KR20120060263A - 사이클로펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클로펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양 또는 말단비대증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 CXCR4 길항제인 Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열을 가지는 사이클로펜타펩타이드가 뇌하수체의 종양 확대 및 GH 분비에 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 종래의 신호기작과 다른 신호기작을 타겟으로 하여 뇌하수체 종양을 비롯한 다양한 종양의 증식을 차단하고 종양세포의 세포사를 유도하는 새로운 항암제의 유효성분으로써 유용하게 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 성장호르몬을 과다 분비하는 뇌하수체 종양세포에서 성장호르몬의 생산 및 분비를 억제함으로써 말단비대증에 대한 효율적인 치료제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

사이클로펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Tumors Comprising Cyclopentapeptides}

본 발명은 사이클로펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

키모카인 SDF-1(stromal cell-derived factor 1)과 이의 수용체인 CXCR4는 정상세포 및 종양성의 뇌하수체 성상자극세포에서의 성장호르몬(growth hormone, GH)의 생산 및 세포 증식에 중요한 역할을 한다. 따라서, 키모카인 수용체 CXCR4는 말단비대증 환자를 위한 항종양제의 매력적인 타겟이 될 수 있다. CXCR4의 합성 길항제인 사이클릭 펜타펩타이드 d-Arg3FC131 (c[Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-Nal5])는 인 비트로에서 GH 생산 및 GH3 성상자극세포의 증식을 유의하게 억제한다. 또한 이는 캐스파제-3(caspase-3) 경로를 활성화시킴으로서 GH3 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. d-Arg3FC131의 전신투여에 의해 면역결핍 누드마우스에 이식된 GH3 세포의 성장이 아폽토시스 유도를 통하여 억제됨으로써 종양세포의 증식을 억제하였다. 이러한 결과는 d-Arg3FC131가 말단비대증 환자에 있어서 과량의 GH를 생산하는 뇌하수체 종양의 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 말단비대증과 관련된 뇌하수체 종양은 악성인 경우가 드물지만, GH 및 IGF(insulin-like growth factor)의 수준이 높은 경우는 다양한 심혈관, 호흡기, 내분비계 및 대사관련 질환을 야기할 수 있다(1,2). 종양조직을 모두 제거하는 외과적 수술만이 말단비대증 환자를 완전하게 치료하는 유일한 방법이다; 그러나, 부피가 큰 종양을 가진 환자를 수술 후에 관리하거나 재발환자를 다루는 경우에는 대개 2차 치료(second-line therapies)가 필요하다(3). 말단비대증 치료를 위해 도파민(dopamine) 아고니스트, 소마토스타틴(somatostatin) 수용체 리간드(SRLs) 및 GH 수용체 길항제의 3종류의 약물이 현재 사용되고 있다. SRL 만을 사용하는 치료는 혈청 IGF-1의 60-70%의 생화학적 조절을 유도하였다(4). SRL과 GH 수용체 길항제를 함께 사용할 경우 95%의 IGF-1 정상화가 이루어졌으나, 고비용이 문제로 남아있다(3, 5, 6). 만약 뇌하수체 종양에서 다른 신호기작을 타겟으로 하는 새로운 약리학적 시약이 개발된다면, GH를 분비하는 종양의 치료를 위한 현재의 의약품과 결합하는 다양한 접근들을 제공할 수 있을 것이다.

키모카인 SDF1(stromal cell-derived factor-1) 및 이의 수용체인 CXCR4는 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell)의 트래피킹(trafficking), 인간 면역결핍바이러스의 감염, 암세포의 이동 및 전이 및 류마티스 관절염의 발달에 관여하는 것으로 보고되었다(7-11). SDF1은 마우스의 뇌, 심장, 폐, 흉선, 신장, 비장, 위, 소장 및 골수를 포함하는 많은 기관에서 발현되는 것으로 알려져 있다. CXCR4는 SDF1 처럼 광범위하게 발현되며, 특히 신경조직에서 많이 발현된다(12). SDF1은 뮤린의 골수 간엽세포에서 클로닝하였고(13), 이의 아미노산 서열은 진화기간 동안 매우 보존되어있어 상기 부위가 중요한 생물학적 역할을 한다는 것을 암시한다. SDF1/CXCR4 상호작용은 기관-특이적 성장, 생존 및 유방암, 신장암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma), 다발골수종, 난소암 및 악성 뇌종양을 포함하는 악성 종양의 전이에 필수적인 역할을 한다(14-18). 중추신경계 및 뇌하수체 전엽의 신경세포, 성상세포, 미세아교세포 및 내피세포에서의 SDF1 및 CXCR4의 발현은 이들 키모카인과 신경내분비계 조절 간의 연관성이 있을 수 있음을 제시한다(12, 20, 21). 본 발명자들은 정상 및 암에 걸린 래트의 뇌하수체 세포(22) 및 인간 뇌하수체 세포(23)에서 SDF1 및 CXCR4가 발현됨을 밝혀냈다. SDF1/CXCR4 상호작용은 Erk1/2 인산화를 통카인GH3 세포 증식은 정상 및분비를 자극하였으며(22), 이는 이전의 연구결과와 일치한다(19, 24).

