KR20120058370A - 베르베린을 함유하는 조골세포 분화 촉진 조성물 - Google Patents

Abstract

베르베린(BBR)은 조골세포 내에서 p38 MAPK를 통하여 Runx2의 활성을 촉진시키고 p38 MAPK-RUNX2 경로를 통하여 COX2 발현을 증대시킴으로써, 조골세포 분화를 증가시키는데 이는 생체 외에서의 새로운 골 형성 시험으로 입증되었다. 그러므로, 잠재적으로 BBR은 골다공증을 비롯한 뼈-관련 질병을 치료하기 위한 치료용 조성물로 이용할 수 있다.

Description

베르베린을 함유하는 조골세포 분화 촉진 조성물 {Composition for promoting osteoblast differentiation comprising berberine}

본 발명은 조골세포 분화 촉진 및 뼈 관련 질병의 치료용 조성물에 관한 것이다.

조골세포는 중간엽 줄기세포로부터 유래하고 골질 표면에 침착된다(1). 조골세포는 골 형성과정 중에 매트릭스 단백질을 합성하며 이 단백질이 이후 무기질화 된다(2). 조골세포는 Runx2 및 오스테릭스를 비롯한 몇 가지 전사인자들에 의해 영향을 받는다(3, 4). Runx2는 전적으로 무기질화된 조직 및 조골세포 내에서 발현되며 골 합성 및 골 형성에 있어서 핵심적인 전사인자로 알려져 있다(5). 중간엽 줄기세포에서의 Runx2의 과발현은 조골세포 분화를 촉진시킨다(6). Runx2 대립유전자 중 하나가 불활성되면 빗장머리뼈 이골증(the cleidocranial dysplasia syndrome), 생쥐와 인간의 세포막 내 골화작용을 통한 골 형성을 위한 조골세포 분화의 지연에 의하여 발생하는 질병이 발생한다(4, 7). 동형접합성 Runx2가 결손되거나 Runx2의 카르복시기 말단을 제거한 생쥐는 기능적인 조골세포의 완전한 결실, 무기질화된 뼈 및 비대성의 연골이 나타난다(8, 9). 그러나, Runx2 발현과 조골세포 마커 유전자의 발현 정도는 적어도 실험실 연구에 있어서는 상관관계가 거의 없다. 예를 들어, 오스테오칼신(osteocalxin, OC) 및 오스테오폰틴(osteopontin, OPN)과 같은 다른 조골세포 마커 유전자들의 발현은 급격히 증가하는 반면, Runx2 단백질 수치는 MC3T3-E1 세포에서 골 합성 중에 상당히 감소하지는 않는다(10). 더욱이, Runx2의 전사적인 활성을 증가시킴으로써 세포 밖의 기질(extracellular matrix, ECM) 생성이 조골세포 분화를 유도하는 것으로 알려져 있으나, Runx2 mRNA 또는 단백질 수치에 있어서 상당한 변화를 수반하지는 않는다(10, 11). 따라서, Runx2가 양에 있어서의 변화에 의한 것이 아니라 아마도 번역후(post-translation)의 단계에서 활성의 변화를 통하여 조골세포 분화를 또한 조절하는 것으로 나타났다.

조골세포에 의해 생성되는 주요한 프로스타글란딘(prostaglandin)인 프로스타글란딘 E₂ (prostaglandin E₂, PGE₂)는 조골세포 복제와 분화를 동시에 증가시킴으로써 골 형성을 촉진한다(12). 아라키돈산(arachidonic acid)의 세포막 인지질로부터 PGE₂로의 변환을 조절하는 속도제한 효소(rate-limiting enzymes)는 COX1과 COX2를 포함하는 사이클로옥시지나제들(COXs)이다(13, 14). COX2는 종양괴사인자-α와 BMP-2와 같은 다양한 호르몬들과 사이토카인들에 의해 유도될 수 있는 발현을 나타내는 반면 COX1은 구성적으로(constitutively) 발현된다(13, 15). 조골세포에 있어서, BMP-2는 Runx2-의존 방식으로 COX2 발현을 촉진하는 반면, 골 합성 유전자 발현 및 골 형성에 있어서는 필수적인 것으로 나타났다(15). 비록 COX2가 골 대사를 위하여 중요한 요소임에도 불구하고, 조골세포에 있어서의 COX2의 조절에 대해서는 거의 알려져 있지 아니하다.

베르베린(BBR)은 황련(Rhizoma coptidis), 황백(Cortex phellodendri)을 포함한 몇몇 약용식물로부터 추출되는 이소퀴놀린 알카로이드(isoquinoline alkaloid) 화합물이다. 최근의 연구결과는 BBR이 퍼옥시좀-증식제-활성화 수용체 감마(proliferator-activated receptor gamma; PPARg)와 같은 지방합성 전사 인자들의 발현을 저해함으로써 지방세포 분화를 억제하는 것으로 밝혀졌다(16, 17). 비록 베르베린(BBR)의 직접적인 세포 표적은 아직 밝혀지지 않았지만, BBR은 근육세포(myocytes)와 지방세포(adipocytes)에 있어 지방대사 조절을 위하여 AMP-활성 단백질 키나아제(AMP-activated protein kinase; AMPK)와 분열제-활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases; MAPKs)를 강력하게 활성시킨다(17, 18). 따라서, 아마도 BBR은 AMPK 또는 MAPKs를 통하여 어떤 세포 타입의 분화 및/또는 물질대사를 조절할 수 있을 것이다.

최근에, BBR이 골밀도를 증가시키고 파골세포 활성을 저해함으로써 골다공증 발생을 감소시킨다고 보고된바 있다(19). 그러나, 골 합성 과정 중의 조골세포에 미치는 BBR의 영향은 철저하게 밝혀지지는 않았다. 본 발명에서, 본 발명자들은 BBR이 Runx2의 인산화반응을 촉진시키고 Runx2의 전사적인 활성을 증가시키는데, 이는 SB203580, p38 MAPK-특이 억제자에 의하여 섬세하게 억제됨을 입증하였다. 게다가, BBR은 Runx2와 p38 MAPK 신호를 통하여 COX2 발현을 증가시키고 새로운 골 형성을 증대시켰다. 이를 종합하면, BBR이 조골세포 분화를 아마도 증가시켜서, 뼈 관련 질병을 위한 치료 목표가 될 수 있음을 시사한다.

골-관련 질병은 일반적으로 대부분 노년층 여성들 사이에서 폐경기 이후 에스트로겐의 결핍에 의해 골 흡수가 증가함으로써 발생하는 주요한 공중 보건 문제이다. 사실상, 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(Selective estrogen receptor modulators; SERMs) 및 비스포스포네이트(Bisphosphonate)와 같은 대부분의 골 치료법은 파골세포에 의한 뼈 흡수를 억제하는데 현재 유용하다. 게다가, 재흡수된 뼈 부위를 조골세포 분화가 증가되어 채우는 것 또한 중요하다. 최근에는, 스타틴(Statins; HMG-CoA 환원효소의 저해제)과 같은 골 형성을 위한 효과적인 촉진제의 개발이 각광을 받고 있는데 이러한 촉진제는 조골세포에 있어서 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP-2)의 발현과 활성을 증대시키고 무기질화를 촉진시킨다(31, 32). 따라서, 조골세포 분화를 유도할 수 있는 합성 약물(anabolic drugs)을 개발하면 재흡수된 뼈 부위를 회복시킴으로써 골다공증과 같은 골-관련 질병을 치료하는데 유용할 것이다. 그러나, 골 합성 과정 중의 조골세포에 미치는 BBR의 영향은 철저하게 밝혀진 것은 아니다.

본 발명은 초기 골수세포들이 조골세포로 분화될 수 있도록 하는 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 조골세포 분화 촉진에 유용한 치료적으로 유효한 양의 BBR을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 BBR은 야생에서 수집하거나, 전통적으로 재배하거나, 공인된 유기농 출처에 의하거나, 이들의 결합 또는 인위적인 합성에 의하여 얻을 수 있다. 그리고 본 발명의 조성물은 이들의 염, 이성질체, 용매 화합물, 수화물 및 프로드럭(prodrug)과 같은 모든 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 첨가제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 형태로, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 베르베린을 함유하는 골-관련 질병을 치료하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 골-관련 질병은 골다공증, 골감소증, 골흡수 증가, 골절, 및 골밀도 감소증으로 구성된다. 그리고 상기 조성물은 이들의 염, 이성질체, 용매 화합물, 수화물 및 프로드럭(prodrug)과 같은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 첨가제를 선택적으로 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 공지 기술을 이용하여 약학적으로 허용되는 담체에 포함되는 것과 같이, 생리학적으로 허용되는 제형을 제공한다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 분절은 약학적으로 허용되는 첨가제와 결합되어 치료용 조성물을 형성한다.

