KR20120081723A - Monoclonal antibody to specific monkey cd43 and a hybridoma producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 원숭이의 혈액으로부터 직접 분리한 PBMC (peripheral blood mononuclear cell) 세포를 이용하여 얻은 고친화성 단일클론 항 원숭이 CD4 항체 및 이를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다. The present invention relates to a high affinity monoclonal anti monkey CD4 antibody obtained using peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cells isolated directly from the blood of monkeys and to fusion cell lines producing the same.
원숭이류 (Non-human primates)에는 유인원 (Apes)과 원숭이 (Monkey)로 대별된다. 원숭이 중 실험용 동물로서 이용되고 있는 것은 약 30종 정도이며, 세계적으로 널리 이용되고 있는 원숭이류는 Rhesus 원숭이, Cynomolgus 원숭이 등의Macaca 원숭이와 Baboon 원숭이 및 Common marmoset 등이 있다. 그 중 수많은 연구들이 Rhesus 원숭이를 중심으로 보고되고 있다. 현재 원숭이를 이용한 AIDS, 뇌질환, 유전자치료 등의 질환연구, 이종간 장기이식 등의 인공장기개발 연구 등 영장류를 이용하는 연구의 붐이 일어나고 있는 상황이다 (생명공학 정책 연구센터,27-62009-09-01,Biozine, 2004-06-17). 하지만 이를 성공시키기 위해서는 우선 원숭이 면역체계의이해와 분석방법의 확립이 무엇보다도 중요하다. 이를 위해서는 각 면역세포의 변화 및 기능 분석을 위해 필수적인 원숭이 특이항체의 생산이 선행되어야 한다. CD43+T 세포의 검출법으로는 일반적으로 유세포 분석(FACS analysis), 면역조직염색법 (Immunohistochemistry), 면역형광법 (Immunofluoresce) 등의 방법이 시행되고 있으며, 이들은 모두 CD43 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 개발을 요구하고 있다. 하지만 Rhesus 원숭이 CD43 항원을 인식하며 현재 상용화되고 있는 항체는 모두 전무한 상태이다. 원숭이 CD43 항체와 교차반응이 있는 항사람 CD43 항체 (anti-human CD43 antibody)또한 전무한 상태이므로 원숭이 CD43항원에만 특이적으로 인식하는 항체의 개발이 절실하다.Non-human primates are roughly divided into apes and monkeys. About 30 kinds of monkeys are used as experimental animals, and monkeys widely used around the world include Macaca monkeys such as Rhesus monkey, Cynomolgus monkey, Baboon monkey and Common marmoset. Numerous studies have been reported around Rhesus monkeys. Currently, there is a boom in research using primates, such as research on AIDS, brain diseases, gene therapy using monkeys, and research on artificial organs, such as cross-organ transplantation (Biotechnology Policy Research Center, 27-62009-09-). 01, Biozine, 2004-06-17). However, in order to succeed, it is important to first understand the monkey's immune system and establish analytical methods. To this end, the production of monkey specific antibodies essential for the analysis and function of each immune cell should be preceded. As a method of detecting CD43 + T cells, methods such as FACS analysis, immunohistochemistry, and immunofluoresce are generally performed. All of them develop antibodies that specifically recognize the CD43 antigen. Is asking. However, no antibody is currently available that recognizes the Rhesus monkey CD43 antigen. Since there is no anti-human CD43 antibody that cross-reacts with the monkey CD43 antibody, there is an urgent need to develop an antibody that specifically recognizes only the monkey CD43 antigen.
본 발명자들은 상기의 문제점 및 필요성을 인식하고, 원숭이 CD43 항원에 친화력이 높은 항 원숭이 CD43 항체를 개발하고자, Rhesus 원숭이의 PBMC 세포를 직접분리하고, 이를 생쥐에 면역 (immunization)함으로서 원숭이 CD43항원을 인지하는 항체를 생산할 수 있는 융합 세포주를 선별해내고, 상기 항체가 CD43T 세포를 검출하거나 암세포 치료를 위한 면역증강제로 활용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have recognized the above problems and needs, and in order to develop an anti-monkey CD43 antibody having high affinity for monkey CD43 antigen, we recognize monkey CD43 antigen by directly isolating PBMC cells of Rhesus monkey and immunizing them with mice. The present invention was completed by screening a fusion cell line capable of producing an antibody, and discovering that the antibody can detect CD43T cells or use as an adjuvant for treating cancer cells.
따라서 본 발명의 목적은 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide anti-monkey CD43 monoclonal antibodies specific for the CD43 antigen.
본 발명의 다른 목적은 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a fusion cell line that produces anti-monkey CD43 monoclonal antibodies specific for the CD43 antigen.
본 발명의 또 다른 목적은 CD43+ T세포와 관련된 질병의 치료용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a composition for the treatment of diseases associated with CD43 + T cells.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 원숭이로부터 분리된 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides anti-monkey CD43 monoclonal antibodies specific for CD43 antigen isolated from monkeys.
상기 항체에서, 항체의 중사슬의 가변부위는 서열번호 1로 표시되고, 경사슬의 가변부위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하다.In the above antibody, the variable region of the heavy chain of the antibody is represented by SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain is preferably made of an amino acid represented by SEQ ID NO: 2.
또한 상기 단일클론항체는 수탁번호가 KCLRF-BP-00231인 융합세포주에 의하여 생산될 수 있다.In addition, the monoclonal antibody can be produced by a fusion cell line with accession number KCLRF-BP-00231.
또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 융합세포주를 제공한다. The present invention also provides a fusion cell line for producing the monoclonal antibody.
