KR20120071736A - 애기뿔소똥구리에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 항균용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기뿔소똥구리에서 분리한 펩타이드인 코프리신을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 항균용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 항진균 활성을 가지는 것으로 알려진 코프리신을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 안전성이 강화된 새로운 항균 펩타이드이자 창상 부위의 치료에 효과가 있는 펩타이드로, 기존의 화학합성 항생제를 대체하여 항생제 내성 미생물의 발생을 억제할 수 있고, 또한 기존 항생제에 대한 내성을 가지는 세균을 치료할 수 있는 신개념 항생제를 제공함과 동시에 창상 부위의 치료 효과로 피부 감염 예방 및 재생에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

애기뿔소똥구리에서 분리한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 항균용 조성물{Composition for treating skin wound or anti-bacterial composition comprising peptide derived from Copris tripartitus}

본 발명은 애기뿔소똥구리에서 분리한 펩타이드인 코프리신을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 항균용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 항진균 활성을 가지는 것으로 알려진 코프리신을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물에 대한 것이다.

염증 반응은 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부물질의 자극에 의해 각종 염증 매개인자 및 면역세포에 의한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 말하며, 이로 인해 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 증상이 수반된다. 염증반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되는 등 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상, 조직 파괴 등이 일어나고, 암, 자가 면역질환, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 관절염 등의 질환을 초래하기도 한다.

그 중 최근 항균 펩타이드에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며, 항균 펩타이드는 약 12 내지 50개 정도의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 지구상의 거의 모든 생물체에서 발견되고 있다. 이러한 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 미생물에 대하여 작용 범위가 매우 넓으며, 항생제 남용으로 인한 항생제 저항성을 일으키지 않아 항생제 내성 균주와 같은 문제를 해결할 수 있고, 부작용이 적어 인체에도 안전하게 이용할 수 있다는 장점이 있다.

곤충으로부터 유래된 항균 펩타이드의 경우 항진균, 항생제로 널리 이용되며, 염증성 질환의 치료제로서 사용될 수 있다. 곤충은 많은 종류와 개체를 유지하기 위하여 체내에 다양한 면역 체제를 가지고 있으며, 이에 관여하는 수많은 유전자 및 단백질이 밝혀져 있다. 인간과 같은 고등동물은 선천성 면역과 후천성 면역의 두 가지 경로가 면역 반응에 관여하고 있으나, 곤충의 경우에는 선천성 면역기구를 강화하여 자신을 보호하고 있다. 이러한 선천성 면역 기구는 곤충에서 뿐만 아니라 고등 동물에서 질병의 초기 감염 시 중요한 방어 체계로서 역할을 수행한다. 특히 곤충 유래의 항균성 펩타이드 또는 단백질은 안전성이 강화되어 인간을 포함한 고등 동물의 질병의 치료 및 예방에 효과적이다.

딱정벌레목 소똥구리과에 속하는 애기뿔소동구리 (Copris tripartitus)는 몸 길이가 13~19mm 정도로 작은 곤충이다. 몸 빛깔은 검은색으로 광택이 난다. 근연종인 뿔소똥구리와 매우 비슷하나 크기가 훨씬 작고, 머리의 뿔은 보다 짧으며, 광택은 보다 강한 특징을 가지고 있다. 이들은 소의 배설물을 먹고 살며 과거 소를 방목하던 곳이 점차 줄어듦에 다라 서식지를 잃어 그 개체수가 감소해 가고 있는 종이다. 현재 멸종위기종 및 반출금지종으로 지정되어 채집 및 보관이 금지되어 있으며, 우리나라를 비롯하여 중국, 대만, 일본 등지에 분포한다. 본 발명의 발명자들은 이전 연구에서 애기뿔소똥구리 유래 항균 펩타이드를 발견한 바 있으나, 아직까지 피부 염증 예방 및 치료 또는 피부 상처 치료 및 재생에 대한 연구는 이루어지지 않은 실정이다.

