KR20120083777A - Edwardsiella tarda-binidng peptides, their preparation method and a method of detecting edwardsiella tarda using the peptides - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A peptide which is conjugated to Edwardsiella tarda and a method for preparing the same are provided to identify the kinds of bacteria. CONSTITUTION: A peptide conjugated with Edwardsiella tarda has TLYPLDR (ET-01) sequence number or WVWPARL (ET-02). A method for detecting Edwardsiella tarda comprises: a step of binding peptides to a sample containing Edwardsiella tarda; a step of removing free peptides from a sample using a filter; and a step of measuring fluorescent material, radioactive substance, or enzyme activity.

Description

에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법{Edwardsiella tarda-binidng peptides, their preparation method and a method of detecting Edwardsiella tarda using the peptides}Edwardsiella tarda-binidng peptides, their preparation method and a method of detecting Edwardsiella tarda using the peptides}

본 발명은 에드와드 균 (Edwardsiella tarda)에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 에드와드 균에 결합하는 특성을 가짐으로써 에드와드 균 항체를 대신할 수 있는 펩티드, 그의 제조방법 및 상기 펩티드를 이용하여 에드와드 균을 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a peptide that binds to Edwardsiella tarda, a method for producing the same, and a method for detecting Edweed using the same. More particularly, the present invention relates to a method for producing an Edweed antibody, An alternative peptide, a method for producing the same, and a method for detecting an edword using the peptide.

그람 음성균으로 운동성이 있는 단간균인 에드와드 균 (Edwardsiella tarda)은 자연계에 널리 분포하는 장내 세균이며 우리나라 양식장에 가장 많은 어병인 에드와드 병을 일으키는 원인 균이다. Edwardsiella tarda, a gram-negative bacterium that is motile, is the intestinal bacterium widely distributed in nature and is the causative agent of Edward disease, the largest fish disease in Korean farms.

이와 같은 박테리아를 검출하기 위해서는 일반적으로 고체 배지에 배양한 후 형성된 군체의 수를 세는 방법이 사용되는데 2-7일 정도의 시간이 소요되기 때문에 신속한 검사가 불가능한 문제점이 있다. 이 때문에, 신속한 검사를 위해서는 박테리아 내부에 있는 ATP라는 화학물질의 양을 측정하는 방법이 사용되기도 하는데, 이 방법으로는 박테리아 종류의 구별이 곤란한 문제점이 있다. 이에, 최근에는 박테리아를 실시간에 검출하기 위한 바이오센서에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.In order to detect such bacteria, a method of counting the number of colonies formed after culturing in a solid medium is generally used, which takes about 2-7 days, so that a rapid test cannot be performed. For this reason, a method of measuring the amount of a chemical called ATP in bacteria is used for rapid testing, but this method has a problem in that it is difficult to distinguish bacterial types. Recently, many researches have been conducted on biosensors for detecting bacteria in real time.

바이오센서는 분석 대상 박테리아와 특이적으로 결합할 수 있는 바이오 인터페이스 (bio-interface)와 결합에 반응하여 신호를 발생하는 신호 변환기 (signal transducer)로 구성되어 있다. 바이오 인터페이스로는 대개 면역 단백질인 항체가 많이 사용되는데 항체는 친화도와 특이성이 높은 장점이 있는 반면에 분자량이 크고, 화학적인 처리가 어렵고, 변질되기 쉽고, 가격이 비싸다는 문제점이 있다.The biosensor is composed of a bio-interface that can specifically bind to the bacteria to be analyzed and a signal transducer that generates a signal in response to the binding. Antibodies, which are usually immune proteins, are commonly used as bio-interfaces, while antibodies have advantages of high affinity and specificity, but have high molecular weight, difficult chemical treatment, easy deterioration, and high price.

에드와드 균과 관련하여, 대한민국 특허출원 제10-1997-0051986호 ‘에드와드병의 감염에 대한예방백신 및 이를 이용하여 넙치의 에드와드병 감염을 예방하는 방법’에는 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 항원을 포함하는 에드와드병 감염에 대한 예방 백신이 기재되어 있으나, 에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조 방법 및 상기 펩티드를 이용하여 에드와드 병을 치료하는 방법은 아직까지 시사되거나 암시된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 연구하여 밝혀내어 상기한 문제점을 해결한 에드와드 균의 검출 방법을 제공하게 됨으로써 본 발명에 이르게 되었다.
Regarding the Edward bacteria, Korean Patent Application No. 10-1997-0051986, 'Prevention vaccine for the infection of Edward disease and a method for preventing the infection of Edible disease of the flounder by using the same,' Edwardsiela tarda ( Although a prophylactic vaccine against Edward's disease infection, including the Edwardsiella tarda) antigen, has been described, peptides that bind to Edward's bacteria, methods for their preparation, and methods for treating Edward's disease using the peptides are still suggested or suggested. It has never been. Accordingly, the present inventors have led to the present invention by providing a method for detecting Edward bacteria that has solved the above-mentioned problems by studying and discovering peptides that bind to Edward bacteria.

본 발명의 목적은 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 제공하는 한편, 이를 이용하여 신속하고 간단하면서도 경제적으로 에드와드 균을 검출하는 방법을 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a peptide that binds to the Ed Ward bacteria, while providing a method for detecting the Ed Ward bacteria quickly, simply and economically using the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for preparing the peptide.

본 발명에서는 에드와드 균과 결합하는 것을 특징으로 하는, TLYPLDR (ET-01)과 WVWPARL (ET-02) 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드가 제공된다.In the present invention, there is provided a peptide selected from the group consisting of TLYPLDR (ET-01) and WVWPARL (ET-02) sequences, characterized by binding to Edward bacteria.