상기 융합세포주는 수탁번호가 KCLRF-BP-00231인 것이 바람직하다.Preferably, the fusion cell line has an accession number of KCLRF-BP-00231.
또한 본 발명은 상기 단일클론항체 또는 이의 변형물을 포함하는, CD43+ T세포에 의해 매개되거나, CD43+ T세포와 관련된 질환의 치료용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention may be mediated by, CD43 + T cells comprising the monoclonal antibody or its variations, there is provided a composition for the treatment of diseases which are associated with the CD43 + T cells.
상기 질병은 암 또는 바이러스 감염에 의해 발생된 질환을 포함한다.The disease includes a disease caused by cancer or viral infection.
본 발명에 따른 항 원숭이 CD43항체는 원숭이 특이 CD43 항원을 높은 친화성을 가지고 인지할 수 있으며, T 세포의 활성을 증강시킴으로써 암이나 바이러스에 의해 유발되는 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The anti-monkey CD43 antibody according to the present invention can recognize monkey-specific CD43 antigen with high affinity, and can be usefully used for the treatment of diseases caused by cancer or viruses by enhancing the activity of T cells.
도 1은 원숭이 면역세포 CD43 항원에 특이성을 갖는 단일클론 항체의 제작 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 원숭이 CD43항체의 특징을 파악하기 위해, 상업적으로 판매되고 있는 aCD43 항체(clone : YG-5, DFT-1)와 본 발명의 단일클론 항 원숭이 CD43 항체를 이용하여 immunoprecipitation(IP)법과 western blot(WB)법을 교차로 실시한 결과를 나타낸 것이다 ( 1) 본 발명항체 IP/YG5 WB 2) CEM7 lysate/본 발명항체 WB 3) YG5 IP/본 발명 항체 WB 4) DFT1 IP / 본 발명 항체 WB).
-CEM7 : human T cell, lysate 를 이용함
-YG5 IP : anti-CD43 antibody
-DFT1 : anti-CD43 antibody
도 3은 본 발명을 통해서 얻은 고 친화성 단일 클론 항 원숭이 CD43항체의 cDNA염기서열 중 친화력을 결정하는 CDRs지역에 대한 유전자 정보를 중사슬과 경사슬의 가변 부위(variable region)으로 나누어서 나타낸 것이다. 각 아미노산 서열상에서 CDR 부분은 붉은 글씨로 표시하였다. VH는 중사슬 가변부위, VL는 경사슬 가변부위를 뜻한다.
도 4는 생쥐 Igg (1ug/well), CTLA4-Ig (0.5ug/well) 및 본 발명의 항 원숭이 CD43 항체를 처리하여, T 세포의 활성 증가 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 agonistic 항체로서 CD43항체를 보여주는 그래프로서, mIgg (1ug/well), aCD43 hybridoma 배양액 30ul, 정제된 aCD43 항체(0.5ug/well)를 넣고 beta-counter를 이용하여 방사능 양을 측정한 결과이다.Figure 1 shows a schematic diagram of the manufacturing process of a monoclonal antibody having specificity for monkey immune cell CD43 antigen.
FIG. 2 shows immunoprecipitation (IP) using commercially available aCD43 antibodies (clone: YG-5, DFT-1) and monoclonal anti-monkey CD43 antibodies of the present invention to characterize monkey CD43 antibodies of the present invention. ) And the results of western blot (WB) method is shown in cross-section (1) Antibody IP / YG5 WB 2) CEM7 lysate / Antibody WB 3) YG5 IP / Antibody WB 4) DFT1 IP / present invention Antibody WB).
-CEM7: human T cell, lysate
-YG5 IP: anti-CD43 antibody
-DFT1: anti-CD43 antibody
Figure 3 shows the genetic information for the CDRs region for determining the affinity of the cDNA base sequence of the high-affinity monoclonal anti-monkey CD43 antibody obtained through the present invention divided into the variable region of the heavy chain and light chain. CDR portions on each amino acid sequence are shown in red letters. VH means heavy chain variable region, VL means light chain variable region.
Figure 4 is treated with mouse Igg (1ug / well), CTLA4-Ig (0.5ug / well) and the anti-monkey CD43 antibody of the present invention, showing the degree of increased T cell activity.
5 is a graph showing the CD43 antibody as an agonistic antibody, mIgg (1ug / well), 30ul of aCD43 hybridoma culture solution, purified aCD43 antibody (0.5ug / well) and the result of measuring the amount of radioactivity using a beta-counter .
본 발명은 원숭이로부터 분리된 CD43 항원에 특이적인 항-원숭이 CD43 단일클론항체에 관한 것이다. The present invention relates to anti-monkey CD43 monoclonal antibodies specific for the CD43 antigen isolated from monkeys.
보다 구체적으로는, 수탁번호 KCLRF-BP-00231의 융합세포주에 의해 분비되는 원숭이 CD43 항원을 특이적으로 인식하는 단일클론항체에 관한 것이다. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes the monkey CD43 antigen secreted by the fusion cell line of accession number KCLRF-BP-00231.
본 발명에서 사용되는 용어 "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위 (에피토프 (epitope))에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 (hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이 (phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다.As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to a highly specific antibody directed against a single antigenic site (epitope) as is known in the art. Typically, unlike polyclonal antibodies that include different antibodies directed against different epitopes, monoclonal antibodies are directed against a single epitope on the antigen. Monoclonal antibodies have the advantage of improving the selectivity and specificity of diagnostic and analytical assays that use antigen-antibody binding, and can also be produced by hybridoma culture or phage display methods. Has the advantage of not being contaminated by other immunoglobulins.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 필요에 의해 정제하여 사용될 수 있다. 이러한 정제 방법의 예로는 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피,크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 항체 정제 방법이 제한되는 것은 아니다.The monoclonal antibody of the present invention may be used without purification, but may be purified by necessity according to a method commonly used in the art. Examples of such purification methods include dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, size exclusion chromatography, affinity chromatography, and the like, but the antibody purification method of the present invention is not limited by the above examples.
