 IL_4 수용체의 발현이 높은 MS-1 cell에 특이적으로 결합하는지를 배양된 세포에서 확인한 T1 영상결과이다.
도 4는 도 3의 실험에서 MS-1 cell에 결합된 Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 ICP-AES를 사용하여 Gd의 함량을 확인한 결과이다.
도 5는 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 혈류 내 잔존시간을 ICP-AES를 사용하여 측정한 결과이다.
도 6은 Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 정맥주사하고 시간에 따른 신장, 간, 근육의 T1 intensity를 측정하여 체외배출경로를 예측할 수 있는 결과를 제공한다.
도 7은 ApoE (-/-) 생쥐 동맥경화 모델에서 Gd-PLN의 T1강조영상이다.
도 8은 ApoE (-/-) 생쥐 동맥경화 모델에서 Gd-PLN-pIL-4의 T1강조영상이다.
도 9는 ApoE (-/-) 생쥐 동맥경화 모델에서 Gd-PLN-cRGD의 T1강조영상이다.
도 10은 ApoE (-/-) 생쥐 동맥경화 모델에서 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 동맥경화반 특이적 T1 강조영상이다.
본 발명은 분자영상의 가장 본질적인 한계로 판단되는 영상소재의 표적 지향적 타겟팅 능력을 개선하기 위해 기존의 단일 타겟팅을 벗어나 다중특이적 타겟팅 전략을 적용하여 두 개 이상의 동맥경화반 특이적 표적자를 인지질 나노입자에 결합시킨 동맥경화반 특이적 엠알 조영제를 제공한다.
본 발명의 분자영상은 기존의 해부학적 영상과 달리 질병특이적 마커에 선택적으로 결합하는 표적자를 영상소재에 결합시킴으로써 질병 특이적 영상을 구현하고자 하는 능동적 조영 기술인 것이다.
또한 본 발명의 조영제는 생체 내에서 체내 잔류시간을 연장시킬 수 있도록 적절한 입자로 제작하여 혈류 내 잔존시간을 유지시켜 targeting chance를 높여 동맥경화반 특이적 MR 영상을 효과적으로 실현할 수 있다.
상기 조영제란 위, 장관, 혈관, 뇌척수강, 관절강 등에 투입하여 자기공명영상 (MRI) 촬영이나 컴퓨터단층 (CT) 촬영과 같은 방사선 검사 때에 조직이나 혈관을 잘 볼 수 있도록 각 조직의 X선 흡수차를 인위적으로 크게 함으로써 영상의 대조도를 크게 해주는 약품이다. 따라서 조영제를 사용함으로써 생체 구조나 병변을 주위와 잘 구별할 수 있게 해 주어 진단적 가치를 향상시켜줄 수 있는 것이다.
상기 자기공명영상 (MRI)이란 인체를 구성하는 물질의 자기적 성질을 측정하여 컴퓨터를 통하여 재구성, 영상화하는 기술을 말한다.
또한, 조영제는 T1 또는 T2 조영제로 분류된다. 초상자기성 산화철 나노입자는 상자기성 킬레이트 화합물 및 거대분자와 결합한 화합물들 중 전자를 T2 조영제라 하고, 후자를 T1 조영제라 하며, T1 조영제로 상용화 되어 있는 것이 가돌리니움 킬레이트이다.
본원 발명에서는 T1 조영제 또는 T2 조영제가 모두 포함될 수 있다.
본 발명은 보다 구체적으로 인지질 나노입자 (phospholipid nanoparticles, PLN)에 동맥경화반 특이적 표적자 및 엠알 조영제가 결합된 것을 포함하는 영상소재를 제공한다.
상기 인지질은 생체적합성이 높으며 나노입자의 주성분으로서 소수성 부분이 모여 구형을 형성하고 있다.