또한, 본 발명에서는 에드와드 균에 Ph.D-7 파지-펩티드 문고를 첨가하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 펩티드의 제조방법이 제공된다.In addition, the present invention provides a method for preparing the peptide, comprising the step of repeating the biopanning process by adding Ph.D-7 phage-peptide library to Ed Ward bacteria.

또한, 본 발명에서는 상기 펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.In addition, the present invention provides a method for detecting Edward bacteria, wherein the peptide is used.

또한, 본 발명에서는 상기 펩티드를 형광물질, 방사성 물질 또는 효소와 결합시켜서 사용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.The present invention also provides a method for detecting Edward bacteria, wherein the peptide is used in combination with a fluorescent substance, a radioactive substance or an enzyme.

마지막으로, 본 발명에 따르면, 상기 펩티드를 형광물질과 결합시킨 후에 형광 편광 (fluorescence polarization)시키는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.
Finally, according to the present invention, there is provided a detection method of Ed Ward bacteria, characterized in that the fluorescence polarization (fluorescence polarization) after combining the peptide with a fluorescent material.

본 발명의 펩티드를 이용할 경우 종래의 박테리아 군체 개체수를 세는 방법에 비해 신속하게 에드와드 균을 검출할 수 있으며, 균의 종류 또한 확인할 수 있고, 항체를 이용하는 경우보다 더 간단하고 경제적으로 에드와드 균을 검출할 수 있는 효과가 있다. 그 결과, 넙치 등을 비롯한 어종의 양식업에 크게 기여하는 산업적 효과도 갖는다.
When the peptide of the present invention is used, it is possible to detect the Edward bacteria more quickly than the conventional method of counting the bacterial population, the type of bacteria can be identified, and the Edward bacteria can be detected more simply and economically than when using the antibody. There is a detectable effect. As a result, it also has an industrial effect that greatly contributes to the aquaculture industry of fish species including flounder.

도 1은 섬유상 박테리오파지의 구조를 나타낸다.
도 2는 바이오패닝의 원리를 나타낸 그림이다.
도 3은 Ph.D-7 파지-펩티드 문고에서의 무작위 아미노산 서열의 구조를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 바이오패닝 방법을 나타낸다.
도 5는 필터와 페록시다아제를 이용한 펩티드들의 에드와드 균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 필터와 포스파타아제를 이용한 펩티드들의 에드와드 균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 필터와 포스파타아제를 이용한 ET-02 펩티드의 에드와드 균과 대장균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 8a는 자성 비드, ET-02 펩티드, 포스파타아제를 이용한 에드와드 균의 검출 방법을 나타낸 것이다.
도 8b는 자성 비드, ET-02 펩티드, 포스파타아제를 이용한 에드와드 균의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 형광 물질을 붙인 ET-02 펩티드를 이용하여 형광 편광 (fluorescence polarization) 방법으로 에드와드 균을 검출한 결과이다.1 shows the structure of a fibrous bacteriophage.
2 is a diagram illustrating the principle of biopanning.
Figure 3 shows the structure of random amino acid sequences in Ph.D-7 phage-peptide library.
4 shows a biopanning method according to the present invention.
Figure 5 shows the results of the affinity measurement of the Ed Ward bacteria of the peptides using a filter and peroxidase.
Figure 6 shows the results of the affinity measurement of the Ed Ward bacteria of the peptides using a filter and phosphatase.
Figure 7 shows the results of the affinity measurement for the E. coli and E. coli of the ET-02 peptide using a filter and phosphatase.
Figure 8a shows the detection method of Ed Ward bacteria using magnetic beads, ET-02 peptide, phosphatase.
Figure 8b shows the detection results of Ed Ward bacteria using magnetic beads, ET-02 peptide, phosphatase.
9 is a result of detecting the Ed Ward bacteria by the fluorescence polarization method using the ET-02 peptide with a fluorescent material.

본 발명에 따르면, 파지-펩티드 문고를 검색하는 단계, 에드와드 균에 파지-펩티드 문고를 첨가하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계, 바이오패닝 과정에서 회수된 펩티드 중 발생 빈도가 높은 펩티드의 염기 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해 본 발명의 펩티드를 제공한다.According to the present invention, a step of searching for phage-peptide library, adding a phage-peptide library to Edward bacteria, repeating the biopanning process, and the high frequency of peptides recovered from the biopanning process It provides a peptide of the present invention by a method comprising the step of identifying the base sequence.

파지-펩티드 문고 기술은 M13이나 fd와 같은 섬유상 박테리오파지 (filamentous bacteriophage)의 껍질 단백질 (coat protein)에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 박테리오파지들로 이루어진 집단으로부터 특정 목표 분자에 결합하는 리간드를 검색하는 기술이다. 도 4는 섬유상 박테리오파지의 구조를 나타내는데, coat protein 가운데 protein 3의 N-말단 부분에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 구조를 볼 수 있다. Phage-peptide library technology is a technique for searching for ligands that bind to a specific target molecule from a population of bacteriophages that exhibit peptides of random amino acid sequence in a coat protein of fibrous bacteriophages such as M13 or fd. . Figure 4 shows the structure of the fibrous bacteriophage, which can be seen the structure of a peptide of the random amino acid sequence in the N-terminal portion of protein 3 of the coat protein.