지금까지, 암치료를 위한 CXCR4의 억제는 몇몇 악성 종양에서 전임상 연구로부터 임상으로 옮겨가고 있다. 그러나, 몇몇 연구만이 CXCR4 길항제의 뇌하수체 종양에 관한 영향을 보고하였다. CXCR4 길항제에는 AMD3100, T22 및 T140를 포함하여 많은 종류가 있다. 각각의 길항제는 서로 다른 약동학 및 약력학에 의한 다양한 기작을 가진다. 강력한 CXCR4 길항제 중 하나인 T140 [Arg1-Arg2-Nal3-c(Cys4-Tyr5-Arg6-Lys7-d-Lys8-Pro9-Tyr10-Arg11-Cit12-Cys13)-Arg14]에서, Arg2, Nal3, Tyr5 및 Arg14와 같은 잔기는 CXCR4에 대한 길항 활성을 유지하는 데에 가장 중요한 잔기이다(25). T140은 마우스 혈청 또는 래트 간에서 안정하기 않기 때문에, 필수적인 잔기들(혈청의 Arg14; 간 균질물에서의 Arg2, Nal3 및 Arg14)도 불가피하게 삭제되어 효능의 극적인 감소를 보였다(26, 27). T 140의 구조적인 불안정성을 극복하기 위하여, 분자 크기를 최소화시키고 사이클릭 펜타펩타이드 라이브러리를 설계하였다. 사이클로(-Arg1-Arg2-Nal3-Gly4-DTyr5-)의 구조를 수득하였으며, 이는 T140과 유사한 강력한 CXCR4-길항 활성을 보였다(25, 28). 이에, 본 발명자들은 CXCR4 길항제인 사이클릭 펜타페타이드 FC131[c(Gly1-d-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5) 및 이의 이성질체 펩타이드가 효율적으로 뇌하수체 선종세포의 증식을 억제하고 GH의 분비를 억제할 것이라고 가정하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 뇌하수체 종양을 비롯한 다양한 종양에 대한 효율적인 펩타이드 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드가 CXCR4에 대한 길항작용을 통하여 암세포의 증식, 이동 및 전이를 억제하고 세포사를 유도한다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 말단 비대증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드(cyclopentapeptide)를 유효성분으로 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 뇌하수체 종양을 비롯한 다양한 종양에 대한 효율적인 펩타이드 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드가 CXCR4에 대한 길항작용을 통하여 종양세포의 증식, 이동 및 전이를 억제하고 세포사를 유도한다는 사실을 발견하였다. CXCR4는 인간의 종양세포에서 가장 널리 발현되는 키모카인 수용체 중의 하나이며, SDF1/CXCR4 상호작용은 종양에서의 혈관신생 뿐만 아니라, 종양의 증식, 이동, 침투 및 전이를 야기한다(4, 12, 13).

본 발명에 따르면, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 종양세포에서 성장호르몬(GH)의 생산 및 분비를 억제하며, 종양세포의 증식을 억제하고, G1 체크포인트에서 세포주기를 어레스트하며, 종양세포의 성장을 억제할 뿐 만 아니라, 종양세포의 아폽토시스를 유도한다. 따라서, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 CXCR4 신호기작을 타겟으로 하는 효과적인 항암제 조성물이 될 수 있다.

본 명세서에서 용어“펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear) 또는 환형(circular)의 분자를 의미한다.

본 명세서에서 용어“사이클로펜타펩타이드”는 5개의 아미노산 잔기로 이루어진 고리형 분자(cyclic molecule)를 의미하며, Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5 사이클로펜타펩타이드는 Gly, Tyr, Arg, Arg 및 Nal가 순서대로 연결된 고리형 펩타이드분자를 말한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 하기의 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택된다:

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 1 (FC131 [cyclo(Gly1-d-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5)]), 2 (d-Arg3FC131 [cyclo(Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-Nal5)]) 및 3 (d-Arg3-d-Nal5FC131 [cyclo(Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-d-Nal5)])은 동일한 다섯 개의 아미노산 잔기가 동일한 순서로 연결되어 있으면서 그 입체구조를 달리하는 입체이성질체(stereoisomer)를 나타낸다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학 적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19 th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스 제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 화학식 2의 사이클로펜타펩타이드이다. 본 발명에 따르면, 화학식 2의 사이클로펜타펩타이드는 화학식 1 및 3과 동일한 아미노산 잔기가 동일한 순서로 결합되는 고리형 펩타이드로서 2번 Tyr 및 3번 Arg이 D 형인 화합물을 지시한다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 종양은 유방암, 신장암, 전립선암, 폐암, 췌장암, 흑색종, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 다발골수종, 난소암 및 뇌종양을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 적용되는 종양은 뇌하수체 종양이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뇌하수체 종양은 과량의 성장호르몬을 생산 및 분비하는 종양이고 본 발명의 조성물은 상기 뇌하수체 종양의 성장호르몬의 생산 및 분비를 감소시킨다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 성장호르몬(GH)을 생산 및 분비하는 GH3 뇌하수체 종양세포에서 GH 유전자의 프로모터의 활성을 0.02배로 감소시킴으로써 GH의 발현을 전사수준에서 크게 억제시킴을 알 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 종양세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도한다. 본 발명의 실시예에서 보여지는 바와 같이, 본 발명자들은 종양조직에서의 아폽토시스를 측정하기 위하여 TUNEL 분석을 실시하였으며, 그 결과 본 발명의 조성물을 처리한 종양세포에서 대조군에 비하여 3배에 달하는 아폽토시스 증가가 관찰되었다. 이로써 본 발명의 조성물은 세포사 효율이 높은 효과적인 항암제로 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈관 신생을 억제한다. 암 조직이 성장하기 위해서는 기존 혈관의 세포들이 증식하고 이주하면서 새로운 혈관을 만들어 나가는 혈관 신생(angiogenesis)이 반드시 필요하다. 본 발명의 실시예에서 확인하는 바와 같이, 종양 조직에 대한 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색 결과 대조군의 종양조직에서 적혈구로 채워진 미세혈관이 두드러지지만, 본 발명의 조성물을 처리한 마우스의 종양조직에서는 거의 보이지 않는다는 사실을 관찰함으로써(도 6), 본 발명의 조성물은 종양조직의 혈관 신생을 억제하고 이로 인하여 종양조직의 성장을 억제함을 확인하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 종양세포의 세포주기를 어레스트한다. 본 발명에 따르면, 유세포 분석을 통하여 본 발명의 조성물의 처리로 인해 G0-G1기의 세포 비율이 증가하였음을 관찰함으로써 G1 세포주기 어레스트가 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 세포주기 어레스트를 통해 종양세포의 증식을 차단함으로써 본 발명의 조성물은 효율적인 항암제 조성물로서 기능할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드(cyclopentapeptide)를 유효성분으로 포함하는 말단 비대증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어“말단 비대증(acromegaly)”은 뇌하수체에서 과량의 성장호르몬이 생산, 분비되어 손, 발 또는 얼굴 등의 신체의 말단이 과도한 성장에 의하여 비대해지는 증상을 말한다. 말단 비대증은 신체 말단의 비대 뿐 아니라 과다발한, 다모증, 두통, 기억력감퇴, 체중증가, 관절병증, 고혈압, 불임, 유루증, 심장비대, 당뇨병 및 지각이상 등의 증상을 보이기도 한다. 본 발명의 조성물은 과량의 성장호르몬을 분비하는 뇌하수체 종양에 대해 치료 효과를 가지는 것을 그 특징으로 하므로, 상기 조성물은 뇌하수체 종양에 의한 과량의 성장호르몬 분비를 주 원인으로 하는 말단 비대증에 대해서도 효과를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 하기의 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택된다 :