또한, 상기 나노입자의 내부는 올레산 (oleic acid), 미리스토일산 (myristoyl acid), 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid) 등의 지방산과 폴리소르베이트 80 (polysorbate 80)의 소수성 친화력로 결합된 것임을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 조영제가 생체시스템에 적용될 때 매우 잘 디자인 된 형태라 하더라도 대부분 신장으로 배출되거나 세망내피계에 포획되어 실제 매우 미량 (<5%)이 종양 특이적 분자에 결합하여 분자영상에 관여하므로 이를 개선하기 위하여 다음과 같은 논리적 가설로 본 발명을 기획하였다.
Figure pat00001

따라서, 위 가설에서는 단일 표적형 영상소재와 같은 농도의 다표적형 영상소재 (같은 Kd를 가정 할 때)를 사용하더라도 표적분자의 수 (N)만큼 높은 targeting efficiency (x N)를 기대할 수 있다. 즉, 표적의 수가 2가지라면 2회 주사하는 것이 아니라 1회 다표적형 영상소재를 주사하여 2배 높은 분자영상 효과를 획득 할 수 있다는 것이다.
즉, 나노입자의 표면에 동맥경화반 특이적 표적자가 다중으로 결합될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 동맥경화반 특이적 표적자로서 pIL-4 펩티드(LQRLFRAFRCLK), cRGD 를 사용하였다.
상기 pIL-4 펩티드 (LQRLFRAFRCLK)는 취약성 동맥경화반 특이적 마커인 IL-4receptor에 강한 결합력을 가지고 있으며, 상기 cRGD는 동맥경화반 혈관내피세포의 integrin (αvβ3)에 결합할 수 있다.
조영제가 T1인 경우에 있어서 조영제는 이에 제한되는 것은 아니나, 가돌리늄 (Gd) 착화합물을 포함할 수 있다.
또한, 가돌리늄 (Gd) 착화합물로서는 이에 제한되는 것은 아니나, Gd-DTPA (gadolinium- diethylenetriaminepenta acetic acid) 화합물을 포함할 수 있으며, 이는 Gd가 DTPA에 배위결합 된 킬레이트 화합물이다.
또한, 조영제가 T2인 경우에 있어서 조영제는 이에 제한되는 것은 아니나, 산화철나노입자를 포함할 수 있다.
상기 조영제는 신생혈관의 혈관내피세포와 염증조직에 특이적으로 결합함으로써, 염증 및 plaque를 수반하는 혈관내피세포의 MR 영상, 국소병변의 감별진단, 염증 및 plaque성 병변의 범위결정 및 심각성판단, 동맥경화성 병변의 초기진단 등의 병변조직을 특이적으로 조영하여 진단에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 동맥경화반 특이적 엠알 영상소재의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 생체 구성물질인 인지질을 주축으로 하는 생체적합성 나노입자를 제조하여 본 분자영상소재의 플랫폼으로 사용하기 위해,
(a) 비오틴 (biotin) 및 DTPA (Diethylene triamine pentaacetic acid)를 결합시킨 인지질 나노입자를 형성하는 단계;
(b) 상기 (a)에 가돌리늄 용액과 아비딘을 첨가하는 단계;
(c) 상기 (b)에 동맥경화반 특이적 표적자를 첨가한 후 교반 및 여과하는 단계; 를 포함하는 영상소재의 제조방법을 제공한다.
보다 구체적으로,
상기 (a) 단계의 인지질 나노입자의 내부는 oleic acid, myristoyl acid, palmitic acid, stearic acid 등의 지방산과 polysorbate 80 의 소수성 친화력으로 결합된 것을 포함할 수 있으며, PEG 350으로 균일하게 표면 수식된 것을 더 포함할 수 있다.
혈류 내 잔존시간을 유지시켜 타겟팅 확률을 높여 동맥경화반 특이적 엠알 영상을 효과적으로 실현 시킬 수 있는 바, 상기 나노입자의 평균크기는 Φ=5-100 nm인 것이 바람직하다.
상기 각 지방산에 대한 용매로는 Chloroform과 Methanol 등을 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 혼합액을 실온에서 대략 3시간 동안 교반 하여 반응시킬 수 있으며, (c) 단계에서는 cut-off=100K Dalton filter 를 사용하여 실온에서 2회 혹은 3회 filtering시켜 수득할 수 있다.