종래의 항생제는 항생제 저항성으로 인한 항생제 내성을 가지는 미생물이 양산될 수 있다는 문제점을 가지고 있었다. 또한 애기뿔소똥구리 유래 펩타이드에서 피부 상처 치유 신호전달체계를 활성시키는 기작에 대하여는 아직까지 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 항균활성을 가져 피부 상처, 즉 창상 부위에 효과적인 치료제의 개발을 위하여 연구한 결과, 애기뿔소똥구리 유래 펩타이드인 코프리신이 이러한 활성을 가지고 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 애기뿔소똥구리 유래의 항균 펩타이드인 코프리신의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 스타필로코커스 아우레우스에 대해서 항균활성을 가지며, 창상 부위에 있어서의 상기 미생물의 감염을 막고, 감염으로 인한 여러 가지 신호전달과정의 혼란을 미연에 방지하여 창상 부위의 피부 조직의 재생을 돕는다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

창상은 피부 조직이 날카로운 외부 자극에 의해 손상되어 생긴 상처를 말하는 것으로, 창상 치유 과정은 하기와 같이 염증기, 육아기, 상피화기, 증식기 및 성숙기의 5기로 구분할 수 있다.

염증기(inflammatory phase)는 조직 손상 후, 출혈이 일어나면 지혈을 위해 카테콜아민이 방출되어 일시적인 혈관 수축이 일어나며, 곧이어 비만세포 등에서 분비된 세로토닌, 히스타민 등으로 국소 혈관이 확장되면서 혈장 및 단백질이 누출(diapedesis)되는 과정이다.

육아기(Granulation)는 개방성 창상에서 나타나며, 콜라겐, 피브로넥틴, 히알우론산, 대식세포 및 섬유아세포 및 모세혈관 내피 세포로 구성되는 육아조직으로부터 새로운 세포외 조직이 형성되는 과정을 말한다.

상피화기(Epithelialization)에서는 상처 발생 후 수분 이내 상처 부위의 표피가 두꺼워지고, 기저세포가 커지며, 창상의 결손부위로 이동하게 되는데, 이때, 상처 부위의 가까운 곳에 있는 고정된 기저세포가 계속 분열하며 그 딸세포가 창상 기질 위로 이동하며, 결합성 당단백질인 피브리노겐, 비트로넥틴, 테나신등은 창상기질 위로 상피세포 이동을 촉진한다.

증식기(Fibroplasia)는 반흔이 형성되는 과정으로, 콜라겐이 주된 성분이 되며, 콜라겐 합성 및 분해의 균형으로 반흔의 크기와 양이 조절된다.

수축기(Contraction)는 반흔의 면적을 줄여 결손 부위를 치유하기 위한 과정으로, 근섬유아세포(myofibroblast)에 의해 이루어진다.

스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus, 황색 포도상구균)는 대표적인 식중독균으로 알려져 있으며, 전체 인구의 약 30%에서 상재균으로 존재하며, 집락 형성을 잘 하고, 병원성이 높고, 항생제 내성 및 조직 침습력이 강하다.

스타필로코커스 아우레우스에 의한 피부 감염 경로는 다음과 같다. 일단 피부가 손상되면 국소 세균증식으로 감염 부위에서 염증과 조직괴사가 시작된다. 중성구가 즉시 그 부위로 들어가서 많은 스타필로코커스 아우레우스를 탐식한다. 주변의 모세혈관의 혈전이 일어나고 섬유소가 부위에 침착한다. 그 후에 섬유아세포가 그 부위에 비교적 무혈관성 벽을 형성한다. 완전히 진행된 포도구균 농양은 죽었거나 죽어가는 백혈구의 중심 핵과 세균으로 구성되고 이것은 점점 액화되어서 섬유아세포벽에 둘러싸인 진한, 크림같은 농을 형성한다. 숙주의 방어기전이 피부나 점막하 감염을 억제하지 못하면 포도구균은 임파관이나 혈류로 유입된다 농피증의 원인이 되고, 골수염, 심내막염, 패혈증 등 전신 감염증을 유발할 수 있다.