화학식 1

화학식 2

화학식 3

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 사이클로펜타펩타이드는 화학식 2의 사이클로펜타펩타이드이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 사이클로펜타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 종래의 신호기작과 다른 신호기작을 타겟으로 하여 악성 뇌하수체 종양을 비롯한 악성 종양의 증식을 차단하고 종양세포의 세포사를 유도하는 새로운 항암제의 유효성분으로써 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명은 성장호르몬을 과다 분비하는 뇌하수체 종양세포에서 성장호르몬의 생산 및 분비를 억제함으로써 말단비대증에 대한 효율적인 치료제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 CXCR4 길항제로 기능하는 사이클릭 펜타펩타이드의 구조를 나타낸 그림이다. 도 1a는 FC131[cyclo(Gly1-d-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5)], 도 1b는 d-Arg3FC131 [cyclo(Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-Nal5)], 도 1c는 d-Arg3-d-Nal5FC131 [cyclo(Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-d-Nal5)]를 각각 나타낸다.
도 2는 CXCR4 길항제의 GH 유전자발현 억제효과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 인간 GH 프로모터 유래 루시퍼라제 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스(Ad-GHp-Luc)를 나타낸 그림이다. E3 부위를 제거하고 GH 유전자 프로모터 및 루시퍼라제 유전자를 아데노바이러스 타입 5의 E1a 부위에 삽입하였다. 도 2b는 Ad-GHp-Luc에 감염된 GH3 세포를 다양한 길항제로 처리한 후 루시퍼라제 리포터 시스템을 이용하여 GH 프로모터에 의한 전사활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. *P < 0.001 대조군과 비교. †P < 0.05 소마토스타틴-14(SST)-처리 그룹과 비교. 도 2c는 GH3 세포에 CXCR4 길항제 및 SST를 처리한 경우의 GH mRNA 발현을 나타낸 그림이다. 길항제(100 nM)를 처리한 후 실시간 RTPCR을 1시간 동안 수행하였다. GH mRNA 수준을 표준화하기 위한 기준 유전자로 GAPDH를 사용하였다. ‡P < 0.05 대조군과 비교. 도 2b 및 2c에 나타난 결과는 3개의 독립된 실험결과를 평균하여 평균±표준편차로 나타내었다. 도 2d는 d-ArgFC131(100 nM) 처리로 인해 GH3 세포에서의 GH 생산이 감소하였음을 보여주는 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 그림이다. β-액틴 유전자를 대조군으로 사용하였다. 도 2e는 d-Arg3FC131 및 SST의 투여가 GH3 세포 배양배지에서 GH의 농도를 감소시킴을 나타낸 그림이다. 배지에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 3일 동안 연속적으로 수행하였다(d-ArgFC131 및 SST 각각 100 nM).
도 3은 GH3 세포의 증식에 CXCR4 길항제가 미치는 영향을 나타낸 그림이다. GH3 세포의 증식을 비방사성 세포증식 분석을 이용하여 측정하였다(도 3a). GH3 세포의 숫자는 대조군 숫자에 대한 백분율 값으로 표현하였다. CXCR4 길항제 중에서, d-Arg3FC131(10, 100 nM) 및 d-Arg3-d-Nal5FC131(10, 100 nM)가 세포증식을 약 30-60% 억제하였다. 실험결과는 3개의 독립된 실험결과를 평균하여 평균±표준편차로 나타내었다. *P<0.001 대조군과 비교. †P < 0.001 SST-처리군(100 nM)과 비교. 도 3b는 GH3 세포에서 CXCR4 길항제인 d-Arg3FC131가 Erk1/2 및 Akt의 인산화를 억제함을 나타낸 그림이다. SDF1 또는 SDF1와 d-Arg3FC131를 처리한 후에 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 Erk1/2 및 Akt의 인산화를 조사하였다.
도 4는 GH3 세포에서의 세포주기 및 아폽토시스에 대한 d-Arg3FC131가 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 실시예에서 기술한 바대로 GH3 세포를 72시간 동안 d-Arg3FC131(100 nM)에 노출시키고 유세포 분석기로 세포주기 분포를 분석하여 특정 세포주기의 GH3 세포의 비율을 나타내었다(도 4a). 0 h에서 대조군과 비교한 P 값은 선형 대 선형 결합을 이용하여 계산하였다. 도 4b는 d-Arg3FC131(100 nM) 처리 후 72시간이 지난 뒤 양성 TUNEL 반응이 유도됨을 나타낸 그림이다. 녹색 형광염색은 TUNEL을 나타내며 PI를 이용한 붉은색 형광염색은 세포밀도 조사를 위한 GH3 세포의 핵을 나타낸다. 도 3c는 GH3 세포에서의 절단된 캐스파제-3 및 BCL-6의 발현을 나타낸 그림이다. 세포들을 72시간 동안 d-Arg3FC131(100 nM)로 처리하고 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 아폽토시스 경로를 조사하였다; β-액틴 유전자를 대조군으로 사용하였다.
도 5는 누드 마우스에서 d-Arg3FC131가 GH3 세포의 생장에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. 도 5a는 대조군, d-Arg3FC131(1.23 mg/kg 체중), 및 옥트레오타이드(1.23 mg/kg 체중) 처리 그룹의 GH3 종양이 이식된 누드마우스의 예를 나타낸 그림이다. 배양된 GH3 세포를 수집하여 누드마우스의 옆구리에 주입(1x10⁶ cells)하였다. 붉은 화살표는 옆구리의 종양 덩어리를 나타낸다. 마우스를 1개월 째에 죽이고 GH3 종양을 분리하였다. 도 5b는 누드 마우스의 이종이식 모델에서의 종양 형성을 나타낸 그림이다. 실시예에서 기술한 바와 같이, 각각의 점은 각 그룹 당 10마리의 마우스의 종양 부피에 대한 평균±표준오차 값을 나타낸다. 대조군 마우스에 대한 값은 검은색 정사각형으로, d-Arg3FC131-처리 마우스에 대한 값은 흰색 정사각형으로, 옥트레오타이드에 대한 값은 붉은색 원으로 각각 나타내었다. *P<0.05 대조군과 비교. d-Arg3FC131- 및 옥트레오타이드 처리군에 있어서 통계적으로 유의한 차이점은 없었다. 도 5c는 대조군 마우스와 d-Arg3FC131-처리 마우스 및 옥트레오타이드 처리 마우스의 종양 무게를 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 검은색 막대는 d-Arg3FC131-처리 마우스의 평균 종양무게를, 흰색 막대는 대조군 누드 마우스의 평균 종양무게를 각각 나타낸다. *P<0.05 대조군과 비교.
도 6은 이종이식 누드 마우스의 종양조직에 대한 조직학 및 면역조직화학 분석결과를 나타낸 그림이다. 왼쪽 컬럼은 대조군의 종양조직을, 오른쪽 컬럼은 d-Arg3FC131-처리 마우스의 종양조직을 보여준다. 상부 패널은 H&E 염색결과를 나타낸다. 대조군의 종양 조직에서 붉은색으로 염색된 부분은 적혈구이고 인접한 구조물은 혈관이며, 이들은 d-Arg3FC131-처리 마우스에서는 거의 관찰되지 않는다. Ki-67의 면역염색은 중간 패널에, TUNEL 염색은 하부패널에 각각 나타냈다(400배 확대).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포 배양 및 약물 처리

