KR20120059785A - 3-dimensional matrix - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 세포, 미생물 등을 역분화시키는 3차원 매트릭스에 관한 것이다.
The present invention relates to a three-dimensional matrix for reverse differentiation of cells, microorganisms and the like.
흑색종은 멜라닌 색소를 만들어 내는 멜라닌 세포의 악성화로 생긴 종양으로서, 멜라닌 세포가 존재하는 부위에서는 어디에나 발생할 수 있으나, 피부에 발생하는 경우가 가장 많고, 피부에 발생하는 암 가운데 악성도가 가장 높다. 인간 정상 피부 색소 세포에 비해 역분화되어 있다고 알려진 흑색종을 비롯한 색소 세포 관련 피부 증상의 메커니즘 및 치료 방법에 대한 연구가 필요하다.
Melanoma is a tumor caused by the melaninization of melanocytes that produce melanin pigment, which can occur anywhere in the presence of melanocytes, but most often occurs on the skin, and the highest malignancy among the cancers on the skin. There is a need for research on the mechanism and treatment of pigment cell-related skin symptoms, including melanoma, which is known to be dedifferentiated from human normal skin pigment cells.
본 발명은 3차원 매트릭스용 조성물 및 3차원 매트릭스를 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 3차원 매트릭스를 이용한 세포 배양 방법을 제공하고자 한다.
The present invention is to provide a composition for a three-dimensional matrix and a three-dimensional matrix. In addition, the present invention is to provide a cell culture method using a three-dimensional matrix.
본 발명의 일측면은 콜라겐 4(Collagen Ⅳ), 라미닌(Laminin), 니도젠(Nidogen) 및 프로테오글라이칸(Proteoglycan)을 포함하는 3차원 매트릭스(matrix)용 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a composition for a three-dimensional matrix (Collagen IV), laminin (Laminin), nidogen (Nidogen) and proteoglycan (Proteoglycan).
본 발명의 다른 일측면은 상기 3차원 매트릭스용 조성물을 이용하여 제조한 3차원 매트릭스를 제공한다.Another aspect of the invention provides a three-dimensional matrix prepared using the composition for the three-dimensional matrix.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 3차원 매트릭스를 이용하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다.
Another aspect of the invention provides a cell culture method comprising the step of culturing cells using the three-dimensional matrix.
본 발명에 따른 콜라겐 4(Collagen Ⅳ), 라미닌(Laminin), 니도젠(Nidogen) 및 프로테오글라이칸(Proteoglycan)을 포함하는 3차원 매트릭스(matrix)용 조성물을 이용하여 3차원 매트릭스를 제조할 수 있으며, 상기 3차원 매트릭스 위에 세포를 배양하면 세포 분열이 억제되고 역분화(dedifferentiation)가 일어난다. 따라서 이를 토대로 피부 세포 분화의 메커니즘, 점(nevi), 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소 침착증, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증, 흑색종(mealnoma)을 포함하는 암의 메커니즘 또는 치료 방법 등을 연구할 수 있다.
A three-dimensional matrix can be prepared using the composition for a three-dimensional matrix including collagen 4 (Collagen IV), laminin, nidogen, and proteoglycan according to the present invention. In addition, when the cells are cultured on the three-dimensional matrix, cell division is suppressed and dedifferentiation occurs. Therefore, based on this, the mechanism of skin cell differentiation, nevi, skin hyperpigmentation such as surplus or blotch, pigment deficiency such as vitiligo or white hair, mechanism or treatment method of cancer including melanoma can do.
도 1은 비교예 1과 2 및 실시예 위에 인간 정상 피부 색소 세포를 배양한 경우 세포 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.
도 2는 실시예 위에 배양한 세포의 변화를 촬영한 동영상의 스틸 컷이다.
도 3은 실시예 위에 3일 동안 배양한 세포를 다시 비교예 1 위에 배양한 경우 세포의 형태학적 변화를 나타낸 사진이다.
도 4는 비교예 1과 2 및 실시예 위에 피부 색소 세포를 배양한 경우 티로시나아제, 티로시나아제 관련 단백질 1, 2(TRP 1, 2) 및 GAPDH의 발현 정도를 전기 영동으로 확인한 결과이다.
도 5는 비교예 1과 2 및 실시예 위에 피부 색소 세포를 배양한 경우 멜라닌 함량을 비교한 그래프이다.
도 6은 비교예 1과 2 및 실시예 위에 피부 색소 세포를 배양한 경우 PAX 3, SOX 10 및 PCNA의 발현 정도를 전기 영동으로 확인한 결과이다.1 is a photograph showing cell morphological changes when human normal skin pigment cells were cultured on Comparative Examples 1 and 2 and Examples.
2 is a still cut of a moving picture photographing the change of cells cultured in Example.
Figure 3 is a photograph showing the morphological changes of the cells when the cells cultured for 3 days above Example again cultured on Comparative Example 1.
Figure 4 is a result of confirming the expression level of tyrosinase, tyrosinase-related proteins 1, 2 (TRP 1, 2) and GAPDH when the skin pigment cells were cultured on Comparative Examples 1 and 2 and Example by electrophoresis.
