KR20120054279A - Ph sensitive block copolymer, preparation method thereof and drug delivery system using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 산성 pH에 반응하는 이미다졸 그룹을 함유한 아스파르트산 고분자를 포함하는 pH 반응성 블록 공중합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물전달체에 관한 것이다. The present invention relates to a pH-reactive block copolymer comprising an aspartic acid polymer containing an imidazole group reacting with an acidic pH, a method for preparing the same, and a drug carrier using the same.
마이셀(micelle)은 일반적으로 양친성, 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하며, 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서의 응용 가능성이 대단히 높다.Micelle generally refers to a thermodynamically stable and uniform spherical structure of low molecular weight materials having amphiphilic, for example, hydrophilic and hydrophobic groups, and dissolves and injects a water-insoluble drug into the compound having the micelle structure. In this case, the drug is present in the micelle, and since the micelle can release the target-oriented drug in response to a change in temperature or pH in the body, there is a high possibility of application as a carrier for drug delivery.
일반적으로 정상조직 및 혈액의 pH가 7.4인 반면, 암세포의 pH는 평균 7.0-6.5 사이에 있다고 알려져 있다. 따라서, 대부분 고형암이 그 세포 주변 pH가 약산성인 것을 주목할 때, 암세포의 pH를 집중 타켓할 수 있는 pH-민감성 고분자 소재의 개발은 암의 진단 및 치료 등에 널리 활용되어질 수 있으며, 암세포 이외에도 세포외 pH가 약산성인 병소 및 류마티스 관절염의 진단 및 치료를 위한 의약품 개발에 필요한 소재로서 활용될 가능성이 있다.It is generally known that the pH of normal tissues and blood is 7.4 while the pH of cancer cells is on average between 7.0-6.5. Therefore, when it is noted that most solid cancers have a weakly acidic pH around the cell, the development of a pH-sensitive polymer material that can target the pH of cancer cells can be widely used for diagnosis and treatment of cancer. It may be used as a material for the development of medicines for the diagnosis and treatment of weakly acidic lesions and rheumatoid arthritis.
한편, 종래 pH-민감성 고분자로서 널리 알려진 히스티딘 고분자 합성 시에 필요한 N-카르녹시안하이드라이드(N-carnoxyanhydride; NCA)가 공기에 매우 취약하고 공기 중의 수분과도 반응하여 수득율이 낮고, 높은 분자량의 고분자(5000Da 이상의 분자량)를 합성하기 어려워 다중약물내성 항암치료를 위한 엔도좀 pH에 표적하는 고분자 합성에 어려움이 따르며, 또한 휘발성 용매에 녹지 않는 성질 때문에 오직 투석에 의한 방법으로만 마이셀 형성이 가능하므로 조작의 불편함과 대량생산의 어려움이 있었다.Meanwhile, N-carnoxyanhydride (NCA), which is required for synthesizing histidine polymers, which is widely known as a pH-sensitive polymer, is very vulnerable to air and reacts with moisture in the air, resulting in low yield and high molecular weight. Difficult to synthesize polymers (molecular weight of 5000 Da or more), which leads to difficulty in synthesizing polymers targeting endosomal pH for multi-drug-resistant chemotherapy, and also because they are insoluble in volatile solvents, micelle formation is possible only by dialysis. There was inconvenience of operation and difficulty of mass production.
이에, 본 발명자들은 종래 사용하던 히스티딘 대신 아스파르트산을 모핵으로 한 NCA가 안정성이 높아 수득율을 히스티딘보다 높여줄 수 있으며, 분자량 조절이 용이하여 높은 분자량(5000Da 이상)을 갖는 고분자의 합성이 가능하고, 이미다졸의 도입을 조절하여 원하는 pH에서 물성을 변하게 할 수 있으며, 마이셀 형성 시 휘발성 용매에도 녹는 성질이 있어 투석 이외의 바텀 플라스크(bottom flask) 방법 등 여러 가지 방법으로 마이셀을 형성할 수 있으므로 대량생산을 가능하게 하며, 또한 이미다졸 그룹의 도입을 조절하여 수용성/지용성의 조절이 가능하고 이러한 특징으로 항암제 및 조영제의 탑재를 가능하게 한다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention can increase the yield than the histidine NCA using aspartic acid as a mother nucleus instead of histidine used in the prior art, the molecular weight can be easily controlled to synthesize a polymer having a high molecular weight (5000 Da or more), By controlling the introduction of imidazole, it is possible to change the physical properties at the desired pH, and because it has a property of dissolving in volatile solvent when forming micelles, it can form micelles by various methods such as bottom flask method other than dialysis. The present invention was completed by revealing that it is possible to control the introduction of the imidazole group and to control the water solubility / lipidity and to mount the anticancer agent and the contrast agent.
