KR20120081708A - 생체물질 고정 다층구조막 및 이것의 제조방법 - Google Patents

생체물질 고정 다층구조막 및 이것의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기판 위에 생체물질을 고정하기 위한 다층구조막 및 이것의 제조방법에 대한 것으로, 특히 기판 위에, 스트렙타비딘으로 이루어진 적어도 하나 이상의 스트렙타비딘층과 생체물질-바이오틴 중합체로 이루어진 적어도 2개 이상의 생체물질-바이오틴층이 교대로 적층된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 본 발명에 의하면, 제한된 표면 위에 많은 양의 생체물질을 간단하게 고정화시킬 수 있고, 사용자의 의도에 따라 상기 스트렙타비딘층과 생체물질-바이오틴층의 수를 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역센서의 증감도를 현저히 증감시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

생체물질 고정 다층구조막 및 이것의 제조방법{MULTILAYER STRUCTURE FILM IMMOBILIZED WITH BIOMATERAILS AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 기판 위에 생체물질을 고정하기 위한 다층구조막 및 이것의 제조방법에 대한 것으로, 특히 스트렙타비딘(streptavidin)과 바이오틴(biotin)의 결합을 이용하여 제한된 표면 위에 가급적 많은 양의 생체물질을 고정시킬 수 있는 단백질 센서(바이오 센서)용 다층구조막에 대한 것이다.
단백질 센서는 생체물질이 갖는 매우 우수한 분자인식능력을 이용하여 화학물질 혹은 생체물질의 농도를 측정하는 센서로써 이를 이용하여 각종 효소기질, 항원 등의 유무 판단 및 농도를 정량 분석할 수 있게 하는 장치이다. 이러한 단백질 센서를 제작하기 위해서는 효소나 항체 등 식별물질의 고정화가 필수적이다. 이러한 이유로 단백질 칩을 제작하기 위한 단백질의 고정화 방법에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다.
종래에 이루어진 연구 중 슬라이드 글라스 위에 단백질을 어레이하는 기술로써 단백질의 아민기와 반응하여 결합을 할 수 있는 교차결합제를 가지고 슬라이드 글라스를 처리한 후, DNA 어레이를 제작할 때 사용된 마이크로어레이어(microarrayer)나 마이크로스캐너를 사용하여 DNA칩을 제작할 때와 같은 방식으로 제작을 한다. 이때 단백질의 안정성을 유지시키기 위하여 고정화시키고자 하는 단백질은 40% 글리세롤(glycerol) 용액에 처리하는 방법이다.
이는 단백질 어레이 기판을 슬라이드 글라스를 사용하여 경제적이고, 공유결합에 의한 단백질의 결합력이 강하다는 장점은 있으나, 각각의 단백질 패턴을 어레이어(arrayer) 팁(tip)으로 고정화해야 한다는 번거로움과 고정화된 단백질의 3차원 구조의 안정성을 고려하지 않아 단백질의 민감도가 떨어질 수 있다는 점, 그리고 단백질 용액이 표면에 고정화 될 때 확산 현상이 발생하기 때문에 정확한 사이즈와 모양을 구현할 수 없다는 단점이 있다.
한편, 최근에는 제한된 2차원의 평면 위에 많은 양의 항체를 고정화하기 위하여, 자기조립 단분자막(Self Assembled Monolayer : SAM)이라는 방식이 대표적으로 사용되어 왔다. SAM은 고체표면에 자발적으로 형성되는 유기 단분자막을 말하는 것으로, SAM을 형성하는 구성분자가 고체 표면에 흡착됨과 동시에 분자들끼리의 상호작용에 따른 초분자 조립체를 형성하는 바, 말단에 여러 종류의 작용기를 도입시켜서 생체물질을 고정화하는 방법이다.
그러나, 이러한 방법은 SAM 의 최종 말단 층만이 유일하게 항체를 함유하기 때문에, 항체는 단일층으로서 고정화되게 되고, 고정화되는 항체의 양은 상대적으로 적은 단점을 지닌다. 그리고, SAM의 경우 표면과 고정화하고자 하는 항체간의 반응이 여러 조합의 화학적인 공유결합에 기인하기 때문에, 사용되는 화학적 연결자(Chemical linker)의 제어가 매우 중요하며, 또한 미 반응 화학적 연결자를 퀸칭(Quenching)해주는 과정이 복잡하게 들어가는 등 많은 절차상의 복잡함을 가진다.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 제한된 표면 위에 가급적 많은 양의 생체물질을 고정시킬 수 있고, 사용자의 의도에 따라 생체물질의 양을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역센서의 증감도를 현저히 증감시키고자 하는 것이 목적이다.