5 is a graph comparing melanin content when the skin pigment cells were cultured on Comparative Examples 1 and 2 and Examples.
6 is a result of confirming the expression level of PAX 3, SOX 10 and PCNA by electrophoresis when the skin pigment cells were cultured on Comparative Examples 1 and 2 and Example.
피부 색소 세포(melanocyte)는 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)을 만드는 세포로서, 피부의 진피와 표피의 경계선 역할을 하는 기저막 위에 위치한다. 발생학적으로 볼 때 피부 색소 세포는 뉴럴 클러스트 세포(neural-crest cells)에서 출발하여 멜라노사이트 줄기 세포(Melanocyte stem cell), 전구 세포인 멜라노블라스트(melanoblast)를 거쳐 피부로 이동하면서 최종적으로 멜라닌을 생성할 수 있는 색소 세포로 분화한다고 알려져 있다. 하지만 이들은 대부분 마우스를 이용한 발생학적 연구에서 도출된 결과들이고, 실제 인간에서는 배아 연구를 할 수 없기 때문에 피부 색소 세포가 어떻게 분화되는지 정확히 연구된 바 없다. 완전히 분화된 피부 색소 세포를 이용한 실험의 경우에도 유전자 조작이나 성장 호르몬 처리 등의 방법으로 피부 색소 세포를 멜라노블라스트로 역분화 시킨 실험은 있으나, 이 또한 인간 피부 색소 세포를 이용한 실험은 없고 마우스나 조류의 색소 세포를 이용한 실험들이다.Skin pigment cells (melanocytes) are the cells that make up the melanin (melanin) that determines the skin color, located on the basement membrane that serves as a boundary between the dermis and epidermis of the skin. Developmentally, the skin pigment cells start from neural-crest cells and travel through the melanocyte stem cell, the progenitor cell melanoblast, to the skin and finally produce melanin. It is known to differentiate into possible pigment cells. However, most of these results are derived from mouse developmental studies, and since humans cannot study embryos, it has not been studied exactly how skin pigment cells differentiate. In the case of experiments using fully differentiated skin pigment cells, there have been experiments in which the skin pigment cells are reversely differentiated into melanoblasts by genetic manipulation or growth hormone treatment. However, there are no experiments using human skin pigment cells. Experiments using pigment cells.
점(nevi), 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소 침착증, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증, 흑색종(mealnoma)을 포함하는 암 등은 피부 색소 세포의 분화와 발생에 이상이 생기면 인간 특이적으로 나타나는 현상이기 때문에, 인간의 피부 색소 세포의 분화와 발생에 대한 실험은 중요하다. 특히 흑색종의 경우 피부 색소 세포에 변이가 일어나 세포 분열이 촉진되고 분화 전 단계에 나타나는 단백질의 발현이 증가되는 등 정상 피부 색소 세포인 경우에 비해 역분화된 특징을 보이는데, 이를 연구하기 위해서는 인간 피부 색소 세포를 역분화시키는 방법이 매우 유용할 것이다. 또한 점의 경우에는 흑색종과 비슷한 특징을 나타내면서도 동시에 세포 분열이 정지하는 특징을 가져 암세포로 발전하지 않는데, 이와 같은 차이점에 대한 연구는 흑색종의 치료에 도움이 될 것이다. 그리고 백모나 백반증은 피부 색소 세포의 줄기 세포가 고갈되어 나타나는 노화 현상이라고 알려진 바 있다. 따라서 인간의 피부 색소 세포를 분화, 역분화, 발생시키는 방법은 그 자체가 매우 중요하다고 볼 수 있다.
Nevi, skin hyperpigmentation such as surplus or blotch, pigment deficiency such as vitiligo or albino, cancers including melanoma, etc. are specific to humans if abnormalities occur in the differentiation and development of skin pigment cells. Because of this phenomenon, experiments on the differentiation and development of human skin pigment cells are important. In particular, melanoma has a reversed characteristic compared to normal skin pigment cells, such as mutation in skin pigment cells, which promotes cell division and increases the expression of proteins during the differentiation stage. Methods for dedifferentiating pigment cells would be very useful. In addition, the point is similar to melanoma but at the same time stops cell division does not develop into cancer cells, the study of the difference will be helpful in the treatment of melanoma. And leukemia and vitiligo are known to be an aging phenomenon caused by depletion of stem cells of skin pigment cells. Therefore, the method of differentiating, dedifferentiating, and generating human skin pigment cells can be considered very important.