상기에서 각 지방산과 인지질은 소수결합으로 되어 있으며, DTPA 및 cRGD, pIL-4는 공유결합으로 결합되어 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 일 예에 지나지 않으며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1 조영제 제조>
chloroform에 녹아있는 DPSC (25.3mM), DOPE-PEG 350 (22.2mM), DMPE-DTPA (22.8mM), DSPE-PEG 350 (17.7mM), DSPE-PEG (2K)-biotin (8.3mM)을 3:8:36:14:39의 비율로 혼합한 후 methanol을 lipid mix와 1:1 비율로 첨가하여 교반 하였다.
Nitrogen flux를 이용하여 지질박막을 형성하고, PBS를 첨가하여 lipid를 녹인 후 70℃이상에서 10분 정도 rehydration시켰다. 다음으로 초음파기기 (90% cycle dute, 70W)를 이용하여 60℃, 15min 조건에서 sonication 하고, Tween 80을 total volume의 14%를 넣었다.
초음파기기 (90% cycle dute, 70W)를 이용하여 60℃, 15min 조건에서 sonication 하고, 혼합액을 cut-off φ=30nm인 membrane과 Min-extruder를 사용하여 11회 왕복펌프 하였다. 그 후, Gd을 100 mM 첨가 및 Avidin을 DSPE-PEG (2K)-biotin의 10배에 해당하는 농도로 첨가하고 혼합액을 실온에서 3시간 교반 하였다.
다음으로 cut-off=100K Dalton filter를 사용하여 2회 filtering하고, 혼합액에 cRGD와 pIL-4을 5 mM 농도로 첨가하여 실온에서 교반 하였다. 용액을 PBS로 완충한 다음 cut-off=100K Dalton filter를 사용하여 2회 filtering하고, 생성물을 ICP-MS (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)분석을 통해 Gd양을 확인하였다.
< 실시예 2>
① 마우스 혈관내피세포주 MS-1을 5% FBS가 함유된 DMEM에서 sub confluent 배양시켰다. ② 세포를 5x106개 배양시킨 다음 Gd-PLN 또는 Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 10 mM [Gd]로 2시간 동안 37℃에서 처리하였다. ③ PBS를 사용하여 2회 세척한 후 세포를 수거하였다. ④ 수득액을 3000rpm에서 3분간 원심분리 후, 상층액을 제거하였다. ⑤ 수득액의 1/10을 취하여 ICP-AES로 Gd의 content를 분석하는데 사용하였다. ⑥ 최종 수득액은 1% agarose gel에 embedding 하여 MR 영상을 획득하여 specificity를 평가하였다. 이때 MR (SIEMENS, 1.5T) 영상은 slice thickness 2.0mm, TR/TE=500/15ms T1 강조영상으로 agarose를 채운 tube의 영상을 획득 하였다.
< 실시예 3>
①C57BL/6 background를 가지는 ApoE (-/-) knock-out 마우스를 11 주 동안 고지혈 사료를 먹여 동맥경화반 마우스 모델을 제작하였다. ② 마우스에 Gd-PLN, Gd-PLN-cRGD, Gd-PLN-pIL-4, Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 각각 10 μmoles Gd/kg농도로 정맥투여 하였다. ③ 24시간 후 실험동물용 microMR (Bruker Biospec, 7T)을 사용하여 slice thickness 1.0mm, TR/TE=400/8.6ms의 black blood sequence로 영상을 획득하였다.
< 실시예 4>
① 11주간 고지혈 사료를 먹여 제작한 ApoE (-/-) 동맥경화반 마우스에 Gd-PLN, Gd-PLN-cRGD, Gd-PLN-pIL-4, Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 각각 10 μmoles Gd/Kg농도로 정맥투여한 후 24시간이 경과한 마우스를 경추탈골로 희생시켰다. ② 마우스의 대동맥궁을 수집하여 10% formalin 용액에 24시간 고정시켰다. ③ 조직을 paraffin block으로 만든 후 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색을 실시하였다.