따라서, 본 발명의 목적은 생체에 독성이 없는 생체 적합성(biocompatibility)과 생분해성(biodegradability)이 우수한 아스파르트산을 모핵으로 하여 이미다졸 그룹을 도입함으로써 히스티딘과 유사한 pH-민감성을 나타냄과 동시에 합성의 간이함과 마이셀 형성 시 다양한 방법을 도입할 수 있어 대량생산을 가능케 하는 pH 민감성 블록 공중합체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.Accordingly, an object of the present invention is to introduce a group of imidazoles with aspartic acid having excellent biocompatibility and biodegradability, which is not toxic to a living body, and exhibits a pH-sensitivity similar to that of histidine, while simulating synthesis. The present invention provides a pH-sensitive block copolymer and a method for preparing the same, which can introduce various methods to form a mass and micelles.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 pH 민감성 블록 공중합체를 이용한 약물전달체를 제공하는 데에 있다.In addition, another object of the present invention to provide a drug carrier using the pH sensitive block copolymer.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 아스파트르산에 이미다졸을 그래프트시킨 폴리(아스파르트산-그래프트-이미다졸); 및 폴리에틸렌글리콜계 화합물을 공중합시켜 형성된 pH 반응성 블록 공중합체를 제공한다.In order to solve the problems of the prior art, the present invention is a poly (aspartic acid-graft-imidazole) grafted imidazole to aspartic acid; And it provides a pH reactive block copolymer formed by copolymerizing a polyethylene glycol-based compound.
바람직하게는, 상기 pH 반응성 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:Preferably, the pH-reactive block copolymer may be a compound represented by Formula 1 below:
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서, m은 10 내지 45의 정수이고, n은 15 내지 35의 정수이며, m과 n의 합이 18 내지 60의 정수일 수 있다.In
상기 pH 반응성 블록 공중합체는 pH 변화에 따라 마이셀을 형성하거나 붕괴할 수 있으며, 바람직하게는 pH가 7.4 이상에서 마이셀을 형성하며, pH가 7.0 이하에서는 형성된 마이셀이 붕괴될 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH가 7.4 내지 14.0에서 마이셀을 형성하며, pH가 7.0 내지 3.0에서는 형성된 마이셀이 붕괴될 수 있다. 따라서, 상기 pH 반응성 블록 공중합체의 마이셀 내부로 생리활성물질을 봉입하여 생리활성물질을 표적 부위에서 방출시킬 수 있는 약물전달체로서 사용될 수 있다.The pH-reactive block copolymer may form or disintegrate micelles according to pH change, preferably, micelles are formed at a pH of 7.4 or more, and micelles formed may be disintegrated at a pH of 7.0 or less, and more preferably. At pH 7.4 to 14.0, micelles are formed, and at pH 7.0 to 3.0 the micelles formed can collapse. Accordingly, the bioactive material may be used as a drug carrier capable of encapsulating the bioactive material into the micelles of the pH-reactive block copolymer to release the bioactive material at the target site.
상기 pH 반응성 블록 공중합체는 아스파트르산에 이미다졸을 그래프트시킨 폴리(아스파르트산-그래프트-이미다졸) 5 내지 95 중량%; 및 폴리에틸렌글리콜계 화합물 5 내지 95 중량%을 공중합시켜 형성될 수 있다.The pH reactive block copolymer may comprise 5 to 95% by weight of poly (aspartic acid-graft-imidazole) grafted imidazole to aspartic acid; And it may be formed by copolymerizing
상기 폴리(아스파르트산-그래프트-이미다졸)은 이미다졸 도입율이 1 내지 95%이며, 상기 폴리(아스파르트산-그래프트-이미다졸)의 분자량 범위는 특별한 제한은 없으나, 4,000 내지 10,000 범위가 바람직하다. 만약, 분자량이 상기 범위를 벗어나면 pH 6.5~7.0 사이에서 마이셀이 붕괴되지 않는 문제가 야기될 수 있다.The poly (aspartic acid-graft-imidazole) has an imidazole introduction ratio of 1 to 95%, and the molecular weight range of the poly (aspartic acid-graft-imidazole) is not particularly limited, but is preferably in the range of 4,000 to 10,000. . If the molecular weight is out of the above range may cause a problem that the micelle does not collapse between pH 6.5 ~ 7.0.