즉, 스타필로코커스 아우레우스 균에 감염된 상처 부위는 상기 균의 대사산물로 인하여 재상피화, 조직치유 세포의 침윤, 혈관 신생 등이 억제되어 상처의 수렴과 치유가 늦어지게 되는데, 본 발명의 코프리신 펩타이드는 상기 스타필로코커스 아우레우스로 감염된 상처 부위의 치유 촉진 효과를 가진다. 따라서 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 코프리신 펩타이드의 상처 부위에 대한 치유 효과를 확인하기 위하여, 창상의 치유 속도의 변화를 관찰하였다. 랫트의 피부에 인위적인 상처 유발 후, 스타필로코커스 아우레우스로 감염시킨 다음, 상처 크기 변화를 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 코프리신 펩타이드를 처리한 군은 대조군과 비교하여 상처의 치유 속도가 현격하게 향상되었음을 알 수 있었다. (실시예 1 참조)

창상 부위의 재상피화의 비율은 육안적 상처면적과 직접적으로 관련되며 따라서 상처치유 속도의 조직학적인 척도가 된다는 점에서 중요한 의미를 지닌다(Ashcroft GS, Yang X, Glick AB, Weinstein M, Letterio JL, Mizel DE, Anzano M, Greenwell-Wild T, Wahl SM, Deng C, Roberts AB. Mice lacking Smad3 show accelerated wound healing and an impaired local inflammatory response. Nat Cell Biol 19991:2606).

따라서 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명 조성물의 상처 치유에 대한 육안적 관찰에 이어, 재상피화에 관여하는 정도를 관찰하기 위하여 스타필로코커스 아우레우스를 감염시킨 상처 부위를 잘라내어 고정시킨 후, PBS, 코프리신 펩타이드 및 앰피실린 등으로 처리하여 비교하였다. 그 결과, 코프리신 펩타이드를 처리한 군에서 창상 부위의 재상피화 비율이 높은 것을 확인하였다. (실시예 2 참조)

또한, 본 발명의 또 다른 일실시예에서는 재상피화에 뒤따르는 창상 조직의 복구 상태를 비교하기 위하여, 신생 혈관의 형성 정도 및 조직 치유와 관련된 세포의 수를 비교하였다. 그 결과, 코프리신 펩타이드 처리군에서 신생혈관이 많이 형성되었고, 조직 치유에 관여하는 세포의 수도 증가된 것을 확인하였다(실시예 3 참조). 상기 결과로부터 본 발명의 조성물은 스타필로코커스 아우레우스의 작용을 억제하여 상처 부위의 재생을 활발히 이루어지도록 촉진하는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 모든 종류의 펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 사멸세포에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 펩타이드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩타이드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 창상 치료용 약학적 조성물은 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여 방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 경피 투여, 피하 내, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여’란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필 메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 코프리신 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 창상의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 코프리신 펩타이드의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.001 ㎍ 내지 100 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 1 mg일 수 있다. 그러나 상기 코프리신 펩타이드의 농도는 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 코프리신 펩타이드의 창상 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다

한편, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 항균활성을 가지며, 특히 스타필로코커스 아우레우스에 대해서 항균활성을 가진다.

스타필로코커스 아우레우스는 창상 부위에 감염 시, 상기 검토한 바와 같이, 상처 치유의 신호전달체계를 억제하는 작용을 한다. 따라서 코프리신 펩타이드의 항균 작용은 상기 신호전달체계 억제 작용의 방지라고 볼 수 있다.

Smad는 TGF-β 신호전달체계를 조절하는 세포 내 단백질로, TGF-β는 세포의 화학주성, 분화, 부착을 조절하는 중요한 인자이다. 특히 상처치유에 있어서 TGF-β 신호체계는 재상피화를 담당하는 케라티노사이트, 조직을 형성하는 피브로블라스트, 각종 세포들의 사이토카인 분비에 영향을 주는단핵구의 증식 및 억제에 큰 영향을 미친다. Smad는 기능에 따라 R-Smads, Co-Smads, I-Smads로 분류되는데, 이중 R-Smads(receptor activated Smads) 중 하나인 Smad3는 TGF-β 수용체가 받은 신호를 세포내로 전달하는데 직접적으로 관여하며, Smad3-null 마우스는 정상 마우스에 비해 재상피화의 촉진과 상처부위 단핵구의 침윤을 현저한 감소로 상처치유 속도가 향상된 것이 확인된 바 있다(* Ashcroft GS, Yang X, Glick AB, Weinstein M, Letterio JL, Mizel DE, Anzano M, Greenwell-Wild T, Wahl SM, Deng C, Roberts AB. Mice lacking Smad3 show accelerated wound healing and an impaired local inflammatory response. Nat Cell Biol 19991:2606). 이 사실은 Smad3를 포함, 이와 연계된 Smad2 및 3의 발현이 상처치유에 관여하는 신호전달체계를 억제하는 기능을 하고 있음을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 일실시예에서는 상기 Smad 중, p-Smad 2/3의 발현 정도를 확인하기 위하여 스타필로코커스 아우레우스로 감염된 창상 부위에 항-인산화된 Smad 2/3 항체를 사용하여 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, 코프리신 펩타이드 처리 시, Smad 2/3 발현이 억제되었으며, 이는 코프리신 펩타이드의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균 효과로 상처 치유 신호전달체계의 억제를 방지한 것을 확인할 수 있는 결과이다.