본 발명에 따르면, 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 찾기 위해 무작위 아미노산이 7개인 Ph.D-7 파지-펩티드 문고를 검색하였다. Ph.D-7은 7개의 잔기로 이루어진 펩티드가 일직선으로 나열된 것이다. Ph.D-7의 무작위 아미노산 서열 부분은 도 3에 나타나 있으며 X로 표시된 부분이 무작위 서열이다.According to the present invention, the Ph.D-7 phage-peptide library with seven random amino acids was searched for a peptide that binds to the Edward bacteria. Ph.D-7 is a straight line of peptides consisting of seven residues. The random amino acid sequence portion of Ph.D-7 is shown in FIG. 3 and the portion denoted by X is the random sequence.

바이오패닝은 특정 목표 분자에 결합하는 파지를 찾는 방법이다. 바이오패닝 방법의 원리는 이하에 기재된 바와 같다(도 2 참고). 목표 분자가 부착되어 있는 고체 표면에 파지-펩티드 문고를 넣어 결합시킨 후 씻어내면 결합성이 있는 파지들만 남게 된다. 결합한 파지들을 다시 회수하여 숙주 박테리아에 감염시키면 같은 성질을 갖는 파지들이 증폭되고, 증폭된 파지를 이용하여 앞의 과정을 반복하게 되면 특이적으로 결합하는 파지의 비율이 높아져서 마침내는 원하는 펩티드만을 분리할 수 있게 된다. 바이오패닝을 통해 목표 분자에 결합하는 파지를 찾으면 그 파지에 표현된 펩티드의 아미노산 서열은 protein 3의 유전자인 gene 3 앞에 삽입된 DNA의 염기서열로부터 추정할 수 있다. Biopanning is a method of finding phages that bind to specific target molecules. The principle of the biopanning method is as described below (see FIG. 2). When the phage-peptide library is put on the solid surface to which the target molecule is attached and then washed, the remaining phages remain. By recovering the bound phage and infecting it with a host bacterium, phages having the same properties are amplified. When the above process is repeated using the amplified phage, the ratio of the specifically bound phage increases, finally separating only the desired peptide. It becomes possible. When the phage binds to the target molecule through biopanning, the amino acid sequence of the peptide expressed in the phage can be estimated from the base sequence of the DNA inserted before gene 3, the gene of protein 3.

본 발명에 따르면, 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 찾기 위해 도 4에 나타낸 것처럼 먼저 에드와드 균에 파지-펩티드 문고를 더하여 결합시키고 원심분리를 하여 에드와드 균만 가라앉혔다. 용액 중의 결합하지 않은 파지를 제거하고 완충용액으로 에드와드 균을 씻어주었다. 그리고 마지막으로 에드와드 균에 결합한 파지를 회수하여 대장균에서 증폭하였다. According to the present invention, in order to find a peptide that binds to the Ed Ward bacteria, as shown in FIG. 4, the Ed Ward bacteria were first added to the phage-peptide library, combined, and centrifuged to sink only the Ed Ward bacteria. Unbound phages were removed from the solution, and the Edward bacteria were washed with the buffer solution. Finally, the phages bound to the Ed Ward bacteria were recovered and amplified in E. coli.

상기와 같은 바이오패닝 과정을 4회 반복한 후 3회와 4회에 회수된 파지 가운데 14개와 10개를 각각 무작위로 선별하여 펩티드에 대한 암호를 가지고 있는 염기서열을 결정하였다. 그 결과 발생 빈도가 높은 펩티드로 TLYPLDR (ET-01)과 WVWPARL (ET-02) 서열이 확인되었다. 이와 같이 반복된 바이오패닝 과정을 통해 발생 빈도가 높아진 아미노산 서열은 에드와드 균에 결합하는 특성이 우수하다는 것을 의미한다. After repeating the biopanning process four times, 14 and 10 of the phages recovered three times and four times were randomly selected to determine the base sequence having the code for the peptide. As a result, TLYPLDR (ET-01) and WVWPARL (ET-02) sequences were identified as high incidence peptides. As described above, the repeated amino panning process increases the frequency of amino acid sequences, which means that they bind to Edward bacteria.

상기로부터 수득된 본 발명의 펩티드는 에드와드 균을 검출하는데 사용할 수 있다. The peptide of the present invention obtained from the above can be used for detecting Edward bacteria.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the scope of the present invention is not limited thereto.

제조예Manufacturing example 1: 펩티드의 제조 1: Preparation of Peptides

약 109 cfu 정도의 에드와드 균을 포함하는 PBS (phosphate-buffered saline)에 Ph.D-7 파지 펩티드 문고 10 μl (2×1013 pfu/ml, 2×109 independent sequences)를 더하여 실온에서 1시간 동안 흔들어주며 결합시켰다. 원심분리로 에드와드 균을 가라앉힌 후 상층액을 제거하고 에드와드 균을 PBS로 2회 씻어주었다. 마지막으로 0.2 M glicine-HCl, pH 2.2 완충용액 1 ml을 넣어 에드와드 균에 결합한 파지들을 해리시켰다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 1 M Tris-Cl, pH 9.6 완충용액을 0.15 ml 넣어 중화시켰다. 중화시킨 용액 1 ml에 액체 배지에서 배양한 Escherichia coli (E. coli) XL1-blue 30 ml을 더하여 파지를 증폭시켰다. 중화시킨 나머지 용액으로는 회수된 파지의 수를 결정하였다. 파지를 증폭한 후 원심분리 하여 침전된 세포는 제거하고 상층액에 있는 파지를 다음 바이오패닝에 사용하였다.Add 10 μl (2 × 10 13 pfu / ml, 2 × 10 9 independent sequences) of Ph.D-7 phage peptides to PBS (phosphate-buffered saline) containing about 10 9 cfu of Edward bacteria Combined shaking for 1 hour. The Edwards bacteria were settled by centrifugation, the supernatant was removed, and the Edwards bacteria were washed twice with PBS. Finally, 1 ml of 0.2 M glicine-HCl, pH 2.2 buffer was added to dissociate the phages bound to Edward bacteria. After centrifugation, the supernatant was transferred to a new tube and neutralized with 0.15 ml of 1 M Tris-Cl, pH 9.6 buffer. Phage was amplified by adding 30 ml of Escherichia coli (E. coli) XL1-blue cultured in liquid medium to 1 ml of the neutralized solution. The number of phages recovered was determined as the remaining solution neutralized. After amplifying the phage, the precipitated cells were removed by centrifugation, and the phage in the supernatant was used for the next biopanning.

