KR20120082203A - Burkholderia pyrrocinia ch-44 and microbial agent for preventing plant-pathogenic fungi containing the same - Google Patents

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이광렬
문병주
김종식
김충곤
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재단법인 경북해양바이오산업연구원
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Abstract

PURPOSE: An agent containing Burkholderia pyrrocinia CH-44 with an antibacterial function against various plant pathogenic fungi is provided to prevent Fulvia fulva, bacteria causing tomato leaf mold. CONSTITUTION: A Burkholderia pyrrocinia CH-44 strain has an antibacterial functional against plant pathogenic fungi. A biologic formulation for preventing plant pathogenic fungi contains the strain. The formulation contains 85-90g of starch per 1 L of medium in which the strain is cultured. Fulvia fulva is prevented using the strain or a formulation containing the strain as an active ingredient.

Description

식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지는 버크홀데리아 파이로시니아 ＣＨ-44 균주 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 생물 제제{Burkholderia pyrrocinia CH-44 and microbial agent for preventing plant-pathogenic fungi containing the same}Burkholderia pyrrocinia CH-44 and microbial agent for preventing plant-pathogenic fungi containing the same, which have antimicrobial activity against plant pathogenic fungi and phytopathogenic fungi containing same

본 발명은 다양한 식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지는 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 생물 제제에 대한 것으로, 특히 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)에 대하여 우수한 방제 효과를 가지는 것이다.
The present invention has an antimicrobial activity against various plant pathogenic fungi Burkholderia pyrosinia ( Burkholderia) pyrrocinia ) CH-44 strain and a biologic for controlling phytopathogenic fungi comprising the same, in particular Fulvia tomato leaf fungus fulva ) has an excellent control effect.

최근, 과다한 농약 등의 남용이 심각한 문제로 대두되고 이를 대체하는 식물 방제용 무공해 농약(biocide)의 개발이 국제적으로 경쟁이 치열한 핵심 분야로 등장하고 있다. 기존 농약에 의한 환경오염 문제를 극복하기 위하여, 생산, 저장 및 적용이 용이하고 병원균을 효과적으로 억제하는 길항 미생물을 선발하고 생물 활성 물질을 분리하는 것은 매우 시급한 과제이다. 특히 항진균 활성 물질은 포유동물에 대하여 독성이 기존 농약보다 낮고, 식물에 약해가 없으면서, 활성은 탁월하고 잔류성은 적어서 윤작에도 영향이 없으며, 지하수, 토양, 하천수 등을 오염시키지 말아야 한다.In recent years, the abuse of excessive pesticides and the like has emerged as a serious problem, and the development of biocide for plant control to replace it has emerged as a key field of international competition. In order to overcome the environmental pollution problem caused by conventional pesticides, it is very urgent to select antagonistic microorganisms that are easy to produce, store and apply and effectively inhibit pathogens and to separate biologically active substances. In particular, antifungal actives are less toxic to mammals than conventional pesticides, no harm to plants, excellent in activity and less residual, and do not affect rotation, and should not contaminate groundwater, soil and river water.

한편, 특정 미생물들은 식물병원성 곰팡이들에 대하여 길항성을 가지고 있으며, 이들이 생산하는 각종 대사산물과 세포벽 분해효소들이 병원균에 대해 길항작용을 갖는 것으로 알려져 있다.On the other hand, certain microorganisms are antagonistic against phytopathogenic fungi, and various metabolites and cell wall degrading enzymes they produce are known to have antagonism against pathogens.

현재까지 알려진 생물학적 제어(biological control)방법을 통하여 식물병원균 억제에 관여하는 미생물 대사산물은 항진균제를 포함하여 시더로포아(siderophore), NH3 효소, 파이롤나이트린(pyrrolnitrin), 알터리시딘(altericidins), 세파시딘(cepacidine), 페나진(phenazine), 세파시아마이드(cepaciamide), 하이드로겐 시아니드(hydrogen cyanide) 등을 들 수 있고, 이들은 길항적 활성을 보인다. 지금까지 보고된 진균류에 대한 생물학적 제어에 활용되는 미생물 살균제제로는 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 아그로박테리움, 버콜데리아 등의 세균과 트리코더마, 지로클라디움, 퓨사리움 등과 같은 진균으로부터 유래한 것 등이 알려져 있다.Microbial metabolites involved in the inhibition of phytopathogens through biological control methods known to date include antifungal agents such as siderophore, NH 3 enzyme, pyrrolnitrin, and allericidins. ), Cephacidine, phenazine, phenazine, cepaciamide, hydrogen cyanide, and the like, and these exhibit antagonistic activity. Microbial fungicides used for biological control of fungi reported so far are derived from bacteria such as Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Agrobacterium and Bercholeria, and fungi such as Trichoderma, Zirocladium, and Fusarium Etc. are known.