하지만 인간 피부 색소 세포는 피부에서 혼자 존재하는 것이 아니라 기저막이라 불리는 특정 매트리스 위에 있으며, 표피의 대부분을 차지하고 있는 각질 형성 세포(keratinocyte)의 지배를 받고 멜라닌(melanin)을 생성한다. 기저막의 주요 성분은 콜라겐 4(Collagen IV), 라미닌(Laminin), 니도젠(Nidogen), 프로테오글라이칸(Proteoglycan) 등이다. 이들 성분 각각이 피부 색소 세포의 분화와 활성에 어떤 역할을 하는지 밝혀져 있지 않으며, 특히 이들 성분을 포함하는 3차원 매트리스 위에 인간 피부 색소 세포를 배양하였을 때 어떤 현상이 일어나는지에 대한 보고는 전혀 없다.Human skin pigment cells, however, do not exist alone in the skin, but on a specific mattress called the basement membrane, which is controlled by keratinocytes, which make up most of the epidermis, producing melanin. The main components of the basement membrane are collagen IV, laminin, nidogen, and proteoglycan. It is not known how each of these components plays a role in the differentiation and activity of skin pigment cells, and there are no reports on what happens especially when human skin pigment cells are cultured on a three-dimensional mattress comprising these components.
다만 흑색종의 경우 피부의 기저막을 통과하여 진피로 이동하는데, 이것은 암 전이의 매우 중요한 단계이기 때문에 이를 연구하기 위해 위의 4가지 주요 성분을 세포 배양기 바닥에 코팅하고, 세포의 2차원적 움직임을 연구한 예는 있으나, 이는 3차원적 배양과 다르다. 또한 기저막이 피부뿐만 아니라 혈관이나 뇌, 기타 생체 조직에도 존재하여 다른 조직들과 경계를 이루는 역할을 하기 때문에 기저막 위에 혈관 내피 세포를 배양하고 in vitro 상에서 혈관을 형성하는 연구를 한 예가 있으나, 완전히 분화된 정상 인간 피부 색소 세포를 기저막 위에 3차원적으로 배양한 예는 없다.
However, melanoma passes through the basement membrane of the skin and into the dermis, which is a very important stage of cancer metastasis. To study this, four main components of the above are coated on the bottom of the cell incubator. There is an example studied, but this is different from three-dimensional culture. In addition, the basement membrane because it acts not only exist in the skin blood vessels and brain and other biological tissue bounded with other organizations cultured endothelial cells on the basilar membrane and in There is an example of the formation of blood vessels in vitro , but no three-dimensional culture of fully differentiated normal human skin pigment cells on the basement membrane.
본 명세서에서 "매트릭스(matrix)"는 세포, 미생물 등이 붙어 자라는 지지대로서, 실제 세포 등이 자라는 주변 환경 내지 그와 유사한 환경, 예를 들어 실제 주변 환경이 가지는 물리적 또는 화학적 특징을 부여해 주기 위해 특정 구조의 단백질 또는 여러 성분을 첨가하여 만든 혼합물을 의미한다. As used herein, a "matrix" is a support on which cells, microorganisms, and the like grow, and is used to give a physical or chemical characteristic to the surrounding environment in which the actual cells grow, or similar environments, for example, the actual surrounding environment. Refers to a mixture of proteins or other components of the structure.
본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
As used herein, the term "skin" refers to a tissue covering the body surface of an animal, and is a broad concept including not only tissues covering the body surface such as the face or body, but also the scalp and hair.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일측면은 콜라겐 4(Collagen Ⅳ), 라미닌(Laminin), 니도젠(Nidogen) 및 프로테오글라이칸(Proteoglycan)을 포함하는 3차원 매트릭스(matrix)용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일측면은 상기 3차원 매트릭스용 조성물을 이용하여 제조한 3차원 매트릭스를 제공한다.One aspect of the present invention provides a composition for a three-dimensional matrix (Collagen IV), laminin (Laminin), nidogen (Nidogen) and proteoglycan (Proteoglycan). Another aspect of the invention provides a three-dimensional matrix prepared using the composition for the three-dimensional matrix.
상기 3차원 매트릭스에 세포, 구체적으로 완전히 분화된 정상 인간 피부 색소 세포를 배양하는 경우 줄기 세포와 같이 서로 끌어당겨 뭉치는 현상이 나타나며, 색소 세포의 최종 분화 산물인 멜라닌 생성이 억제되고, 멜라닌을 생성하는 효소인 티로시나아제(tyrosinase) 및 관련 단백질(tyrosinase related protein 1, 2)의 발현이 감소한다. 또한 뉴럴 클러스트 세포(neural-crest cells)에서 발현되어 멜라노블라스트(melanoblast)로 변화되게 하는 중요한 전사인자로서, 완전히 분화된 인간 정상 피부 색소 세포에서는 발현되지 않는다고 알려진 역분화 마커인 PAX 3의 발현이 증가한다. 그리고 초기 분화 단계에서부터 PAX 3와 함께 발현되는 전사 인자이지만, PAX 3과는 달리 완전히 분화된 인간 피부 색소 세포에서 계속 발현되는 분화 마커인 SOX 10의 경우 그 발현이 감소한다. SOX 10는 멜라노사이트 줄기 세포가 존재한다고 알려진 모발의 팽륭부(hair bulge)에서는 발현이 억제된다고 알려져 있기도 하다. 또한 세포 증식의 마커인 PCNA의 발현이 억제되어 세포 분열이 감소됨을 확인할 수 있다. 이는 2차원적으로 조성물을 얇게 코팅하고 피부 색소 세포를 얹어 배양하거나 다른 성분으로 이루어진 매트릭스용 조성물을 이용하는 경우 얻을 수 없는 효과이다.In the case of culturing cells, specifically, fully differentiated normal human skin pigment cells, in the three-dimensional matrix, they are attracted and aggregated together like stem cells, and melanin production, which is the final differentiation product of pigment cells, is suppressed and melanin is produced. The expression of tyrosinase and tyrosinase related proteins 1 and 2, which are enzymes, decreases. It is also an important transcription factor that is expressed in neural-crest cells and transformed into melanoblasts, resulting in increased expression of PAX 3, a known differentiation marker that is not expressed in fully differentiated human normal skin pigment cells. do. SOX 10, which is a transcription factor expressed with PAX 3 from the early differentiation stage but is continuously expressed in fully differentiated human skin pigment cells unlike PAX 3, decreases its expression. SOX 10 is also known to inhibit expression in the hair bulge, where it is known that melanocyte stem cells are present. In addition, the expression of PCNA, a marker of cell proliferation, may be suppressed to decrease cell division. This is an effect that cannot be obtained when the composition is thinly coated in two dimensions and cultured by placing skin pigment cells on top of each other or using a composition for a matrix composed of other components.
