KR20120077263A - Ａｒｈｇａｐ 15 유전자의 넉-다운(ｋｎｏｃｋ?ｄｏｗｎ)을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법 - Google Patents
Ａｒｈｇａｐ 15 유전자의 넉-다운(ｋｎｏｃｋ?ｄｏｗｎ)을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Arhgap 15 유전자의 넉-다운을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 외부스트레스 (에탄올, serum starvation 등)에 강한 한우 fibroblastt) 세포 주를 확립하여 복제 한우 생산 시 배양기간 증진을 통한 세포융합기술 및 넉-다운 줄기세포주 확립에 활용할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 Arhgap 15 유전자의 넉-다운(knock-down)을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법에 관한 것이다.
생체에서는 줄기세포, 생식세포 또는 신경세포 등과 같은 일부를 제외하고 대다수의 체세포는 노화의 과정을 거치며 한정된 수명을 지니고 있다. 즉, 정상적인 체세포는 일정 수의 세포분열 후 세포의 성장이 멈추는 세포 노화 단계에 도달하기 때문에 무한하게 증식할 수 없다(Hayflick과 Moorhead, 1961; Campisi, 2001).
확립된 세포주는 생체에서 분리한 세포가 인위적인 체외배양 조건하에서도 일반적으로 세포노화의 과정을 극복하고 지속적으로 세포증식의 특성을 보이는 세포를 일컫는다. 현재 일반적으로 설명되고 있는 세포 노화 기작은 세포 증식 시 필연적으로 생성되는 세포 내생 독성산화물질(Reactive oxygen species; O2-, H2O2)이 세포에 손상을 줌으로써 이런 손상을 인식해서 세포의 증식을 억제하는 유전자 발현과 활성이 증가하여 세포의 무한 증식을 억제한다는 것이다 (Sherr과 DePinho, 2000). 따라서 내생 독성산화물질의 세포 내 축적을 억제할 수 있는 다양한 항산화제(MnSOD나 카탈라제)들의 발현을 증가시킴으로써 체외배양조건에서 세포의 분열횟수를 증가시켰으며(Kim 등, 2004), 세포 성장 억제유전자의 기능을 직접적으로 억제할 수 있는 바이러스(SV40, HPV)에서 유래된 유전자를 이용하여 정상세포를 불멸화 세포로 전변시킬 수 있었다(Hahn 등, 1999).
한우의 세포주를 이용한 관련유전자들의 상호작용기작에 관한 연구는 거의 이루어져 있지 않으며, 현재 이루어지고 있는 연구들은 모두 초대배양세포를 이용하고 있어 초대배양세포가 갖는 분열능력의 한계로 인해 실험을 지속할 수 있는 기간이 매우 한정되어 있고 결과의 재현성을 검증하기가 어렵다.
한우 태아 체세포를 이용한 연구가 활발하게 수행되기 위해서는 마우스나 래트와 같이 지속적으로 분열할 수 있는 불멸화된 세포주의 개발이 매우 절실한 상황이다.
또한, 한우 고급육생산을 위한 사양 및 관리 프로그램은 개발되어 있으나 보다 효율적인 프로그램의 개발을 위해서는 보다 심층적인 연구가 필요하며, 고급육생산을 위한 모델 시스템이 필요하다.
이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 한우에서 우수한 세포주를 개발하기 위해 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
결국 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 Arhgap 15 유전자의 넉-다운을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, Arhgap 15 유전자의 넉-다운을 통한 동물의 스트레스 내성 세포주 제조방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 동물은 소일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 동물은 한우(Bos taurus coreanae)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포주는 섬유아세포(fibroblast) 유래인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 넉-다운은 Arhgap 15 유전자의 결실돌연변이를 이용하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 에탄올에 의한 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 스트레스 내성은 세포사멸이 줄어드는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 따라 제조된 스트레스 내성 세포주가 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 외부스트레스(에탄올, serum starvation 등)에 강한 한우 fibroblastt) 세포주를 확립하여 복제 한우 생산 시 배양기간 증진을 통한 세포융합기술 및 넉-다운 줄기세포주 확립에 활용할 수 있는 장점이 있다.