그런데, 현재 식물병원성 진균류의 방제용으로 상용되는 제품들은 아직 시장점유율이 미비한 실정이다. 또한, 미생물 자체를 이용하여 병해 방제용으로 연구된 것도 담배의 모자이크병(TMV), 세균성마름병(Bacterial wilt), 오이의 시들음병(Fusarium wilt), 고추의 역병(Phytophthora blight), 딸기의 시들음병, 눈마름병(Rhizoctonia budrot), 사탕무우의 입고병(Damping-off), 벼의 도열병, 문고병 방제 등에 국한되어 있을 뿐이다.
However, products currently commercially available for controlling phytopathogenic fungi still have insufficient market share. In addition, research on the control of diseases using microorganisms has also been carried out for tobacco mosaic disease (TMV), bacterial blight (Bacterial wilt), cucumber wilting (Fusarium wilt), pepper blight (Phytophthora blight), strawberry wilting disease, eyes It is limited to Rhizoctonia budrot, Damping-off of Beet, Rice Blast, and Paperback Disease.

상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 다양한 식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지면서도, 생균이 포함되지 않은 생화학 제형으로서 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)에 대하여 화학농약에 버금가는 우수한 방제 효과를 가지는 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) 균주 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 생물 제제를 제공하는 것이 목적이다.
The present invention for solving the above problems, while having antimicrobial activity against a variety of plant pathogenic fungi, biochemical formulations containing no live bacteria in the chemical pesticide against Fulvia fulva , tomato leaf fungus when a second only Ria Burke holde pie having an excellent controlling effect California (Burkholderia It is an object to provide a biological agent for controlling phytopathogenic fungi comprising the same ( pyrrocinia ) strain and the same.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지는 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주(수탁번호 KFCC 11497P)이다.The present invention for achieving the above object is Burkholderia pyrosinia ( Burkholderia) having antibacterial activity against plant pathogenic fungi pyrrocinia ) CH-44 strain (Accession No. KFCC 11497P).

여기서, 상기 식물 병원성 진균은 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)인 것이 바람직하다.Here, the plant pathogenic fungi are preferably Fulvia fulva , which is a tomato leaf fungus.

그리고, 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 진균 방제용 생물 제제일 수 있다. In addition, another embodiment of the present invention may be a biologic agent for controlling plant pathogenic fungi, comprising the above-mentioned Berkholderia pyrosinia CH-44 strain as an active ingredient.

여기서, 상기 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 배양된 배지 1 리터(ℓ) 당 전분(starch, 썬크리미)이 85~90g 범위 내로 포함된 것을 특징으로 하는 식물 병원성 진균 방제용 생물 제제도 가능하다.Here, starch (starch, sunscreen) per 1 liter (ℓ) of culture medium of the Berkholderia pyrocinia CH-44 strain is contained in the range of 85 ~ 90g biologic agents for controlling plant pathogenic fungi It is also possible.

또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 상기한 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주 또는 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 제제를 이용하여, 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)를 방제하는 방법일 수 있다.In addition, another embodiment of the present invention using the above-mentioned Berkholderia pyrosinia CH-44 strain or an agent comprising the strain as an active ingredient, Fulvia fulva ( Mulvia leaf fungus) It may be a method of controlling.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
Specific details of other embodiments are included in the detailed description and the drawings.