래트 뇌하수체 종양세포인 GH3-분비세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA)는 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO-BRL), 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 첨가한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, GIBCO-BRL, Grand Island, NY)에서 37℃에서 5% CO₂하에 배양하였다. 이들 세포는 GH 유전자 발현 및 이의 분자적 메카니즘 연구를 위한 확립된 모델이다(22, 29, 30). 세포들에 18 nM 의 SDF1(CXCL12, R&D Systems, Minneapolis, MN)(22), 100 nM 의 소마토스타틴-14(SST, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 또는 100 nM의 FC131, cyclo[Gly1-d-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5]; d-Arg3FC131, cyclo[Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-Nal5]; 및 d-Arg3-d-Nal5FC131, cyclo[Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-d-Nal5] (Anygen, Daejeon, Korea, 도 1)을 포함하는 FC131 유사물질을 처리하였다. FC131 유사체의 농도를 결정하기 위하여, GH3 세포를 1, 10 및 100 nM의 FC131 유사체로 처리하였다. 100 nM에서 종양성장의 억제효과가 가장 높았다. 이에, 이후의 실험은 100 nM의 FC131 유사체를 이용하여 수행하였다.

재조합 아데노바이러스 벡터의 제작

인간 GH 프로모터(610, +58; 인간 지놈 DNA에서 클로닝, 도 2a)에서 유래한 루시퍼라제 유전자를 포함하는 카세트를 pcDNA3(Invitrogen)에 기초한 아데노바이러스 전달 플라스미드에 서브클로닝하였다(32). GH3 세포에서의 GH 유전자 활성화를 조사하기 위하여 재조합 아데노바이러스(Ad-GHp-Luc)를 공지된 방법으로 제작하였다(32).

루시퍼라제 분석

GH 3 세포를 12-웰 플레이트에 5x10⁵/웰의 농도로 씨딩(seeding)하고, Ad-GHp-Luc를 세포당 2 PFU(plaque forming units)로 접종하였다. 감염된 세포는 무혈청 배지에서 6시간 동안 CXCR4 길항제(1x10⁷ M, Anygen) 및 소마토스타틴(1x10⁷ M, Sigma-Aldrich)(32)을 처리한 후, 루시퍼라제 분석 시스템(Promega, Madison, WI)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상대광도(Relative light units)는 MicroLumat LB96PEG&G luminometer(Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 이용하여 측정하였으며, 루시퍼라제 활성은 공지된 방법으로 표준화하였다(33).

정량적 실시간 RT-PCR

GH 유전자를 증폭하기 위한 프라이머는 다음과 같이 디자인하였다: 센스, 5’-gctgcgttctgcttctcag-3’및 안티센스, 5’-ccgaggtaccaaacatcagg-3’.

SYBR Green Ⅰ형광염료 및 1xPCR Master Mix(TaKaRa, Shuzo, Kyoto, Japan)를 함유하는 cDNA를 ABI 7300 서열검출 시스템(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 증폭하였다. PCR 사이클 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분간, 95℃에서 15초간 40 사이클, 56℃에서 15초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 연장(extension). 상대적인 발현 수준은 증폭역가 방법(cycle threshold method)을 이용하여 측정하였다(17). 모든 실험에서의 타겟 유전자 발현 수준은 내인적 대조군에 맞추어 표준화하였으며, 데이터는 대조군 mRNA(무 호르몬)에 대한 상대적인 값으로 플롯팅 하였다.

세포 증식의 측정

GH3 세포(5x10³ 세포/웰)를 무혈청 DMEM에서 96-웰 플레이트에 씨딩(seeding)하고, 다음날부터 상이한 길항제를 하루 2회씩 처리하였다. 6일 째에, 세포증식을 비방사성 세포증식 분석기(Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega)를 이용하여 측정하였다. 광학밀도(optical density)는 490 nm에서 측정하였으며, 상대적인 데이터 값은 백분율(평균±표준편차)로 표시하였다(34).

TUNEL

TUNEL(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 분석 키트를 이용한 세포 아폽토시스의 측정은 제조자의 프로토콜에 따라 실시하였다. 요약하자면, GH3 세포를 커버슬립에 씨딩하고 CXCR4 길항제 100 nM 의 존재 또는 부존재 하에서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 세포들을 4% 포름알데히드에 고정시키고 0.1% 소듐 아세테이트에 용해된 0.1% Triton X-100을 이용하여 2분 간 얼음 위에서 투과화한 뒤, 37℃에서 60분 간 DNA 표지 용액에 노출시키고 OLYMPUS BX51 현미경(OLYMPUS, Tokyo, Japan), OLYMPUS DP71 카메라(OLYMPUS) 및 DP controller Software(OLYMPUS)를 이용하여 관찰하였다.

유세포 분석

본 발명자들은 형광-활성화 세포 분류법(fluorescence-activated cell sorting)을 이용하여 CXCR4 길항제가 GH3 세포의 세포주기 및 아폽토시스에 미치는 영향을 분석하였다. CXCR4 길항제를 처리한 후에, GH3 세포(1x10⁶ cells/mL)를 수집하여 2시간 동안 -20℃에서 70% 에탄올에 재부유시켰다. 세포들을 PBS로 세척하고 50 mg/mL RNase A, 0.1 mM EDTA 및 0.1% Triton X-100을 포함하는 0.5 mL PI(propidium iodide, Sigma-Aldrich) 용액에서 30분간 상온에서 암상태로 반복적으로 재부유시켰다. 형광은 PI 채널을 이용하여 검출하였다.