상기 조성물은 식품 또는 음료의 형태로도 제공될 수 있다. BBR 화합물의 정제 및 분리는 당해 기술의 당업자에게 잘 알려진 전형적인 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 방법의 예는 다음과 같다: 용매에 의한 추출법, 실리카 겔 크로마토그래피법과 같은 다양한 크로마토그래피법, 프리페어러티브 고성능 액체 크로마토그래피법 등의 이러한 방법들의 단독 또는 결합으로 사용될 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 BBR 화합물은 당해 기술의 당업자에게 잘 알려진 어떠한 반응기술에 따라서 BBR의 화학적 구조에 기초하여 합성될 수 있다. 더불어, 본 발명의 BBR은 효소 촉매를 이용한 합성을 통해 제공될 수 있다. 본 발명에 사용된 BBR 화합물은 상기 추출물 또는 합성물질 중 어느 하나일 수 있다. 더욱더, 이러한 화합물은 단독 화합물 또는 2 이상의 화합물의 혼합물일 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 골 합성에 있어서 BBR이 미치는 새로운 영향을 발견해 냈다. 조골성 세포들(osteoblastic cells)에 있어서, BBR은 오스테오폰틴과 오스테오칼신을 포함한 골 합성 마커 유전자들의 발현을 증대시켰고, 핵심적인 골 합성 전사인자인 Runx2의 전사적인 활성을 촉진시켰다. 조골세포에 있어서, BBR은 Runx2의 오스테오폰틴의 프로모터 영역으로의 도입(recruitment)을 증가시켰다. 오스테오폰틴 및 오스테오칼신의 프로모터 영역으로의 p300 및 HDACI와 같은 공동인자들(cofactors)의 도입은 BBR에 의해 조절되었다. 더욱이, BBR은 조골세포 분화에 있어서 특유한 인자들인 p300 MAPK를 활성화시켰으며 COX2의 발현을 증가시켰다. 이와 같이, p38 MAPR 과발현이 BBR-유도된 골 합성 유전자 발현을 증대시키는 반면, p38 MAPR-특이 억제제는 골 합성에 있어서의 BBR의 영향을 감소시켰다. 게다가, BBR은 두개골 기관 배양(calvarial organ culture)에 있어서 골 형성을 증대시켰다. 따라서 본 발명의 화합물은 골-관련 질병을 치료하기 위한 잠재적인 치료용 조성물이 될 수 있다.