또한 본 발명의 단일클론 항체는 항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체의 결합특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경사슬 및 2개의 전체 길이의중사슬을 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.In addition, the monoclonal antibody of the present invention recognizes a specific epitope of the antigen and has the binding properties of the antigen-antibody complex, as well as the complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as the antibody molecule. Include functional fragments.
항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등일 수 있다.A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and may be Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv, and the like.
본 발명의 일 실시예에서는 단일클론 항체를 얻기 위해서 Rheus 원숭이의 혈액으로부터 PBMC를 분리하고, 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합하여 얻어진 융합 세포주에서 단일클론 항 원숭이 CD43항체를 분리 정제할 수 있다.
In one embodiment of the present invention, in order to obtain monoclonal antibodies, PBMCs are isolated from the blood of Rheus monkeys, and the splenocytes isolated after immunoinjection into the mouse abdominal cavity are fused with rat myeloma cells. Monoclonal anti-monkey monkey CD43 antibodies can be isolated and purified.
본 발명의 단일클론항체는 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 단일클론항체일 수 있다. 본 발명 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 부위는, "상보성 결정 영역 (complementarity-determining resion, CDR)"라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 "구조 영역 (framework region, FR)"을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3으로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 한편, 본 발명의 단일클론항체는 상보성 결정 영역 (CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역 (FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 본 발명에서는 상기 단일클론항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 부위에 대한 CDRs의 염기서열을 제공한다. The monoclonal antibody of the present invention may be a monoclonal antibody comprising both a light chain variable region and a heavy chain variable region. The variable regions of the light and heavy chains of the antibodies of the invention comprise three multivariable regions called "complementarity-determining resions (CDRs)" and four "framework regions (FRs)". The CDRs mainly serve to bind to epitopes of antigens. The CDRs of each chain are typically called CDR1, CDR2, CDR3 sequentially from the N-terminus and are also identified by the chain in which the particular CDR is located. On the other hand, the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by conjugating the structural region (FR) of a known therapeutic antibody to a complementarity determining region (CDR). The present invention provides a nucleotide sequence of the CDRs for the variable region of the heavy and light chain of the monoclonal antibody.
항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위인 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region) 이 복합체의 친화력을 결정하므로 기 단일클론항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬의 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석할 수 있다. 염기서열을 분석하기 위해 융합 세포주로부터 RNA 을 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행할 수 있다.By recognizing a specific epitope of the antigen and forming the antigen-antibody complex, the heavy and heavy chain variable regions, particularly the complementarity determining region (CDR), determine the affinity of the complex, thus cloning the existing monoclonal antibody genes. Gene sequencing of variable regions of the heavy and light chains of the antibody can be analyzed. To analyze the nucleotide sequence, RNA can be extracted from the fusion cell line and subjected to RT-PCR using Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA).
상기의 "PCR" 은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 상기의 "RTPCR"은 역전사 효소 중합 연쇄반응 (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)으로, 특정 부위의 RNA을 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA) 을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA 을 제조하는 과정과 cDNA 을 이용하여 특정부위를 증폭하는 과정으로 나누어진다. cDNA을 이용한 증폭과정은 상기의 PCR의 증폭과정과 동일하다. 상기 단일클론항체의 염기서열은 항체의 중사슬 (heavy chain) 및 경사슬 (light chain)의 가변부위가 각각 서열번호 1,2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
The "PCR" is well known in the art using a target nucleic acid as a template, using a primer specific for the target nucleic acid, amplifying the target nucleic acid by repeating the process of denaturation, annealing and extension reaction it means. The "RTPCR" is a reverse transcriptase polymerase chain reaction, a technique of synthesizing a corresponding cDNA (complementary DNA) using RNA of a specific site as a template and then using the PCR amplification. The experimental procedure is divided into the process of preparing cDNA from RNA using reverse transcriptase and the process of amplifying a specific site using cDNA. The amplification process using cDNA is the same as the amplification process of the above PCR. The base sequence of the monoclonal antibody is characterized in that the variable region of the heavy chain (light chain) and light chain (light chain) of the antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,2.
본 발명의 또 다른 양태로는 상기의 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주에 관한 것이다. 본 발명에서 용어‘하이브리도마’란, 항체를 생산하는 B 림프구와 골수종 암세포를 융합하여 얻은 세포를 의미하는데, 골수종세포는 형질전환된 세포로, 배양접시에서 오랜 기간 배양할 수 있는 장점이 있어, 한 가지 항체만을 만들어 내는 골수종 하이브리도마를 분리해 내면 손쉽게 단일클론항체를 대량으로 획득하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 한 실시예로, Rheus 원숭이의 혈액으로부터 CD43T 세포를 순수 분리하고, 이를 생쥐 복강에 면역 주사한 후 분리한 비장세포를 쥐의 골수종 세포(myeloma cell)와 융합하여 단일클론 항 원숭이 CD43항체를 생산하는 융합 세포주를 얻었다. 이를 한계희석 배양법 (limit dilution culture)을 통해 CD43+T 세포에 친화력이 높은 항체를 생산하는 융합 세포주를 최종 선별하였다. Another aspect of the present invention relates to a fusion cell line producing the monoclonal antibody. In the present invention, the term 'hybridoma' refers to a cell obtained by fusing B lymphocytes that produce antibodies and myeloma cancer cells, and myeloma cells are transformed cells, which have the advantage of being cultured for a long time in a culture dish. For example, the isolation of myeloma hybridomas that produce only one antibody means that a large amount of monoclonal antibodies can be easily obtained. In one embodiment of the present invention, CD43T cells are purely isolated from the blood of Rheus monkey, and the splenocytes isolated after immuno-injection into the mouse abdominal cavity are fused with rat myeloma cells to monoclonal anti-monkey CD43 antibody. Obtained fusion cell lines were produced. This was finally screened for fusion cell lines producing antibodies with high affinity for CD43 + T cells through limit dilution culture.