본 발명의 일 측면에 따른 생체물질 고정 다층구조막은, 기판 위에, 스트렙타비딘으로 이루어진 적어도 하나 이상의 스트렙타비딘층과 생체물질-바이오틴 중합체로 이루어진 적어도 2개 이상의 생체물질-바이오틴층이 교대로 적층된 구조를 가지는 것이 특징이다.
이러한 본 발명은 기판 위에 생체물질을 고정하기 위한 다층구조막에 대한 것으로, 상기 기판은 본 발명의 사용 목적에 따라 도체 또는 부도체 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 금, 은, 구리, 알루미늄, 유리, 세라믹, 실리콘, Si/SiO2 웨이퍼, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드로 이루어된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 기판의 형태는 생체물질이 고정될 수 있는 어떠한 형태라도 가능하지만, 플레이트 형태인 것이 가장 바람직하다.
본 명세서에서, 용어 "생체물질"은 단백질, 핵산, 다당류 등의 생체를 구성하는 생체고분자물질에서부터 효소나 수용체 등의 단백질이나 핵산 등의 생명활동에 관여하는 물질을 포함한다. 예를 들어, DNA와 같은 핵산, 단백질, 효소, 압타머, 세포, 항원, 항체 등과 같은 생체분자들을 포함하고, 바람직하게는 항체 또는 DNA일 수 있다. 나아가, 환경호르몬 등을 포함하는 환경 오염 물질, 및 바이러스, 식중독 균 등과 같은 질병 인자나 병원 독성 물질도 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "생체물질-바이오틴 중합체"는 상기한 생체물질과 바이오틴이 결합된 것을 뜻하며, 결합시키는 방법은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 널리 알려진 다양한 방법을 사용할 수 있다. 구조 역시 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 항체에 바이오틴이 연결된 형태를 가지는 것이 적합하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 기판 위에 형성된 제1스트렙타비딘층; 상기 제1스트렙타비딘층 위에 적층된 제1생체물질-바이오틴층; 상기 제1생체물질-바이오틴층 위에 적층된 제2스트렙타비딘층; 및 상기 제2스트렙타비딘층 위에 적층된 제2생체물질-바이오틴층;을 포함하는 것이 가능하다.
상기 기판 위에 제1스트렙타비딘층이 형성되었다는 것은 기판 위에 구비되거나 고정화된 것이 바람직하다.
또한, 상기 스트렙타비딘층 또는 생체물질-바이오틴층 위에 생체물질-바이오틴층 또는 스트렙타비딘층이 적층되었다는 것은, 각 층의 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체가 전체적으로 서로 교대로 구비되거나 위치한다는 것으로, 각 층의 일부 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체는 층간 영역을 다소 벗어날 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생체물질은 항체인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 분석물은 면역학적 반응, 즉 항원항체 반응에 의해 제 1항체 및 제 2항체와 결합하고 샌드위치형 면역 복합체를 형성할 수 있는 것이면 특히 제한되지 아니한다. 본 발명에 있어서 항원 및 항체는 항원-항체반응에 의해 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 아니하며, 분석물이 항체인 경우에는 이와 특이적으로 결합하는 물질을 항원으로 할 수 있다. 상기 항원 및 항체는 분석물에 따라 공지의 항원 및 항체를 채용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스트렙타비딘층의 스트렙타비딘과 상기 생체물질-바이오틴층의 바이오틴은 서로 결합되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명은 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합을 이용하는 것이 가능하고, 스트렙타비딘과 바이오틴 반응은 매우 강한 결합력을 가지고 있는 생체반응으로서, 면역 바이오센서에 사용되는 항원, 항체 반응보다 결합력이 약 100,000배 정도 강하다고 알려져 있어, 항체를 고정화시키기 위한 단백질 층 구조를 형성하기에 매우 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 스트렙타비딘층 또는 생체물질-바이오틴층에서 스트렙타비딘 또는 생체물질-바이오틴 중합체는 비드(bead) 입자에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 고정 다층구조막.