도 1은 BBR이 지방세포 합성을 억제하고 골 합성을 촉진하는 것을 나타낸 것이다 (A 및 B). C3H10T1/2 세포를 5일 동안 BBR (1-10 mg/ml) 존재 또는 부존재 하에 지방세포로 분화시켰다. (A) 지질소포(lipid droplets)가 축적되는 것을 탐지하기 위해서 오일 레드 O(Oil red O) 염색을 사용하였다. (B) PPARg, ADDl, FAS, 및 aP2 유전자들의 각 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다(C 및 D). C3H10T1/2 세포들은 6일 동안 조골세포로 분화되었고 BBR의 다른 양의 존재 또는 부존재 하에 8일 동안 초기 골수 세포로 분화되었다. ALP 염색을 사용하여 알카리성 인산분해효소(alkaline phosphatase; ALP)-양성 세포에 대하여 분화된 조골세포를 염색하였다. (E) C3H10T1/2 세포들은 6일 동안 BBR (1 mg/ml) 존재 또는 부존재 하에 조골세포로 분화되었다. OPN 및 OCN mRNAs의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다.수치는 평균 표준편차로 나타내었다. *, p < 0.05; **, p < 0.01. BBR, 베르베린; PPARg, 퍼옥시좀-증식제-활성화 수용체 감마(proliferator-activated receptor gamma; ADDl, 지방세포 결정 및 분화 의존 인자 1; FAS, 지방산 합성효소; aP2, 지방세포 지방산-결합 단백질; OPN, 오스테오폰틴; 및 OCN, 오스테오칼신.
도 2는 BBR이 MC3T3-E1 세포들에서 조골세포 분화를 증대시키는 것을 나타낸 것이다. (A) 골 합성 중에 MC3T3-E1 세포들을 6일 동안 BBR의 다른 양으로 처치했다. ALP-양성 세포들은 ALP 에세이(ALP assay)에 의해 모니터링했다. (B) MC3T3-E1 세포들은 BBR (5 mg/ml) 존재 또는 부존재 하에 6일 동안 분화시켰다. OPN, OCN, Runx2 및 OSX과 같은 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA 정도에 따라 정규화했다. (C) BBR (5 mg/ml)은 분화과정 동안 지정된 시간으로 MC3T3-E1 세포 내에서 처치했다. mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. Runx2, Runt-연관 전사인자 2 및 OSX, 오스테오릭스.
도 3은 BBR이 인산화 및 공동인자 도입(recruitment)을 통하여 Runx2의 전사 활성을 증가시키는 것을 나타낸 것이다. (A) OCN 프로모터 영역을 포함한 리포터 컨스럭트는 HEK293 세포들 내에서 Myc-태그 Runx2와 함께 형질전환하였다. Runx2 전사적인 활성은 BBR 존재 또는 부존재 하에 결정되었다. 루시퍼라아제 활성은 형질전환 24시간 후에 측정되었다. 형질전환 효율은 b-gal 활성에 따라 정규화했다. (B) Runx2 인산화 정도는 BBR 존재 또는 부존재 하에 측정했다. Myc-태그 Runx2 는 HEK293 세포들로 형질전환시켰다. 인산-프리 DMEM 배지에서 [³²P] 오르토인산염(orthophosphate)과 함께 배양한 후, 항-Myc 항체(a-Myc)로 면역침강하고 SDS-PAGE 하에서 Myc-Runx2 단백질을 분해하였다. 항-Myc 항체(a-Myc)를 사용하여 Western blot 분석법을 수행했다. 인산화된 Runx2 정도의 상대적인 양은 BBR 부존재 하에 Myc-Runx2 정도에 따라 정규화했다. Runx2의 인산화는 PhosphorImager (BAS2500; Fuji, Japan) 로 양을 조절했다. (C 및 D) MC3T3-E1 세포를 2일 동안 조골세포로 분화시키고 12시간 동안 BBR (10 mg/ml)로 처치했다. (C) 골 합성 마커 유전자 프로모터로의 공동인자 도입을 추적하기 위해 ChIP 에세이를 수행하였다. 포름알데히드와 세포를 교차결합시키고, 지정된 항체와 격리된 핵을 면역침강시켰다. 면역침강된 DNA 분절을 지정된 유전자들의 프로모터 부위에서 PCR에 의해 증폭시켰다. 투입(input)은 총 투입 염색질의 10%를 나타낸다. (D) OPN 및 OCN의 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. 수치는 평균 표준편차로 나타내었다. *, p < 0.05; **, p < 0.01.
도 4는 BBR이 p38 MAPK-의존 방식으로 골 합성을 촉진시키는 것을 나타낸 것이다. (A) MC3T3-E1 세포 내에서 BBR (5 mg/ml)을 지정된 시간 동안 처치하였다. 인산화된 p38(a-p-p38) 및 p38 (a-p38)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블랏(Western blot)분석법을 수행하였다. (B) p38 MAPK 키나아제 활성은 BBR 부존재 또는 존재 하에서 결정되었다. HEK293 세포를 2시간 동안 BBR의 여러 양으로 처리하였다. 전체 세포 용해물은 항-p38 MAPK 항체 (a-ρ38)와 면역침강하고, 실험실 내에서 키나아제 에세이(assays)를 30℃에서 30분 동안 GST-ATF2 펩타이드 기질을 사용하여 수행하였다. 인산화된 p38(a-ρ-p38) 및 p38 (a-p38)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석법을 수행하였다. p38 MAPK의 정도는 대조구에 의해서 결정되었다. 투입(input)은 총 투입 면역침강의 10%를 나타낸다. (C) 시험관 내에서 HEK293 세포에 SB203580 (10 mM), p38 MAPK-특이 억제제로 전처리한 후에 상기 언급한 방법에 의해서 Runx2 인산화를 측정하였다. SB203580는 BBR (10 mg/ml)처리 전에 1시간 동안 전처리하였다. Myc(a-Myc)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석법을 수행하였다. 인산화된 Runx2 정도의 상대적인 양은 BBR 부존재 하에 Myc-Runx2의 정도에 따라 정규화했다. Runx2의 인산화는 PhosphorImager (BAS2500; Fuji, Japan)로 정량되었다. (D 및 E) OPN 및 OCN에 대한 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. (D) MC3T3-E1 세포를 6일 동안 BBR (5 mg/ml) 및 SB203580 (10 mM) 존재 또는 부존재 하에 조골세포로 분화시켰다. (E) MC3T3-E1 세포를 MOCK 또는 Flag-p38 MAPK 리트로바이러스(retrovirus)로 감염시키고, 6일 동안 BBR (5 mg/ml) 존재 또는 부존재 하에 조골세포 분화를 위하여 유도시켰다. 수치는 평균 표준편차로 나타내었다. **, p < 0.01. GST-ATF2, 글루타티온(glutathione) S- 전이효소-활성 전사 인자 2; MOCK, pWZL 벡터-감염 세포; 및 Flag-p38, Flag-p38 MAPK-감염 세포.
도 5는 p38 MAPK를 통하여 BBR이 C0X2 발현을 유도하는 것을 나타낸 것이다. (A 및 B) MC3T3- El 세포에 표시된 시간 동안 BBR (5 mg/ml)을 처치하였다. (A) C0X2 mRNA 및 단백질의 정도는 실시간 PCR에 의해 측정되었다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. (B) C0X2의 단백질 정도는 웨스턴블랏 분석법으로 측정하였다. 액틴(a- Actin)에 대한 항체를 대조구로 사용하였다. (C) MC3T3-E1 세포를 BBR (5 mg/ml) 존재 또는 부존재 하에 6일 동안 분화시켰다. C0X2 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. (D) HEK293 세포에서 C0X2 프로모터를 포함한 리포터 컨스트럭을 Myc-태그 Runx2과 함께 형질전환시켰다. Runx2 전사 활성은 BBR 존재 또는 부존재 하에 결정되었다. 루시퍼라아제 활성은 형질전환 24시간 후에 결정되었다. 형질전환 효율은 b-gal 활성에 따라 정규화했다. (E) 상기 언급한 바에 따라 ChIP 에세이를 수행하였다. C0X2의 프로모터 영역에서 면역침강된 DNA 분절을 PCR에 의해 증폭시켰다. 투입(input)은 총 투입 염색질의 10%를 나타낸다. (F 및 G) BBR (5 mg/ml) 존재 또는 부존재, Dup (10 mM), C0X2-특이 억제제 및 SB203580 (10 mM)로 MC3T3-E1 세포를 골 합성 분화 배지에서 6일 동안 배양시켰다. OPN 및 C0X2에 대한 mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. (H) p38 MAPK를 과발현시키는 MC3T3-E1 세포를 6일 동안 BBR 존재 또는 부존재 하에 분화시켰다. mRNA의 상대적인 양은 실시간 PCR을 사용하여 결정했다. 수치는 GAPDH mRNA의 정도에 따라 정규화했다. 수치는 평균 표준편차로 나타내었다. **, p < 0.01. Dup, Dup697. MOCK, pWZL 벡터-감염 세포; Flag-p38, Flag-p38 MAPK-감염 세포.
도 6은 BBR이 골 형성을 촉진시키는 것을 나타낸다. (A) 두정골 스컬캡(Parietal skullcaps)을 BBR (0.05 mg/ml) 존재 또는 부존재 및 심베스타틴(simvastatin, 지질저하제) (1 mM) 하에 4일 동안 추출하여 배양하였다. 배양된 신생아의 두개골 뼈들의 박편을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. (B) BBR 및 심베스타틴(simvastatin)에 의하여 새로 형성된 골의 상대적인 너비를 나타내었다.
도 7은 BBR-조작 조골세포 분화의 모델을 나타낸 것이다. 조골세포에 있어서, BBR은 p38 MAPK을 활성화시키고, Runx2의 인산화를 증가시켰다. BBR-유도 Runx2 활성은 C0X2 뿐만 아니라 그것의 표적 유전자의 발현도 촉진시킨다. 골 합성에 있어서의 BBR의 다양한 효과는 특유한 p38 MAPK-특이 억제제에 의해 강력하게 억제된다.
도 8은 MC3T3-E1 세포에서 p38 MAPK이 과발현된 것을 나타낸 것이다. MC3T3-E1 세포를 MOCK 또는 Flag-p38 MAPK 리트로바이러스(retrovirus)로 감염시켰다. p38(a-p38) 및 Flag(a-Flag)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석법을 수행하였다. b-투블린 (a-b-tubulin)의 정도는 대조구에 의해서 결정되었다.
[최선의 형태]
본 발명은 초기 골수세포들이 조골세포로 분화될 수 있도록 하는 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 조골세포 분화 촉진에 유용한 치료적으로 유효한 양의 BBR을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 BBR은 야생에서 수집하거나, 전통적으로 재배하거나, 공인된 유기농 출처에 의하거나, 이들의 결합 또는 인위적인 합성에 의하여 얻을 수 있다. 그리고 본 발명의 조성물은 이들의 염, 이성질체, 용매 화합물, 수화물 및 프로드럭(prodrug)과 같은 모든 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 첨가제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 형태로, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 베르베린을 함유하는 골-관련 질병을 치료하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 골-관련 질병은 골다공증, 골감소증, 골흡수 증가, 골절, 및 골밀도 감소증을 포함한다. 그리고 상기 조성물은 이들의 염, 이성질체, 용매 화합물, 수화물 및 프로드럭(prodrug)과 같은 약학적으로 허용되는 담체, 보조제, 또는 첨가제를 선택적으로 더 포함할 수 있다.
조골세포 분화에 미치는 BBR의 영향을 이해하기 위해서, BBR 존재 또는 부존재 하에 프리-조골세포(preosteoblastic cells)에서 골 합성을 유도하였다. 조골세포 및 지방세포 분화의 정도를 각각 알카리성 인산화효소(ALP) 염색 및 오일 레드 O 염색에 의해 측정하였다. 실시간 PCR을 사용하여 상이한 골 합성 유전자 발현을 분석하였다. Runx2 인산화는 오르토인산염(orthophosphate) 표지로 조사하였고, p38 MAPK는 시험관 내에서 키나아제 에세이를 수행하였다. 루시퍼라아제 리포터 에세이(reporter assays) 및 세포질 면역침강 에세이에 의해 프로모터 연구를 수행하였다. BBR 신호 및 골 합성에 있어서의 p38 MAPK의 역할을 p38 MAPK-특이 억제제 사용 및 p38 MAPK의 리트로바이러스 과발현으로 평가하였다. 생쥐의 두개골 기관 배양 시스템(calvarial organ culture system)에 의해 체외 골 형성에 있어서의 BBR의 영향을 조사하였다. 상기 실험들의 결과로서, 본 발명자들은 다음과 같은 결론을 도출하였다.