이와 동일한 방법으로 바이오패닝을 4회 반복한 후 3회와 4회에 회수된 파지 가운데 14개와 10개를 각각 무작위로 선별하여 파지를 배양하였다. 배양된 파지로부터 DNA를 분리하고 각 DNA의 gene 3 앞에 삽입된 무작위 염기서열을 결정하여 아미노산 서열로 전환한 결과 3회에 WVWPARL (ET-02) 서열이 2회 나타났고 TLYPLDR (ET-01) 서열은 3회와 4회에 한 번씩 나타났다. 처음 사용한 Ph.D-7 문고에는 2×109 종류의 파지가 있으며 파지의 수는 2×1012 개이기 때문에 한 종류 파지의 수는 약 1,000개가 된다. 이 가운데서 10개의 파지를 임의로 선택했을 때 동일한 파지가 두 번 선택될 확률은 2.5×10- 17 으로 극히 낮다. 따라서 3회 또는 4회의 바이오패닝 이후에 ET-01과 ET-02 서열이 2회씩 나타났다는 것은 그 서열을 갖는 파지들이 다른 파지들에 비해 훨씬 강하게 증폭되었다는 것을 의미한다. 그리고 이 파지들이 에드와드 균에 결합하는 성질을 기준으로 바이오패닝을 했을 때 강하게 증폭되었다는 사실은 이 파지들이 에드와드 균에 잘 결합하는 특성을 가지고 있음을 보여준다.
In the same manner, the biopanning was repeated four times, and then 14 and 10 of the phages recovered three times and four times were randomly selected, and the phages were cultured. DNA was isolated from the cultured phage, and the random nucleotide sequence inserted before gene 3 of each DNA was determined and converted into amino acid sequence. The WVWPARL (ET-02) sequence appeared twice, and the TLYPLDR (ET-01) sequence appeared three times. Appeared three times and four times. The first Ph.D-7 library used has 2 × 10 9 types of phages, and the number of phages is 2 × 10 12 , so the number of phages of one kind is about 1,000. When you choose randomly from among 10 phages selected with the same probability of being gripped, double the 2.5 × 10 - 17 is extremely low. Thus, two or more ET-01 and ET-02 sequences appearing after three or four biopannings indicate that the phages carrying the sequences are amplified much more strongly than other phages. And the fact that these phages were strongly amplified by biopanning based on their binding to Edward bacteria showed that these phages had good binding properties to Edward bacteria.

에드와드Edward 균에 대한 친화도 확인 Confirmation of affinity for bacteria

ET-01과 ET-02 두 종류 펩티드의 에드와드 균에 대한 친화도를 확인하기 위해 각 펩티드의 아미노산 서열의 카르복시 말단에 두 개의 글리신 잔기와 한 개의 리신 잔기를 추가하고 마지막 리신 잔기의 아미노기에 비오틴 기를 더한 펩티드를 합성하였다. 즉 ET-01은 TLYPLDRGGK-biotin의 서열이 되고 ET-02는 WVWPARLGGK-biotin의 서열이 되었다. To confirm the affinity of the two peptides, ET-01 and ET-02, two glycine residues and one lysine residue were added to the carboxy terminus of the amino acid sequence of each peptide and biotin was added to the amino group of the last lysine residue. Peptides plus groups were synthesized. That is, ET-01 became the sequence of TLYPLDRGGK-biotin and ET-02 became the sequence of WVWPARLGGK-biotin.

스트렙트아비딘 (streptavidin, StAv) 단백질과 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase, HRP) 효소를 화학결합으로 연결시킨 StAv-HRP 단백질에 위에서 합성한 두 가지 펩티드를 각각 넣어주었다. 그 결과 비오틴과 스트렙트아비딘 단백질 사이의 강한 결합에 의해 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 만들어졌다.Two peptides synthesized above were added to the StAv-HRP protein, which is a chemical bond between streptavidin (StAv) protein and horseradish peroxidase (HRP) enzyme. As a result, ET01-StAv-HRP protein or ET02-StAv-HRP protein was produced by the strong binding between biotin and streptavidin protein.