상기 비드 입자는 임의의 모양을 갖는 것으로, 구형인 것이 가장 바람직하며, 예를 들어, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 금속 비드, 유리 비드 및 자성 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 비드 입자는 상기 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체가 결합할 수 있을만한 충분한 크기를 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 nm 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법은, 기판을 준비한 다음, 여기에 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체를 교대로 적층하는 과정을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 기판 위에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제1스트렙타비딘층을 형성하는 단계; 상기 제1스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제1생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계; 상기 제1생체물질-바이틴층에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제2스트렙타비딘층을 형성하는 단계; 및 상기 제2스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제2생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;를 포함하는 것이 가능하다.
여기서, 반응하지 않은 스트렙타비딘 또는 생체물질-바이오틴 중합체를 제거하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 에탄올과 증류수 등으로 세척한 후 건조하는 것이 가능하다.
상기한 본 발명에 의하면, 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합을 이용하여 제한된 표면 위에 가급적 많은 양의 생체물질을 고정시킬 수 있고, 사용자의 의도에 따라 스트렙타비딘층과 생체물질-바이오틴층의 수를 조절하여 생체물질의 양을 조절할 수 있으며, 이에 따라 면역센서의 증감도를 현저히 증감시킬 수 있는 효과가 있다.
이러한 본 발명에 따른 다층구조막은 면역분석 원리를 채용한 미세유체흐름 디바이스에 광범위하게 적용될 수 있으며, 항체의 고정량을 비약적으로 늘려 면역센서의 성능을 향상시키는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 구조를 나타내는 모식도이고,
도 2 및 도 3은 본 발명의 다른 구체예에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법을 설명하기 위한 흐름도이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 B형간염바이러스항원(HBsAg)이 고정된 다층구조막를 이용하여 전기화학적 신호를 실험한 결과 그래프이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 B형간염바이러스항원(HBsAg)이 없는 다층구조막를 이용하여 전기화학적 신호를 실험한 결과 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 구조를 나타내는 모식도이다.
본 발명의 일 측면에 따른 생체물질 고정 다층구조막은, 기판 위에, 스트렙타비딘(20)으로 이루어진 적어도 하나 이상의 스트렙타비딘층(100)과 생체물질-바이오틴 중합체(10)로 이루어진 적어도 2개 이상의 생체물질-바이오틴층(200)이 교대로 적층된 구조를 가지는 것이 특징이다.
상기 스트렙타비딘층(100)은 스트렙타비딘이 포함된 용액을 반응시켜서 형성할 수 있고, 이러한 스트렙타비딘층(100)은 기판 위에 형성되거나 생체물질-바이오틴층(200) 위에 형성되는 것이 가능하다. 기판 위에 스트렙타비딘(20) 용액을 코팅하는 경우 물리적인 흡착반응에 의해 결합을 형성할 수 있고, 생체물질-바이오틴 중합체(10)에 반응시키는 경우 상기 스트렙타비딘(20)과 바이오틴(12)에 의한 결합이 이루어질 수 있다.
이러한 과정을 통해 부착된 스트렙타비딘(20)은 그 고유의 성질로 인하여, 바이오틴(12) 결합부위를 늘 표면에 노출한다. 스트렙타비딘(20)의 바이오틴(12) 결합부위가 4개로 알려져 있으므로, 어떠한 형태로 고정이 되어도 늘 1개 이상의 결합부위를 노출하는 것이다. 여기에, 생체물질-바이오틴 중합체(10)를 반응시키면, 생체물질(11) 1 분자당 최소 4개 이상의 바이오틴(12)이 연결되게 된다. 상기 생체물질-바이오틴 중합체(10)는 표면에 고정화된 스트렙타비딘(20)과 결합을 형성하게 되고, 생체물질(11)에 남아있는 바이오틴(12)은 그 후에 적층될 스트렙타비딘(20)과 반응을 하는데 쓰이게 되는 것이다.