이러한 결과를 토대로, 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 포함하는 3차원 매트릭스용 조성물을 이용하여 제조한 3차원 매트릭스에서 세포를 배양하는 경우 세포 분열이 억제되고 역분화가 일어난다는 것을 알 수 있다. 즉, 상기 3차원 매트릭스는 세포 분화 억제 또는 역분화가 일어나도록 할 수 있다.Based on these results, cell division was inhibited and reverse differentiation occurred when the cells were cultured in the three-dimensional matrix prepared using the composition for the three-dimensional matrix including collagen 4, laminin, nidogen, and proteoglycan. Able to know. That is, the three-dimensional matrix may allow cell differentiation inhibition or reverse differentiation to occur.
흑색종은 인간 정상 피부 색소 세포에 비해 역분화되어 있다고 알려져 있으며, 점과 함께 PAX 3의 발현이 증가하는 대표적인 피부 증상이다. 그리고 세포 분열이 감소되는 것은 점 등의 과색소 침착증과 줄기 세포의 특징 중 하나라고 알려져 있다. 따라서, 세포를 배양하면 그 분열이 억제되고 역분화가 나타나는 본 발명에 따른 3차원 매트릭스를 이용하여 점(nevi), 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소 침착증, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증, 흑색종(mealnoma)을 포함하는 암의 메커니즘 및 치료 방법 등을 연구할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로 본 발명에 따른 3차원 매트릭스는 세포가 역분화된 상태에서 자외선이나 임의의 물질을 처리하였을 때 흑색종이나 점이 나타나는지 확인하여 임의의 물질이 발암성 물질인지 여부 등을 판단할 수 있다.
Melanoma is known to be dedifferentiated compared to human normal skin pigment cells and is a representative skin symptom with increased expression of PAX 3. Reduction of cell division is known to be one of the features of hyperpigmentation and stem cells. Therefore, by culturing the cells, the division is suppressed and reverse differentiation is carried out using the three-dimensional matrix according to the present invention. The mechanism and treatment of cancer, including species (mealnoma) will be studied. More specifically, the three-dimensional matrix according to the present invention may determine whether any substance is a carcinogenic substance by checking whether melanoma or spots appear when UV or any substance is treated in a state where cells are dedifferentiated.
본 발명의 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 각각 조성물 전체 중량 대비 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 각각 조성물 전체 중량 대비 0.01 중량% 내지 20 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 각각 조성물 전체 중량 대비 0.1 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 중량%로 포함되는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.In one aspect of the present invention, the composition for a three-dimensional matrix may include collagen 4, laminin, nidogen and proteoglycan in 0.001% to 30% by weight relative to the total weight of the composition, respectively. In another aspect of the present invention, the composition for a three-dimensional matrix may include collagen 4, laminin, nidogen and proteoglycans each 0.01 to 20% by weight relative to the total weight of the composition. In another aspect of the present invention, the composition for a three-dimensional matrix may include collagen 4, laminin, nidogen and proteoglycan in 0.1% to 10% by weight relative to the total weight of the composition, respectively. When included in the weight percent, not only is it appropriate to exhibit the intended effect of the present invention, but also satisfies both the stability and safety of the composition, it may be appropriate to include in the above range in terms of cost-effectiveness.
본 발명의 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 인간, 마우스 또는 조류와 같은 척추 동물의 기저막 또는 세포에 포함된 성분을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 척추 동물의 기저막 또는 세포에서 추출한 추출물을 더 포함할 수 있다. 이로 인해, 기저막 또는 세포와 더욱 유사한 조건을 제공할 수 있다.In one aspect of the invention, the composition for three-dimensional matrix may further comprise a component contained in the basement membrane or cells of vertebrates, such as humans, mice or birds. In another aspect of the invention, the composition for three-dimensional matrix may further comprise an extract extracted from the basement membrane or cells of vertebrates. This may provide conditions more similar to the basement membrane or cells.