BBR은 중간엽 줄기 세포에서 지방세포합성을 억제하고 골 합성을 촉진시킨다. 중간엽 프로제니터(progenitor)세포의 분화에 있어서의 BBR의 영향을 알아보기 위하여, 본 발명자들은 지방세포합성과 골 합성 분화 동안 BBR 존재 또는 부존재 하에 중간엽 줄기 세포 라인 C3H10T1/2을 처리하였다. 이미 보고된 바와 같이(17), 본 발명자들은 지방세포 분화는 BBR에 의해 주로 억제된다는 것을 관찰하였다. (도 I A 및 B). BBR은 지질소포(lipid droplet)의 축적을 상당히 감소시키고, PPARg 발현 및 ADDl, FAS 및 aP2를 포함한 지방합성 마커 유전자의 발현을 억제시켰다. 반면에, 본 발명자들은 BBR의 골 합성에서 촉진시키는 영향을 관찰하였다. 중간엽 줄기 세포에 있어서, C3H10T1/2 및 초기 골수 세포를 포함하여, BBR은 주로 알칼리성 인산화효소 (ALP)-양성 세포를 증대시켰다.(도. 1C 및 D). 게다가, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신을 포함한 골 합성 마커 유전자들의 발현이 BBR에 의해 상승되었다. (도. 1E). 중간엽 줄기 세포에 있어서 BBR은 조골세포 분화를 촉진시키는 반면 지방세포 분화에 있어서는 부정적으로 작용한다는 결론을 내렸다.
MC3T3-E1 세포에 있어서 BBR은 조골세포 분화를 촉진시킨다. 조골세포 분화에 있어서의 BBR의 영향을 더 깊게 조사하기 위해서, 본 발명자들은 골 합성과정 중에 BBR과 함께 조골세포 셀 라인 MC3T3-E1을 처리하였다. 도 2A에 도시한 바와 같이, 투여량(dose)-의존적으로 BBR은 ALP-양성 세포의 수를 증가시켰다. 또한, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 mRNA의 발현이 BBR에 의하여 상당히 유도되었고(도. 2B), 이러한 유전자의 발현 정도는 BBR 처리시기에 비례하였다(도. 2C). 그러나 Runx2 및 오스테릭스(osterix)와 같은 다른 골 합성 유전자는 BBR에 의해 적절하게 증대되었다(도. 2B). BBR이 골 합성 유전자 발현을 유도할 수 있으며, 결과적으로 중간엽 줄기 세포에서뿐만 아니라 골 합성 세포 라인들에서도 골 합성을 촉진시킬 수 있다는 결과를 도출해 내었다.
공동인자와 함께 BBR은 Runx2의 전사적인 활성을 촉진시킨다. 골 합성 마커 유전자의 조직-특이 활성은 종종 염색질 변형 및 전사적인 공동인자들의 도입과 연관된다(21,25). 이러한 결과와 같이, 본 발명자들은 오스테오칼신 프로모터로의p300의 도입은 골 합성 중에 상당히 증가되고, 반면에 HDACl 도입을 감소시켜 그 부위의 아세틸레이션(hyperacetylation)이 증가된다는 것을 보고하였다(21). 오스테오칼신과 오스테오폰틴은 둘 다 Runx2의 잘 알려진 표적 유전자이기 때문에, 본 발명자들은 이러한 유전자들과 함께 Runx2의 전사적인 활성에 있어서 BBR의 영향을 조사하기로 결정하였다. 도. 3A에 도시한 바와 같이, BBR은 주로 오스테오칼신 프로모터에 있어서 Runx2 전사적인 활성을 촉진시켰다. Runx2 인산화가 오스테오칼신 프로모터에 있어서 이의 전사적인 활성을 촉진시킨다는 것을 보고한 이래(26), 본 발명자들은 BBR이 Runx2 인산화에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 흥미롭게도, BBR은 Runx2 단백질 양을 변화시키지 않고, Runx2 인산화를 증가시켰다(도. 3B). BBR-조절 Runx2 인산화가 표적 유전자 발현을 증대시키는 기작을 해독하기 위해서, 본 발명자들은 염색질 면역 침강 (ChIP) 에세이를 수행하였다. BBR이 오스테오폰틴 프로모터로의 Runx2의 도입을 증가시킨다는 것을 관찰했다(도. 3C). 더욱더, BBR은 HDACl 및 공동억제제(corepressor)의 표적 유전자들의 프로모터로의 도입은 대단히 감소시키는 반면에, BBR은 p300 및 HAT 공동활성제(coactivator)의 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 프로모터로의 도입을 촉진시켰다(도. 3C). 이와 같이, BBR은 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 mRNA 발현을 증가시키는 조절을 한다.(도. 3D). 또한, 이러한 결과들은 BBR이 Runx2 전사적인 활성을 증가시킴으로써, 주로 Runx2 인산화를 증가시키고 조골세포 분화과정 중에 그것의 표적 유전자들에 공동인자 도입을 조절함으로써 골 합성을 촉진시킨다는 것을 보여준다.
BBR 신호는 p38 MAPK 경로에 의존한다. 최근의 연구는 BBR이 p38 MAPK 및 ERK MAPK 포함한 MAPK 경로를 활성화할 수 있다는 것을 보여주었다(17,27). 조골세포에 있어서 BBR이 MAPK 신호를 촉진시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해서, MC3T3-E1 세포들을 BBR 존재 또는 부존재 하에 시험함으로써 BBR에 의한 p38 MAPK 인산화가 증가된다는 결과를 얻었다(도. 4A). 게다가, BBR은 p38 MAPK의 기질인 활성적인 전사 인자 2(ATF2)의 인산화를 증대시키는 바, 이는 BBR이 조골세포에 있어서 p38 MAPK 키나아제 활성을 촉진시킨다는 것이 보고되었다(도. 4B). MAPK 신호 경로는 Runx2의 인산화에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것을 나타내기 때문에(26,28), 본 발명자들은 p38 MAPK의 활성이 BBR에 의한 Runx2 인산화에 관여하는지 여부를 조사하였다. 이것을 조사하기 위해서, a p38 MAPK-특이 억제제인 SB203580를 BBR과 함께 동시에 처리하여 Runx2 인산화가 상당히 억제되었음을 관찰하였으며(도. 4C), 이는 p38 MAPK가 BBR-유도 Runx2 인산화를 위해서 필요하다는 것을 암시한다. 게다가, SB203580 은 오스테오폰틴 및 오스테오칼신 유전자 발현에 있어서 BBR-의존적인 증가를 방해했다(도. 4D). p38 MAPK가 조골세포 분화에 있어서의 BBR의 영향에 중요한지 여부를 직접적으로 설명하기 위하여, 본 발명자들은 p38 MAPK- 과발현 MC3T3-E1 세포들에 있어서 BBR의 영향을 조사하였다(도. 8). BBR은 p38 MAPK-과발현 조골세포에서 오스테오폰틴과 오스테오칼신의 mRNA 발현을 각각 60%와 33%까지 상당히 증가시켰다(도. 4E). 그러므로, 이러한 결과들은 BBR에 의한 조골세포 분화의 촉진은 주로 p38 MAPK 경로에 의해 조절된다는 것을 나타낸다.
COX-2 발현은 BBR에 의하여 증가된다. 이러한 BBR이 골 합성을 촉진시키는 메카니즘을 이해하기 위해서, 본 발명자들은 BBR 존재 또는 부존재 하에서 MC3T3-E1 세포들의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 BBR이 C0X2 발현을 현저하게 증가시킨다는 것을 관찰하였다. MC3T3HE1 세포들에 대하여 BBR을 처리하면 C0X2의 mRNA 및 단백질 수준은 모두 증가되었다(도. 5A 및 B). 게다가, 조골세포 분화 중에 BBR에 의해서 C0X2 발현이 상당히 증가되었다(도. 5C). 최근의 보고는 C0X2 유전자의 프로모터는 Runx2-결합 사이트(site)를 가지고 있으며 Runx2 전사적인 활성을 조절한다는 것을 보여주었다(29). BBR이 Runx2에 의한 C0X2 발현을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 Runx2 또는 BBR의 존재 또는 부존재 하에서 C0X2 프로모터를 사용하여 루시퍼라아제 리포터 에세이(reporter assay)를 수행하였다. 상기 보고와 마찬가지로(29), Runx2는 C0X2 프로모터 활성을 촉진시키고, C0X2 프로모터에 있어서 Runx2 전사적인 활성을 증대시켰으며(도. 5D), 이는 C0X2가 Runx2의 표적 유전자이며 이의 발현은 BBR에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 다음으로, 본 발명자들은 Runx2와 공동인자들의 BBR 존재 또는 부존재 하에 C0X2의 프로모터 영역으로의 도입을 조사하였다. 오스테오폰틴 유전자와 마찬가지로, HDACl의 하기 프로모터 부위로의 도입은 감소시키는 반면, C0X2 프로모터로의 Runx2 및 p300의 도입은 BBR에 의하여 상당히 증가되었다(도. 5E). 더욱이, C0X2-특이 억제제 Dup697은 골 합성 마커 유전자 발현에 있어서 BBR의 영향을 억제시켰으며(도. 5F), 이는 BBR-유도 C0X2 활성이 적어도 부분적으로나마 Runx2 전사적인 활성의 조절에 기여한다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 C0X2 발현이 BBR-유도에 의해 증가되는 것이 p38 MAPK에 의존하는지 여부를 조사하였다. p38 MAPK가 SB203580와 함께 억제될 때 C0X2 mRNA 발현에 있어서 BBR의 영향이 감소되었다(도. 5G); 그러나, 이러한 영향은 p38 MAPK 의 과발현에 대하여 상당히 증대되었다(도. 5H). 종합해 보면, BBR-유도 C0X2 발현은 p38 MAPK 및 Runx2에 의해 조절되는 것으로 나타났으며 BBR은 Runx2 뿐만 아니라 p38 MAPK의 활성을 통하여 조골세포 분화를 촉진할 수 있는 것으로 추측할 수 있다.
BBR은 골 형성을 증가시킨다. 골 형성에 있어서 BBR의 영향을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 BBR과 함께 신생 생쥐로부터 두개골 기관 배양(calvarial organ cultures)을 체외에서 처치했다. 심베스타틴(simvastatin)과 마찬가지로, 이는 골 형성을 유도하는 것으로 알려져있으며(30), BBR은 새로운 골 형성을 상당히 증가시켰다(도. 6). 그러므로, 이러한 결과들은 BBR이 조골세포 분화를 촉진시킴으로써 새로운 골 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
골다공증은 대부분 주로 나이 든 여성들에게서 폐경기 이후 에스트로겐의 결핍에 의해 골 흡수가 증가함으로써 발병하는 공중보건 문제이다. 사실상, 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(Selective estrogen receptor modulators; SERMs) 및 비스포스포네이트(Bisphosphonate)와 같은 대부분의 골 치료법은 파골세포에 의한 뼈 흡수를 억제하는데 현재 유용하다. 게다가, 재흡수된 뼈 부위를 조골세포 분화가 증가되어 채우는 것 또한 중요하다. 최근에는, 스타틴(Statins; HMG-CoA 환원효소의 저해제)과 같은 골 형성을 위한 효과적인 촉진제의 개발이 각광을 받고 있는데 이러한 촉진제는 조골세포에 있어서 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP-2)의 발현과 활성을 증대시키고 무기질화를 촉진시킨다(31, 32). 따라서, 조골세포 분화를 유도할 수 있는 합성 약물(anabolic drugs)을 개발하면 재흡수된 뼈 부위를 회복시킴으로써 골다공증과 같은 골-관련 질병을 치료하는데 유용할 것이다.
골다공증과 같은 뼈 질병을 가진 환자들에게 있어서, 골수에 축적된 지방세포를 포함하고 있는 지방골수가 임상적으로 관찰된다(33, 34). 지방세포와 조골세포는 중간엽 줄기 세포들로부터 유래하기 때문에(35), 지방합성 및 골 합성을 위한 조절 기작을 이해하기 위해서 임상적 및 생물학적으로 중요하다. PPARg는 Runx2 전사적 활성을 억제하는 지방합성의 주 조절자이며, 로직리타존(Rosiglitazone)과 같은 PPARg 리간드들은 조골세포 분화를 저해시킨다(36, 37). 그러므로, 아마도 골 합성과 지방합성 사이의 균형을 잡아주는 관계가 존재하며, 이는 PPARg가 골다공증을 위한 잠재적인 치료적 표적이 될 수 있음을 암시한다. 최근에, 본 발명자들의 그룹을 포함한 몇몇 그룹들은 BBR이 PPARg 활성을 억제함으로써 지방세포 분화를 강력하게 저해한다는 것을 밝혔다(16, 17). 본 연구에서, 본 발명자들은 BBR이 시험관 내에서 p38 MAPK 경로를 통하여 Runx2의 인산화 및 활성을 증가시킴으로써 조골세포 분화를 촉진한다는 첫 번째 증거를 제공하였으며, 체외 골 형성 연구에 의해서 BBR의 영향을 입증하였다.