이와 같이, 스트렙타비딘(20)을 반응시키고, 그 후 생체물질-바이오틴 중합체(10)을 반응시키는 일련의 반복과정을 통해서 다층구조를 원하는 데로 형성시킬 수 있고, 고정시키고자 하는 생체물질(11)의 양에 따라서 층수를 조절함으로서 고정되는 생체물질(11)의 양을 제어할 수 있다.
본 발명의 다른 특징은, 기판 위에 형성된 제1스트렙타비딘층(110); 상기 제1스트렙타비딘층(110) 위에 적층된 제1생체물질-바이오틴층(210); 상기 제1생체물질-바이오틴층(210) 위에 적층된 제2스트렙타비딘층(120); 및 상기 제2스트렙타비딘층(120) 위에 적층된 제2생체물질-바이오틴층(220);을 포함하는 것이 가능하다.
기판 위에 스트렙타비딘층(100)이 먼저 형성되는 것도 가능하고, 생체물질-바이오틴층(200)이 먼저 형성되는 것도 가능하지만, 검출대상과의 반응을 위하여 다층구조막의 최외각 표면에는 생체물질-바이오틴 중합체(10)가 외부로 드러나는 것이 바람직하므로, 기판 위에 스트렙타비딘층(100)이 먼저 형성되는 것이 바람직하다.
또한, 후술하는 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4층 이상 무한정의 적층구조의 경우 노이즈 신호가 발생하는 문제점이 있고, 이에 따르면 2층 또는 구조이 다층막이 바람직하며, 그 중에서도 2층 구조의 다층막 구조가 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 특징은, 상기 스트렙타비딘층(100) 또는 생체물질-바이오틴층(200)에서 스트렙타비딘(20) 또는 생체물질-바이오틴 중합체(10)는 비드(bead) 입자에 고정되어 있는 것이 가능하다.
스트렙타비딘(20)과 생체물질-바이오틴 중합체(10)를 단백질 단위로 사용하지 않고, 일정크기의 비드(bead)에 결합시킨 형태로 사용함으로서, 고정화되는 생체물질(11)의 양을 한층 더 극대화 시키는 것이 가능하다. 스트렙타비딘(20)과 생체물질-바이오틴 중합체(10)를 각각 부착함에 있어서, 비드를 이용하면 상기 비드에 더 많은 스트렙타비딘(20)을 결합시킬 수 있기 때문에, 스트렙타비딘(20) 대신에 비드-스트렙타비딘 복합체를 부착시켜서 더 많은 더욱 밀집된 구조의 3D 적층 구조 생성이 가능하다.
상기 비드 입자는 임의의 모양을 갖는 것으로, 구형인 것이 가장 바람직하며, 예를 들어, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 금속 비드, 유리 비드 및 자성 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 비드 입자는 상기 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체가 결합할 수 있을만한 충분한 크기를 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 10 nm 내지 10 ㎛의 직경을 갖는 것일 수 있다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 다른 구체예에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
본 발명의 다른 측면에 따른 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법은, 기판을 준비한 다음, 여기에 스트렙타비딘과 생체물질-바이오틴 중합체를 교대로 적층하는 과정을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 먼저, 기판 위에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제1스트렙타비딘층을 형성하는 단계(S10)를 거친다. 즉, 고정화 하고자 하는 표면(금전극, 플라스틱 표면 등)을 준비하고, 여기에 스트렙타비딘 용액을 반응시켜서 고정화를 유도하며, 미반응된 스트렙을 세척하여 제거한다.
그런 다음, 상기 제1스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제1생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계(S20)를 거친다. 즉, 항체-바이오틴 중합체를 반응시켜 스트렙타비딘과 반응을 유도하고, 미반응된 항체-바이오틴 중합체를 세척하여 제거한다. 이에 따르면, 1층 구조의 항체 고정막 형성이 완료된다.
이어서, 상기 제1생체물질-바이틴층에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제2스트렙타비딘층을 형성하는 단계(S30)를 거친다. 즉, 상기와 같이 완료된 1층 고정층에 다시 스트렙타비딘 용액을 반응시켜서 표면에 고정된 항체-바이오틴 중합체와의 반응을 유도한 다음, 미반응된 스트렙타비딘을 세척하여 제거하는 것이다.