상기한 본 발명에 의하면, 부엽토와 다양한 유기질이 함유된 산림토양으로부터 분리된 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주는 다양한 식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지고 있고, 상기 균주를 포함하는 생물 제제는 생균이 포함되지 않은 생화학 제형임에도 불구하고 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)에 대하여 화학농약에 버금가는 우수한 방제 효과를 가진다.
According to the present invention described above, Burkholderia pyrocinia ( Burkholderia) isolated from the forest soil containing the foliar soil and various organic matters pyrrocinia ) CH-44 strains have antimicrobial activity against various plant pathogenic fungi, and biologics containing these strains have been found in Fulvia fulva , a tomato leaf fungus, despite being a biochemical formulation containing no live bacteria. It has an excellent control effect comparable to that of chemical pesticides.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 산림토양 샘플로부터 chitinase 활성균주를 탐색하는 과정을 설명하기 위한 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주가 다양한 식물병원성 곰팡이에 대하여 길항능력을 가지고 있음을 확인할 수 있는 테스트 결과 사진이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주에 대한 전자현미경(TEM) 사진이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주에 대한 생화학적 동정 결과를 나타내는 표이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주에 대한 16S rRNA 유전자 분석 결과를 나타내는 계통도이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주에 대한 rec A 유전자의 분석 결과를 나타내는 계통도이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주를 이용한 Biological control agent 제조 과정을 개략적으로 설명하기 위한 절차도이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 생물 제제를 위하여 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 배지와 혼합되는 수화제의 조성 및 성분비를 설명하기 위한 표이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약의 토마토 잎곰팡이병에 대한 항균 활성 실험 결과 그래프이고,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약에 대한 플라스틱 하우스내에서의 방제가 측정 결과를 나타내는 그래프이고,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약에 대한 자연발병 조건에서의 방제가 측정 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a photograph illustrating a process of searching for chitinase active strains from forest soil samples according to an embodiment of the present invention,
Figure 2 is a Burkholderia Pyrosine ( Burkholderia) according to an embodiment of the present invention pyrrocinia ) CH-44 strain is a photograph of test results confirming that it has an antagonistic ability against various phytopathogenic fungi,
Figure 3 is an electron microscope (TEM) photograph of the strain Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention,
Figure 4 is a table showing the results of biochemical identification for Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention,
Figure 5 is a schematic diagram showing the results of 16S rRNA gene analysis for the strain Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention,
Figure 6 is a rec for the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention It is a systematic diagram showing the analysis result of the A gene,
7 is a procedure for schematically illustrating a process for preparing a Biological control agent using a strain of Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention.
8 is a table for explaining the composition and composition of the hydrating agent mixed with the medium containing the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain for the biologic according to an embodiment of the present invention,
9 is a graph showing the results of the antimicrobial activity test against the tomato leaf fungal disease of the chemical pesticides as a comparative example with a biologic containing Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention,
FIG. 10 is a graph showing a measurement result of a control in a plastic house against chemical pesticides as a comparative example with a biologic including a strain of Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing a measurement result of a control agent in spontaneous onset conditions for a chemical pesticide as a comparative example and a biologic including the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 상세하게 설명하기로 한다. 하기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.
Hereinafter, one preferred embodiment of the present invention will be described in detail. While the invention has been illustrated and described with reference to certain preferred embodiments thereof, it will be understood that the invention may be variously modified and modified without departing from the spirit or scope of the invention provided by the following claims. It can be apparent to one of ordinary skill in the art.

본 발명은 부엽토와 다양한 유기질이 함유된 산림토양으로부터 분리한 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주와, 상기 균주가 생산하는 것으로서 다양한 식물 병원성 진균(특히, 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva))에 대한 억제효과가 있는 항균물질을 포함한다. The present invention is Burkholderia Pyrosine ( Burkholderia) isolated from the forest soil containing the rich soil and various organic matter pyrrocinia ) CH-44 strain and various plant pathogenic fungi produced by the strain (particularly, Fulvia , tomato leaf fungus) fulva )) contains antimicrobial agents that have inhibitory effects.

이 균주의 분리를 위하여, 먼저 키티네이즈(chitinase) 활성을 가진 균주를 선별하고자 산림토양에 crude chitin 을 섞어서 약 6개월 가량 묻어둔 뒤 시료 1g 를 채취한 후, colloidal chitin 이 0.2% 함유된 배지에서 도말하여 chitinase 활성균주를 탐색하였다.For the isolation of this strain, first of all, to screen the strains with chitinase activity, mix crude chitin in the forest soil, bury it for about 6 months, take 1 g of the sample, and then in a medium containing 0.2% of colloidal chitin. Staining was performed to search for chitinase active strains.

그리고, 이렇게 탐색된 chitinase 활성 균주의 식물병원성 곰팡이에 대한 다범위성 항진균활성을 측정해 보기 위해 PDA 배지상에서 항균활성 test 를 실시하였다. 그 결과, 상기 균주는 다양한 식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지고 있고, 특별히 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지고 있음을 확인하였다. In addition, the antimicrobial activity test was carried out on PDA medium to determine the multi-range antifungal activity against the phytopathogenic fungi of the chitinase active strains thus detected. As a result, it was confirmed that the strain has antibacterial activity against various plant pathogenic fungi, and also excellent antimicrobial activity against Fulvia fulva , a tomato leaf fungus.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 균주가 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia)에 속하는 균주임을 확인하고, 상기 균주를 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44(Burkholderia pyrrocinia CH-44)라 명명하였으며, 상기 균주를 2010년 11월 8일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KFCC 11497P 를 부여받았다.
The present inventors confirm that the strain according to the present invention belongs to the strain Burkholderia pyrrocinia ( Burkholderia pyrrocinia ), the strain Burkholderia pyrosinia CH-44 ( Burkholderia pyrrocinia CH-44), and the strain was deposited on November 8, 2010 with the Korea Microorganism Conservation Center and received accession number KFCC 11497P.