이와 같이 피부 상처 치료 시, 본 발명의 조성물은 스타필로코커스 아우레우스가 상처 치유 신호전달체계를 억제하는 기작을 방지하며, 다른 조직독성, 염증 및 면역반응을 초래하지 않아 다른 부작용이 없이 피부 창상 등을 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 안전성이 강화된 새로운 항균 펩타이드이자 창상 부위의 치료에 효과가 있는 펩타이드로, 기존의 화학합성 항생제를 대체하여 항생제 내성 미생물의 발생을 억제할 수 있고, 또한 기존 항생제에 대한 내성을 가지는 세균을 치료할 수 있는 신개념 항생제를 제공함과 동시에 창상 부위의 치료 효과로 피부 감염 예방 및 재생에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 스타필로코커스 아우레우스균의 감염 여부를 조직학적으로 확인한 것이다.
도 2는 코프리신 펩타이드 처리에 따른 상처치유 속도를 처리 날짜별로 관찰한 것을 사진으로 촬영하여 나타낸 것이다.
도 3은 코프리신 펩타이드 처리에 따른 상처치유 속도를 상처의 크기 비율로 확인한 것이다.
도 4는 상처의 표피(epidermis)로 덮인 정도로 상처치유 정도를 촬영한 것이다.
도 5는 상처부위에 처리한 물질별로 재상피화 비율을 나타낸 것이다.
도 6은 코프리신 펩타이드를 처리에 따른 신생혈관의 양을 비교한 것이다.
도 7은 코프리신 펩타이드를 처리에 따른 조직치유 관련 세포의 양을 사진을 통하여 육안으로 확인한 것이다.
도 8은 코프리신 펩타이드를 처리에 따른 조직치유 관련 세포의 평균 양을 나타낸 것이다.
도 9는 코프리신 펩타이드가 보여준 상처치유효과를 항생제 처리에 따른 효과와 비교한 것이다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1>

항진균 펩타이드의 분리 및 정제

하기 표 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 애기뿔소똥구리에서 유래하는 항진균 펩타이드인 코프리신 펩타이드를 아래 방법으로 합성 및 분리 정제하였다.

펩타이드	아미노산 서열
코프리신	VTCDVLSFEAKGIAVNHSACALHCIALRKKGGSCQN-GVCVCRN

먼저, 항진균 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 (Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc., 85, 2149, 1963) 항균 펩타이드를 제조하였다. 상기 항균 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-amino group의 보호기 (protecting group)로 사용하는 고상법 (solid phase method)으로 합성하였다. 구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 N-hydroxybenzo- triazole (HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide (DCC)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈 (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄 (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조 (crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배 (acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC (reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110 ℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 또한 합성된 펩타이드의 시퀀스 (sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과, 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

< 실험예 2>

적정 처리 조건의 설정

E.coli 등 6 종의 세균에 대하여 코프리신 펩타이드 유전자의 일부영역에 대한 아미노산을 합성하여 항진균 활성을 검정하였다. 8주령 수컷 랫드(n=9)의 등쪽 피부를 면도 후 지름 8mm의 생검펀치를 이용해 원형의 상처를 4개씩 낸 후 상처에 모두 포도상구균(Staphylococcus aureus; Sa)을 비롯한 6종 세균을 각각 2.5×10⁸ CFU/20㎕의 농도로 감염시켰다. 코프리신 펩타이드의 농도를 달리하여 MIC50 농도의 10배인 50ug/ml과 MIC50 농도의4배인 20ug/ml 그리고 PBS를 처리했다.