계속해서, 상기 제2스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제2생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계(S40)를 거친다. 즉, 다시 항체-바이오틴 중합체를 반응시켜서 스트렙타비딘과의 반응을 유도하고, 비반응된 항체-바이오틴 중합체를 세척하여 제거한다. 그러면, 2층 구조의 항체 고정막 형성이 완료된다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 기판 위에 먼저 제1생체물질-바이오틴층을 형성하고, 여기에 제1스트렙타비딘층을 적층한 다음, 이어서 제2생체물질-바이오틴층을 적층시키는 것도 가능하다.
즉, 본 발명은 기판 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제1생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계; 상기 제1생체물질-바이오틴층에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제1스트렙타비딘층을 형성하는 단계; 및 상기 제1스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제2생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;를 포함하는 것일 수도 있다.
본 발명의 다층 구조막 고정화 방식기술은 항체 고정화 이외에도 다른 분석물질에도 광범위하게 적용이 될 수 있다.
다른 대표적인 적용사례가 DNA이며, DNA의 접합(Hybridization) 특성을 사용하여 목표로 하는 특정 DNA를 효과적으로 탐지하는 것도 가능하다. 고정화는 항체의 경우와 동일하며, 추가적으로 항체 대신 DNA probe를 사용할 수 있으며, 스트렙타비딘과의 결합을 위해서 다량의 바이오틴을 연결시키는 구조가 바람직하다.
DNA probe의 합성 공정에서 재료로서 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신등의 염기가 사용되게 되는데, 이러한 염기에 미리 바이오틴 결합이 된 것을 사용하게 된다면, 중합효소의 작용결과로 생성되는 DNA probe에 효과적으로 바이오틴을 표지할 수 있게 된다. 그리고, 이렇게 생성된 DNA probe-바이오틴 중합체를 스트렙타비딘과 함께 본 발명의 다층구조막을 형성하면, 보다 효율적으로 DNA를 다층으로 고정시키는 효과를 얻을 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 스트렙타비딘-바이오틴 반응의 결합원리를 적용하면, 항체 이외에도 효소, 핵산, 압타머, 세포등의 생체물질의 고정화에도 광범위하게 적용이 확대될 수 있다.
본 발명은 고정화 기법에 대한 것으로서, 모든 고체모상 고정화 방식을 채택하는 바이오센서에 폭 넓게 적용될 수 있다. 신호발생원에 따라 바이오센서는 비색(Colorimetric), 화학발광(Chemiluminometric), 전기발광(Electrochemiluminometric), 형광(Fluorometric), 전기화학(Electrochemical) 등 다양하게 분류되는데, 본 발명은 그 어떠한 신호발생원을 사용하는 바이오센서 시스템에도 적용이 가능하다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 B 형간염바이러스항원(HBsAg)측정용 전기화학센서
인간 B형간염바이러스항원(HBsAg)을 전기화학적 방식으로 측정하는데 있어서, 본 발명이 효과적으로 사용될 수 있다.
먼저, 하기와 같이 금전극 표면에 인간 B형간염바이러스항원에 대한 항체를 본 발명에 따라 고정화하여 포획항체(Capture antibody)로 사용하고, 또 다른 인간 B형간염바이러스항원에 대한 항체에 전기화학적 신호발생을 위한 효소인 alkaline phosphatase를 중합시켜서 탐지항체-효소중합체를 제조한 후, 샌드위치 면역분석을 수행하였다.
이렇게 구축된 면역센서는 일반적으로 포획항체의 사용량에 따라 센서성능도 변하는 특성을 갖는다. 이에 따라, 본 발명에서 사용된 다층구조막을 몇 겹으로 형성할 것이냐에 따라서 센서성능은 변하게 된다.
a. 대조군 : 포획항체를 금전극 표면에 물리흡착으로 고정한 후에, 탐지항체-alkaline phosphatase를 표준물질(HBsAg 1과 0 ng/mL)과 반응시킨 후 전극 표면위에서 전기화학적 반응을 측정하였다.
b. 실험군 1 : 본 발명의 다층구조 원리를 적용하여 1층구조(아래서부터 스트렙타비딘=-항체)로 금전극 표면에 포획항체를 고정화 후에, 상기 방식과 동일한 방식으로 전기화학적 반응을 측정하였다.