도 1 및 도 2는 트렌스펙션 이후의 섬유아세포의 형태변화 양상을 나타낸다.
도 3은 siRNA에 의한 Arhgap15의 mRNA 발현양상을 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블롯에 의해 Bax, Bcl-2 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯에 의해 사이토크롬 C(Cytochrome C) 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 6은 웨스턴 블롯에 의해 Caspase-3 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 PARP-1 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 8은 fura-2로 세포 내 칼슘이온의 농도를 측정한 결과이다.
도 9는 섬유아세포 내 caspase-3 및 PARP-1 단백질의 면역형광 검출 결과이다.
도 3은 siRNA에 의한 Arhgap15의 mRNA 발현양상을 나타낸다.
도 4는 웨스턴 블롯에 의해 Bax, Bcl-2 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯에 의해 사이토크롬 C(Cytochrome C) 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 6은 웨스턴 블롯에 의해 Caspase-3 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 PARP-1 단백질의 발현양상을 나타낸다.
도 8은 fura-2로 세포 내 칼슘이온의 농도를 측정한 결과이다.
도 9는 섬유아세포 내 caspase-3 및 PARP-1 단백질의 면역형광 검출 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, Arhgap 15 유전자의 넉-다운을 통한 동물의 스트레스 내성 세포주 제조방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 동물은 소일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 동물은 한우(Bos taurus coreanae)일 수 있다.
본 발명에서는 한우 섬유아세포(fibroblast)에 Arhgap 15 유전자에 대한 siRNA 트렌스팩션(50nM, 30h) 방법을 통해 효율적으로 유전자를 넉-다운 하였다.
상기 Arhgap 15 유전자가 정상기능을 나타내는 세포에 에탄올을 처리(100mM, 48h)한 결과, bcl-2 단백질의 발현 저하, caspase-3, PARP-1 단백질의 발현 증가 등으로 세포사멸이 유도되었다.
그러나, 상기 Arhgap 15 유전자가 넉-다운된 세포에 에탄올을 처리한 결과, Bax/Bcl-2 ratio 증가, Caspase-3, 사이토크롬 C 단백질 발현이 감소됨으로써 에탄올로 인한 세포사멸이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 Arhgap 15 유전자가 넉-다운될 경우 에탄올 등을 포함하는 스트레스에 세포의 저항성이 보다 항진된 세포주를 확립할 수 있음을 나타낸다. 이러한 방법을 통해 외부 스트레스에 보다 강한 한우의 세포주를 확립할 수 있어 품종 개량 등에도 이용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 세포주는 섬유아세포(fibroblast) 유래인 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 넉-다운은 Arhgap 15 유전자의 결실돌연변이를 이용하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 스트레스는 에탄올에 의한 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 스트레스 내성은 세포사멸이 줄어드는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법에 따라 제조된 스트레스 내성 세포주가 제공될 수 있다.
본 발명에서는 한우에서 유래한 섬유아세포(fibroblast)에서 Rho GTPase activating protein 15(Arhgap 15) 유전자를 siRNA 기법을 이용하여 넉-다운 시킴으로써 에탄올에 의한 세포사멸에 대한 저해효과를 하기의 실시예 4 내지 5와 같은 방법을 조사하였다. 그 결과 Arhgap 15 유전자를 siRNA 기법을 이용하여 넉-다운시킨 세포에서 에탄올과 같은 스트레스에 대한 저항성이 관찰되었으며, 이는 세포사멸의 감소로 측정되었다. 이를 이용하여 장차 세포융합기술 및 넉-다운 줄기세포주 확립에 응용할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1.
siRNA
트렌스팩션(transfection)에
대한 세포형상 변화 측정
도 1 및 도 2는 트렌스펙션 이후의 섬유아세포의 형태변화 양상을 나타낸다. siRNA를 50 nM, 100 nM 농도로 트렌스팩션시킨 후 24시간 뒤 세포의 변화를 관찰하였다. siRNA를 50 nM, 100 nM 농도로 각기 달리 처리했을 때, 대조군(control)에 비해 섬유아세포(fibroblast)의 형태는 크게 변화가 없어 보였다.