이하는 본 발명의 일실시예에 따른 발명의 조영제 제조에 있어 합성된 Gd-PLN-cRGD-pIL-4 결합체의 분석자료이다.
도 1은 본 발명의 조영제 모식도이다. 기본적으로 생체 구성물질인 인지질을 주축으로 소수성 결합을 바탕으로 체내에서 생분해되어 쉽게 제거될 수 있도록 디자인하였다. DTPA 및 cRGD, pIL-4는 공유결합으로 되어 있으며, Gd-DTPA는 Gd가 DTPA에 배위 결합된 금속-킬레이트 화합물이다. 또한 Gd-PLN의 동맥경화반 특이적 표적자 탑재기술로 avidin-biotin conjugation 방법을 사용하여 DSPE-PEG (2K)-biotin을 이용해 인지질 나노입자를 합성하고 biotinylated oligopeptide 표적자를 합성한 후 avidin을 매개로 하여 결합체를 합성하였다.
도 2는 본 발명의 제조방법 의해 합성된 인지질 나노입자에 cRGD와 pIL-4를 conjugation한 후 hydrodynamic size를 DLS (Dynamic light scattering)로 측정한 결과이다. 생체 내에서 분자영상소재는 적절한 size (10nm<φ<20nm)를 조절하여 kidney로 빨리 배출되거나 과도한 Liver uptake를 피하여 적절한 circulation time을 유지시킴으로써 targeting chance를 높이는 것이 중요한데, 본 발명의 조영제는 평균크기가 Φ=13.89±0.30nm 를 가지는 균질한 나노입자임을 확인하였다.
도 3은 본 발명의 MR 영상으로 얻어진 MS-1 cell에 결합 또는 수용체 유도에 의한 세포 내 섭취된 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 specificity test로 T1영상과 조영 강도를 보여준다. 본 실험에서 Gd-PLN-cRGD-pIL-4가 Gd-PLN에 비하여 높은 T1 조영 정도를 보여주는 것을 확인하였다.
도 4는 ICP-AES에 의한 Gd의 함량분석으로 MS-1 세포에 결합 또는 수용체 유도에 의한 세포 내 섭취 된 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 특이성 시험결과이다. IL-4 수용체와 integrin (αvβ3)의 발현이 높은 혈관내피세포주 MS-1에 Gd-PLN-cRGD 와 Gd-PLN-pIL-4가 의미 있는 특이적 결합을 보였으며 다표적형 Gd-PLN-cRGD-pIL-4은 단일 표적형 소재보다 MS-1에 대한 뛰어난 특이성을 보여주고 있다.
도 5는 Gd-PLN-cRGD-pIL-4의 마우스 혈류 내 잔존시간을 ICP-AES를 사용하여 측정한 결과로서 혈류 내 반감기가 1.79±0.53 hr인 것을 확인하였으며 이는 인체에서 3-4시간 이상에 해당되므로 분자영상소재가 표적세포에 결합하기 위한 적절한 시간을 유지시켜줄 것으로 본다.
도 6은 Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 정맥주사하고 시간에 따른 신장, 간, 근육의 T1 intensity를 측정하여 체외배출경로를 예측할 수 있는 결과를 제공한다. 본 결과는 Gd-PLN-cRGD-pIL-4가 간의 세망내피계를 통한 담도 배출과 신장으로 서서히 배출되는 것으로 확인되었으며 이는 생체에서 적용하기에 적절한 크기로 디자인된 소재의 특성 때문으로 해석된다.
도 7은 고지혈 사료를 먹여 동맥경화를 유도한 Apoe (-/-) 생쥐에서 Gd-PLN을 0.2 mmole Gd/kg로 정맥 주사한 후 얻은 T1강조영상이다. MR영상에서 대동맥벽에 뚜렷한 조영 증강이 나타나지 않았으나, MR영상 후 mouse의 aorta를 적출하여 H&E 염색을 통해 동맥경화반 (AP)의 생성 여부를 확인하였다.