또한, 상기 폴리에틸렌글리콜계 화합물의 분자량 범위는 특별한 제한은 없으나, 500 내지 8,000 범위가 바람직하다. 만약, 분자량이 상기 범위를 벗어나면 친유성부분의 길이가 친수성부분 보다 길어져 임계 마이셀 형성 농도(CMC)가 감소되고 크기가 커지는 문제가 야기될 수 있다.In addition, the molecular weight range of the polyethylene glycol compound is not particularly limited, but is preferably in the range of 500 to 8,000. If the molecular weight is out of the above range, the length of the lipophilic portion may be longer than that of the hydrophilic portion, thereby causing a problem of decreasing the critical micelle formation concentration (CMC) and increasing the size.
본 발명에 따른 pH 반응성 블록 공중합체는 생체 적합성(biocompatibility) 및 생분해성(biodegradability)이 우수하며, 수용액 상에서 표면이 친수성 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성되고 내부가 소수성인 이미다졸 그룹이 도입된 아스파르트산으로, 수십 ~ 수백 나노미터 크기의 구형 집합체를 형성하고, 임계 마이셀 형성 농도(CMC), 입자 분포도, 제타 전위, 주사전자현미경 관찰 등을 통하여 pH 반응성 블록 공중합체의 특성을 확인할 수 있었다.The pH-reactive block copolymer according to the present invention is excellent in biocompatibility and biodegradability, and aspartic acid in which an imidazole group having a surface composed of hydrophilic polyethylene glycol (PEG) in an aqueous solution and having a hydrophobic interior is introduced. As a result, spherical aggregates of several tens to hundreds of nanometers were formed, and the properties of the pH-reactive block copolymers were confirmed through the critical micelle formation concentration (CMC), particle distribution, zeta potential, and scanning electron microscope observation.
또한, 본 발명은 i) 아스파르트산의 N-카르복시안하이드라이드(NCA)를 만든 후 중합개시제를 사용하여 개환 중합(ring opening polymerization)에 의해 아스파르트산 고분자를 합성하는 단계(제1단계); ii) 제1단계에서 얻어진 아스파르트산 고분자를 활성화된 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응시키는 단계(제2단계); iii) 제2단계에서 얻어진 반응물에서 미활성 벤젠을 제거하는 단계(제3단계); 및 iv) 제3단계에서 얻어진 반응물에 이미다졸 고리를 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 블록 공중합체 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of: i) synthesizing the aspartic acid polymer by ring opening polymerization using a polymerization initiator after N-carboxyhydride (NCA) of aspartic acid (first step); ii) reacting the aspartic acid polymer obtained in the first step with activated polyethylene glycol (PEG) (second step); iii) removing unactivated benzene from the reactants obtained in the second step (third step); And iv) introducing an imidazole ring into the reactant obtained in the third step.
바람직하게는, 상기 pH 반응성 블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다:Preferably, the pH-reactive block copolymer may be a compound represented by Formula 1 below:
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서, m은 10 내지 45의 정수이고, n은 15 내지 35의 정수이며, m과 n의 합이 18 내지 60의 정수일 수 있다.In
상기 pH 반응성 블록 공중합체는 교반, 가열, 초음파 주사, 유화법을 이용한 용매증발법, 매트릭스 형성 또는 유기용매를 이용한 투석법 등의 방법을 단독 또는 병행하여 생산할 수 있으며, 바람직하게는 유기용매를 이용한 바텀 플라스크법으로 대량 생산할 수 있다.The pH-reactive block copolymer may be produced alone or in parallel with a method such as agitation, heating, ultrasonic scanning, solvent evaporation using an emulsification method, matrix formation, or dialysis using an organic solvent, preferably using an organic solvent. It can be mass-produced by the bottom flask method.
본 발명에서 제조된 pH 반응성 블록 공중합체 마이셀의 직경은 특별한 제한이 없으나, 10 내지 1000 nm 범위가 바람직하다. The diameter of the pH-reactive block copolymer micelles prepared in the present invention is not particularly limited, but is preferably in the range of 10 to 1000 nm.