그 결과, 본 발명에 의한 항진균 단백질이 RDA분석 방법에서 실험된 6 종의 세균들의 생장이 억제되었고, 표 2에 나타난 바와 같이 9CpCR peptide에서는 전혀 활성이 검정되지 않았고, 12Cp peptide와 9Cp peptide는 E.coli에서만 각각 32-64㎍/ml, 8-16㎍/ml농도가 최소억제 농도로 나타났다. 9CpHL pepetide는 스타필로코커스 아우레우스에서 16-32㎍/ml, E.coli에서는 4-8㎍/ml농도가 최소 억제 농도였고, 항생제 내성균주인 MRSA와 MDRPA에서는 8-16㎍/ml농도가 최소억제농도로 나타내며 다양한 범위의 세균 모두에서 활성을 보였다.

Peptides	MIC(㎍/㎖)
	S.aureus	E.coli	P.aerusinosa	MRSA	MDRPA
12Cp	>64	32-64	>64	>64	>64
9Cp	>64	8-16	>64	>64	>64
9CpCL	>64	>64	>64	>64	>64
9CpCR	>64	>64	>64	>64	>64
9CpHL	16-32	4-8	8-16	8-16	8-16
9CpHR	>64	16-32	>64	>64	>64

< 실시예 1>

스타필로코커스 아우레우스 감염 억제를 통한 본 발명의 펩타이드의 창상 치료 효과 확인

서열번호 1 (VTCDVLSFEAKGIAVNHSACALHCIALRKKGGSCQN-GVCVCRN)의 코프리신 펩타이드가 스타필로코커스 아우레우스균에 감염된 상처의 치유속도에 영향을 주는지를 확인하기 위하여 상처치유의 육안적인 과정을 관찰하였다.

8주령 수컷 랫드(n=32)의 등쪽 피부를 면도 후 지름 8mm의 생검 펀치를 이용해 원형의 상처를 4개씩 내었다. 랫드의 절반은 상처에 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus; Sa)균 (20㎕, 2.5×10⁸ CFU/ml)을 감염시켰고 나머지 그룹은 동량의 PBS(20㎕)를 처치하였다. 감염 24시간 후 감염군과 비감염군에서 임의로 1마리씩 선별하여 조직학적으로 Sa균의 감염이 이루어졌음을 그람염색을 통해 확인하였다(도 1). 나머지 랫드는 감염 24시간 후부터 하루에 2번씩 5일간 상처부위에 20㎕의 PBS, 앰피실린(20ug/ml) 및 코프리신 펩타이드(50ug/ml)를 각각 처리하면서 상처크기의 변화를 관찰하였다. 앰피실린과 코프리신 펩타이드의 농도는 앞선 연구들을 참고하였으며(1. Goto H, Shimada K, Ikemoto H, Oguri T. Study Group on Antimicrobial Susceptibility of Pathogens Isolated from Respiratory Infections.: Antimicrobial susceptibility of pathogens isolated from more than 10,000 patients with infectious respiratory diseases: a 25-year longitudinal study. J Infect Chemother. 2009;15(6):347-60; 2. Hwang JS, Lee J, Kim YJ, Bang HS, Yun EY, Kim SR, Suh HJ, Kang BR, Nam SH, Jeon JP, Kim I, Lee DG.. Isolation and characterization of a defensin-like peptide (coprisin) from the dung beetle, Copris tripartitus. International Journal of Peptides 2009) 본 실험에 선행해 실시한 예비 실험에서 그 효과를 미리 확인, 적정 농도를 적용하였다. 상처크기의 변화는 매일 디지털 카메라로 스케일을 포함하여 촬영하였다. 촬영된 사진은 Image J라는 프로그램을 이용하여 상처의 면적을 pixel 단위로 산출한 후 전체 그룹의 상처크기의 변화를 백분위(첫째 날 상처면적을 100%로 환산)로 재변환 하였다.

그 결과, 도 2 및 도 3에서 보듯이, 코프리신 펩타이드를 처리한 랫드와 그렇지 않은 그룹 사이의 상처치유 속도에 차이가 있었다. 스타필로코커스 아우레우스균 감염군에서 코프리신 펩타이드를 처리한 랫드의 상처는 동량의 PBS를 처치한 랫드의 상처보다 치유속도가 빨라 스타필로코커스 아우레우스균의 감염 효과가 약화되었음을 시사하였다. 특히 이 결과는 비감염군 랫드의 상처치유 속도와 유사하여 코프리신 펩타이드가 스타필로코커스 아우레우스균의 영향을 현저히 상쇄하였음을 다시 한 번 보여주었다.