다음으로 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질을 에드와드 균과 섞어 결합시킨 후 0.45 μm의 구멍을 갖는 필터를 이용하여 걸러주었다 (도 5의 3번과 5번 시료). 단백질들은 필터의 구멍보다 작기 때문에 필터를 빠져나가지만 에드와드 균은 구멍보다 커서 빠져나가지 않는다. 따라서 에드와드 균에 결합한 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질만 필터에 남고 에드와드 균에 결합하지 않은 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질은 모두 필터를 빠져나가게 된다. 따라서 필터에 남아있는 HRP 효소 활성을 측정하면 ET-01 또는 ET-02 펩티드가 에드와드 균에 결합하는 활성이 있는지 확인할 수 있다. HRP 효소 활성은 루미놀과 과산화수소를 넣고 반응 결과 발생하는 빛의 세기를 측정함으로써 평가하였다.Next, ET01-StAv-HRP protein or ET02-StAv-HRP protein was combined with EdWard bacteria, and then filtered using a filter having a hole of 0.45 μm (samples 3 and 5 in FIG. 5). Proteins exit the filter because they are smaller than the hole in the filter, but the Edward germ is larger than the hole and does not exit. Therefore, only the ET01-StAv-HRP protein or ET02-StAv-HRP protein bound to Edward bacteria remain in the filter, and all the ET01-StAv-HRP protein or ET02-StAv-HRP proteins not bound to Edward bacteria leave the filter. . Therefore, by measuring the HRP enzyme activity remaining in the filter, it is possible to confirm whether the ET-01 or ET-02 peptides bind to Edward bacteria. HRP enzyme activity was assessed by adding luminol and hydrogen peroxide and measuring the light intensity resulting from the reaction.

도 5의 1번은 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균을 직접 섞어 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균 사이의 비특이적인 결합 정도를 평가하기 위한 비교치이고, 2번과 4번은 각각 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 에드와드 균에 결합하지 않은 상태로 필터에 얼마나 남는지 평가하기 위한 비교치이다. 이 실험을 3회 수행하였으며 그래프에는 평균치와 표준편차를 나타내었다.5 is a comparison for assessing the degree of nonspecific binding between the StAv-HRP protein and Ed Ward bacteria by directly mixing the StAv-HRP protein and Ed Ward bacteria, and No. 2 and 4 are ET01-StAv-HRP proteins or This is a comparison to evaluate how much ET02-StAv-HRP protein remains in the filter without binding to the Edward bacteria. This experiment was performed three times and the graph shows the mean and standard deviation.

도 5에 있는 실험 결과를 보면 1번 시료에서는 약간의 빛이 발생하여 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균 사이에 약간의 비특이적인 결합이 있는 것을 알 수 있다. 2번과 4번 시료에서는 거의 빛이 검출되지 않아 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 에드와드 균에 결합하지 않은 상태로는 필터에 거의 남지 않는다는 것을 알 수 있다. 3번 시료는 1번 시료에 비해 약간 높게 나타났는데 이는 ET01이 에드와드 균에 결합하는 활성이 있기는 하지만 친화도가 그렇게 높지 않음을 의미한다. 마지막으로 5번 시료는 발생한 빛의 세기가 현저하게 강하게 나타나 ET-02가 에드와드 균에 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다.In the experimental results in FIG. 5, it can be seen that there is a slight non-specific binding between the StAv-HRP protein and the Ed Ward bacteria because a little light is generated in the first sample. It was found that almost no light was detected in samples 2 and 4, so that the ET01-StAv-HRP protein or ET02-StAv-HRP protein remained in the filter without binding to Edward bacteria. Sample 3 was slightly higher than sample 1, which means that ET01 has the activity of binding to Edward bacteria, but not so high affinity. Finally, the fifth sample showed a markedly strong light intensity, indicating that ET-02 binds to Edward bacteria.

두 펩티드의 친화도를 더 분명하게 확인하기 위해 HRP 효소를 염기성 포스파타아제 (alkaline phosphatase, AP) 효소로 바꿔 도 5에서 수행한 것과 동일한 실험을 수행하였다 (도 6 참조). 이 실험에서 AP 효소 활성은 p-nitrophenol phosphate를 더하여 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가하였다.In order to more clearly confirm the affinity of the two peptides, the same experiment as in FIG. 5 was performed by replacing the HRP enzyme with an alkaline phosphatase (AP) enzyme (see FIG. 6). In this experiment, AP enzyme activity was evaluated by measuring the absorbance at 405 nm after adding p-nitrophenol phosphate.

이 두 번째 실험에서도 역시 도 6에 있는 것처럼 ET-02가 에드와드 균에 대해 뚜렷한 친화도를 가지고 있는 것으로 확인되어 이후에는 ET-02에 대한 실험을 진행하였다.
In this second experiment, as shown in FIG. 6, ET-02 was found to have a clear affinity for Edward bacteria, and then the experiment for ET-02 was performed.

에드와드Edward 균에 대한 특이성 확인 Specificity of bacteria

ET-02 펩티드가 에드와드 균에만 특이적으로 결합하는 활성을 가지고 있는지 확인하기 위해 에드와드 균과 동일한 그람 음성균인 대장균을 대상으로 도 6에서 수행한 것과 동일한 실험을 수행하였다 (도 7 참조). 여기에서 2번과 3번 시료는 대장균을 대상으로 한 실험이고 4번과 5번은 에드와드 균을 대상으로 한 실험이다.In order to confirm that the ET-02 peptide has an activity that specifically binds to Edward bacteria, the same experiment as in FIG. 6 was performed on E. coli, the same Gram-negative bacterium as Edward bacteria (see FIG. 7). Here, samples 2 and 3 are for E. coli and samples 4 and 5 are for Edward.