또한, 본 발명은 상기 pH 반응성 블록 공중합체; 및 상기 블록 공중합체에 봉입될 수 있는 생리활성물질을 포함하는 약물전달체를 제공한다.In addition, the present invention is the pH reactive block copolymer; And it provides a drug carrier comprising a bioactive material that can be encapsulated in the block copolymer.
상기 pH 반응성 블록 공중합체는 고분자 마이셀 형태이며, 상기 생리활성물질은 질병의 치료, 예방 도는 진단을 위한 물질이라면 특별한 제한이 없으며, 특히 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제, 조영제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.The pH-reactive block copolymer is in the form of a polymer micelle, and the bioactive substance is not particularly limited as long as it is a substance for treating, preventing or diagnosing a disease, and particularly in the group consisting of peptide or protein medicine, antimicrobial agent, anticancer agent, contrast agent and anti-inflammatory agent. It may be any one or more than one selected.
또한, 추적자 또는 유전자를 효과적으로 고분자 마이셀 내부로 물리적인 봉입을 가능하게 하므로 상기 pH 반응성 블록 공중합체를 분자영상학적으로 사용 가능한 추적자, 유전자 전달체로서도 유용하게 활용할 수 있다.In addition, it is possible to effectively encapsulate the tracer or gene into the polymer micelles, so that the pH-reactive block copolymer may be usefully used as a tracer and gene transporter that can be used molecularly.
본 발명에 따른 pH 반응성 블록 공중합체는 종래 사용하던 히스티딘 대신 아스파르트산을 모핵으로 사용함으로써 종래 히스티딘보다 수득율을 향상시킬 수 있으며, 분자량 조절이 용이하여 높은 분자량(5000Da 이상)을 갖는 고분자의 합성이 가능하고, 이미다졸 그룹의 도입을 조절하여 원하는 pH에서 물성을 변하게 할 수 있으며, 마이셀 형성 시 휘발성 용매에도 녹는 성질이 있어 투석 이외의 바텀 플라스크(bottom flask) 방법 등 여러 가지 방법으로 마이셀을 형성할 수 있으므로 대량생산을 가능하게 하며, 또한 이미다졸 그룹의 도입을 조절하여 수용성/지용성의 조절이 가능하여 항암제 및 조영제 등과 같은 생리활성물질을 탑재하여 약물전달체로서 활용할 수 있다.The pH-reactive block copolymer according to the present invention can improve yield than conventional histidine by using aspartic acid as a mother nucleus instead of histidine, and it is possible to easily synthesize a polymer having a high molecular weight (more than 5000 Da) by controlling molecular weight. In addition, it is possible to change the physical properties at the desired pH by controlling the introduction of the imidazole group, and it is soluble in a volatile solvent when forming micelles, and thus micelles can be formed by various methods such as a bottom flask method other than dialysis. Therefore, it is possible to mass production, and also to control the introduction of the imidazole group to control the water solubility / fat solubility can be used as a drug carrier by mounting a bioactive substance such as anticancer agent and contrast agent.
도 1은 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG의 제조를 위한 합성 경로를 나타낸 개념도이고,
도 2는 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG을 근거로 한 pH 반응성 마이셀의 구조를 나타낸 것이고,
도 3은 (a) PBLA, (b) PBLA-PEG, (c) P(Asp)-PEG 및 (d) P(Asp-g-Im)-PEG의 화학적 구조 및 1H NMR 분석 결과를 나타낸 것이고,
도 4는 NaCl (○), P(Asp)-PEG (■) 및 P(Asp-g-Im)-PEG (●)의 pH 프로파일을 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG의 CMC에 대한 pH의 효과를 나타낸 것이고,
도 6은 다양한 pH에서 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG으로부터 제조된 마이셀의 입자경을 나타낸 것이고,
도 7은 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG의 (a) pH 7.4 및 (b) pH 6.0에서의 FE-SEM 이미지를, 그리고 (c) pH 7.4 및 (d) pH 6.0에서의 DLS에 의한 마이셀의 입자경 분포도를 나타낸 것이고,
도 8은 다양한 pH에서 본 발명에 따른 P(Asp-g-Im)-PEG의 제타 전위를 나타낸 것이다.1 is a conceptual diagram showing a synthetic route for the preparation of P (Asp-g-Im) -PEG according to the present invention,
Figure 2 shows the structure of pH-reactive micelles based on P (Asp-g-Im) -PEG according to the present invention,
Figure 3 shows the chemical structure and 1 H NMR analysis of (a) PBLA, (b) PBLA-PEG, (c) P (Asp) -PEG and (d) P (Asp-g-Im) -PEG. ,
4 shows pH profiles of NaCl (○), P (Asp) -PEG (■) and P (Asp-g-Im) -PEG (●),
Figure 5 shows the effect of pH on CMC of P (Asp-g-Im) -PEG according to the present invention,
6 shows particle diameters of micelles prepared from P (Asp-g-Im) -PEG according to the present invention at various pHs,
7 shows (a) FE-SEM images of (p) pH 7.4 and (b) pH 6.0 of P (Asp-g-Im) -PEG according to the present invention, and (c) at pH 7.4 and (d) pH 6.0. Shows the particle size distribution of micelles by DLS of
8 shows the zeta potential of P (Asp-g-Im) -PEG according to the invention at various pHs.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited by these examples.