웨스턴 블롯팅

길항제-처리 GH3 세포를 RIPA 완충액(20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 5% 포스파타아제 억제제, 0.5% 프로테아제 억제제)에서 파쇄하였다. 나아가, GH3 세포 배양 배지를 수집하고 농축하여 여막 분석(dialysis)을 하였다. Bradford 단백질 분석 키트(Bio-Rad. Richmond, CA)를 이용하여 조절한 동일한 양을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 이용하여 분리하고 폴리비닐리덴 디플로라이드 막으로 이동시켰다. 인산화된 세포 외 신호조절 카이네이즈(1:1000; Cell Signaling, Beverly, MA), 인-단백질 카이네이즈 B/Akt(1:1000 Cell Signaling), Bcl-2(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Bcl-6(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 캐스파제-3(1:1000; Cell Signaling) 또는 β-액틴(1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)에 대한 1차 항체를 이용하여 블롯들을 내부 대조군으로서 표지하였다.

동물 실험

동물실험은 6주령 수컷 비흉선 면역결핍 누드 마우스(Charles River Japan Inc., Yokohama, Japan)를 이용하여 실시하였다. 5마리로 이루어진 각각의 그룹을 23±2℃, 55± 5% 습도로 조절한 동물실에서 12시간 광조건/12시간 암조건 사이클 하에 놓아 두며 표준 비제한(unrestricted) 먹이를 주었다. GH-분비 종양세포를 수집하여 PBS에서 두 번 세척하고 배지에 재부유시킨 뒤 0일 째에 마우스 옆구리에 주입(2x10⁶ cells)하였다. 이후, 하루 두 번씩 CXCR4 길항제(1.23 mg/kg 체중), 옥트레오타이드(Sandostatin, Norvatis, Stein, Switzerland, 1.23 mg/kg body weight) 또는 PBS를 복강투여하였다(25). 종양의 크기(mm³)는 캘리퍼스를 이용하여 3차원적으로 측정하고(34) 다음의 공식을 이용하여 계산하였다: (3.14 x 길이 x 폭 x 깊이)/6. 처리 후 30일이 지나서, 마우스를 죽이고 종양부분을 제거하였다. 모든 동물실험은 연세대학교 의과대학의 동물실험 윤리위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 수집된 종양조직은 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하고 파라핀 블록을 만들었다. 4-μm 두께의 단면을 H&E, TUNEL 및 Ki-67 염색을 한다. 형광 TUNEL 시약 및 Ki-67에 대한 1차 항체와 함께 배양한 후에, 특이적으로 바이오틴화된 2차 항체(1:100, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 및 스트렙타비딘-퍼록시다제(Dako, Kyoto, Japan)를 연속적으로 배양하였다. DAB(Diaminobenzidine, Vector Laboratories)를 색원체(chromogen)로써 사용하였고 헤마톡실린(hematoxylin)을 이용하여 카운터염색을 하였다.

통계적 분석

모든 통계적 분석은 2개 그룹 간의 비교 또는 2개 이상 그룹 간의 다중 비교를 위하여 스튜던트의 t 검정(Student’s t test)을 이용하여 수행하였으며, 선형 대 선형 결합검정(linear-by-linear association test)을 통해 비교하였다

P<0.05 인 경우 유의적인 연관성이 있는 것으로 간주하였다. 통계적 분석은 Windows 소프트웨어(version 15.0; SPSS Inc., Chicago IL)용 SPSS를 이용하여 수행하였다.

실험결과

CXCR4 길항제는 GH3 뇌하수체 종양세포에서 GH 의 생산 및 분비를 억제시킨다 .

본 발명자들은 CXCR4 길항제가 다양한 펩타이드(소마토스타틴-14, CXCR4 길항제 FC131(사이클로[Gly1-d-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5]), d-Arg3 FC131(사이클로[Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-Nal5]), d-Arg3-d-Nal5 FC131(사이클로[Gly1-d-Tyr2-d-Arg3-Arg4-d-Nal5]))에 대한 반응으로 GH의 분비 및 생산에 관여하는지를 조사하였다. 본 발명자들은 루시퍼라제 유전자로부터 유래한 GH 프로모터를 포함하는 아데노바이러스로 형질전환된 GH3 세포를 사용하였다(도 1a). 루시퍼라제 분석을 통하여 d-Arg3 FC131(100 nM) 및 d-Arg3-d-Nal5 FC131(100 nM)이 대조군(임의의 값으로 1을 설정)과 비교하여 GH 프로모터의 활성을 유의하게 감소(0.02배)시킴을 확인함으로써 CXCR4 길항제인 d-Arg3FC131 및 d-Arg3-d-Nal5FC131가 GH 생산을 전사수준에서 억제함을 알 수 있었다. 루시퍼라제 활성은 길항제 FC131 또는 소마토스타틴-14를 처리한 후 대조군에 비하여 각각 0.3배 및 0.4배로 감소하였다(도 2b).