본 발명의 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma에서 추출한 겔성 단백질 혼합물(gelatinous protein mixture)일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물은 2-14 mg/ml, 보다 구체적으로 7-10 mg/ml의 단백질 농도를 가질 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 3차원 매트릭스용 조성물은 -20℃이하에서 냉동 보관될 필요가 있을 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스용 조성물로 매트리겔™(Matrigel™, BD Sciences 사 제품)을 이용할 수 있다.In one aspect of the invention, the composition for the three-dimensional matrix may be a gelatinous protein mixture extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma. In another aspect of the invention, the composition for three-dimensional matrix may have a protein concentration of 2-14 mg / ml, more specifically 7-10 mg / ml. Composition for a three-dimensional matrix according to an aspect of the present invention may need to be stored frozen at -20 ° C or less. In another aspect of the present invention, Matrigel ™ (Matrigel ™, manufactured by BD Sciences) may be used as a composition for a three-dimensional matrix.
본 발명의 일측면에서, 3차원 매트릭스는 척추 동물의 피부 세포, 피부 색소 세포 또는 정상 피부 색소 세포의 분열 억제 또는 역분화를 위한 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스는 인간 세포, 피부 세포 및 색소 세포 중 하나 이상의 분열 억제 또는 역분화를 위한 것일 수 있다. 상기에서 인간 세포는 흑인종, 백인종, 황인종 또는 혼혈인의 세포를 모두 포함하며, 인간의 모든 세포를 포함한다. 또한 본 발명의 또 다른 일측면에서, 3차원 매트릭스는 인간 피부 세포, 인간 색소 세포, 인간 피부 색소 세포 또는 정상 인간 피부 색소 세포의 분열 억제 또는 역분화를 위한 것일 수 있다. 상기 모든 세포들은 완전히 분화된 것을 포함한다. 특히 완전히 분화된 정상 인간 피부 세포를 본 발명의 일측면에 따른 3차원 매트릭스에서 배양하는 경우 세포 분열이 억제되고 역분화가 일어나는 효과가 뛰어나므로 유용하다. 피부 색소 세포의 분화가 가장 많이 일어난 흑인의 정상 피부 세포를 본 발명의 일측면에 따른 3차원 매트릭스에서 배양하는 경우 그 효과를 가장 확연히 관찰할 수 있어 더욱 유용할 수 있다.
In one aspect of the invention, the three-dimensional matrix may be for suppression or reverse differentiation of skin cells, skin pigment cells or normal skin pigment cells of vertebrates. In another aspect of the invention, the three-dimensional matrix may be for inhibiting or re-differentiating one or more of human cells, skin cells and pigment cells. In the above, the human cell includes all cells of a black race, a white race, a yellow race, or a mixed race, and includes all cells of a human. In still another aspect of the present invention, the three-dimensional matrix may be for inhibiting or re-differentiating human skin cells, human pigment cells, human skin pigment cells or normal human skin pigment cells. All of these cells contain fully differentiated cells. In particular, when fully differentiated normal human skin cells are cultured in a three-dimensional matrix according to an aspect of the present invention is useful because cell division is suppressed and the effect of reverse differentiation is excellent. When the normal skin cells of the black, which have the most differentiation of skin pigment cells, are cultured in a three-dimensional matrix according to an aspect of the present invention, the effect can be observed most clearly, and thus may be more useful.
본 발명의 일측면은 상기 3차원 매트릭스를 이용하여 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다. 상기 세포 배양 방법을 통해 세포 분열이 억제되고 역분화된 세포를 수득할 수 있으므로, 이를 토대로 점(nevi), 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소 침착증, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증, 흑색종(mealnoma)을 포함하는 암의 메커니즘 및 치료 방법 등을 연구할 수 있을 것이다.
One aspect of the invention provides a cell culture method comprising the step of culturing cells using the three-dimensional matrix. Since cell division is suppressed and dedifferentiated cells can be obtained through the cell culture method, hyperpigmentation such as nevi, surplus or blotch, pigment deficiency such as vitiligo or white hair, melanoma ( The mechanism and treatment of cancer including mealnoma may be studied.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Comparative Examples and Experimental Examples. However, the following Examples, Comparative Examples and Experimental Examples are provided only for the purpose of illustration in order to facilitate understanding of the present invention, but the scope and scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 및 비교예][Examples and Comparative Examples]
기저막의 중요 구성 성분인 콜라겐 4(collagen IV), 라미닌(laminin), 니도젠(Nidogen) 및 프로테오글라이칸(proteoglycan)이 7-10 mg/ml로 함유된 혼합 젤성(gelatinous) 조성물(Matrigel™, BD Biosciences)(-20℃에서 냉동 보관)을 얼음에 녹여 액체 상태로 만들었다. 이를 6-웰 플레이트에 웰 당 1.5ml씩 넣은 후 37℃ 배양기에서 한 시간 이상 굳혀 3차원 매트릭스를 제조한 다음 실시예로 하였다. 젤라틴(gelatin)이 코팅된 6-웰 플레이트를 제조하여 비교예 1로 하였고, 진피의 구성 성분인 콜라겐 1(collagen Ⅰ, 1mg/ml)로 만든 3차원 매트릭스를 제조하여 비교예 2로 하였다.