<실시예 1> P(Asp-Example 1 P (Asp- gg -Im)-PEG 제조-Im) -PEG Manufacturing
1. β-벤질-L-아스파르트산 N-카르복시안하이드라이드 (BLA-NCA) 제조1. Preparation of β-benzyl-L-aspartic acid N-carboxyhydride (BLA-NCA)
BLA-NCA는 트리포스겐을 이용한 Fuchs-Farthing 방법에 의해 합성하였다. 즉, L-아스파르트산-β-벤질 에스테르 (5g)를 트리포스겐 (2.2g)을 함유한 무수 1,4-다이옥산 (100ml)에서 현탁시키고, 용액이 맑아질 때까지 60℃에서 교반하였다. 합성된 BLA-NCA는 헥산을 첨가하여 침전시켰고, 여과하여 얻은 후, 진공 하에서 건조하였다. 활성화된 모노카르복실레이티드 PEG는 이전에 알려진 방법(Zalipsky, et al., Facile synthesis of α-hydroxy-ω-carboxymethylpolyethylene oxide, Sage, London, ROYAUME-UNI, 1990)에 따라 준비하였다.BLA-NCA was synthesized by Fuchs-Farthing method using triphosgen. That is, L-aspartic acid-β-benzyl ester (5 g) was suspended in anhydrous 1,4-dioxane (100 ml) containing triphosgen (2.2 g) and stirred at 60 ° C. until the solution became clear. The synthesized BLA-NCA was precipitated by addition of hexane, obtained by filtration and dried under vacuum. Activated monocarboxylated PEG is prepared according to previously known methods (Zalipsky, et al., Facile synthesis of α-hydroxy-ω -carboxymethylpolyethylene oxide , Sage, London, ROYAUME-UNI, 1990). Ready.
2. P(Asp-2.P (Asp- gg -Im)-PEG 제조-Im) -PEG Manufacturing
P(Asp-g-Im)-PEG은 도 1과 같이 합성하였다. 먼저, 폴리(β-벤질-L-아스파르트산) (PBLA; a)은 헥실아민(HA)을 개시제로 사용하여 BLA-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 즉, BAL-NCA (6 mmol)를 HA (0.14 mmol) 존재 하 무수 1,4-다이옥산에서 용해시키고, 질소 분위기 하 45℃에서 3일 동안 교반하였다. PBLA는 헥산으로 침전시키고 2일 동안 진공에서 건조하였다. 이의 분자량은 내부표준물질로서 TMS과 300-MHz unit를 사용하여 DMSO-d6에서 1H NMR 분석을 통해 확인하였다. PBLA의 중합도(DP)는 35로 산출되었고 92.6%의 수율을 얻었다.P (Asp- g -Im) -PEG was synthesized as shown in FIG. First, poly (β-benzyl-L-aspartic acid) (PBLA; a) was synthesized by ring-opening polymerization of BLA-NCA using hexylamine (HA) as an initiator. That is, BAL-NCA (6 mmol) was dissolved in
PBLA-PEG는 PBLA와 활성화된 모노카르복실레이티드 PEG를 커플링하여 합성하였다(Macromol Biosci, 5, 1118-1124, 2005). PBLA로부터 벤질기를 제거하기 위하여, PBLA-PEG를 DMF/MeOH 혼합물 (1:1 부피비)에서 용해시키고, Pd/C 촉매를 상기 용액에 첨가하였다. 그후, 실온 1시간 동안 수소분위기 하에서 상기 용액을 교반하였다. 그후, 셀라이트를 이용하여 촉매를 여과하여 제거하였고, 여과물을 콜드 디에틸에테르로 침전시키고, 여과물을 얻었으며, 진공 건조하였다. P(Asp)-PEG 상에 탈보호된 카르복실기의 존재를 TMS 표준물질을 사용하여 DMSO-d6에서 1H NMR 분석을 통해 확인하였다. p(Asp)-PEG를 60.5% 수율로 얻었다.PBLA-PEG was synthesized by coupling PBLA with activated monocarboxylated PEG ( Macromol Biosci, 5, 1118-1124, 2005) . To remove benzyl groups from PBLA, PBLA-PEG was dissolved in a DMF / MeOH mixture (1: 1 volume ratio) and Pd / C catalyst was added to the solution. The solution was then stirred under hydrogen atmosphere at room temperature for 1 hour. The catalyst was then removed by filtration using celite, the filtrate was precipitated with cold diethyl ether and the filtrate was obtained and dried in vacuo. The presence of deprotected carboxyl groups on P (Asp) -PEG was confirmed by 1 H NMR analysis in DMSO-d 6 using TMS standards. p (Asp) -PEG was obtained in 60.5% yield.