본 발명자들은 이후 CXCR4의 GH 생산에 대한 억제효과를 정량적 실시간 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 및 웨스턴 블롯팅을 이용하여 조사하였다. d-Arg3FC131 및 d-Arg3-d-Nal5FC131 100 nM 를 투여하자 GH 전사수준이 각각 0.6±0.1배 및 0.67±0.2배 감소하였다(도 2c). 웨스턴 블롯팅 결과 d-Arg3FC131-처리 GH3 세포에서의 GH 단백질 수준 또한 시간 의존적으로 감소함을 알 수 있었다(도 2d). 웨스턴 블롯팅에 의한 정량화 결과로부터, d-Arg3FC131(100 nM)를 처리한 후 18시간이 지난 후부터 GH 발현이 유의하게 감소됨을 알 수 있었다. GH3 세포 배양배지에서의 GH 수준은 시간이 흐름에 따라 증가하였다. 반면, D-Arg3FC131 또는 SST의 처리는 GH3에서 GH의 분비를 억제하였다(도 2e). 이들 결과는 d-Arg-FC131가 GH3 뇌하수체 종양세포에서 GH 생산을 억제함을 명확하게 보여준다.

CXCR4 길항제는 GH3 뇌하수체 선종세포의 증식을 억제시킨다 .

CXCR4 길항제가 놔하수체 종양세포의 증식을 억제하는지 여부를 조사하기 위하여, GH3 세포에 다양한 투여량(dose)(1100 nM)의 CXCR4 길항제 및 소마토스타틴-14를 처리하였다. 처리 후 6일이 지나자 성장이 억제되는 것을 관찰하였다. 그림 3a에서 보듯이, d-Arg3-d-Nal5FC131는 투여량(dose)-의존적으로(10 nM 에서 67.1±13.2%, 100 nM 에서 59.3±10.6%, 양쪽 대조군과 비교시 P<0.05)로 GH3 세포의 성장을 억제한다. d-Arg3FC131의 GH3 세포증식 억제효과는 가장 강력하였으며(100 nM, 30%±3.8, 대조군과 비교시 p<0.01), 소마토스타틴-14의 경우보다 훨씬 강력하였다(100 nM, 65.3% ± 11, 대조군과 비교시 P < 0.05)(도 3a). 따라서, d-Arg3FC131를 다음 실험에 사용하였다. SDF1/CXCR4 상호작용이 Erk1/2 및 포스파티딜이노시톨 3-키나아제/Akt 경로를 자극함으로서 세포의 증식 및 성장을 활성화시킨다는 몇몇 보고들이 있다(25). 따라서, 본 발명자들은 CXCR4 길항제의 세포증식 억제효과가 Erk1/2 및 Akt의 인산화와 관련되었는지 여부를 조사하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 SDF1 처리 후 5, 10 분 또는 10, 30, 60 분 후부터 Erk1/2 및 Akt가 활성화된다는 사실을 보여준다(도 3b). 그러나, 길항제 d-Arg3FC131(100 nM)은 이러한 활성화를 억제하였다.

d- Arg3FC131 는 G1 체크포인트에서 세포주기 억제를 유도하며 아폽토시스를 일으킨다.

CXCR4 길항제-유도 세포증식 억제의 기작을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 유세포 분석기를 이용하여 각각 다른 세포주기에서의 세포 숫자 및 아폽토시스가 진행 중인 세포 숫자를 정량화하였다. 도 4a에서 보는 바와 같이, 세포주기 분석에 의하여 d-Arg3FC131(100 nM) 처리로 인해 G0-G1기의 세포 비율이 증가하였음을 확인함으로써 부분적인 G1 세포주기 어레스트가 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 어레스트는 72시간 동안 지속되었다. 또한 본 발명자들의 연구에 의하여 d-Arg3Fc131가 시간-의존적으로 GH3 세포에서의 아폽토시스를 유도한다는 사실도 밝혀졌다(도 4a). 아폽토시스를 일으킨 세포의 비율(8±3.4%, P < 0.05)은 비이클(vehicle)-처리 GH3 세포(1.35 ± 0.8%)에 비하여 100 nM 의 d-Arg3Fc131 처리 후 72시간 후에 유의하게 증가하였다.

d-Arg3FC131-유도 아폽토시스는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) 분석을 통하여 측정하였다(도 4b). 아폽토시스 핵은 100 nM d-Arg3FC131을 처리한 후 3일이 되자 크게 증가하였다. d-Arg3FC131를 처리한 경우 아폽토시스를 일으킨 세포의 수(33.4 ± 7.1%)는 비이클(vehicle)-처리 GH3 세포에서 아폽토시스를 일으킨 세포의 수(11.24 ± 4.8%)보다 약 3배 증가하였다(P < 0.05). 아폽토시스-관련 유전자에 대한 웨스턴 블롯팅 분석으로 이를 확인하였다. 72시간 동안 d-Arg3Fc131(100 nM)를 처리한 GH3 세포와 처리하지 않은 세포에서의 BCL-6, BCL-2, BCL-XL, Bad, Bax, 캐스파제-3 및 절단된(cleaved) 캐스파제-3의 발현수준을 조사하여 비교하였다(도 4c). 캐스파제-3의 절단된 형태의 양은 0%(대조군)에서 6시간 째에 0.8%로, 12시간 째에 1.2%로, 18시간 째에 1.5%로, 24시간 째에 1.1%로, 48시간 째에 0.8%로, 72시간 째에 0.5%로 증가하였으며(모든 경우에 P<0.05), 대조군과 비교한 BCL-6 발현의 증가는 18시간 후에 관찰되었다. 그러나, d-Arg3FC131의 처리로 인하여 BCL-2, BCL-XL, Bad 및 Bax를 포함하는 BCL 패밀리의 발현수준의 유의한 변화는 유도되지 않았다.