실시예
2.
siRNA
트렌스팩션(transfection)에
대한
mRNA
발현 변화 측정
도 3은 siRNA에 의한 Arhgap15(좌측 전기영동 사진) 및 GAPDH(우측 전기영동 사진)의 mRNA 발현양상을 나타낸다. siRNA를 50 nM, 100 nM 농도로 트렌스팩션 시킨 후 24시간 뒤 세포의 mRNA 변화를 관찰하였다. siRNA를 50 nM, 100 nM 농도로 각기 달리 처리했을 때, siRNA 처리군에서 siRNA 농도 의존적으로 mRNA가 넉-다운되는 현상을 보였으며 50 nM일 때 섬유아세포의 넉-다운이 가장 잘 일어났다. 도 3의 우측 사진에 나타난 바와 같이, 대조군인 GAPDH에서는 Arhgap15 유전자의 넉-다운 현상은 일어나지 않았다.
실시예
3.
에탄올 및
siRNA
처리에 의한 세포사멸(
apoptosis
)관련 단백질 변화
도 4는 웨스턴 블롯에 의해 Bax, Bcl-2 단백질의 발현양상을 나타낸다. 한우 섬유아세포(fibroblast)를 DMEM 배지에 48시간 배양 후, 네 개의 실험군으로 나누어 각각 대조군(control), siRNA 처리군, 에탄올 처리군, 에탄올 + siRNA 처리군으로 나누어 siRNA는 50nM, 30시간 에탄올은 100mM 30시간 각각 처리하였다. 결과 항-세포사멸 유발인자(anti-apoptosis inducer)인 Bcl-2 단백질의 발현 양은 siRNA 처리만으로도 증가 되었을 뿐만 아니라 에탄올 처리로 인한 Bcl-2 발현감소가 siRNA 트렌스팩션을 통해 크게 회복되었다. 반면 세포사멸 유발인자(apoptosis inducer) 인 Bax의 경우 에탄올 처리에 의해 오히려 감소하였으나 Bax/ Bcl-2 ratio를 비교해보면 에탄올 + siRNA group에서 크게 감소함으로써 Arhgap 15 gene 의 넉-다운 은 세포사멸을 저해시키는데 효과적임을 알 수 있다.
Bax/ Bcl-2 ratio 변화로 인한 세포사멸 신호는 곧이어 미토콘드리아에 전해져 사이토크롬 C를 방출하게 된다. 실험결과 siRNA 처리군에서는 사이토크롬 C 단백질 발현양은 변화되지 않았다. 반면 에탄올 처리군에서는 사이토크롬 C 가 다소 증가되었고, 이를 siRNA가 크게 감소시켰다. 이로써 에탄올 로 인해 세포사멸이 유도될 때 Arhgap 15 gene 의 넉-다운은 사이토크롬 C 단백질 발현을 크게 저해함을 알 수 있다.
도 6은 웨스턴 블롯에 의해 Caspase-3 단백질의 발현양상을 나타낸다. Caspase-3 는 미토콘드리아로부터 방출된 사이토크롬 C가 Apaf-1/Caspase-9 과 복합체(complex)를 이루어 활성화되며, 세포사멸을 알아보는 핵심적인 지표가 된다. 결과는 위의 Cytochorme C과 같은 패턴을 보였는데, siRNA 처리군에서는 Caspase-3 단백질 발현양은 변화되지 않았다. 반면 에탄올 처리군에서는 Caspase-3 가 다소 증가되었고, 이를 siRNA가 크게 감소 시켰다. 이로써 에탄올로 인해 세포사멸이 유도될 때 Arhgap 15 gene 의 넉-다운은 Caspase-3 단백질 발현을 크게 저해함을 알 수 있다.