Mixed gelatinous composition (Matrigel ™ ) containing 7-10 mg / ml of collagen IV, laminin, nidogen and proteoglycan, which are important components of the basement membrane , BD Biosciences (frozen storage at -20 ° C) was dissolved in ice to form a liquid. 1.5 ml per well was put in a 6-well plate and then solidified in an incubator at 37 ° C. for at least one hour to prepare a three-dimensional matrix. Gelatin-coated 6-well plate was prepared as Comparative Example 1, and a three-dimensional matrix made of collagen 1 (collagen I, 1 mg / ml) of the dermis was prepared as Comparative Example 2.
[실험예 1] 배양한 세포의 형태학적 특징Experimental Example 1 Morphological Characteristics of Cultured Cells
비교예 1의 플레이트 및 비교예 2와 실시예의 3차원 매트릭스 위에 인간 정상 피부 색소 세포를 웰 당 2 X 105개가 되도록 넣었다. 실험에 사용한 인간 정상 피부 색소 세포는 흑인 신생아의 표피에서 배양한 세포로써 멜라닌 생성량이 많고 분화 관련 유전자의 발현이 높아 실험의 효과를 분명하게 볼 수 있다는 장점이 있다. 이후 Cascade Biologics 사에서 판매하는 미디움 254(Medium 254) 배지에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate) 10 ng/ml을 함유한 인간 멜라노사이트 성장 보충제(HMGs, human melanocyte growth supplement)를 넣어 배지를 만든 후 이것을 웰 당 2 ml씩 넣어주었다. 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양한 후 1일, 3일 뒤에 광학 현미경 사진을 찍어 형태 변화를 확인하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다. A와 D는 각각 비교예 1의 배양 1일 및 3일 후, B와 E는 각각 비교예 2의 배양 1일 및 3일 후, C와 F는 실시예의 배양 1일 및 3일 후를 나타낸다. 또한 타임랩스(time lapse) 현미경을 사용하여 세포를 배양한 후 하루에서 이틀 사이의 형태 변화를 동영상으로 촬영하였다. 촬영 스틸 컷을 도 2에 나타내었다.Human normal skin pigment cells were placed on the plate of Comparative Example 1 and the three-dimensional matrix of Comparative Example 2 and Example to be 2 × 10 5 cells per well. Human normal skin pigment cells used in the experiments are cells cultured in the epidermis of black newborns, and have high melanin production and high expression of differentiation-related genes. Human melanocyte growth supplement (HMGs, human) containing 10 ng / ml of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in Medium 254 medium sold by Cascade Biologics. melanocyte growth supplement) was added to the medium, followed by 2 ml per well. One day, three days after incubating the cells in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator to confirm the morphological changes by taking optical micrographs and the results are shown in FIG. A and D after 1 day and 3 days of culture of Comparative Example 1, B and E after 1 day and 3 days of culture of Comparative Example 2 respectively, and C and F after 1 day and 3 days of culture of Example. In addition, after culturing the cells using a time lapse (micrograph) of the morphology changes between one day and two days were photographed. The photographing still cut is shown in FIG.
도 1에서 보는 바와 같이, 비교예 1과 2에서는 세포가 세포 가지(dendrite)를 많이 뻗으면서 골고루 분산되어 자라고 있는 반면에 실시예에서는 세포 가지가 없어지고 서로 뭉치면서 세포 덩어리(cluster)를 이루고 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 타임랩스를 이용한 동영상 촬영에서도 실시예의 경우 세포가 서로 가지를 뻗어 만나면서 서로를 끌어당겨 뭉치는 현상이 확인되었다. 도 2에서 가지를 뻗어 서로 끌어 당기고 있는 세포 모습을 확인할 수 있다.As shown in Figure 1, in Comparative Examples 1 and 2 cells are evenly distributed while growing a lot of cell branches (dendrite), while in the embodiment the cell branches are lost and clustered together to form a cluster (cluster) You can see that. In addition, in the video recording using the time-lapse, in the embodiment, the cells were stretched to meet each other and pulled together to see a phenomenon. In Figure 2, you can see the cells stretched to each other pulling the branches.
줄기 세포(stem cell)의 경우에는 세포가 뭉쳐 있어야 줄기 세포의 성질을 잃어버리지 않기 때문에 줄기 세포 성질을 유지하기 위해서는 인위적으로 세포가 뭉쳐 자랄 수 있도록 하는 것이 필요하다. 본 실험을 통해 실시예의 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 포함하는 3차원 매트릭스에서 완전히 분화된 인간 피부 색소 세포를 배양하는 경우 줄기 세포와 같이 뭉치는 현상이 나타남을 관찰하여, 실시예에서 세포를 배양하면 줄기 세포의 성질이 나타남을 확인할 수 있다.