본 발명자들은 본 발명의 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주의 형태학적 동정을 위해 TEM 촬영을 하였고, 생화학적 동정을 위하여 API 20E 를 이용하였으며, 분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자 분석과 rec A 유전자의 분석을 수행한 결과, 상기 균주가 버크홀데리아 파이로시니아에 속함을 확인하였다.
We performed TEM imaging for morphological identification of the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain of the present invention, used API 20E for biochemical identification, and 16S rRNA gene analysis and rec for molecular biological identification. As a result of analysis of the gene A, it was confirmed that the strain belongs to Berkholderia pyrosinia.

한편, 본 발명자들은 상기 균주를 포함하면서 우수한 효과를 가지는 생물 제제를 제조하고자, 상기 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 배양된 배지에 5가지 종류의 다양한 성분 및 조성을 가지는 수화제를 각각 혼합해서 수화제형 제제를 제조하였다. 그 결과, 상기 수화제형 제제는 생균이 전혀 포함되지 않은(Cell free formulation) 생화학 제제임을 확인하였고, 그 중에서도 상기 CH-44 균주가 배양된 배지 1 리터(ℓ) 당 전분(starch, 썬크리미)이 85~90g 범위 내로 포함된 CH-44C 균주가 토마토 잎곰팡이병에 대해 가장 우수한 효과가 있음을 확인하였다.On the other hand, the inventors of the present invention, to prepare a biological preparation having an excellent effect while including the strain, the hydration having a variety of components and compositions of five kinds of various components and compositions in the medium cultured the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain, respectively Thus, a hydrated formulation was prepared. As a result, it was confirmed that the hydration-type formulation was a cell-free biochemical formulation. Among them, starch (sunch) per 1 liter (ℓ) of the culture medium of the CH-44 strain was It was confirmed that the CH-44C strain contained in the 85 ~ 90g range has the best effect against tomato leaf fungal disease.

그리고, 상기 5가지 종류의 수화제 중에서 토마토 잎곰팡이병에 대해 가장 효과가 우수한 CH44-C 제형을 가지고, 플라스틱 하우스내에서의 조건과 자연발병 조건에서 각각 방제가를 측정한 후, 대조구로서 일반 화학농약과 비교하여 방제 효과를 검증하였다.
And, among the five kinds of hydrating agent, the most effective CH44-C formulation against tomato leaf fungal disease, and after controlling the control value under the conditions in the plastic house and natural onset, respectively, general chemical pesticides as a control The control effect was verified in comparison with.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
The present invention may be better understood by the following examples, which are for the purpose of illustrating the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.

실시예Example 1:  One: 버크홀데리아Burkholderia 파이로시니아Pyrosineia CHCH -44(-44 ( BurkholderiaBurkholderia pyrrociniapyrrocinia CHCH -44) 균주의 분리 및 동정44) Isolation and Identification of Strains

부산에 위치한 승학산의 부엽토와 다양한 유기질이 함유된 산림토양에서 식물병원성 진균에 대한 길항효과가 우수하고 chitinase 활성을 지니는 균주를 선발하였다. 일차적 chitinase 를 생성하는 균주의 분리를 위해서, 산림토양에 crude chitin 을 섞어서 철통에 넣은 뒤 random 하게 6개월 가량 묻어두었다. 이 후 시료 1g 를 채취하여 diluent (Composition per 1 liter : NaCl, 4.25 g; KH2PO4, 0.15 g; Na2HPO4, 0.3 g; MgSO4, 0.1 g; Gelatin, 0.05 g) 에 희석한 뒤 colloidal chitin 이 0.2% 함유된 배지에서 도말하여 chitinase 활성균주를 탐색하였다. Strains with excellent chitinase activity and antagonistic effects against phytopathogenic fungi were selected from the subleaf soils of Seunghaksan and various organic soils in Busan. For the isolation of the primary chitinase-producing strains, crude chitin was mixed with forest soil and placed in a barrel and randomly buried for 6 months. After that, take 1 g of the sample and dilute in diluent (Composition per 1 liter: NaCl, 4.25 g; KH 2 PO 4 , 0.15 g; Na 2 HPO 4 , 0.3 g; MgSO 4 , 0.1 g; Gelatin, 0.05 g) Chitinase active strains were screened by smearing in a medium containing 0.2% colloidal chitin.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, chitinase 활성을 가지는 균주(CH-44)를 확인하였으며, 이를 분리하였다.
As a result, as shown in Figure 1, the strain having a chitinase activity (CH-44) was confirmed, it was isolated.