도 7을 보면 에드와드 균과 ET02-StAv-Ap을 섞어준 5번 시료는 여전히 다른 비교치에 비해 현저하게 높은 값을 보여주지만 대장균과 ET02-StAv-Ap을 섞어준 3번 시료는 비교치와 큰 차이가 없어 ET-02가 에드와드 균에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다.
7 shows that the sample No. 5 mixed with Ed ward and ET02-StAv-Ap still shows a significantly higher value than the other comparison values, but the sample No. 3 mixed with E. coli and ET02-StAv-Ap was compared with the comparison value. There was no significant difference, indicating that ET-02 specifically binds to Edward bacteria.

실험예Experimental Example :  : 포획비드와Capture bead 검출표지를 이용한  Detection label 에드와드Edward 균 검출 Fungus detection

에드와드 균에 결합하는 ET-02 펩티드는 항체에 비해 친화도는 낮지만 안정성이 높고, 경제적이고, 화학적인 조작이 쉽고, 분자량이 작은 장점을 가지고 있기 때문에 도 8a와 같이 펩티드를 포획 자성비드와 검출 표지 양쪽에 모두 사용하는 검출방법에 응용할 수 있다. 포획 자성비드는 자성 비드 (magnetic bead)에 ET-02 펩티드를 고정시킨 것으로 시료에 섞여 있는 에드와드 균을 분리해내는 전처리에 사용된다. 검출 표지는 ET-02 펩티드를 효소와 연결시킨 것으로 에드와드 균에 결합하여 에드와드 균을 검출할 때 사용되는 표지이다.The ET-02 peptide that binds to the Edward bacteria has a lower affinity than the antibody but has high stability, economical efficiency, easy chemical manipulation, and low molecular weight. It is applicable to the detection method used for both detection labels. Capture magnetic beads are immobilized ET-02 peptides on magnetic beads and used for pretreatment to isolate Edward bacteria from the sample. The detection label is a label used to detect the Edward bacteria by binding to the Edward bacteria by connecting the ET-02 peptide with the enzyme.

에드와드 균과 같은 박테리아는 표면에 동일한 분자가 반복하여 분포하고 있기 때문에 한 개의 박테리아에 여러 개의 펩티드가 결합하는 다가 결합 (multi-valent binding)을 할 수 있다. 따라서 한 개의 자성 입자에 여러 개의 ET-02 펩티드를 고정시켜 사용하면 여러 개의 펩티드가 동시에 결합하기 때문에 자성 입자와 에드와드 균 사이의 친화도가 높아진다. Bacteria, such as Edward bacteria, can be multi-valent binding (multi-valent binding) to a single bacteria because the same molecule is repeatedly distributed on the surface. Therefore, when several ET-02 peptides are immobilized and used on one magnetic particle, several peptides bind at the same time, thereby increasing the affinity between the magnetic particles and Edward bacteria.

또한 ET-02를 포함하는 포획 자성 비드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어주면 한 개의 에드와드 균에 여러 개의 포획 자성 비드가 결합할 수 있다. 그러나 크기가 큰 자성 비드를 사용할 경우 비드들 사이의 입체적 장애로 인하여 자성 비드가 모든 결합자리에 결합하지 못하고 결과적으로 비어있는 결합자리들이 남게 된다. 여기에 ET-02를 포함하는 검출 표지를 넣어주면 비어있는 결합자리에 검출 표지들이 추가로 결합할 수 있다. 포획 비드들이 결합하고 남은 자리에 검출 표지들이 결합하기 위해서는 비드들로 인한 입체적 장애를 피하여 결합해야 하기 때문에 분자량이 작은 ET-02 펩티드는 항체에 비해 유리한 특성을 갖는다.In addition, when the capture magnetic beads containing ET-02 are put in a sample containing Ed Ward bacteria, multiple capture magnetic beads may bind to one Ed Ward bacteria. However, when a large size magnetic bead is used, the magnetic beads cannot bind to all binding sites due to the steric hindrance between the beads, resulting in empty binding sites. If a detection label containing ET-02 is put here, the detection labels may be further bound to an empty binding site. Smaller molecular weight ET-02 peptides have an advantage over antibodies because the binding beads must be bound to avoid the steric hindrance caused by the beads in order to bind the detection markers to the remaining sites.

ET-02 펩티드를 이용하여 위의 방법으로 에드와드 균을 검출할 수 있는지 확인하기 위해 ET-02 펩티드를 자성 비드에 고정시킨 포획 비드와 ET-02 펩티드를 AP 효소에 연결시킨 검출 표지를 제조하였다. 다음으로 도 8b의 1번 시료와 같이 에드와드 균과 포획 비드 그리고 검출 표지를 모두 섞어 결합시키고 자석을 이용하여 포획 비드를 회수하였다. 그리고 회수한 포획 비드에 p-nitrophenol phosphate를 넣어 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 2번 시료는 ET-02가 없는 자성 비드를 사용한 비교치, 3번 시료는 에드와드 균을 넣지 않은 비교치, 4번 시료는 ET-02가 없는 AP 효소를 사용한 비교치이다. 도 8b의 그래프에서 볼 수 있는 것처럼 1번 시료에서만 흡광도가 높게 나타나 에드와드 균에 포획비드와 검출표지가 모두 결합했음을 확인할 수 있다.
In order to check whether the ward bacteria can be detected by the above method using the ET-02 peptide, capture beads obtained by immobilizing the ET-02 peptide on magnetic beads and a detection label linking the ET-02 peptide to the AP enzyme were prepared. . Next, as shown in sample 1 of FIG. 8B, the Ed Ward bacteria, the capture beads, and the detection label were all mixed and combined, and the capture beads were recovered using a magnet. P-nitrophenol phosphate was added to the collected capture beads and the absorbance was measured at 405 nm. Sample 2 is the comparison using magnetic beads without ET-02, sample 3 is the comparison without Ed Ward bacteria, and sample 4 is the comparison using AP enzyme without ET-02. As can be seen in the graph of FIG. 8B, only one sample showed high absorbance, indicating that both the capture bead and the detection label were bound to the Ed Ward bacteria.