< 실시예 2>

감염군에서 코프리신 펩타이드를 처리한 상처의 재상피화 속도 향상 확인

상처의 육안적 관찰에 이어 재상피화 정도를 현미경으로 관찰하였다. 이를 확인하기 위하여 상기 ‘실시예 1’에서 4일 동안 PBS, 앰피실린, 코프리신 펩타이드를 처리한 랫드의 상처부위를 조직학적으로 관찰하였다. 각 랫드는 에테르 마취 후 상처부위를 면도날로 잘라내어 10% 포르말린으로 고정시켰다. 고정된 조직은 상처부위의 중심부를 포함시켜 상처면에 수직이 되도록 면도날로 자른 후 3-4㎛ 두께로 섹션을 만들어 헤마토톡신-에오진염색을 실시하였다. 그 후 상처의 표피(epidermis)로 덮인 정도를 측정하여 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 상처의 지름 대비 백분위로 환산하였다

그 결과, 도 4 및 도 5에서 보듯이, 관찰 결과 Sa균이 감염된 랫드의 상처에 코프리신 펩타이드를 처리하였을 때 동량의 PBS를 처리한 랫드의 상처보다 재상피화의 비율이 현저하게 높았다. 또한 이 결과는 비감염군의 재상피화 정도와 유사하여 코프리신 펩타이드를 처리한 상처는 그 항균효과로 인해 Sa균의 영향을 거의 받지 않았음을 보여주었다.

< 실시예 3>

상처의 조직학적 치유양상 비교를 통한 코프리신 펩타이드의 효과 확인

상기 실시예 2의 재상피화에 뒤따르는 상처조직의 복구상태를 비교하고자 하였다. 가장 대표적인 조직재생의 증거 중 하나로 신생혈관의 형성을 비교할 수 있는데, 이는 혈관내피세포에서 발현되는 VEGF(vascular endothelial growth factor)를 통해 쉽게 관찰할 수 있다. 이를 위해 ‘실시예 2’에서 고정시키고 섹션 한 조직을 탈파라핀화→재수화→endogenous peroxidase blockade 과정을 거친 후 항-VEGF 항체를 1차 항체로 사용하는 면역염색을 실시하여 VEGF의 발현 정도를 비교하였다. 또한 ‘실시예 2’에서 헤마토톡신-에오진 염색을 한 조직의 진피(dermis) 조직의 염증세포를 제외한 상처치유와 관련된 세포의 숫자를 비교하여 조직치유의 진행상태를 확인하였다.

그 결과 도 6에서 보듯이, 스타필로코커스 아우레우스균이 감염된 그룹에서 코프리신 펩타이드가 처리된 조직은 PBS를 처리한 조직에 비해 신생혈관이 많았고, 도 5에서 보는 바와 같이 코프리신 펩타이드 처리군에서 조직치유에 관여하는 세포의 수가 증가된 상태임을 알 수 있었다. 이 결과는 코프리신 펩타이드가 스타필로코커스 아우레우스균을 억제하여 해당 상처부위의 조직재생이 더욱 활발히 이루어지고 있음을 시사하는 것이다.

< 실시예 4>

코프리신 펩타이드의 항균효과의 기작 확인

스타필로코커스 아우레우스균에 감염된 상처는 세균과 세균의 대사산물로 말미암아 재상피화, 조직치유 세포의 침윤, 혈관신생 등이 억제되어 상처의 수렴과 치유가 늦어지는 것으로 알려져 있다. 이에 연구자 등은 코프리신 펩타이드를 처리한 스타필로코커스 아우레우스균 감염군 랫트의 빠른 상처치유의 원리검증을 위해 p-Smad 2/3의 발현 정도를 확인하고자 하였다.