그리고, 상기 분리한 균주의 식물병원성 곰팡이에 대한 다범위성 항진균활성을 측정해 보기 위해 PDA 배지상에서 항균활성 test 를 실시하였다. 식물병원성 진균의 포자 또는 균사 디스크(가로, 세로 1㎝)를 PDA (Difco Co.) 배지에 이식한 후, 길항 세균(CH-44)을 배양한 배양액 (NB broth, 2일간 30℃ 에서 150 rpm)을 페이퍼 디스크(직경 6mm)에 묻힌 후, 식물 병원성진균이 이식된 배지위에 올려놓고 각각 25℃ 에서 3?4일 배양하여 조사하였다.In addition, the antibacterial activity test was carried out on PDA medium to determine the multirange antifungal activity against the phytopathogenic fungi of the isolated strain. Spores or mycelia of phytopathogenic fungi (horizontal, 1 cm long) were implanted in PDA (Difco Co.) medium and cultured with antagonistic bacteria (CH-44) (NB broth, 150 rpm at 30 ° C for 2 days). ) Was buried in a paper disk (6 mm in diameter), and then placed on a culture medium in which plant pathogenic fungi were transplanted, and cultured at 25 ° C. for 3 to 4 days, respectively.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주는 다양한 식물병원성 곰팡이에 대하여 길항능력을 가지고 있음을 확인할 수 있다. 도 2에서 각 식물 병원성 곰팡이는 다음과 같다.As a result, as shown in Figure 2, it can be confirmed that the Berkholderia Pyrosinia CH-44 strain according to the present invention has the ability to antagonize against various phytopathogenic fungi. In Figure 2, each plant pathogenic fungus is as follows.

Bc : 잿빛곰팡이균 (Botrytis cineria) - 토마토식물에 잿빛 곰팡이병 유발Bc: Blight fungus ( Botrytis cineria ) -causes gray mold on tomato plants

KRS : 탄저병균(Colletotrichum gloeosporiodes) - 딸기에 탄저병 유발 KRS: anthrax ( Colletotrichum gloeosporiodes ) -causing anthrax on strawberries

TF : 잎곰팡이균 (Fulvia fulva) - 토마토에 잎곰팡이병 유발TF: Leaf fungus ( Fulvia fulva ) -causes leaf fungus on tomatoes

Ss : 균핵병균 (Sclerotinia scleotiorum) - 결구상추에 균핵병 유발Ss: Sclerotinia scleotiorum ) -Induces fungal disease in cabbage lettuce

AG1 : 밑둥썩음병균 (Rhizoctonia solani AG1) - 결구상추 혹은 토마토에 모잘록병 혹은 밑둥썩음병 유발AG1: Rhizoctonia solani AG1)-Causes mozzarella or rot on cabbage lettuce or tomatoes

K4 : 역병균 (Phytopthora capsici) - 감자, 고추에 역병을 일으킴
K4: Phytothora capsici ) -causes late blight on potatoes and peppers

한편, 상기와 같이 분리된 균주를 동정하였다.On the other hand, isolated strains were identified as above.

형태학적 동정을 위해 negative staining 한 후 TEM 촬영을 하였으며, 도 3에 나타난 바와 같이, 이 균은 그람음성균이며, 극편모를 가지고 단간균의 형태를 띤다.After morphological identification, negative staining was performed, followed by TEM imaging. As shown in FIG. 3, the bacterium is Gram-negative, and has a polar flag and has a form of single bacilli.

생화학적 동정을 위해, API 20E 를 써서 분석하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 균주에 대한 결과는 Burkholderia cepacia 와 99.7% 일치하였으며, Burkholderia cepacia 와 상반되는 결과는 12번의 Mannitol assimilation 하나만 틀린것으로 조사되었다.For biochemical identification, it was analyzed using API 20E, and as shown in Figure 4, the results for the strain according to the present invention is Burkholderia 93.5 % matched with cepacia , Burkholderia Contrary to cepacia , only 12 Mannitol assimilations were wrong.

분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA 유전자를 분석하여 계통도를 그려본 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 Burkholderia cepacia 에 속하는 균주로 동정이 되었다. 이와 함께, Burkholderia cepacia 의 경우는 비병원성 균주와 병원성 균주의 분류가 절실히 요구되는 균주이며, 이러한 특성상 현재 rec A 유전자의 분석으로 genomovar 별로 나누어서 분류하고 있는 실정이다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주에 대한 rec A 유전자의 분석 결과를 나타내는 계통도이고, 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 genomovar Ⅸ 에 속하는 Burkholderia pyrrocinia 로 동정되었다(Nature Reviews Microbiology 3, 144-156 (February 2005) 참조).
As a result of analyzing the 16S rRNA gene for molecular identification, as shown in FIG. 5, the strain according to the present invention is Burkholderia. It was identified as a strain belonging to cepacia . With this, Burkholderia In the case of cepacia , the non-pathogenic and pathogenic strains are urgently required to be classified. Due to these characteristics, genomovar is currently analyzed by rec A gene analysis. The situation is divided by category. Figure 6 is a rec for the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention Schematic diagram showing the analysis results of the gene A, as shown here, the strain according to the invention is Burkholderia belonging to genomovar var Pyrrocinia was identified (see Nature Reviews Microbiology 3, 144-156 (February 2005)).