상기의 특징을 가지는 단일클론항체를 분비하는 융합 세포주는 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2010년 4월 5일자로 한국 세포주 은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)에 수탁번호 제 KCLRF-BP-00231호로서 기탁하였다.
A fusion cell line secreting monoclonal antibodies having the above characteristics was issued to the Korean Cell Line Bank (KCLB) on April 5, 2010, in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Approval of Microbial Deposits in Patent Procedures. It was deposited as Accession No. KCLRF-BP-00231.
또한 본 발명은 상기의 융합 세포주에서 얻은 항 원숭이 CD43 단일클론항체의 원숭이 CD43T 세포에 대한 높은 친화력을 이용하여 CD43+T 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 원숭이 CD43항원에 높은 친화력을 보이므로, 유세포 분석, 형광면역, 면역조직 염색 등을 통해 CD43+T 세포의 분석에 탁월하고, 높은 효율로 CD43+T 세포를 분리해낼 수 있다. The present invention also relates to a method for separating CD43 + T cells using a high affinity for monkey CD43 T cells of the anti-monkey CD43 monoclonal antibody obtained in the above fusion cell line. Since the antibody of the present invention shows high affinity for monkey CD43 antigen, it is excellent for analysis of CD43 + T cells through flow cytometry, fluorescence immunoassay, immunohistostaining, etc., and can isolate CD43 + T cells with high efficiency.
상기 유세포 분석법은 수많은 세포를 플루이드 컬럼 (fluid column) 안에서 single flow로 형성하여 레이저 빔 (laser beam)을 통과하면서 각 세포의 크기, 구조 및 과립도 등을 측정하므로 다양한 세포의 특징을 분석할 수 있는 방법이다. 극히 미량의 형광 물질도 인지할 수 있어 정확도와 민감도가 높고 다양한 혼합 세포군에서 소수의 아형군을 측정 혹은 분리할 수 있다. 상기 유세포 분석법은 단클론항체를 이용한 백혈병 마커 검사 등 세포 표지자 검사, 세포의 DNA량 측정에 따른성장 주기 분석, 망상 적혈구수 측정, 호중구 기능검사, 항-혈소판 항체 검사 및 망상 혈소판수 검사, 종양 단백 검출과 기타 연구목적의 검사 등에 사용되는 것을포함한다. 기존의 항체보다 항원과의 친화력이 우수한 본 발명의 항체를 사용하면 CD43+T 세포를 보다 정확하고 효율적으로 분리해 낼 수가 있다.The flow cytometry can analyze the characteristics of various cells by forming numerous cells in a single flow in a fluid column and measuring the size, structure and granularity of each cell while passing through a laser beam. It is a way. Very small amounts of fluorescent material can be recognized, allowing for high accuracy and sensitivity, and measuring or isolating a small subset of subtypes from a variety of mixed cell populations. The flow cytometry is a cell marker test such as leukemia marker test using a monoclonal antibody, growth cycle analysis according to the amount of DNA of the cell, reticulocyte count, neutrophil function test, anti-platelet antibody test and retinal platelet count test, tumor protein detection And other research purposes. By using the antibody of the present invention with superior affinity to antigen than conventional antibodies, CD43 + T cells can be isolated more accurately and efficiently.
상기의 형광 면역법은 항체와 항원이 선택적으로 결합하는 특성을 이용하여 특정한 생물분자의 정량과 분자량의 측정 및 그 분자가 세포나 조직 내에서 존재하는 위치 등을 알아내는 방법을 말한다.
The fluorescence immunoassay refers to a method of quantifying a specific biomolecule, measuring molecular weight, and determining a location of the molecule in a cell or tissue by using a characteristic of antibody and antigen binding.
또한 본 발명은 상기 항-원숭이 CD43 단일클론항체 또는 이의 변형물을 포함하는 CD43+ T세포에 의해 매개되거나, CD43+ T세포와 관련된 질병의 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기의 항체 또는 이의 변형물은 CD43T 세포 매개 질병의 진단에 응용하는 모든 방법에 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 원숭이 CD43항원의 분석, CD43T 세포의 정량 및 정성 분석 등이 포함될 수 있다.In another aspect, the present invention the anti-monkey CD43 monoclonal antibody or or mediated by CD43 + T cells including the modifications thereof, the present invention relates to a composition for the treatment of diseases related to the CD43 + T cells. In addition, the above antibodies or modifications thereof can be used in all methods applied to the diagnosis of CD43T cell mediated diseases. More specifically, analysis of monkey CD43 antigen, quantitative and qualitative analysis of CD43T cells, and the like may be included.
상기의 변형물은 항 CD43항체를 이용하여 생체 내 CD43 +T 세포의 제거(depletion) 및 무력화(inactivation)에 응용되는 모든 변형체의 제조에 해당되는것을 포함한다. 보다 구체적으로 CD43 항체에 화학적 결합(conjugation)에 의한 변형체나, 상기 단일클론항체의 cDNA염기서열 정보를 이용하여 항체의 유전학적 변형및 그로 인해 생산된 모든 변형물을 의미한다.Such modifications include the use of anti-CD43 antibodies for the production of all variants applied to depletion and inactivation of CD43 + T cells in vivo. More specifically, it refers to a variant by chemical conjugation to the CD43 antibody, or the genetic modification of the antibody and all the variants produced by using the cDNA base sequence information of the monoclonal antibody.