d- Arg3FC131 는 누드마우스 이식 종양모델의 GH3 세포에서 성장을 억제하고 아폽토시스를 촉진한다

CXCR4 길항제인 d-Arg3FC131는 인 비트로에서 세포 성장을 억제하고 아폽토시스를 유도한다는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 d-Arg3FC131가 면역결핍 누드 마우스에서 GH-생산 뇌하수체 선종세포에 의한 종양 생성을 억제할 것이라고 가정하였다(도 5). GH3 세포를 실시예에서 서술한 바대로 수컷 비흉선 마우스(athymic mice)에 피하주사 하였다. d-Arg3FC131 또는 대조군으로서 PBS(phosphate buffered saline)를 주사한 마우스에서는 종양이 15일 이내에 발달하였으며, 옥트레오타이드 투여 마우스와 유사하게, d-Arg3FC131 투여 마우스에서는 종양 형성이 대조군과 비교하여 10일 이상 지연되었다. d-Arg3FC131 처리 마우스에서는 PBS 처리군과 비교하여 종양의 성장률과 크기가 크게 감소하였다. 나아가, d-Arg3FC131의 투여는 종양 무게 및 총 체중을 유의하게 감소시켰다(각각 84±1.9 및 28.16±0.5% ; P<0.05). 옥트레오타이드 처리 마우스와 d-Arg3FC131-처리 마우스 간에서의 종양 성장 억제에 있어서 유의한 차이점이 없었다.

본 발명자들은 조직학을 이용하여 누드 마우스에서의 CXCR4 길항제의 종양 성장에 대한 영향을 조사하였다. 종양 조직에 대한 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색 결과, 대조군의 종양조직에서 적혈구로 채워진 미세혈관이 두드러지지만, d-Arg3FC131 처리-마우스에서는 거의 보이지 않는다는 사실을 확인하였다(도 6 상부 패널). 본 발명자들은 Ki-67을 염색하여 세포 증식을 검출하였으며 종양조직에서의 아폽토시스를 측정하기 위하여 TUNEL 분석을 실시하였다(도 6). Ki-67 발현이 양성인 세포의 숫자 및 TUNEL을 컴퓨터 영상 분석 소프트웨어(Meta Morph, version 4.6, Universal Imaging Co., Downingtown, PA)를 이용하여 카운팅하였다. d-Arg3FC131 처리 마우스의 종양조직은 대조군에 비하여 세포 핵에서 낮은 Ki-67 발현수준을 보였으며(10.3% vs. 4.4%, P < 0.05; 도 6 중간패널), TUNEL-양성 세포핵의 비율은 d-Arg3FC131 처리 마우스에서 유의하게 증가하였다(5.6% vs. 1.2%(대조군) P < 0.05; 도 6 하부패널). 따라서, d-Arg3FC131은 아폽토시스를 유도하고 세포 증식을 억제함으로써 이식된 종양 크기를 감소시킬 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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33. Ishikawa T, Lee EJ, & Jameson JL, Nonhomologous end-joining ligation transfers DNA regulatory elements between cointroduced plasmids. Molecular and cellular biology 24(19):8323-8331(2004).

34. Lee EJ, Duan WR, Jakacka M, Gehm BD, & Jameson JL, Dominant negative ER induces apoptosis in GH(4) pituitary lactotrope cells and inhibits tumor growth in nude mice. Endocrinology 142(9):3756-3763(2001).

Claims (11)

1. Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드(cyclopentapeptide)를 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 사이클로펜타펩타이드는 하기의 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:
   화학식 1
   

   

   
   
   화학식 2
   

   

   
   
   화학식 3
   

   

   
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 사이클로펜타펩타이드는 상기 화학식 2의 사이클로펜타펩타이드인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 종양은 뇌하수체 종양인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 뇌하수체 종양은 과량의 성장호르몬을 생산 및 분비하는 종양이고 상기 조성물은 상기 뇌하수체 종양의 성장호르몬의 생산 및 분비를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 종양세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈관 신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 종양세포의 세포주기를 어레스트하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. Gly1-Tyr2-Arg3-Arg4-Nal5의 아미노산 서열로 구성된 사이클로펜타펩타이드(cyclopentapeptide)를 유효성분으로 포함하는 말단 비대증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 사이클로펜타펩타이드는 하기의 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:
    화학식 1
    

    

    
    
    화학식 2
    

    

    
    화학식 3
    

    

    
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 사이클로펜타펩타이드는 상기 화학식 2의 사이클로펜타펩타이드인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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