Runx2 활성은 유비퀴틴화(ubiquitination), 아세틸화 및 인산화를 포함한 몇몇 공유결합적 조정(covalent modifications)에 의해 조절된다(28, 38, 39). 이와 같이, Runx2 인산화의 역할은 잘 알려져 있다. Runx2는 복합적인 인산화 영역을 가지며, 상이한 잔기(residue)에서 인산화가 일어나면 억제적인 영향 또는 촉진적인 영향을 제공할 수 있다. 예를 들어, Runx2는 2개의 세린 잔기(serine residues) (S104 및 S451)에서의 인산화에 의해서는 억제적으로 조절된다 (40). 한편, 섬유아세포 성장인자 2 (FGF2)는 C-터미널 영역에서 ERK1/2 MAPK를 통하여 Runx2 인산화를 유도하고 Runx2 활성을 증가시킨다(26). 더욱더, FGF2는 PKCd를 통하여 Runx2 인산화를 촉진시키고 Runx2 전사적인 활성을 증가시킨다(41). 여기서, 본 발명자들은 BBR이 p38 MAPK 활성을 통하여 Runx2의 인산화 및 활성을 유도함으로써, BBR이 Runx2 인산화와 전사적인 활성을 상당히 증가시키고 이는 SB203580에 의해 강력하게 억제된다는 것을 밝혔다. 게다가, Runx2 인산화의 억제는 Runx2 DNA 결합 활성의 상당한 손실(loss)을 유도한다는 것이 보고되고 있으며(42), 이는 Runx2 인산화가 이의 DNA 결합 능력을 증대시킴을 암시한다. 이러한 결과와 마찬가지로, 본 발명자들은 오스테오폰틴 및 C0X2 프로모터로의 Runx2 도입이 BBR과 함께 처리될 때 증가된다는 것을 기술하였다. 그러나, Runx2 단백질 잔기가 BBR-조절 p38 MAPK의 활성에 의해 인산화된다는 것은 불명확하다. 사실상, 본 발명자들은 DNA-결합 능력에 영향을 미치게 하기 위해 인산화 이외의 Runx2의 알려지지 않은 조절이 BBR에 의해 유도될 수 있다는 가능성을 배제할 수 없다. 이러한 의문에 답하기 위해서, BBR에 의해 유도되는 정밀한 Runx2 인산화 사이트를 정의하고 전사적인 활성뿐만 아니라 DNA 결합 관련성에 있어서 Runx2 돌연변이들의 영향을 조사하기 위한 연구가 더욱 요구된다.
조골세포 분화를 제공하기 위해서, Runx2 활성은 공동인자들의 결합에 의해 철저하게 조절된다. 예를 들어, HDACl 및 TLEF를 포함한 공동억제제는 Runx2와 상호작용하고 Runx2 전사적인 활성을 억제한다(21, 43). 반면에, 골 합성 신호에 있어서, p300 및 TAZ을 포함한 공동활성제들은 Runx2로부터 공동억제제들을 대체하고 이의 전사적인 활성을 촉진시킨다고 밝혀졌다(44, 45). 놀랍게도, 본 발명자들은 MC3T3-E1 세포들에 BBR을 처리하면 HDACl의 이러한 영역으로의 도입이 극적으로 감소되는 반면, C0X2 프로모터뿐만 아니라 오스테오폰틴 및 오스테오칼신에 있어서 Runx2 및 p300 연합을 증가시킨다는 것을 알아냈다(도. 3 및 5). 그러므로, BBR에 의한 Runx2 인산화는 표적 유전자 프로모터에서 Runx2와 공동인자 사이의 결합을 변화시키는 형태적인 변화를 유도할 수 있을 것이다. 따라서, 인산화된 Runx2가 공동억제제들보다 공동활성제들과 연관성이 더 높을 것이라는 생각은 추가적인 연구에서 조사되어져야 할 것이다.
지금까지, p38 MAPK의 활성은 근육세포(myocytes)와 지방세포와 같은 다양한 세포 타입의 분화에 역할을 하는 것으로 알려져 있었다(46, 47). 골 합성과 관련하여, 조골세포에 있어서 p38 MAPK가 BMP2-유도 골 합성을 위해서 요구된다는 것이 밝혀져 있으며(48), p38 MAPK-특이 억제제가 초기 두개골 조골세포에 있어서 조골세포 분화를 강력하게 억제한다는 것이 밝혀졌다(49). 본 연구에 있어서, 본 발명자들은 BBR이 p38 MAPK의 인산화 및 이의 키나아제 활성을 촉진시키고, 이는 결국 조골세포 분화의 실행을 촉진시킨다는 것을 기술하였다. Runx2가 조골세포에서 BBR-활성 p38 MAPK를 위한 기질일 수 있다는 몇몇 증거를 제안한다. 첫째로, SB203580와 함께 p38 MAPK를 억제하면 Runx2 인산화가 극적으로 감소되었다. 둘째로, MC3T3-E1 세포들에 있어서 p38 MAPK가 과발현되면 오스테오폰틴 및 오스테오칼신과 같은 Runx2 표적 유전자들의 발현에 있어서의 BBR의 영향이 강화되었다. 비록 BBR이 조골세포에서 다른 MAPKs (또는 키나아제)에 영향을 미친다고 하더라도, Runx2 활성에 있어서의 p38 MAPK는 적어도 조골세포 분화 중에 BBR-의존 증가를 위한 주요한 단계 중의 하나에 연관되어 있을 가능성은 있다.
MAPKs을 포함한 BBR-유도 신호 경로와 관련하여, BBR은 간이나 지방 조직을 포함한 몇몇 조직에 있어서 AMPK을 강력하게 활성화시킨다(17). 조골세포에 있어서, BBR에 의한 p38 MAPK 인산화 증가가 15분 이내에 감지되는 것에 반해(실험자료 게시 없음), BBR은 1시간 후에 AMPK 인산화를 증가시키는데, 이는 p38 MAPK가 AMPK보다 더 상위로 반응하는 키나아제라는 것을 나타낸다. 더욱이, 본 발명자들은 AMPK 억제제(AraA) 및 활성제(AICAR)는 골 합성에 상당한 영향을 미치지는 않는데(실험자료 게시 없음), 이는 BBR에 의한 AMPK 활성은 조골세포 분화에 기여하지 않음을 나타낸다.
PGE₂를 생성하는 C0X2는 골 형성에 있어서 주요한 조절자로 고려된다(12, 50). 본 발명의 실험자료는 조골세포에 있어서 BBR이 p38 MAPK을 활성화시키고, Runx2 활성을 촉진함으로써 C0X2 발현을 상승시킨다는 것을 분명히 밝히고 있다. 이와 마찬가지로 p38 MAPK의 과발현이 C0X2 발현에 있어서 BBR의 영향을 증대시키는 반면, SB203580는 C0X2 유전자 발현에 있어서 Runx2의 전사적인 활성을 억제했다. 비록 C0X2가 MAPKs에 의해 조절될 수 있다는 것이 보고된 적이 있으나(14), 본 발명은 조골세포에 있어서 p38 MAPK-Runx2 경로가 C0X2 발현을 조절한다는 것을 밝힌 첫 번째 연구이다. 전반적으로, BBR은 골 합성 마커 유전자 발현을 증대시킬 뿐만 아니라 p38 MAPK-Runx2 경로를 통한 C0X2 발현을 유도함으로써 조골세포 분화를 촉진할 수 있을 것이다(도. 7).
요약하면, 본 발명자들은 BBR이 p38 MAPK-Runx2 경로를 활성화시킴으로써 조골세포 분화 및 골 형성을 촉진시킨다는 것을 밝혀냈다. 비록 앞으로의 연구가 BBR이 생체 내에서 골 형성을 유도하는지 여부를 밝혀낼지라도, 본 발명에 게시된 실험자료는 BBR이 골다공증적 뼈 부위에 있어서 조골세포 분화를 조절함으로써 잠재적인 치료용 조성물이 될 수 있음을 보여준다.
상기 조성물은 공지 기술을 이용하여 약학적으로 허용되는 담체와 같이, 생리학적으로 허용되는 제형을 제공한다. 예를 들어, 단백질, 펩타이드 또는 단백질 분절은 치료용 조성물을 형성하기 위해 약학적으로 허용되는 첨가제가 결합된다.
상기 조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 고체 조성물의 예는 정제, 크림 및 주입식 투여량 유닛(implantable dosage units)을 포함한다. 정제는 경구 투여할 수 있다. 치료용 크림은 국소적으로 사용될 수 있다. 주입식 투여량 유닛(Implantable dosage units)은 예를 들어 특정 부위에 국부적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 피하로 치료용 조성물이 조직적으로 배출되도록 이식할 수 있다. 액체 조성물의 예는 피하주사, 정맥주사, 동맥 내, 국부적이고 안구 내 투여를 위한 제형을 포함한다. 에어로졸 조성물의 예는 폐를 통한 투여를 위해 흡입식 제형을 포함한다.
상기 조성물은 스탠다드 루트(Standard routes)로 투여할 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 국소적, 경구적, 직장의, 질 내의, 비강의 또는 비경구적인 경로로 투여할 수 있다(예를 들어, 정맥으로, 피하로, 근육 내로). 이에 더하여, 상기 조성물은 생분해 폴리머, 전달되야 할 부위의 부근 예를 들어 표적 사이트에 이식되는 폴리머와 같은 지속적인 배출 매트릭스를 포함할 수 있다. 또한 생분해될 수 있는 폴리머 및 다른 폴리머를 조직적인 전달(systemic delivery)이 가능하도록 이식할 수 있다. 투여방법은 단일의 복용량 투여, 미리 정해진 시간 간격으로 반복적인 복용량 투여 및 미리 정해진 시간 간격으로 지속적인 투여를 하는 방법을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 지속적인 배출 매트릭스는 물질로 만들어진 매트릭스, 주로 효소적 또는 산염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해가능한 폴리머이다. 인체에 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 활성화된다. 바람직하게는 지속적인 배출 매트릭스는 리포솜(liposomes), 폴리락타이드산(polylactide acid), 폴리글리코라이드(글리콜산의 폴리머, polymer of glycolic acid), 폴리락타이드 코-글리코라이드 (젖산과 글리콜산의 코폴리머들, copolymers of lactic acid and glycolic acid), 폴리앤하이드라이드(polyanhydrides), 폴리오르토에스터(poly(ortho)esters), 폴리펩타이드(polypeptides), 하이얼루로닉 산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 콘드리친 황산염(chondroitin sulfate), 카르복시산(carboxylic acids), 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 폴리사카라이드(polysaccharides), 핵산(nucleic acids), 폴리아미노산(polyamino acids), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 이소류신(isoleucine)과 같은 아미노산들, 폴리뉴클레오타이드(polynucleotides), 포리비닐프로필렌(polyvinyl propylene), 폴리비닐피로딘(polyvinylpyrrolidone) 및 실리콘(silicone)과 같은 생체 적합성이 있는 물질을 선택할 수 있다. 바람직한 생분해 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리코라이드 또는 폴리락타이드 코-글리코라이드(co-polymers of lactic acid and glycolic acid) 중 어느 하나이다.
상기 조성물의 정량은 치료 상황, 특별한 조성물 사용 및 체중 및 환자의 상태와 같은 기타 임상적인 요소, 투여 형태에 의해 좌우된다. 상기 조성물은 질병의 치료 과정 및 다른 조성물과 함께 결합하여 투여할 수 있다.
상기 조성물은 식품 또는 음료의 형태로도 제공될 수 있다. BBR 화합물의 정제 및 분리는 당해 기술의 당업자에게 잘 알려진 전형적인 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 방법의 예는 다음과 같다: 용매에 의한 추출법, 실리카 겔 크로마토그래피법과 같은 다양한 크로마토그래피법, 프리페어러티브 고성능 액체 크로마토그래피법 등의 이러한 방법들의 단독 또는 결합으로 사용될 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 BBR 화합물은 당해 기술의 당업자에게 잘 알려진 어떠한 반응기술에 따라서 BBR의 화학적 구조에 기초하여 합성될 수 있다. 더불어, 본 발명의 BBR은 효소 촉매를 이용한 합성을 통해 제공될 수 있다. 본 발명에 사용된 BBR 화합물은 상기 추출물 또는 합성물질 중 어느 하나일 수 있다. 더욱더, 이러한 화합물은 단독 화합물 또는 2 이상의 화합물의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 BBR-함유 식품 및/또는 음료제품은 (여기서는 “본 발명의 식품 및 음료제품” 또는 “본 발명의 식품 및/또는 음료제품”으로 언급된다) 수분을 함유한 성분과 함께 BBR을 함유하는 에멀젼 조성물을 혼합하는 것을 제공한다. 수분을 함유한 음료제품을 제공할 경우, 청량음료 또는 탄산수를 만들기 위해 BBR-함유 에멀젼 조성물에, 바람직하게 과일즙, 비타민, 아미노산, 향료, 설탕 등을 포함하는 수분을 함유한 용액을 첨가할 수 있다. 수분을 함유하는 성분으로 오일-인-수분 타입의 에멀젼을 사용하는 경우, 아이스크림과 같은 냉동 디저트, 요거트나 우유와 같은 다양한 유제품, 크림 캬라멜, 무스, 푸딩(bavarois), 드레싱과 같은 다양한 유화 식품 및 음료제품 등이 생산될 수 있다. 겔화된 용액을 사용하는 경우, 젤리와 같은 겔화된 식품이 생산될 수 있다.