상기 화학적 결합에 의한 변형체의 생산을 위한 화학적 방법 및 화학적 첨가물의 한계는 없으나, 구체적으로는 단일사슬 박테리아 톡신 (Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin), 식물 홀로톡신 (plant holotoxins: class II ribosome 불활성화 단백질인 리신 (ricin), 아브린 (abrin), 미슬토 (mistletoe), 렉틴 (lectin), moceccin) 이나 헤미톡신 (hemitoxins: class I ribosome 불활성화단백질인 gelonin, saporin, pokeweed antiviral 단백질) 과 같은 세포 독소의 부착을 통한 변형물을 포함한다. 즉, 항 원숭이 CD43 항체의 Fc부분에 독소 (toxin)인 박테리아 유래 내독소 및 외독소를 화학적 방법 및 유전학적 방법을 이용하여 결합시킨 독소 융합 항체의 생산이 포함될 수 있다.There are no limitations of chemical methods and chemical additives for the production of variants by chemical bonding, but specifically, single chain bacterial toxin (Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin), plant holotoxins (lysine class II ribosome inactivating protein) cell toxins such as ricin, abrin, mistletoe, lectin, moceccin, or hemitoxins (gelonin, saporin, pokeweed antiviral protein, class I ribosome inactivating proteins). Through variants. That is, the production of toxin fusion antibodies in which bacterial endotoxins and exotoxins, which are toxins, are bound to the Fc portion of the anti-monkey CD43 antibody by chemical and genetic methods.
상기의 유전학적 방법에 의한 변형체 생산은 cDNA 정보 및 재조합 기술을 이용하여 만들어지는 모든 형태의 단일사슬, 이중사슬 재조합 단백질을 포함한다.Variant production by the genetic method includes all forms of single-chain, double-chain recombinant protein made using cDNA information and recombinant technology.
상기 조성물에서 CD43+ T세포에 의해 매개되거나, CD43+ T세포와 관련된 질병은 암 또는 바이러스 감염에 의해 발생된 질환을 포함한다. 본 발명에서 생산된 항 원숭이 CD43 항체 또는 이의 변형물은 면역증강제로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에서 생산된 항 원숭이 CD43 항체가 다른 항체보다 많은 양의 T 세포 활성을 증가시켰음을 확인하였다. Or mediated by CD43 + T cells in the composition, the condition associated with CD43 + T cells include the diseases caused by cancer or a virus infection. The anti-monkey CD43 antibody or a variant thereof produced in the present invention can be used as an adjuvant. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the anti-monkey CD43 antibody produced in the present invention increased the amount of T cell activity more than other antibodies.
본 발명에서 사용되는 용어, "암 (cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 바람직하게 본 발명에서는 면역증강제로서 단일클론항체를 사용하면 암을 치료할 수 있다.
As used herein, the term "cancer" refers to a disease associated with cell death control, and refers to a disease caused by excessive proliferation of cells when a normal apoptotic balance is broken. These abnormally overproliferating cells sometimes invade surrounding tissues and organs to form masses and destroy or modify the normal structure of the body, which is called cancer. In general, the term "tumor" refers to a mass abnormally grown by autonomous overgrowth of body tissues, and may be classified into a benign tumor and a malignant tumor. Malignant tumors grow much faster than benign tumors, and metastasis occurs as they infiltrate surrounding tissues, thereby threatening life. Such malignant tumors are commonly referred to as 'cancer', and in the present invention, monoclonal antibodies can be used as an adjuvant to treat cancer.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. The following examples are only for illustrating the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention to those skilled in the art. Will be self-evident.
실시예Example 1: 항 원숭이 1: anti monkey CD43CD43 항체를 분비하는 융합 세포주의 제작 Construction of Fusion Cell Lines Secreting Antibodies
원숭이 CD43항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위해, 융합세포주를 도면 1로 표시되는 과정으로 제작하였다.
In order to produce an antibody that specifically binds to the monkey CD43 antigen, a fusion cell line was constructed by the process shown in FIG.
1-1. 원숭이의 혈액으로부터 1-1. From the blood of a monkey CD43CD43 +T 세포의 분리Isolation of T Cells
Rhesus Macaqu로부터 전혈을 채혈하여 PBMC (peripheral blood mononuclearPeripheral blood mononuclear by collecting whole blood from Rhesus Macaqu
cell)을 분리하였다. PBMC은 Ficoll-gradient centrifugation으로 분리했다. 분리한 세포들은 유세포 분석을 통해 검증했다.
cells) were separated. PBMCs were separated by ficoll-gradient centrifugation. The isolated cells were verified by flow cytometry.
1-2. 항원면역(1-2. Antigen immunity ( ImmunizationImmunization ))
분리된 6X10 PBMC 세포를 다음과 같은 조건으로 면역하였다.Isolated 6 × 10 PBMC cells were immunized under the following conditions.