In the case of stem cells, since the cells do not lose their properties when they are clustered, it is necessary to allow the cells to grow artificially to maintain stem cell properties. In this experiment, when culturing fully differentiated human skin pigment cells in a three-dimensional matrix containing collagen 4, laminin, nidogen, and proteoglycans, the clustering like stem cells appeared. In the example, the culture of the cells can be seen that the properties of the stem cells.
[실험예 2] 일반 배지에서의 재배양Experimental Example 2 Cultivation in General Media
실험예 1과 같이 실시예의 3차원 매트릭스 위에서 3일 동안 키워 덩어리를 이루고 있는 인간 정상 피부 색소 세포를 때어낸 후 아무것도 코팅하지 않은 6 웰 플레이트에 넣고 9일간 배양하였다. 배양 1일, 3일, 4일, 5일 및 9일 후 사진을 도 3에 나타내었다.As in Experiment 1, human normal skin pigment cells, which were grown on a three-dimensional matrix in Example for 3 days, were removed, and then placed in a 6-well plate coated with nothing and incubated for 9 days. Photos are shown in FIG. 3 after 1, 3, 4, 5 and 9 days of culture.
도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 아무 것도 코팅하지 않은 6 웰 플레이트에서 다시 배양하는 경우 인간 정상 피부 색소 세포 덩어리가 풀어지면서 다시 세포 가지를 뻗으며 분산되어 자랐다. 또한 이것을 다시 때어내어 실시예의 3차원 매트릭스 위에서 키우면 다시 세포 덩어리가 만들어짐을 확인하였다.
As can be seen in Figure 3, when cultured again in a 6-well plate coated with nothing, the normal human skin pigment cell mass was released, and the cells branched out again to grow. In addition, it was confirmed that by squeezing again and growing on the three-dimensional matrix of the example, the cell mass was formed again.
[실험예 3] 배양한 세포의 분화 단백질 및 멜라닌 생성 정도 평가Experimental Example 3 Evaluation of Differentiated Protein and Melanin Formation in Cultured Cells
실시예의 3차원 매트릭스 위에서 3일간 배양한 세포를 떼어내어 단백질을 추출하고 전기 영동으로 단백질을 크기 별로 분리하였다. 이렇게 전기 영동으로 분리한 단백질 중 티로시나아제(tyrosinase), 티로시나아제 관련 단백질 1과 2(tyrosinase-related protein 1과 2)를 항체(antibody)를 이용한 면역 반응(Western blotting)으로 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다(A: 비교예 1, B: 비교예 2, C: 실시예).Cells cultured for 3 days on the three-dimensional matrix of the Example were removed, proteins were extracted, and proteins were separated by size by electrophoresis. Among the proteins isolated by electrophoresis, tyrosinase and tyrosinase-related proteins 1 and 2 were identified by Western blotting using an antibody. The results are shown in Fig. 4 (A: Comparative Example 1, B: Comparative Example 2, C: Example).
또한 각 세포의 멜라닌 함량을 측정하였으며, 비교예 1에서 배양한 세포의 멜라닌 함량을 100으로 하였을 때 나머지의 상대적인 멜라닌 함량(%)을 도 5에 그래프로 나타내었다.In addition, the melanin content of each cell was measured, and the relative melanin content (%) of the rest when the melanin content of the cells cultured in Comparative Example 1 was 100 is shown in the graph in FIG.
도 4의 GAPDH에서 볼 수 있듯이, 비교예 1과 2 및 실시예 모두 단백질이 동일한 양으로 전기 영동되었다는 것을 확인할 수 있다. 그리고 비교예 1의 플레이트 또는 비교예 2의 매트릭스에서 배양한 세포에 비해 실시예의 3차원 매트릭스에서 배양한 세포의 분화 단백질의 발현이 현격히 줄어든 것을 알 수 있다. 즉, 실시예의 3차원 매트릭스에서 세포를 배양하는 경우 그 분화가 억제됨을 확인할 수 있다.As can be seen in the GAPDH of Figure 4, in both Comparative Examples 1 and 2 it can be seen that the protein was electrophoresed in the same amount. And it can be seen that the expression of the differentiated protein of the cells cultured in the three-dimensional matrix of Example compared with the cells cultured in the plate of Comparative Example 1 or the matrix of Comparative Example 2 significantly. That is, when the cells are cultured in the three-dimensional matrix of the embodiment it can be confirmed that the differentiation is suppressed.
또한 도 5에서 볼 수 있듯이, 실시예의 3차원 매트릭스 위에서 배양한 세포의 멜라닌 양은 비교예에 비해 약 50% 가량 감소함을 확인할 수 있다. 즉, 실시예의 3차원 매트릭스에서 세포를 배양하는 경우 분화가 억제되어 멜라닌 생성이 이루어지지 않음을 알 수 있다. 한편 분화 단백질의 발현이 배양 후 3일 만에 거의 대부분 억제되었는데도 불구하고 멜라닌 양은 반밖에 줄어들지 않은 것은 한번 생성된 멜라닌은 세포 내에서 분해되지 않기 때문에 실험 시작 전에 세포가 이미 가지고 있던 멜라닌이 계속 존재하여 3일 동안 새로 만들어지는 멜라닌의 양만 변하였기 때문이다.