Smad는 TGF-β 신호전달체계를 조절하는 세포 내 단백질로, 상처치유에 있어서 상기 TGF-β 신호체계는 케라티노사이트, 섬유아세포 및 각종 세포들의 사이토카인 분비에 영향을 주는 단핵구의 증식 및 억제에 영향을 미친다. 이중 Smad3는 TGF-β 수용체가 받은 신호를 세포내로 전달하는데 직접적으로 관여하므로, Smad-2/3의 발현 정도를 확인하기 위해 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 anti-phosphorylated Smad2/3 antibody(1:400)를 primary antibody로 사용하여 면역 염색을 실시하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에서 보듯이, 스타필로코커스 아우레우스균에 감염된 랫드 집단은 코프리신을 처리하였을 때 동량의 PBS를 처리하였을 때보다 표피조직의 세포와 피하조직의 섬유아세포의 핵과 세포질에서 Smad2/3의 발현이 억제되었다. 이상의 결과는 코프리신 펩타이드가 가지는 항균효과로 말미암아 상처치유 신호전달체계 억제를 방지하였음을 의미한다.

< 실시예 5>

조직독성 및 염증면역반응에 미치는 영향 확인

AMPs(antimicrobial peptides)는 이름 그대로 항균효과를 대표적으로 가지지만 다수의 AMPs가 선천선 면역반응과 염증반응에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 이 중에는 염증세포의 침윤, 혈관신생의 유도, 상처치유의 향상 등에 영향을 끼치는 펩타이드도 존재하는 만큼(Jenssen H, Hamill P, Hancock RE. Peptide antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 200619(3):491-511), AMPs의 일종인 코프리신 펩타이드가 보여준 상처치유 현상이 온전히 항균효과에 의한 것인지 확인할 필요성이 있다. 따라서 코프리신 펩타이드의 효과를 스타필로코커스 아우레우스 감염군 내에서의 단순비교가 아니라 감염군비감염군 간의 교차비교 및 대표적인 그람양성균 항생제인 앰피실린을 처치한 결과와 비교하였다.

그 결과, 도 9 및 상기 도 2 내지 도 8에서 보듯이, 코프리신 펩타이드를 처리한 그룹은 앰피실린을 처리한 그룹과 유사한 치유양상을 보여주었을 뿐만 아니라 무감염군 내에서도 대조군과 비교하였을 때 세포 도입의 증가, 혈관신생 및 치유조직 기질의 변화 혹은 기타 상처치유 속도에 영향을 미쳤다는 증거로 사료되는 병리조직학적 특이사항을 발견할 수 없었다.

이상의 결과는 앞서 실험에서 펩타이드가 스타필로코커스 아우레우스 감염군에서 보여준 상처치유 촉진 현상 및 병리조직학적 증거들이 기타 요인들이 아닌 스타필로코커스 아우레우스균에 대한 항균효과에 의한 결과임을 명백히 나타내고 있다. 또한 본 실험에서와 같은 단기적용에서는 펩타이드가 조직독성 및 자극을 유발할 가능성이 극히 낮음을 보여주었다. 향후 심층적인 연구가 계속되어 펩타이드의 이용범위 및 적용방법이 확립된다면 기존 항생제들을 대체할 수 있는 중요한 선택적 치료제로 자리 매김할 것으로 기대된다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 안전성이 강화된 새로운 항균 펩타이드이자 창상 부위의 치료에 효과가 있는 펩타이드로, 기존의 화학합성 항생제를 대체하여 항생제 내성 미생물의 발생을 억제할 수 있고, 또한 기존 항생제에 대한 내성을 가지는 세균을 치료할 수 있는 신개념 항생제를 제공함과 동시에 창상 부위의 치료 효과로 피부 감염 예방 및 재생에 효과적으로 이용될 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for treating skin wound or anti-bacterial composition comprising peptide derived from Copris tripartitus <130> NP10-0067 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Copris tripartitus <400> 1 Val Thr Cys Asp Val Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Ile Ala Val Asn 1 5 10 15 His Ser Ala Cys Ala Leu His Cys Ile Ala Leu Arg Lys Lys Gly Gly 20 25 30 Ser Cys Gln Asn Gly Val Cys Val Cys Arg Asn 35 40

Claims (4)

1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물.
   
2. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 상처 재생 촉진용 조성물.
   
3. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스 아우레우스에 대해서 항균활성을 가지는 것임을 특징으로 하는 조성물.

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