(Immunization)Antigen immunity
(Immunization)
1-3. 융합(1-3. fusion( fusionfusion ))
융합 세포주를 생성하기 위해 면역이 유도된 생쥐에서 얻은 비장세포를 P3X63Ag8.653 mouse myeloma 세포와 융합하였다. 골수종 (myeloma) 세포는 10%의 FBS를 함유한 RPMI 배지에서 성장시켜, 세포융합 전 우태아혈청 (FBS :Fetal bovine serum) 이 들어가지 않은 RPMI 배지로 3회 세척하여 부유시키고 세포수를 확인하였다. 비장 세포는 비장을 적출한 뒤 잘게 절제 후 유리시키며 튜브에 옮겨2분 정도 정치시키고 3회 세척한 후 세포를 계수했다. 골수종 세포 (myeloma)와 비장세포를 1:5 의 비율로 혼합하고 원심분리한 후 상등액을 완전히 제거하였다. 미리 37 ℃로 데운 50% PEG-1500 1ml을 1분에 걸쳐 서서히 첨가하고, 튜브(tube)를 1분 동안 부드럽게 흔들어 주었다. 이 후 RPMI 배지를 1ml, 1ml, 3ml을 각각 1분 동안 떨어뜨리고, 14ml를 2분 동안 떨어뜨리면서 천천히 단계적으로 희석하였다. 이를 1200 rpm 으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 제거하고 융합된 세포의 펠렛(pellet)을 서서히 풀어준 뒤 1x HAT이 포함된 RPMI 배지 (20% FBS, 히포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린 (aminopterin), 티미딘 (thymidine))에 부유시키고,96 웰 배양판에 200ul 씩 분주한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양했다. 융합 후 7일째에 배지를 HT로 교환했다. 4~5일 이후 군락이 형성한 웰에서 상층액을 150~200ul 취하여 유세포 분석법으로 원숭이 PBMC에 특이하게 반응하는 융합 세포주를 선별하였다.
Splenocytes from immunized mice were fused with P3X63Ag8.653 mouse myeloma cells to generate fusion cell lines. Myeloma cells were grown in RPMI medium containing 10% FBS, washed three times with RPMI medium without fetal bovine serum (FBS) before cell fusion, and suspended and checked for cell number. . The splenocytes were removed after the spleens were removed, finely excised, transferred to a tube, left for about 2 minutes, washed three times, and counted. Myeloma cells and myeloma cells were mixed at a ratio of 1: 5, centrifuged, and the supernatant was completely removed. 1 ml of 50% PEG-1500 preheated to 37 ° C. was slowly added over 1 minute, and the tube was gently shaken for 1 minute. Thereafter, 1 ml, 1 ml, and 3 ml of RPMI medium were dropped for 1 minute, and 14 ml were dropped for 2 minutes, gradually diluting. After centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed and the pellets of the fused cells were slowly released, followed by RPMI medium containing 1x HAT (20% FBS, hypoxanthine, aminopterin ( Aminopterin) and thymidine) were suspended and dispensed in 200 ul into 96 well culture plates and incubated in a 37 ° C. 5
1-4. 항체생성 융합세포의 1-4. Of antibody-producing fusion cells 클로닝Cloning
마우스의 복강에서 분리한 복강 마크로 파지 (macrophage)를 이용한 공급자세포 배양 또는 융합세포용 배지를 제조하여, 특히 항체를 생성하는 것으로 확인된융합 세포주를 24 웰에 옮겨 배양했다. 세포 군락이 50~70% 정도로 자랐을 때 배양상층액을 취하여 원숭이 PBMC에 활성도를 보이는지 확인하고 활성도가 높은 융합세포주는 HT 배지에 희석하여 한계희석 배양법 (limit dilution culture)으로 2회또는 3회의 단일세포 배양을 실시하였다.
A feeder cell culture or a fusion cell medium using celiac macrophage isolated from the abdominal cavity of the mouse was prepared, and the fusion cell line, which was found to produce antibodies, was transferred to 24 wells and cultured. When the cell colonies grew to 50-70%, the culture supernatant was taken to confirm the activity on the monkey PBMC. The highly fused cell line was diluted in HT medium and subjected to limit dilution culture twice or three times. The culture was carried out.
1-5. 1-5. CD43CD43 항원 antigen 트랜스펙턴트Transfectant 확립 Establish
CD43 항원들에 대해선 cDNA를 CHO 세포에서 유전자 전달감염(트랜스펙션, transfection) 함으로써 특정 CD 항원이 발현되는 유전자 전달 감염체 (트랜스펙턴트, transfectant)를 확립하였다.
For CD43 antigens, cDNA was transfected in CHO cells to establish a gene transfer infectious agent (transfectant) in which a particular CD antigen was expressed.
실시예Example 2: 2: ImmunoprecipitationImmunoprecipitation 법을 통한 항 원숭이 Anti monkey through the law CD43CD43 항체를 생산하는 친화력 높은 단일 클론 융합 세포주 선별 Screening for Affinity Monoclonal Fusion Cell Lines Producing Antibodies
원숭이 CD43 특이적인 항체를 생성하는 융합세포주를 선별하기 위해서 얻어진 hybridoma를 3일 배양하여 배양액을 얻었다. CD43-발현 T세포 유래 백혈병 세포인 CEM7 세포를 NP-40 lysis buffer (50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40)에 넣어 lysate를 얻고 여기에 hybridoma로부터 얻은 항체와 protein G bead (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, Ca, USA)를 넣은후 4도에서 overnight 배양한다. 이후 14,000g, 4도에서 3초간 원심분리한 후 얻어진 Pellet을 20 ul SDS sample buffer에 넣어 단백질 전기 영동을 실시한다. 도 2에서 보여지는 결과는 아래 그림과 같다.The culture was obtained by culturing the hybridoma obtained for 3 days to select the fusion cell line producing the monkey CD43 specific antibody. CEM7 cells, CD43-expressing T cell-derived leukemia cells, were placed in NP-40 lysis buffer (50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40) to obtain lysate, and antibodies and proteins obtained from hybridomas. Add G bead (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, Ca, USA) and incubate overnight at 4 degrees. After centrifugation for 3 seconds at 14,000g, 4 degrees, the obtained pellet is put in 20 ul SDS sample buffer and subjected to protein electrophoresis. The results shown in Figure 2 are as shown below.