실험예Experimental Example 2 : 형광 편광 방법을 이용한  2: using fluorescence polarization method 에드와드Edward 균 검출에 응용 Application to bacteria detection

에드와드 균에 결합하는 펩티드는 분자량이 작기 때문에 항체에는 적용하기 어려운 형광 편광 (fluorescence polarization)과 같은 검출 방법을 적용할 수도 있다.Since the peptide that binds to the Ed Ward bacteria has a low molecular weight, a detection method such as fluorescence polarization, which is difficult to apply to an antibody, may be applied.

형광 편광의 원리는 다음과 같다. 수직 면 편광 (plane polarized light)으로 형광 분자를 들뜨게 했을 때 만약 분자가 들뜬 상태에서 움직이지 않는다면 방출되는 형광은 처음 들뜨게 했던 빛과 동일한 수직면으로 진동하는 면 편광이 나오게 된다. 반면에 들뜬 분자가 회전을 하면 방출된 빛은 다른 면으로 진동하게 된다. 만약 형광 분자로부터 방출되는 형광을 측정할 때 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광을 측정한다면 움직이지 않는 분자는 수직면으로 진동하는 형광만 측정될 것이다. 이러한 현상을 형광 편광 (fluorescence polarization, FP)이라고 한다. 반면에 회전을 하는 분자는 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광이 모두 측정된다. 분자가 크면 느리게 움직이기 때문에 수평면으로 진동하는 형광에 비해 수직면으로 진동하는 형광의 비율이 커지지만, 분자가 작을 때는 빠르게 움직이기 때문에 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광의 비율이 비슷해진다.The principle of fluorescence polarization is as follows. When a fluorescent molecule is excited by plane polarized light, if the molecule does not move in an excited state, the emitted fluorescence is vibrated in the same vertical plane as the first excited light. On the other hand, when the excited molecules rotate, the emitted light vibrates to the other side. If the fluorescence emitted from the fluorescent molecules is measured when the fluorescence oscillating in the vertical plane and the fluorescence oscillating in the horizontal plane, only the fluorescence oscillating in the vertical plane will be measured. This phenomenon is called fluorescence polarization (FP). On the other hand, the rotating molecule can measure both the fluorescence oscillating in the vertical plane and the fluorescence oscillating in the horizontal plane. Larger molecules move slowly, resulting in a greater proportion of fluorescence oscillating in the vertical plane than fluorescence oscillating in the horizontal plane. However, small molecules move rapidly, resulting in a similar ratio of fluorescence oscillating in the vertical plane and fluorescence oscillating in the horizontal plane.

수직면으로 진동하는 형광의 세기를 V라고 하고 수평면으로 진동하는 형광의 세기를 H라고 하면 형광 편광, FP는 다음 식과 같이 계산되고 그 단위로는 P (polarization unit)가 사용되지만 편의를 위해 일반적으로는 1000분의 1 단위인 mP가 사용된다.If the intensity of fluorescence oscillating in the vertical plane is V and the intensity of fluorescence oscillating in the horizontal plane is H, the fluorescence polarization and FP are calculated as in the following equation, and P (polarization unit) is used as a unit. One thousandth unit of mP is used.

만약 검출하려고 하는 분석물질은 크고 이 분석물질에 결합하는 리간드는 작다면 형광물질을 연결시킨 리간드를 분석물질에 결합시킨 후 형광 편광을 측정하여 분석물질을 검출할 수 있다. 작은 리간드가 큰 분석물질에 결합하면 움직임이 느려져 형광편광 값이 증가하기 때문이다. 그러나 리간드가 항체처럼 너무 크면 분석물질에 결합하지 않은 상태에서도 이미 형광 편광 값이 거의 최고치에 도달하기 때문에 분석물질에 결합해도 형광 편광의 변화를 관찰할 수 없다. 이 형광 편광 방법은 용액 중에서 일어나는 결합을 직접 측정할 수 있으며 매우 간편하고 측정 시간이 짧다는 장점이 있다.If the analyte to be detected is large and the ligand that binds to the analyte is small, the analyte can be detected by binding the fluorescent material-linked ligand to the analyte and measuring fluorescence polarization. The binding of small ligands to large analytes slows the movement and increases the fluorescence polarization value. However, if the ligand is too large, such as an antibody, the fluorescence polarization value already reaches its maximum even without binding to the analyte. This fluorescence polarization method can directly measure the binding occurring in the solution, and has the advantage of being very simple and short in measurement time.