도 8은 고지혈 사료를 먹여 동맥경화를 유도한 Apoe (-/-) 생쥐에서 Gd-PLN-pIL-4를 0.2 mmole Gd/kg로 정맥주사한 후 얻은 T1강조영상으로, 화살표로 표시된 대동맥벽에서 moderate contrast enhancement를 확인할 수 있다.
도 9는 고지혈 사료를 먹여 동맥경화를 유도한 Apoe (-/-) 생쥐에서 Gd-PLN-cRGD를 0.2 mmole Gd/kg로 정맥 주사한 후 얻은 T1강조영상으로, 화살표로 표시된 대동맥벽에 의미 있는 contrast enhancement를 확인할 수 있다.
도 10은 고지혈 사료를 먹여 동맥경화를 유도한 Apoe (-/-) 생쥐에서 Gd-PLN-cRGD-pIL-4를 0.2 mmole Gd/kg로 정맥 주사한 후 얻은 T1강조영상으로, 화살표로 표시된 대동맥벽에 의미 있는 조영 증강이 보이며, MR영상 후 mouse의 aorta를 적출하여 H&E 염색을 통해 동맥경화반 (AP)의 생성 여부를 확인할 수 있다.
이러한 결과에 의해, 본 발명에 따른 동맥경화반 특이적 다표적형 T1 영상소재 Gd-PLN-cRGD-pIL-4는 MR 영상촬영에서 동맥경화반을 수반하는 혈관벽 및 병변조직을 특이적으로 조영할 수 있음을 확인하였다. 또한 종래의 분자 조영제와 달리 두 가지 이상의 타겟을 표적화하는 다중표적기술을 사용하여 영상소재의 표적지향적 타겟팅 능력을 개선할 수 있음을 알 수 있었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 인지질 나노입자 (phospholipid nanoparticles, PLN)에 동맥경화반 특이적 표적자 및 엠알 조영제가 결합된 것을 포함하는 영상소재.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 나노입자의 평균 크기가 Φ=5-100nm 인 것을 특징으로 하는 영상소재.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조영제는 가돌리늄 착화합물 또는 산화철나노입자인 것을 특징으로 하는 영상소재.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 조영제는 T1 또는 T2 인 것을 특징으로 하는 영상소재.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 동맥경화반 특이적 표적자는 pIL-4 펩티드 (LQRLFRAFRCLK) 및 cRGD(RGDfK)를 포함하는 것을 특징으로 하는 영상소재.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 영상소재는 신생혈관 및 염증조직에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 영상소재.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 영상소재는 염증 및 반 (plaque)을 수반하는 혈관내피세포의 MR 영상, 국소병변의 감별진단, 염증 및 반 (plaque)성 병변의 범위 결정 및 심각성 판단, 동맥경화성 병변의 초기진단을 수반하는 병변 조직의 초기 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 영상소재.
  8. (a) 비오틴 (biotin) 및 DTPA (Diethylene triamine pentaacetic acid)를 결합시킨 인지질 나노입자를 형성하는 단계;
    (b) 상기 (a)에 가돌리늄 용액과 아비딘을 첨가하는 단계;
    (c) 상기 (b)에 동맥경화반 특이적 표적자를 첨가한 후 교반 및 여과하는 단계; 를 포함하는 영상소재의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 인지질 나노입자의 내부는 지방산과 폴리소르베이트80 (polysorbate 80) 의 소수성 친화력으로 결합된 것을 특징으로 하는 영상소재의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 지방산은 올레산 (oleic acid), 미리스토일산 (myristoyl acid), 팔미트산 (palmitic acid) 또는 스테아르산 (stearic acid)인 것을 특징으로 하는 영상소재의 제조방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 나노입자의 평균 크기가 Φ=5-100 nm인 것을 특징으로 하는 영상소재의 제조방법.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 동맥경화반 특이적 표적자는pIL-4 펩티드(LQRLFRAFRCLK) 및cRGD(RGDfK)를 포함하는 것을 특징으로 하는 영상소재의 제조방법.