도 7은 웨스턴 블롯에 의해 PARP-1 단백질의 발현양상을 나타낸다. PARP (poly ADP-ribose polymerase) 단백질은 핵 단백질로서 DNA를 수리(repair)하거나 PAR를 생산하여 미토콘드리아를 자극, AIF를 방출시킴으로써 세포사멸을 유도한다. 실험결과 siRNA처리군과 대조군에서는 PARP-1의 단백질 발현에 큰 변화가 없었고, 에탄올 처리군에서는 PARP-1 단백질이 크게 활성화되었지만, 이를 siRNA 가 PARP-1 단백질 발현을 변화시키지는 못했다. 이로써 Arhgap 15 gene 의 넉-다운이 핵단백질인 PARP-1 단백질 발현에 의한 caspase 비의존성 세포사멸에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
실시예
4.
siRNA
처리에 의한 세포질 내
Ca
2
+
변화
외부 자극에 의한 세포사멸 신호는 세포질 내 Ca2+ 농도를 높이고, 이것은 Ca2+의존 phosphatase/ kinase 단백질들을 활성화시킴으로써 세포사멸을 유도한다. 도 8은 fura-2로 세포 내 칼슘이온의 농도를 측정한 결과이다. 실험결과 siRNA 처리로 인해 세포질 내 Ca2+ 농도가 다소 감소됨으로써 Arhgap 15 gene의 넉-다운이 세포사멸을 저해시키킴을 알 수 있다.
실시예
5. 섬유아세포(
Fibroblast
) 내 형광항체를 이용한
Caspase
-3/
DAPI
염색
형광항체를 사용하여 세포내 세포사멸 표지인자(apoptosis indicator)인 caspase-3 의 발현을 확인하였고, 대조염색을 위해 DAPI를 이용한 핵염색을 하였다. 도 9는 섬유아세포 내 caspase-3 및 PARP-1 단백질의 면역형광 검출 결과이다. 관찰결과 대조군(control group)에서 Caspase-3 (빨간색)는 세포질 및 핵에서 강하게 발현되었으며 siRNA처리군에서 세포질 부분의 발현이 감소되었다. 반면 DAPI (파란색) 두 그룹 모두 핵에서 강하게 염색되었다. 이로써 Arhgap 15 유전자에 대한 siRNA 트렌스팩션이 세포사멸을 저해함을 형광면역 염색을 통해서도 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- Arhgap 15 유전자의 넉-다운을 통한 동물의 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 소인 것을 특징으로 하는 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 한우(Bos taurus coreanae)인 것을 특징으로 하는 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포주는 섬유아세포(fibroblastt)) 유래인 것을 특징으로 하는 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 넉-다운은 Arhgap 15 유전자의 결실돌연변이를 이용하는 것을 특징으로 하는 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스트레스는 에탄올에 의한 스트레스인 것을 특징으로 하는 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스트레스 내성은 세포사멸이 줄어드는 것인 스트레스 내성 세포주 제조방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따라 제조된 스트레스 내성 세포주.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100139157A KR101270680B1 (ko) | 2010-12-30 | 2010-12-30 | Ａｒｈｇａｐ 15 유전자의 넉-다운(ｋｎｏｃｋ―ｄｏｗｎ)을 통한 스트레스 내성 세포주 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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| KR101270680B1 KR101270680B1 (ko) | 2013-06-04 |
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Country Status (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8445198B2 (en) | 2005-12-01 | 2013-05-21 | Medical Prognosis Institute | Methods, kits and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy |
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2010
- 2010-12-30 KR KR1020100139157A patent/KR101270680B1/ko active IP Right Grant
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| Publication number | Publication date |
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| KR101270680B1 (ko) | 2013-06-04 |
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