In addition, as can be seen in Figure 5, the melanin amount of the cells cultured on the three-dimensional matrix of the Example can be seen that about 50% decrease compared to the comparative example. That is, when culturing the cells in the three-dimensional matrix of the embodiment it can be seen that differentiation is suppressed, melanin production is not made. On the other hand, despite the fact that the expression of differentiation proteins was almost suppressed after 3 days of culture, the melanin amount was only reduced by half. This is because only the amount of melanin produced during the three days has changed.
[실험예 4] 관련 단백질 발현 변화 관찰Experimental Example 4 Observation of Changes in Related Protein Expression
분화 전 단계의 멜라노블라스트(melanoblast), 멜라노사이트 줄기 세포(melanocyte stem cell) 및 흑색종(melanoma)에서 발현이 증가 또는 감소한다고 알려진 PAX 3과 SOX 10, 그리고 세포 증식의 마커인 PCNA의 발현을 면역 반응(Western blotting)으로 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다(A: 비교예 1, B: 비교예 2, C: 실시예).Immune the expression of PAX 3 and SOX 10, which are known to increase or decrease expression in pre-differentiation melanoblasts, melanocyte stem cells and melanoma, and markers of cell proliferation The reaction was confirmed by Western blotting. The results are shown in Fig. 6 (A: Comparative Example 1, B: Comparative Example 2, C: Example).
도 6의 GAPDH에서 볼 수 있듯이, 비교예 1과 2 및 실시예 모두 단백질이 동일한 양으로 전기 영동되었다는 것을 확인할 수 있다. 그리고 비교예 1과 2의 경우 PAX 3의 발현이 감소되고 SOX 10과 PCNA의 발현이 증가함에 반해, 실시예의 3차원 매트릭스 위에 배양한 세포의 경우 PAX 3의 발현이 증가하고, SOX 10과 PCNA의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있다.As can be seen in the GAPDH of Figure 6, it can be seen that in both Comparative Examples 1 and 2 and Example the protein was electrophoresed in the same amount. In Comparative Examples 1 and 2, the expression of PAX 3 was decreased and the expression of SOX 10 and PCNA was increased, whereas in the cells cultured on the three-dimensional matrix of Example, the expression of PAX 3 was increased, and the expression of SOX 10 and PCNA was increased. It can be seen that the expression decreases.
이상의 결과들로부터 콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸을 포함하는 3차원 매트릭스 위에 완전히 분화된 인간 정상 피부 색소 세포를 배양하면 세포의 분화가 억제됨과 동시에 역분화가 일어나며 세포 분열이 감소되는 등 줄기 세포, 점, 흑색종과 같은 특징을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서 이를 이용하여 각종 색소 관련 피부 질환들의 발생과 생리적 기작을 알 수 있고 이들을 예방하고 제어하는데 필요한 기술을 개발할 수 있을 것으로 판단된다.From the above results, culture of fully differentiated human normal skin pigment cells on a three-dimensional matrix containing collagen 4, laminin, nidogen and proteoglycan inhibits cell differentiation, reverse differentiation and decreases cell division. It can be seen that such features as stem cells, spots, melanoma and the like. Therefore, it is possible to know the occurrence and physiological mechanisms of various pigment-related skin diseases and to develop the technology necessary to prevent and control them.
Claims (8)
Collagen 4 (Collagen IV), Laminin (Laminin), Nidogen (Nidogen) and a composition for a three-dimensional matrix (proteoglycan) containing (Proteoglycan).
콜라겐 4, 라미닌, 니도젠 및 프로테오글라이칸은 각각 조성물 전체 중량 대비 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 3차원 매트릭스용 조성물.
The method of claim 1,
Collagen 4, laminin, nidogen and proteoglycan are each composed of 0.001% to 30% by weight relative to the total weight of the composition for a three-dimensional matrix composition.
3차원 매트릭스는 세포 분열 억제 또는 세포 역분화를 위한 3차원 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 매트릭스용 조성물.
The method of claim 1,
Three-dimensional matrix composition for a three-dimensional matrix, characterized in that it comprises a three-dimensional matrix for cell division inhibition or cell dedifferentiation.
세포는 인간 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 매트릭스용 조성물.
The method of claim 3, wherein
The cell is a composition for a three-dimensional matrix, characterized in that it comprises a human cell.
세포는 피부 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 매트릭스용 조성물.
The method of claim 3, wherein
The cell is a composition for a three-dimensional matrix, characterized in that it comprises skin cells.
세포는 색소 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 매트릭스용 조성물.
The method of claim 3, wherein
The cell is a composition for a three-dimensional matrix, characterized in that it comprises a pigment cell.
A three-dimensional matrix prepared using the composition for three-dimensional matrix according to any one of claims 1 to 6.
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