KR1020110005843A 2011-01-20 2011-01-20 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법 KR20120084466A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110005843A KR20120084466A (ko) 2011-01-20 2011-01-20 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110005843A KR20120084466A (ko) 2011-01-20 2011-01-20 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130128011A Division KR20130124270A (ko) 2013-10-25 2013-10-25 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120084466A true KR20120084466A (ko) 2012-07-30

Family

ID=46715375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110005843A KR20120084466A (ko) 2011-01-20 2011-01-20 동맥경화반 특이적 엠알 조영제 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20120084466A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016504380A (ja) * 2013-01-04 2016-02-12 インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ ナノ粒子支持体表面にコーティングされたｔ１造影物質を含むｍｒｉ造影剤

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016504380A (ja) * 2013-01-04 2016-02-12 インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション，ヨンセイ ユニバーシティ ナノ粒子支持体表面にコーティングされたｔ１造影物質を含むｍｒｉ造影剤

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Gadolinium-based nanoscale MRI contrast agents for tumor imaging
Pan et al. Manganese-based MRI contrast agents: past, present, and future
Mao et al. Functional nanoparticles for magnetic resonance imaging
An et al. Paramagnetic hollow silica nanospheres for in vivo targeted ultrasound and magnetic resonance imaging
Liu et al. Gadolinium loaded nanoparticles in theranostic magnetic resonance imaging
Kim et al. A cancer-recognizable MRI contrast agents using pH-responsive polymeric micelle
Yang et al. Affibody modified and radiolabeled gold–iron oxide hetero-nanostructures for tumor PET, optical and MR imaging
Zhou et al. Gadolinium‐based contrast agents for magnetic resonance cancer imaging
Huang et al. HSA coated MnO nanoparticles with prominent MRI contrast for tumor imaging
Wang et al. Computed tomography imaging of cancer cells using acetylated dendrimer-entrapped gold nanoparticles
Yang et al. Dragon fruit-like biocage as an iron trapping nanoplatform for high efficiency targeted cancer multimodality imaging
Bai et al. Triple-modal imaging of magnetically-targeted nanocapsules in solid tumours in vivo
US8697031B2 (en) Dual function polymer micelles
Dai et al. Comparative study on in vivo behavior of PEGylated gadolinium oxide nanoparticles and Magnevist as MRI contrast agent
Mortezazadeh et al. Glucosamine conjugated gadolinium (III) oxide nanoparticles as a novel targeted contrast agent for cancer diagnosis in MRI
Lee et al. Amphiphilic hyaluronic acid-based nanoparticles for tumor-specific optical/MR dual imaging
Xue et al. 99mTc-labeled iron oxide nanoparticles for dual-contrast (T 1/T 2) magnetic resonance and dual-modality imaging of tumor angiogenesis
Kamaly et al. Chemistry of tumour targeted T1 based MRI contrast agents
Wei et al. Biocompatible low-retention superparamagnetic iron oxide nanoclusters as contrast agents for magnetic resonance imaging of liver tumor
Zhu et al. SPIO-loaded nanostructured lipid carriers as liver-targeted molecular T2-weighted MRI contrast agent
Periyathambi et al. Macrophages mediated diagnosis of rheumatoid arthritis using fibrin based magnetic nanoparticles as MRI contrast agents
Xin et al. Stearic acid-grafted chitooligosaccharide nanomicelle system with biocleavable gadolinium chelates as a multifunctional agent for tumor imaging and drug delivery
Wang et al. Efficient exosome extraction through the conjugation of superparamagnetic iron oxide nanoparticles for the targeted delivery in rat brain
WO2015025983A1 (ja) 高分子ナノ粒子複合体、及びそれを含むｍｒｉ造影用組成物
Cai et al. A transferrin-target magnetic/fluorescent dual-mode probe significantly enhances the diagnosis of non-small cell lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
A107 Divisional application of patent