실시예Example 2:  2: 버크홀데리아Burkholderia 파이로시니아Pyrosineia CHCH -44 균주를 포함하는 생물 제제의 제조Preparation of Biologics Comprising -44 Strains

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주를 이용한 Biological control agent 제조 과정을 개략적으로 설명하기 위한 절차도이고, 여기에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따라 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주를 유효성분으로 포함하는 생물제제는 다음과 같은 과정을 거쳐서 제조한 후 방제가를 확인하였다. 7 is a procedure for schematically illustrating a process for preparing a Biological control agent using a strain of Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention, as shown herein, according to the present invention. The biologic containing the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain as an active ingredient was prepared through the following process and the control value was confirmed.

① 본 발명에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주의 분리 및 동정(실시예 1)① Isolation and Identification of Burkholderia Pyrosinia CH-44 Strains According to the Present Invention (Example 1)

② 7L Jar fermentor 에서 길항 균주(CH-44)의 효율적인 대량배양용 배지 선정 ② Selection of medium for efficient mass culture of antagonistic strain (CH-44) in 7L Jar fermentor

③ 식물에 점착력이 우수하고 전달매체의 함유율이 높은 제형 재료 선택③ Selection of formulation material with excellent adhesion to plants and high content of delivery media

④ 선택된 제형으로 생육상 및 플라스틱 하우스내 에서 방제가 조사
④ Investigate control in growing and plastic houses with selected formulation

본 발명자들은 본 발명에 따른 균주를 포함하면서 우수한 효과를 가지는 생물 제제를 제조하고자, 상기 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 배양된 배지에 5가지 종류의 다양한 성분 및 조성을 가지는 수화제를 각각 혼합해서 수화제형 제제를 제조하였다. 도 8은 본 발명에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 배지와 혼합되는 수화제의 조성 및 성분비를 나타내고 있는 표이고, 여기서 sun creamy 는 삼양 제넥스에서 구입한 modified starch 이다.The inventors of the present invention, to prepare a biological preparation having a superior effect, including the strain according to the present invention, each of the hydrating agents having five kinds of various components and compositions in the culture medium of the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain Mixture prepared a hydrated formulation. 8 is a table showing the composition and composition ratio of the hydrating agent mixed with the medium containing the Berkholderia Pyrosinia CH-44 strain according to the present invention, where sun creamy is a modified starch purchased from Samyang Genex.

구체적으로, 여러가지 종류의 수화제 제형을 제조하기 위해서 CH-44 균주를 NB broth 에 overnight 하여 키운 다음 400 ml 의 rice broth(현미유 3.0%, yeast extract 0.5%)에 접종하여 전배양 하였고, 그런 다음 4L 의 rice broth 에 접종한 후 7L Jar-fermenter 에 접종하여 72 시간 동안 키웠다(approximately 1.7 X 1010 cfu/ml). 이 후 도 8에 나타난 조성대로 전분을 혼합하여 각각의 수화제형 타입별로 dry oven 에서 60℃ 에서 2~3 일간 건조하였다. 이 후 글라인더로 갈아서 200-mesh 로 걸러주어 수화제형 제제를 완성하였다. 이 수화제형 제제를 4℃, 25℃, 30℃ 에서 1년간 보관하여 생균수를 측정 해 본 결과, 생균이 전혀 검출이 되지 않음을 확인하였다. (Cell free formulation)Specifically, CH-44 strains were grown overnight in NB broth to incubate various types of hydrous formulations, and then incubated in 400 ml of rice broth (3.0% brown rice milk, 0.5% yeast extract 0.5%), followed by 4L of After inoculation with rice broth, 7L Jar-fermenter was inoculated and grown for 72 hours (approximately 1.7 X 10 10 cfu / ml). Thereafter, starch was mixed according to the composition shown in FIG. 8 and dried for 2 to 3 days at 60 ° C. in a dry oven for each type of hydration type. Thereafter, by grinding with a grinder to filter by 200-mesh to complete the hydrated formulation. As a result of measuring the number of viable cells by storing the hydrated formulation at 4 ° C, 25 ° C and 30 ° C for one year, it was confirmed that no viable bacteria were detected at all. (Cell free formulation)