본 발명의 실질적이고 바람직한 실시예는 하기에 나타낸다. 그러나, 본 발명의 기재를 고려하여 당해 기술분야에서 본 발명의 목적과 범위 내에서 본 발명의 개량 및 변형이 가능할 것이다.

실시예 1. 세포 배양 및 조골세포와 지방세포의 분화

초기 골수 세포는 4주 된 C57BL/6J 생쥐의 대퇴골과 정강이뼈로부터 떼어내어 20% 말혈청(horse serum) 및 100 nM 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 함유된 변형된 필수 배지(a~MEM; Gibco BRL)에서 유지시켰다. 조골세포 분화를 위하여, 프라이머리 골수세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 50 mM 아스콜빅산(ascorbic acid) 및 10 mM 베타-글리세로포스페이트(b-glycerophosphate)를 함유한 a-MEM에서 배양시켰다. 10% FBS를 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Gibco BRL)에서 C3H10T1/2 쥐의 중간엽 줄기세포들 및 MC3T3-E1 두개골 세포들을 유지시켰다. 10% FBS, 50 mM 아스콜빅산 및 10 mM 베타-글리세로포스페이트를 함유한 DMEM에서 조골세포 분화를 유도했다. 10% FBS, 500 μM 3- 이소부틸-1-메틸잔틴, lμM 덱사메타손 및 5 /zg/ml 인슐린을 함유한 DMEM에서 60시간 동안 지방세포 분화를 유도했다. 10% FBS 및 5 μg/ml 인슐린을 포함한 DMEM을 매 격일로 배양 배지를 교체하였다.

실시예 2. 알카리성 포스파타아제( ALP ) 염색 및 오일 레드 O 염색

BCIP/NBT 색상 향상 기질(Promega)을 사용하여 ALP 활성을 위해 분화된 조골세포를 염색했다. 오일 레드 O를 이용한 염색은 상기 기술한 바와 같이 시행하였다(20).

실시예 3. 컨스트럭트 , DNA 형질전환 및 리포터 에세이( reporter assay)

루시퍼라아제 에세이를 위하여, 형질전환 전에 2일 동안 12웰 플레이트(12-well plate)에서 HEK293 세포들을 배양하였다. 본 발명자들은 칼슘 인산염법을 사용하여 pCS4-3 Myc-Runx2, pII1.3-Luc (1.3 kb of 0G2 프로모터) 또는 pXP-2-C0X2-Luc을 일시적으로 형질전환시켰다(21). 형질전환 후 24시간에, 루시퍼라아제 활성을 위해 세포 용해물을 분석했다. 형질전환 효율을 위하여 내부 대조구로써 pCMV-b-갈락토시다아제 플라스미드를 사용하였다.

실시예 4. 면역침강 및 웨스턴블랏팅

TGN 완충용액 (50 mM Tris [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% Tween- 20, 0.2% NP-40, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루라이드, 100 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄ 및 하나의 프로테아제 억제제 칵테일 테블릿 [Roche])을 사용하여 얼음 위에서 세포들을 용해시켰다. 항-p38 MAPK이나 항-Myc 항체들(Santa Cruz Biotechnology)을 4°C에서 12시간 동안 표시된 바와 같이 상기 용해물을 배양시켰다. 단백질 A-Sepharose CL-4B (Amersham-Biosciences)에서 4°C에서 2시간 동안 면역 복합물을 침전시켰다. TGN 완충용액으로 3차례 비드(beads)를 세척했다. 5분 동안 5 SDS 샘플 완충용액에서 가열하여 비드(beads)로부터 단백질을 녹여서 분리하여, SDS-폴리아크릴아미드겔(S-polyacrylamide gels)에서 전기이동에 의해 분리하고 폴리비닐리덴 디플로라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 세포막(Millipore)으로 이동시켰다. 이러한 이동 이후에, 탈지 우유(skim milk)로 세포막을 블럭(block)시키고 1:1000 희석액에서 초기 항체들로 탐지했다. Myc, p38 MAPK, C0X2, FLAG, 액틴, β-투블린(Santa Cruz Biotechnology) 및 인산화된 p38 MAPK (BD Biosciences)에 저항하는 항체들을 사용하였다. 서양 고추냉이 페록시다제 접합 2차 항체들 (Sigma Aldrich)로 웨스턴블랏 분석법을 가시화하고 화학 발광을 증대시켰다.

실시예 5. 실시간 PCR

제조자의 프로토콜에 따라 트리졸(Invitrogen)로 총 RNA을 분리했다. 총 RNA를 분리한 이후, SYBR 그린 (BioWhittaker Molecular Application)으로 실시간 PCR (Bio-Rad)을 이용하여 M-MuLV 역전사효소 (Fermentas)에 의해 유래된 상보적 DNA를 분석했다. 모든 반응 물질들은 mRNA의 발현 정도에 따라 정규화했다. 본 발명에 사용된 PCR 프라이머 세트는 다음과 같다: Runx2 포워드, 5'-GAA GGA AAG GGA GGA GGG GT (SEQ ID NO: 1); 리버스, 5'-TCT GTC TCT CCT TCC CTT CC (SEQ ID NO: 2); 오스테오칼신 포워드, 5'-CGC TCT CAG GGG CAG ACA CT (SEQ ID NO: 3); 리버스, 5'-GCA CCC TCC AGC ATC CAG TA (SEQ ID NO: 4); 오스테오폰틴 포워드, 5'-TGC CTG ACC CAT CTC AGA AGC A (SEQ ID NO: 5); 리버스, 5'-TGA GAG GTG AGG TCC TCA TC (SEQ ID NO: 6); 오스테릭스 포워드, 5'-TTT CAG CCC CCA AAA CCA TGG G (SEQ ID NO: 7); 리버스, 5'-AGA TGG GTA AGT AGG CAG CT (SEQ ID NO: 8); C0X2 포워드, 5'-AGA AGG AAA TGG CTG CAG AA (SEQ ID NO: 9); 리버스, 5'-GCT CGG CTT CCA GTA TTG AG (SEQ ID NO: 10); PPARg 포워드, 5'-TTG CTG AAC GTG AAG CCC ATC GAG G (SEQ ID NO: 11); 리버스, 5'-GTC CTT GTA GAT CTC CTG GAG CAG (SEQ ID NO: 12); ADDl 포워드, 5'-GGG AAT TCA TGG ATT GCA CAT TTG AA (SEQ ID NO: 13); 리버스, 5'- CCG CTC GAG GTT CCC AGG AAG GGT (SEQ ID NO: 14); FAS 포워드, 5'-TGC TCC CAG CTG CAG GC (SEQ ID NO: 15); 리버스, 5'-GCC CGG TAG CTC TGG GTG TA (SEQ ID NO: 16); aP2 포워드, 5'-CAA AAT GTGTGA TGC CTT TGT G (SEQ ID NO: 17); 리버스, 5'-CTC TTC CTT TGG CTC ATG CC (SEQ ID NO: 18); and GAPDH 포워드, 5'-TGC ACC ACC AACTGC TTA G (SEQ ID NO: 19); 리버스, 5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT C (SEQ ID NO: 20).