우선 선별한 CD43 특이적인 항체 4-29 로 western blot을 한 샘플의 단백질 밴드 크기(위 그림, 2번 레인)와 4-29 항체로 면역침전(Immunoprecipitation)한 후, 알려진 CD43 항체인 YG5로 western blot 한 단백질 밴드 크기(위 그림, 1번 레인)가 약 100 kDa 로 같음을 확인하였다. 이는 알려진 CD43 항원의 단백질 크기와 유사하다. 이와 같은 결과는 면역침전과 western blot 실험 순서를 반대로 수행한 실험인, 즉 알려진 CD43 항체인 YG5 또는 DFT-1으로 각각 면역침전(Immunoprecipitation) 한 후, 4-29 항체로 western blot 한 샘플에서도 역시 같은 크기의 단백질을 확인 (위 그림, 3번, 4번 레인)함으로써, 4-29가 CD43에 대한 항체임을 확인하였다.
First, the protein band size of the sample obtained by Western blot with the selected CD43-specific antibody 4-29 (figure 2, lane 2) and immunoprecipitation with 4-29 antibody, and then Western blot with the known CD43 antibody YG5 One protein band size (Fig. 1, lane 1) was found to be about 100 kDa. This is similar to the protein size of the known CD43 antigen. This result was also the same in the samples performed by western blot with 4-29 antibody after immunoprecipitation with the known CD43 antibody YG5 or DFT-1, which was performed in the reverse order of immunoprecipitation and western blot. By identifying proteins of size (Fig. 3,
실시예Example 3: 친화력이 높은 항체의 3: of high affinity antibodies CDRsCDRs 에 대한 For cDNAcDNA 염기서열 분석 Sequencing
항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요부위는 중사슬과 경사슬의 가변 부위, 특히 CDR (complementarity determining region)이 복합체의 친화력을 결정하므로 상기 실시예를 통해 얻어진 항체 유전자를 클로닝하여 항체 중사슬과 경사슬에 대한 가변부위에 대한 유전자 염기서열을 분석하였다. 융합세포주로부터 RNA를 추출하여 Mouse Ig-Primer set (Novagen,CA, USA)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자를 셔틀 벡터 (shuttlevector)에 클로닝 하여 해당 유전자의 염기서열을 분석하였다. 중사슬의 가변 영역인 VH (variable region of heavy chain) 및 경사슬의 가변 영역인 VL (variableregion of light chain) 유전자 염기서열은 아미노산으로 치환하여 서열화하였다 (도 3 참고).
The main region of the antibody that recognizes a specific epitope of the antigen to form an antigen-antibody complex, the variable region of the heavy chain and light chain, especially the CDR (complementarity determining region) determines the affinity of the complex, the antibody gene obtained through the above example Was cloned to analyze gene sequences for variable regions of the heavy and light chains of the antibody. RNA was extracted from the fusion cell line and RT-PCR was performed using Mouse Ig-Primer set (Novagen, CA, USA). The amplified gene was cloned into a shuttle vector to analyze the nucleotide sequence of the gene. The variable region of heavy chain (VH) of the heavy chain and the variable region of light chain (VL) gene of the light chain variable region were sequenced by substitution with amino acids (see FIG. 3).
실시예Example 4: 4: CD43CD43 항체의 T 세포 활성 증가 유도확인 Induced increase of T cell activity of antibody
2마리의 원숭이로부터 Monkey PBMC를 분리하고 96 well plate에 각각 3X105양의 세포를 넣어 배양하여 Mixed lymphocyte reaction(MLR)을 실시하였다. 이때 생쥐 Igg(1ug/well)를 음성대조군으로 CTLA4-Ig (0.5ug/well)를 양성대조군으로 넣어 배양하고, 실험군으로 항 CD43 항체를 0.5ug/well, 1ug/well 의 농도로 넣어 24시간, 48 시간, 72시간 배양하였다. 각각의 배양시간에 맞추어 배양한 후 thymidine 을 well 에 넣어주어 18시간을 더 배양하고 beta-counter를 이용하여 방사능양을 측정하였다. 도 4의 결과에서처럼 Mixed lymphocyte reaction으로 인해 PBMC의 증식이 이루어졌고, 특히 anti-CD43 항체를 넣은 Mixed lymphocyte reaction에서는 세포의 증식이 48시간의 경우 3.37배 이상 증가하였다. 반대로 음성대조군으로 CTLA4-Ig를 넣은 Mixed lymphocyte reaction 에서는 세포 증식이 오히려 약 8배 정도의 감소하였다. 이를 통해 항원숭이 CD43 항체는 면역세포의 활성을 3.37배 이상 증강시킬 수 있다는점을 알수 있다. 축약어 설명) R+S :원숭이 두 마리에서 얻은 PBMC를 각각 3X10^5씩 96 well plate의 한 well 에 넣은 Mixed lymphocyte reaction임. 이때 다른 항체는 넣지 않음. mIgg: R+S 에 isotype Igg를 넣은 대조군; CTLA4-Ig: R+S 에 CTLA4-Ig를 넣은 대조군; aCD43(0.5ug/well): R+S 에 antiCD43 항체를 0.5ug/well의 농도로 넣은 샘플; aCD43(1ug/well): R+S 에 antiCD43 항체를 1ug/well의 농도로 넣은 샘플.