실시예Example 3:  3: 버크홀데리아Burkholderia 파이로시니아Pyrosineia CHCH -44 균주를 포함하는 생물 제제의 항균활성 검증Antimicrobial Activity of Biologicals Containing -44 Strains

먼저, 상기 실시예 2에 따라 5가지 종류의 수화제를 포함하는 각각의 수화제형 제제에 대하여, 토마토 잎곰팡이병에 대한 항균 활성을 조사하였다. 그리고, 상기 5가지 종류의 수화제 중에서 토마토 잎곰팡이병에 대해 가장 효과가 우수한 CH44-C 제형을 가지고, 플라스틱 하우스내에서의 조건과 자연발병 조건에서 각각 방제가를 측정한 후, 대조구로서 일반 화학농약과 비교하여 방제 효과를 검증하였다. First, the antibacterial activity against tomato leaf fungal disease was investigated for each of the hydration-type preparations containing five kinds of hydrating agents according to Example 2. And, among the five kinds of hydrating agent, the most effective CH44-C formulation against tomato leaf fungal disease, and after controlling the control value under the conditions in the plastic house and natural onset, respectively, general chemical pesticides as a control The control effect was verified in comparison with.

이 실증실험에서 쓰인 토마토 종자는 서건 (Sakata, Japan) 이였으며, 직경 15cm (ø =15cm) 일반적으로 7 주 정도 키워서 유묘 때 실증 실험을 실시하였다. 접종원인 F. fulva 는 25°C 에서 2주간 키워서 100 ml 의 PD broth 에 곰팡이 디스크 (ø = 1 cm) 4개씩 접종하여 25°C 에서 4일간 150 rpm 조건으로 키웠다. 상등액을 이중-가아제로 걸러서 포자 부유액을 A550 = 0.4로 맞추어서 토마토 잎에 살포하였고, 하루 지나서 CH-44 수화제를 각 처리구 별로 5ml씩 엽면살포 하였다. 대조구인 Triflumizole (a. i. 30%, WP; trifumine (Nippon Soda, Japan)) 은 3,000 배로 희석하여 사용하였다. Control 로서 tap water 를 엽면살포한 처리구를 사용하였으며, 모든 처리는 생장실(22±2°C, 90% RH)에서 처리한 후 플라스틱 하우스로 옮겨졌다. 발병도는 병원균 접종 후 5일 후에 조사하였다. 발병도는 엽면에 발생한 병의 면적에 따라 0 = no disease, 1 = 0.1-20%, 3 = 20.1-50%, 5 = 50.1- 70%, 7 = 70.1%- 100% 조사하여 발병도 공식 Disease severity (%) = ((Σ (the number of diseased leaves) X (disease severity index)) / (7 X the number of leaves rated) 에 대입하여 산출하였다. 또한 이렇게 구해진 각 처리구별 발병도로 방제가를 산출 하였고, 모든 실험은 3반복으로 진행하였다. The tomato seeds used in this demonstration were Sakata, Japan, and 15 cm (ø = 15 cm) in diameter were usually grown for 7 weeks. Cause of F. fulva Was incubated at 25 ° C. for 2 weeks and inoculated with 4 mold disks (ø = 1 cm) in 100 ml PD broth at 150 rpm for 4 days at 25 ° C. The supernatant was filtered with double-gaze and spore suspension was sprayed onto tomato leaves with A 550 = 0.4, and after one day, 5 ml of CH-44 hydrating agent was foliar sprayed for each treatment. A control, Triflumizole (ai 30%, WP; trifumine (Nippon Soda, Japan)) was used after diluting 3,000 times. As a control, tap water foliar spray treatment was used. All treatments were transferred to the plastic house after treatment in the growth chamber (22 ± 2 ° C, 90% RH). The incidence was examined 5 days after pathogen inoculation. The incidence was investigated by 0 = no disease, 1 = 0.1-20%, 3 = 20.1-50%, 5 = 50.1- 70%, 7 = 70.1% -100% depending on the area of the disease on the foliar. Calculated by substituting (%) = ((Σ (the number of diseased leaves) X (disease severity index)) / (7 X the number of leaves rated). All experiments were repeated three times.