실시예 6. 오르토인산염 ( Orthophosphate ) 표지

2시간 동안 인산염-프리 DMEM (Gibco BRL)에서 pCS4-3 Myc-Runx2와 형질전환시킨 HEK293 세포들을 배양시켜, [³²P] 오르토인산염(PerkinEImer Life Sciences)을 첨가하고 2시간 동안 세포들을 배양하였다(22). 상기 배양 이후, 1시간 동안 SB203580을 전처리하고 2시간 동안 BBR로 세포들을 처리하여, TGN 완충용액으로 총 세포 용해물들을 추출하였다. 항-Myc 항체들로 면역침강시켜 방사성 동위원소로 표지된(Radiolabeled) Myc-Runx2 단백질들을 획득하였다. SDS-PAGE로 상기 면역침강물을 분리하고 오토라디오그래피(autoradiography)를 시켰다.

실시예 7. 실험실에서의 p38 MAPK 키나아제 분석

항-p38 MAPK 항체들로 총 세포 추출물 (500 μg)을 면역침강시키고 20 mM HEPES (pH 7.4)로 세척하였다. 2 μg 글루타티온 S-전이효소-활성 전사인자 2 (GST-ATF2)를 사용하여 반응 완충용액 (20 mM HEPES [pH 7.4], 10 mM MgCl₂, 12mM β-글리코로포스페이트, 1mM Na₃VO₄, 2mM 디티오트레이톨(DTT, dithiothreitol), 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루라이드 및 1 μCi [γ- ³²P] ATP)에서 기질로서 30°C에서 30분 동안 키나아제 에세이를 수행하였다(23). 5 SDS 샘플 완충용액을 사용하여 반응들을 결정하고, SDS-PAGE로 생성물들을 용해시켜 오토라디오그래피로 관련(incorporated) [ ³²P] 의 정도를 추적하였다. 또한, 항-p38 MAPK 및 인산화된- p38 MAPK 항체들을 사용하여 세포막을 이뮤노블랏시켰다.

실시예 8. 염색질 면역침강 ( ChIP ) 에세이

상기 기술한 바와 같이 ChIP 에세이를 수행하였다(21). 본 연구에서 사용된 PCR 프라이머 세트는 다음과 같다: 오스테폰틴 프로모터 포워드, 5'-GGC CAA CCT AAG CTA CCG AA (SEQ ID NO: 21); 리버스, 5'-CCA CCA ATC AGG AGG TGG AG (SEQ ID NO: 22); 오스테오칼신 프로모터 포워드, 5'-CGC TCT CAG GGG CAG ACA CT (SEQ ID NO: 23); 리버스, 5'-GCA CCC TCC AGC ATC CAG TA (SEQ ID NO: 24); 및 C0X2 프로모터 포워드포워드C TGT GTG CGT GCT CTG A (SEQ ID NO: 25); 리버스, 5'- TCG CAG TTT GAC AAC TGG C (SEQ ID NO: 26).

실시예 9. 리트로바이러스 ( Retroviral ) 감염

칼슘 인산 방법 및 MC3T3-E1 세포에서 감염된 리트로바이러스 입자들을 사용하여 pWZL 또는 pWZL-Flag-p38 MAPK로 BOSC 세포들을 형질전환시켰다. 제네티신(400 mg/mL, Gibco BRL)을 사용하여 리트로바이러스으로 감염된 세포들을 선택하였다.

실시예 10. 생쥐 두개골 기관 배양( calvarial organ culture )

ICR 생쥐의 4일 된 새끼로부터 신생 두개골 뼈들을 획득하여, 상기 기술한 바와 같이 새로운 골 형성 분석을 수행하였다(24). Bioquant Nova Prime software (Nashville)을 사용하여 형태학상으로 새로운 골 형성의 양을 평가하였다.

실시예 11. 통계

스튜던트 테스트를 사용하여 실험자료를 분석하였다. PO.05 및 PO.01가 중요하게 고려되었다.

상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 골 밀도를 증가시켜 골다공증을 예방할 수 있고, 파골세포의 활성을 억제하여 조골세포 분화 촉진 활성을 가진다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 골다공증을 포함한 골-관련 질병의 예방용 또는 치료용 조성물로 사용하기에 유용하다.

[참고문헌]

1. Ducy P, Schinke T, Karsenty G 2000 The osteoblast: a sophisticated fibroblast under central surveillance. Science 289(5484): 1501-1504.

2. Blair HC, Zaidi M, Schlesinger PH 2002 Mechanisms balancing skeletal matrix synthesis and degradation. Biochem J 364(Pt 2):329-341.

3. Yang X, Karsenty G 2002 Transcription factors in bone: developmental and pathological aspects. Trends MoI Med 8(7):340-345.

4. Wagner EF, Karsenty G 2001 Genetic control of skeletal development. Curr Opin Genet Dev 11(5) :527-532.

5. Franceschi RT, Xiao G 2003 Regulation of the osteoblast-specific transcription factor, Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem 88(3) :446-454.

6. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G 1997 0sf2/Cbfal: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell 89(5) :747-754.

7. Mundlos S, Otto F, Mundlos C, MuI liken JB, Aylsworth AS, Albright S, Lindhout D, Cole WG, Henn W, Knoll JH, Owen MJ, Mertelsmann R, Zabel BU, Olsen BR 1997 Mutations involving the transcription factor CBFAl cause cleidocranial dysplasia. Cell 89(5):773-779.

8. Komori T, Yagi H, Nomura S, Yamaguchi A, Sasaki K, Deguchi K, Shimizu Y, Bronson RT, Gao YH, Inada M, Sato M, Okamoto R, Kitamura Y, Yoshiki S, Kishimoto T 1997 Targeted disruption of Cbfal results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 89(5) :755- 764.

9. Choi JY, Pratap J, Javed A, Zaidi SK, Xing L, BaI int E, Dalamangas S, Boyce B, van Wijnen AJ, Lian JB, Stein JL, Jones SN, Stein GS 2001 Subnuclear targeting of Runx/Cbfa/AML factors is essential for tissue-specific differentiation during embryonic development. Proc Natl Acad Sci U S A 98(15):8650-8655.

10. Xiao G, Wang D, Benson MD, Karsenty G, Franceschi RT 1998 Role of the alpha2-integrin in osteoblast-specific gene expression and activation of the 0sf2 transcription factor. J Biol Chem 273(49):32988-32994.

11. Xiao G, Cui Y, Ducy P, Karsenty G, Franceschi RT 1997 Ascorbic acid- dependent activation of the osteocalcin promoter in MC3T3-E1 preosteoblasts: requirement for collagen matrix synthesis and the presence of an intact 0SE2 sequence. MoI Endocrinol 11(8): 1103-1113.

12. Woodiel FN, Fall PM, Raisz LG 1996 Anabolic effects of prostaglandins in cultured fetal rat calvariae: structure-activity relations and signal transduction pathway. J Bone Miner Res 11(9) : 1249-1255.

13. Gasparini G, Longo R, Sarmiento R, Morabito A 2003 Inhibitors of cyclo- oxygenase 2: a new class of anticancer agents? Lancet Oncol 4(10) :605-615.

14. Chun KS, Surh YJ 2004 Signal transduction pathways regulating cycl?oxygenase-2 expression: potential molecular targets for chemoprevent ion. Biochem Pharmacol 68(6) : 1089-1100.

15. Chikazu D, Li X, Kawaguchi H, Sakuma Y, Voznesensky OS, Adams DJ, Xu M, Hoshio K, Katavic V, Herschman HR, Raisz LG, PiIbeam CC 2002 Bone morphogenet ic protein 2 induces cyclo-oxygenase 2 in osteoblasts via a Cbfal binding site: role in effects of bone morphogenet ic protein 2 in vitro and in vivo. J Bone Miner Res 17(8): 1430-1440.

16. Huang C, Zhang Y, Gong Z, Sheng X, Li Z, Zhang W, Qin Y 2006 Berberine inhibits 3T3-L1 adipocyte differentiation through the PPARgamma pathway. Biochem Biophys Res Commun 348(2) :571-578.

17. Lee YS, Kim WS, Kim KH, Yoon MJ, Cho HJ, Shen Y, Ye JM, Lee CH, Oh WK, Kim CT, Hohnen-Behrens C, Gosby A, Kraegen EW, James DE, Kim JB 2006 Berberine, a natural plant product, activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin-resistant states. Diabetes 55(8): 2256-2264.

18. Cheng Z, Pang T, Gu M, Gao AH, Xie CM, Li JY, Nan FJ, Li J 2006 Berberine-stimulated glucose uptake in L6 myotubes involves both AMPK and p38 MAPK. Biochim Biophys Acta 1760(11) : 1682-1689.

19. Li H, Miyahara T, Tezuka Y, Tran QL, Seto H, Kadota S 2003 Effect of berberine on bone mineral density in SAMP6 as a senile osteoporosis model. Biol PharmBull 26(1) : 110-111.