c. 실험군 2 : 본 발명의 다층구조 원리를 적용하여 2층구조(아래서부터 스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체)로 금전극 표면에 포획항체를 고정화 후에, 상기 방식과 동일한 방식으로 전기화학적 반응을 측정하였다.
d. 실험군 3 : 본 발명의 다층구조 원리를 적용하여 3층구조(아래서부터 스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체)로 금전극 표면에 포획항체를 고정화 후에, 상기 방식과 동일한 방식으로 측정한 전기화학적 반응을 측정하였다.
e. 실험군 4 : 본 발명의 다층구조 원리를 적용하여 4층구조(아래서부터 스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체-스트렙타비딘-항체)로 금전극 표면에 포획항체를 고정화 후에, 상기 방식과 동일한 방식으로 전기화학적 반응을 측정하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 B형간염바이러스항원(HBsAg)이 고정된 다층구조막를 이용하여 전기화학적 신호를 실험한 결과 그래프이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 인간 B형간염바이러스항원(HBsAg)이 없는 다층구조막를 이용하여 전기화학적 신호를 실험한 결과 그래프이다.
먼저, 도 4에 나타난 바와 같이, 실험군 2, 3이 어느 정도 꺽인 반응을 나타내는 것으로 보아, 본 발명의 다층구조막을 적용할 경우 측정감도를 향상시키는데 기여할 수 있음이 확인되었다.
반면에, 도 5에 나타난 바와 같이, 노이즈 신호(분석물질 0 ng/mL에서의 신호)가 다층구조막이 3층 이상일 경우 함께 발생됨을 확인 할 수 있다. 즉, 실험군 4는 분석물질이 없는 상태에서도 꺽인 반응을 나타내는 것으로 보아 부적합하다. 이에 따라, 4층 이상 무한대로 다층막을 쌓아서 항체고정량을 늘리는건 실질적으로 바람직하지 않고, 적절한 다층막 예를 들면 2층의 경우 비특이신호의 발생없이 측정감도를 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
10: 생체물질-바이오틴 복합체
11: 생체물질
12: 바이오틴
20: 스트렙타비딘
100: 스트렙타비딘층
200: 생체물질-바이오틴층

Claims (7)

  1. 기판 위에, 스트렙타비딘(streptavidin)으로 이루어진 적어도 하나 이상의 스트렙타비딘층과 생체물질-바이오틴(biotin) 중합체로 이루어진 적어도 2개 이상의 생체물질-바이오틴층이 교대로 적층된 구조를 가지는 생체물질 고정 다층구조막.
  2. 제1항에 있어서,
    기판 위에 형성된 제1스트렙타비딘층;
    상기 제1스트렙타비딘층 위에 적층된 제1생체물질-바이오틴층;
    상기 제1생체물질-바이오틴층 위에 적층된 제2스트렙타비딘층; 및
    상기 제2스트렙타비딘층 위에 적층된 제2생체물질-바이오틴층;을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체물질 고정 다층구조막.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체물질은 항체인 것을 특징으로 하는 생체물질 고정 다층구조막.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘층의 스트렙타비딘과 상기 생체물질-바이오틴층의 바이오틴은 서로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 생체물질 고정 다층구조막.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘층 또는 생체물질-바이오틴층에서 스트렙타비딘 또는 생체물질-바이오틴 중합체는 비드(bead)입자에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 고정 다층구조막.
  6. 기판 위에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제1스트렙타비딘층을 형성하는 단계;
    상기 제1스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제1생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;
    상기 제1생체물질-바이틴층에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제2스트렙타비딘층을 형성하는 단계; 및
    상기 제2스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제2생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;를 포함하는 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법.
  7. 기판 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제1생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;
    상기 제1생체물질-바이오틴층에 스트렙타비딘을 반응시킨 후 반응하지 않은 스트렙타비딘을 제거해서 제1스트렙타비딘층을 형성하는 단계; 및
    상기 제1스트렙타비딘층 위에 생체물질-바이오틴 중합체를 반응시킨 후 반응하지 않은 생체물질-바이오틴 중합체를 제거해서 제2생체물질-바이오틴층을 형성하는 단계;를 포함하는 생체물질 고정 다층구조막의 제조방법.
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