ET-02 펩티드를 형광 편광 측정에 응용하기 위해 ET-02의 아미노 말단에 플루오레신(fluorescein)을 연결한 형광 ET-02 펩티드를 합성하였다. 에드와드 균을 4.1×106 cfu/ml부터 1.7×104 cfu/ml까지 차례로 25분의 4씩 묽혀 4개의 튜브에 100 μl씩 넣고 각 튜브에 형광 ET-02 펩티드를 최종 농도가 100 nM이 되도록 넣었다. 펩티드가 에드와드 균에 결합하도록 1시간 동안 반응시킨 후 퍼킨 엘머 사의 빅터3 (Victor3) 리더로 이 네 가지 혼합물의 형광 편광을 측정하였다. 그리고 ET-02의 에드와드 균에 대한 특이성을 확인하기 위해 대장균과 여시니아 (Yersinia enterocolitica) 균을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과 도 9에 있는 것처럼 에드와드 균의 농도에 비례하여 형광 편광이 증가하였다. 그 이유는 에드와드 균이 많을수록 에드와드 균에 결합한 형광 ET-02 펩티드가 많아지게 되고 결과적으로 형광 ET-02 펩티드들의 움직임이 느려지기 때문이다. 그러나 대장균과 여시니아 균을 이용한 실험에서는 형광 편광 값의 변화가 에드와드 균에 비해 현저하게 낮게 나타나 ET-02 펩티드을 이용하여 에드와드 균을 선택적으로 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
In order to apply the ET-02 peptide to the fluorescence polarization measurement, a fluorescent ET-02 peptide was synthesized in which fluorescein was linked to the amino terminal of ET-02. Add Edward bacteria from 4.1 × 10 6 cfu / ml to 1.7 × 10 4 cfu / ml in 4/25 dilutions and 100 μl in 4 tubes. The final concentration of the fluorescent ET-02 peptide is 100 nM in each tube. I put it as much as possible. The peptide was allowed to react for one hour to bind to the Edvar bacteria, and the fluorescence polarization of the four mixtures was measured with a Perkin Elmer Victor3 leader. In addition, the same experiment was performed using Escherichia coli and Yersinia enterocolitica to confirm the specificity of Edward bacteria of ET-02. As a result, as shown in FIG. 9, the fluorescence polarization increased in proportion to the concentration of the ward bacteria. The reason is that the more Edward bacteria, the more fluorescent ET-02 peptides bound to Edward bacteria, and consequently, slower movement of the fluorescent ET-02 peptides. However, in the experiment using Escherichia coli and Yexinia, the change in fluorescence polarization value was significantly lower than that of Edward bacterium. Thus, it was confirmed that Edward bacterium can be selectively detected using ET-02 peptide.

본 발명은 에드와드 균의 검출에 이용할 수 있다. 그 결과, 넙치 등을 비롯한 어종의 양식업에 크게 기여하는 산업적 효과를 갖는다. The present invention can be used for the detection of Edward bacteria. As a result, it has an industrial effect which greatly contributes to the aquaculture industry of fish species including flounder.

Claims (8)

에드와드 균과 결합하는 것을 특징으로 하는, TLYPLDR (ET-01) 서열 및 WVWPARL (ET-02) 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드.Peptide selected from the group consisting of TLYPLDR (ET-01) sequence and WVWPARL (ET-02) sequence, characterized in that binding to the Ed Ward bacteria. 청구항 1의 펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.A method for detecting Edward bacteria, comprising using the peptide of claim 1. 청구항 1의 펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 분리 방법.Separation method of ward bacteria, characterized by using the peptide of claim 1. 청구항 2에 있어서,
상기 펩티드에 형광물질, 방사성 물질 또는 효소를 고정시켜서 사용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.The method according to claim 2,
A method for detecting Edward bacteria, wherein the peptide is used by immobilizing a fluorescent substance, a radioactive substance or an enzyme. 청구항 4에 있어서,
상기 형광물질, 방사성 물질 또는 효소를 고정시킨 펩티드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어서 결합시키는 단계;
에드와드 균에 결합한 펩티드는 통과시키지 않고 에드와드 균에 결합하지 않은 자유로운 펩티드는 통과시키는 필터를 이용하여 상기 시료로부터 상기 자유로운 펩티드를 제거하는 단계; 및
상기 필터에 남은 펩티드에 고정된 형광물질, 방사성 물질 또는 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.The method of claim 4,
Binding the peptide to which the fluorescent material, radioactive material, or enzyme is immobilized by placing it in a sample including Ed Ward bacteria;
Removing the free peptide from the sample by using a filter that does not pass the peptide bound to the Ed bacteria and passes the free peptide not bound to the Ed bacteria; And
And a method for detecting the activity of the fluorescent substance, radioactive substance or enzyme immobilized on the peptide remaining in the filter. 청구항 4에 있어서,
상기 형광물질, 방사성 물질 또는 효소를 고정시킨 펩티드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어서 결합시키는 단계;
원심분리를 통해 에드와드 균을 침전시키는 단계; 및
상기 침전에 남은 펩티드에 고정된 형광물질, 방사성 물질 또는 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.The method of claim 4,
Binding the peptide to which the fluorescent material, radioactive material, or enzyme is immobilized by placing it in a sample including Ed Ward bacteria;
Precipitating Edward cells through centrifugation; And
The method of detecting Edward bacteria comprising the step of measuring the activity of the fluorescent material, radioactive material or enzyme immobilized on the peptide remaining in the precipitation. 청구항 2에 있어서,
형광물질을 고정시킨 상기 펩티드를 에드와드 균과 결합시킨 후에 형광 편광 (fluorescence polarization)이 일어나는 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.The method according to claim 2,
A method for detecting Edward bacteria, characterized by measuring the extent to which fluorescence polarization occurs after binding the peptide to which the fluorescent substance is immobilized with Edward bacteria. 청구항 3에 있어서,
상기 펩티드 다수를 고정시킨 자성 입자를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어 결합시키는 단계; 및
자석을 이용하여 상기 시료로부터 자성 입자를 회수하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 분리 방법.The method according to claim 3,
Binding the magnetic particles to which the plurality of peptides are immobilized by placing them in a sample including Ed Ward bacteria; And
Separation method of the Ed Ward bacteria, characterized in that the magnetic particles are recovered from the sample by using a magnet.
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