20. Seo JB, Moon HM, Kim WS, Lee YS, Jeong HW, Yoo EJ, Ham J, Kang H, Park MG, Steffensen KR, Stulnig TM, Gustafsson JA, Park SD, Kim JB 2004 Activated liver X receptors stimulate adipocyte differentiation through induction of peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression. MoI Cell Biol 24(8):3430-3444.

21. Lee HW, Suh JH, Kim AY, Lee YS, Park SY, Kim JB 2006 Histone deacetylase 1-mediated histone modification regulates osteoblast differentiation. MoI Endocrinol 20(10):2432-2443.

22. Kim KH, Song MJ, Yoo EJ, Choe SS, Park SD, Kim JB 2004 Regulatory role of glycogen synthase kinase 3 for transcriptional activity of ADDl/SREBPlc . J Biol Chem 279(50) : 51999-52006.

23. Yoon MJ, Lee GY, Chung JJ, Ahn YH, Hong SH, Kim JB 2006 Adiponectin increases fatty acid oxidation in skeletal muscle cells by sequential activation of AMP-activated protein kinase, p38 mitogen-activated protein kinase, and peroxisome proliferator-activated receptor alpha. Diabetes 55(9):2562-2570.

24. Garrett IR 2003 Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Methods MoI Med 80:183-198.

25. Lian JB, Stein JL, Stein GS, van Wijnen AJ, Montecino M, Javed A, Gutierrez S, Shen J, Zaidi SK, Drissi H 2003 Runx2/Cbfal functions: diverse regulation of gene transcription by chromatin remodeling and co-regulatory protein interactions. Connect Tissue Res 44 Suppl 1:141-148.

26. Xiao G, Jiang D, Gopalakrishnan R, Franceschi RT 2002 Fibroblast growth factor 2 induction of the osteocalcin gene requires MAPK activity and phosphorylation of the osteoblast transcription factor, Cbfal/Runx2. J Biol Chem 277(39):36181-36187.

27. Kong W, Wei J, Abidi P, Lin M, Inaba S, Li C, Wang Y, Wang Z, Si S, Pan H, Wang S, Wu J, Wang Y, Li Z, Liu J, Jiang JD 2004 Berberine is a novel cholesterol-lowering drug working through a unique mechanism distinct from statins. Nat Med 10(12) : 1344-1351.

28. Xiao G, Jiang D, Thomas P, Benson MD, Guan K, Karsenty G, Franceschi RT 2000 MAPK pathways activate and phosphorylate the osteoblast-specific transcription factor, Cbfal. J Biol Chera 275(6):4453-4459.

29. Mehrotra M, Saegusa M, Voznesensky 0, Pilbeam C 2006 Role of Cbfal/Runx2 in the fluid shear stress induction of COX-2 in osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun 341(4) : 1225-1230.

30. Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G, Boyce B, Zhao M, Gutierrez G 1999 Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 286(5446) : 1946-1949.

31. Jadhav SB, Jain GK 2006 Statins and osteoporosis: new role for old drugs. J Pharm Pharmacol 58(1):3-18.

32. Li X, Cui Q, Kao C, Wang GJ, Balian G 2003 Lovastatin inhibits adipogenic and stimulates osteogenic differentiation by suppressing PPARgamma2 and increasing Cbfal/Runx2 expression in bone marrow mesenchymal cell cultures. Bone 33(4) :652-659.

33. Rodriguez JP, Montecinos L, Rios S, Reyes P, Martinez J 2000 Mesenchymal stem cells from osteoporotic patients produce a type I collagen- deficient extracellular matrix favoring adipogenic differentiation. J Cell Biochem 79(4) :557-565.

34. Rosen CJ, Bouxsein ML 2006 Mechanisms of disease: is osteoporosis the obesity of bone? Nat Clin Pract Rheumatol 2(l):35-43.

35. Caplan AI, Bruder SP 2001 Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends MoI Med 7(6) :259-264.

36. AIi AA, Weinstein RS, Stewart SA, Parfitt AM, Manolagas SC, Jilka RL 2005 Rosiglitazone causes bone loss in mice by suppressing osteoblast differentiation and bone formation. Endocrinology 146(3) : 1226-1235.

37. Jeon MJ, Kim JA, Kwon SH, Kim SW, Park KS, Park SW, Kim SY, Shin CS 2003 Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma inhibits the Runx2-mediated transcription of osteocalcin in osteoblasts. J Biol Chem 278(26):23270-23277.

38. Jeon EJ, Lee KY, Choi NS, Lee MH, Kim HN, Jin YH, Ryoo HM, Choi JY, Yoshida M, Nishino N, Oh BC, Lee KS, Lee YH, Bae SC 2006 Bone morphogenet ic protein-2 stimulates Runx2 acetylation. J Biol Chan 281(24): 16502-16511.

39. Zhao M, Qiao M, Oyajobi BO, Mundy GR, Chen D 2003 E3 ubiquitin ligase Smurfl mediates core-binding factor alphal/Runx2 degradation and plays a specific role in osteoblast differentiation. J Biol Chem 278(30):27939-27944.

40. fee HJ, Huang G, Shigesada K, Ito Y 2002 Serine phosphorylation of RUNX2 with novel potential functions as negative regulatory mechanisms. EMBO Rep 3(10):967-974.

41. Kim BG, Kim HJ, Park HJ, Kim YJ, Yoon WJ, Lee SJ, Ryoo HM, Cho JY 2006 Runx2 phosphorylation induced by fibroblast growth factor-2/protein kinase C pathways. Proteomics 6(4): 1166-1174.

42. Shui C, Spelsberg TC, Riggs BL, Khosla S 2003 Changes in Runx2/Cbfal expression and activity during osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res 18(2):213-221.

43. Javed A, Guo B, Hiebert S, Choi JY, Green J, Zhao SC, Osborne MA, Stifani S, Stein JL, Lian JB, van Wijnen AJ, Stein GS 2000 Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci 113 ( Pt 12) :2221-2231.

44. Sierra J, Villagra A, Paredes R, Cruzat F, Gutierrez S, Javed A, Arriagada G, Olate J, Imschenetzky M, Van Wijnen AJ, Lian JB, Stein GS, Stein JL, Montecino M 2003 Regulation of the bone-specific osteocalcin gene by p300 requires Runx2/Cbfal and the vitamin D3 receptor but not p300 intrinsic histone acetyltransferase activity. MoI Cell Biol 23(9):3339-3351.

45. Hong JH, Hwang ES, McManus MT, Amsterdam A, Tian Y, Kalmukova R, Mueller E, Benjamin T, Spiegelman BM, Sharp PA, Hopkins N, Yaffe MB 2005 TAZ, a transcriptional modulator of mesenchymal stem cell differentiation. Science 309(5737): 1074-1078.

46. Engelman JA, Lisanti MP, Scherer PE 1998 Specific inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase block 3T3-L1 adipogenesis. J Biol Chem 273(48):32111-32120.

47. Zetser A, Gredinger E, Bengal E 1999 p38 mitogen-activated protein kinase pathway promotes skeletal muscle differentiation. Participation of the Mef2c transcription factor. J Biol Chem 274(8) :5193-5200.

48. Guicheux J, Lemonnier J, Ghayor C, Suzuki A, Palmer G, Caverzasio J 2003 Activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun-NH2- terminal kinase by BMP-2 and their implication in the stimulation of osteoblastic cell differentiation. J Bone Miner Res 18(11) :2060-2068.

49. Hu Y, Chan E, Wang SX, Li B 2003 Activation of p38 mitogen-activated protein kinase is required for osteoblast differentiation. Endocrinology 144(5):2068-2074.

50. Zhang X, Schwarz EM, Young DA, Puzas JE, Rosier RN, 0'Keefe RJ 2002 Cyclooxygenase-2 regulates mesenchymal cell differentiation into the osteoblast lineage and is critically involved in bone repair. J Clin Invest 109(11): 1405-1415.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> A composition promoting osteoblast differentiation comprising berberine. <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaaggaaagg gaggaggggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tctgtctctc cttcccttcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgctctcagg ggcagacact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaccctcca gcatccagta 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgcctgaccc atctcagaag ca 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgagaggtga ggtcctcatc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tttcagcccc caaaaccatg gg 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agatgggtaa gtaggcagct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agaaggaaat ggctgcagaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctcggcttc cagtattgag 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttgctgaacg tgaagcccat cgagg 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtccttgtag atctcctgga gcag 24 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gggaattcat ggattgcaca tttgaa 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ccgctcgagg ttcccaggaa gggt 24 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgctcccagc tgcaggc 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcccggtagc tctgggtgta 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caaaatgtgt gatgcctttg tg 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ctcttccttt ggctcatgcc 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgcaccacca actgcttag 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggatgcaggg atgatgttc 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggccaaccta agctaccgaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccaccaatca ggaggtggag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgctctcagg ggcagacact 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcaccctcca gcatccagta 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 agctgtgtgc gtgctctga 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tcgcagtttg acaactggc 19

Claims (6)

1. 베르베린을 함유하는 조골세포 분화 촉진 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 베르베린은 Runx2 활성에 의하여 조골세포 분화를 촉진하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 치료적으로 유효한 양의 베르베린 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 약학적 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 선택적으로 적어도 하나의 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 음료용 조성물.
5. 치료적으로 유효한 양의 베르베린을 포함하는 골-관련 질병 치료를 위한 약학적 조성물.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 골-관련 질병은 골다공증, 골감소증, 골흡수 증가, 골절 또는 골밀도 감소인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

Images