Monkey PBMC was isolated from two monkeys and cultured by mixing 3 × 10 5 cells in 96 well plates and performing Mixed lymphocyte reaction (MLR). At this time, the mouse Igg (1ug / well) as a negative control group CTLA4-Ig (0.5ug / well) to the positive control group and incubated, and the anti-CD43 antibody 0.5ug / well, 1ug / well concentration for 24 hours, Incubated for 48 hours and 72 hours. After culturing at each incubation time, thymidine was added to the wells for 18 hours, and then radioactivity was measured using a beta-counter. As shown in the results of FIG. 4, PBMC proliferation was performed due to the mixed lymphocyte reaction, and especially in the mixed lymphocyte reaction containing the anti-CD43 antibody, cell proliferation was increased by 3.37 times at 48 hours. In contrast, in the mixed lymphocyte reaction with CTLA4-Ig as a negative control, cell proliferation was decreased by about 8 times. This suggests that the antigenic CD43 antibody can enhance the activity of immune cells by 3.37 times or more. R + S: Mixed lymphocyte reaction in which PBMCs obtained from two monkeys are placed in one well of a 96 well plate, each 3X10 ^ 5. Do not add any other antibody. mIgg: control group containing isotype Igg in R + S; CTLA4-Ig: control group containing CTLA4-Ig in R + S; aCD43 (0.5 ug / well): A sample containing 0.5 ug / well of antiCD43 antibody in R + S; aCD43 (1ug / well): A sample containing 1ug / well of antiCD43 antibody in R + S.
실시예Example 5: 5: agionisticagionistic CD43CD43 항체의 확인 Identification of Antibodies
CD43 항체가 agonistic 항체임을 확인하기위해 원숭이의 PBMC (3 X 105/well)를 넣고 anti-CD3 항체 (0.25ug/ml), anti-CD28 항체 (0.25 ug/ml)를 첨가하여 48 시간, 72 시간 배양하였다. 이때 음성대조군으로 mIgg (1ug/well), 실험군으로 aCD43 hybridoma 배양액 30ul, 정제된 aCD43 항체(0.5ug/well)를 넣고 배양하였다. 각각의 배양시간 후 thymidine을 넣고 18 시간을 배양한 후 beta-counter를 이용하여 방사능양을 측정였다. 그 결과 antiCD43 항체를 넣은 그룹에서는 넣지 않은 그룹 (PBMC, mIgg)에 비해 2배이상 증식이 증가하였다. 이를 통해 antiCD43 항체는 agonistic 형태로 T 세포의 증식을 활성화 시킴을 알수 있다. 축약어 설명) PBMC :원숭이 한 마리에서 얻은 PBMC를 각각 3X10^5씩 96 well plate의 한 well 에 넣고 antiCD3, antiCD28 항체로 T 세포 증식을 유도함. 이때 다른 항체는 넣지 않음. mIgg: 위의 PBMC 그룹에 isotype Igg를 넣은 대조군; aCD43 soup: antiCD43 항체를 분비하는 hybridoma 로부터 배양상등액을 얻은후 이 배양액 50ul를 PBMC 그룹에 첨가한 그룹; aCD43(0.5ug/well): PBMC 그룹에 antiCD43 항체를 0.5ug/well의 농도로 넣은 샘플.To confirm that the CD43 antibody is an agonistic antibody, add monkey PBMC (3 X 10 5 / well) and add anti-CD3 antibody (0.25 ug / ml) and anti-CD28 antibody (0.25 ug / ml) for 48 hours. Time incubation. At this time, mIgg (1ug / well) as a negative control group, 30ul of aCD43 hybridoma culture solution as a test group, and purified aCD43 antibody (0.5ug / well) were added thereto. After each incubation time, thymidine was added and cultured for 18 hours, and then radioactivity was measured using a beta-counter. As a result, in the group with the antiCD43 antibody, the proliferation was more than doubled compared to the group without the group (PBMC, mIgg). This suggests that antiCD43 antibody activates T cell proliferation in agonistic form. Abbreviation) PBMC: PBMCs from a single monkey are placed in a well of a 96 well plate, each 3X10 ^ 5, inducing T cell proliferation with antiCD3 and antiCD28 antibodies. Do not add any other antibody. mIgg: control group containing isotype Igg in the PBMC group above; aCD43 soup: a group obtained by obtaining a culture supernatant from a hybridoma secreting antiCD43 antibody and then adding 50ul of the culture solution to the PBMC group; aCD43 (0.5ug / well): A sample containing 0.5ug / well of antiCD43 antibody in the PBMC group.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Monoclonal antibody to specific monkey CD43 and a hybridoma producing the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Leu Asp Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly Val Leu Cys Glu Val Lys 1 5 10 15 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr Thr Met Ser 35 40 45 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Leu 50 55 60 His Lys Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Gly Thr Val Lys Gly Arg 65 70 75 80 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met 85 90 95 Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu 100 105 110 Tyr Tyr Ser Pro Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser 1 5 10 15 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys 115 120 <110> SNU R & DB FOUNDATION <120> Monoclonal antibody to specific monkey CD43 and a hybridoma producing the same <160> 2 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 130 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Leu Asp Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly Val Leu Cys Glu Val Lys 1 5 10 15 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr Thr Met Ser 35 40 45 Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Leu 50 55 60 His Lys Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Gly Thr Val Lys Gly Arg 65 70 75 80 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met 85 90 95 Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu 100 105 110 Tyr Tyr Ser Pro Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser 1 5 10 15 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala 100 105 110 Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys 115 120
Claims (7)
Anti-monkey CD43 monoclonal antibody specific for CD43 antigen isolated from monkey.
The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the antibody comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is produced by a fusion cell line having an accession number of KCLRF-BP-00231.
A fusion cell line producing the monoclonal antibody of claim 1.
The fusion cell line according to claim 4, wherein the fusion cell line has an accession number of KCLRF-BP-00231.
Any one of claims 1 to 3 wherein the antibody of any one of or a modification to, or mediated by CD43 + T cells including, composition for the treatment of diseases related to the CD43 + T cells.
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