Figure pat00001

Figure pat00001

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약의 토마토 잎곰팡이병에 대한 항균 활성 실험 결과이다. 여기에 도시된 바와 같이, CH-44 균주가 배양된 배지 1 리터(ℓ) 당 전분(starch)이 85~90g 범위 내로 포함된 CH-44C형 균주가 토마토 잎곰팡이병에 대해 가장 우수한 효과가 있음을 확인하였다.9 is an antimicrobial activity test result for tomato leaf fungal disease of chemical pesticides as a comparative example with a biological preparation containing the strain Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention. As shown here, the CH-44C type strain containing starch per 1 liter (ℓ) of culture medium in which the CH-44 strain was cultured was in the range of 85 to 90 g, which has the best effect against tomato leaf fungal disease. It was confirmed.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약에 대한 플라스틱 하우스내에서의 방제가 측정 결과를 나타내는 그래프이고, 여기서 C100은 CH-44C 제형의 100배 희석 처리구이고, C500은 CH-44C제형의 500배 희석 처리구이며, T3000은 Triflumizole의3,000배 희석 처리구이다. 여기에 나타난 바와 같이, CH44-C 은 플라스틱 하우스내에서 방제가를 측정하였을 때, 대조구인 화학농약에 비해서 유의 차 없이 활성이 좋음을 확인할 수 있다.FIG. 10 is a graph showing a measurement result of a control in a plastic house against chemical pesticides as a comparative example with a biologic including a strain of Berkholderia pyrosinia CH-44 according to an embodiment of the present invention. C100 is a 100-fold dilution of the CH-44C formulation, C500 is a 500-fold dilution of the CH-44C formulation, and T3000 is a 3,000-fold dilution of the Triflumizole. As shown here, CH44-C was found to have good activity without significant difference compared to the control chemical pesticides when the control value was measured in the plastic house.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 포함된 생물 제제와 비교예로서 화학농약에 대한 자연발병 조건에서의 방제가 측정 결과를 나타내는 그래프이고, 여기서 C100은 CH44-C 제형을 100배 희석 처리한 것이며, T3000은 Triflumizole의3,000배 희석 처리구이다. 본 실험은 2007년 11월 10일 부산시 강서구에 위치한 실제 토마토 재배농가에서 서건 종자를 가지고 실시하였다. 여기에 나타난 바와 같이, CH44-C 제형은 생균이 포함되지 않은 제형(생화학 제형)임에도 불구하고 자연발병 농가에서 화학농약에 버금가는 강한 방제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
FIG. 11 is a graph showing a measurement result of a control agent in spontaneous onset conditions for a chemical pesticide as a comparative example with a biologic containing the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to an embodiment of the present invention. C100 is a 100-fold dilution of the CH44-C formulation and T3000 is a 3,000-fold dilution of Triflumizole. This experiment was conducted on November 10, 2007 at the real tomato cultivation farm located in Gangseo-gu, Busan. As shown here, although the CH44-C formulation is a formulation containing no live bacteria (biochemical formulation), it can be seen that it exhibits a strong control effect comparable to that of chemical pesticides in spontaneously developed farms.

한국미생물보존센터(국내)Korea Microbial Conservation Center (Domestic) KFCC11497PKFCC11497P 2010110820101108

Claims (5)

식물 병원성 진균에 대해 항균 활성을 가지는 버크홀데리아 파이로시니아(Burkholderia pyrrocinia) CH-44 균주(수탁번호 KFCC 11497P).
When as a buck holde Ria pie with antibacterial activity against phytopathogenic fungi California (Burkholderia pyrrocinia ) CH-44 strain (Accession No. KFCC 11497P).
제1항에 있어서, 상기 식물 병원성 진균은 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)인 것을 특징으로 하는 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주.
According to claim 1, wherein the plant pathogenic fungi Fulvia is a tomato leaf fungus Fulva ) Berkholdereria pyrosinia CH-44 strain.
제1항 또는 제2항에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 진균 방제용 생물 제제.
Biological agent for controlling plant pathogenic fungi, comprising the strain of Berkholderia pyrosinia CH-44 according to claim 1 or 2 as an active ingredient.
제3항에 있어서, 상기 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주가 배양된 배지 1 리터(ℓ) 당 전분(starch, 썬크리미)이 85~90g 범위 내로 포함된 것을 특징으로 하는 식물 병원성 진균 방제용 생물 제제.
4. The plant pathogenic fungus of claim 3, wherein starch (suncream) per 1 liter (l) of the culture medium of the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain is contained within a range of 85 to 90 g. Biologics for control.
제1항에 따른 버크홀데리아 파이로시니아 CH-44 균주 또는 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 제제를 이용하여, 토마토 잎곰팡이균인 풀비아 풀바(Fulvia fulva)를 방제하는 방법.
Method of controlling the tomato leaf fungus Fulvia fulva using the Berkholderia pyrosinia CH-44 strain according to claim 1 or an agent containing the strain as an active ingredient.
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