그후, 탈보호된 P(Asp)-PEG를 디클로로메탄 (DCM)에 용해된 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC)에 의해 예비활성화 시키고, 1-(3-아미노프로필)-이미다졸 (P(Asp)-PEG 상의 카르복실기에 대하여 1.5몰 과량) 존재 하에서 DMF에서 용해시키고 30℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 용액을 preswollen 투석막 튜브 (Spectra/Por; MWCO 2K)로 전이시키고 탈이온수로 3일 동안 투석시켜 결합되지 않은 1-(3-아미노프로필)-이미다졸을 제거하였다. 그후, 얻어진 용액이 동결건조된 1-(3-아미노프로필)-이미다졸 접합체라는 것을 1H NMR (DMSO-d6 with TMS)의 δ6.88-7.63 (이미다졸기)을 통해 확인하였다(도 3 참조).Deprotected P (Asp) -PEG is then preactivated by N-hydroxysuccinimide (NHS) and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) dissolved in dichloromethane (DCM) , Dissolved in DMF in the presence of 1- (3-aminopropyl) -imidazole (1.5 molar excess relative to carboxyl groups on P (Asp) -PEG) and stirred at 30 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the solution was transferred to a preswollen dialysis membrane tube (Spectra / Por; MWCO 2K) and dialyzed with deionized water for 3 days to remove unbound 1- (3-aminopropyl) -imidazole. Then, it was confirmed by δ 6.88-7.63 (imidazole group) of 1 H NMR (DMSO-d 6 with TMS) that the obtained solution was a lyophilized 1- (3-aminopropyl) -imidazole conjugate (FIG. 3).
<실험예 1> 산-염기 적정 분석Experimental Example 1 Acid-Base Titration Analysis
앞서 제조된 고분자의 pH에 따른 반응성을 확인하기 위해 적정 실험을 진행하였다. 즉, 전위차법을 이용하여 P(Asp)-PEG, P(Asp-g-Im)-PEG 및 NaCl (대조군)의 적정 그래프를 얻었다. 블록 공중합체 또는 NaCl을 탈이온수 (30 mmol/L)에 용해시킨 후, 1N NaOH로 pH가 11이 되도록 조정하였다. 이러한 용액을 0.1N HCl로 적정하여 pH 프로파일을 얻었다. Proper experiment was carried out to confirm the reactivity according to the pH of the prepared polymer. That is, a titration graph of P (Asp) -PEG, P (Asp-g-Im) -PEG and NaCl (control) was obtained using the potentiometric method. The block copolymer or NaCl was dissolved in deionized water (30 mmol / L) and then adjusted to pH 11 with 1N NaOH. This solution was titrated with 0.1N HCl to obtain a pH profile.
그 결과, 도 2와 같이 탈보호 과정 직후의 고분자보다 이미다졸 그룹을 도입한 다음의 고분자가 버퍼존이 더 길어짐을 확인하여 각 상태의 고분자를 알 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 2, the polymer after the imidazole group was introduced into the buffer zone longer than the polymer immediately after the deprotection process, and thus the polymer in each state was known.
<실험예 2> 마이셀 형성 및 분석Experimental Example 2 micelle formation and analysis
1. 마이셀 형성1. Formation of micelles
P(Asp-g-Im)-PEG을 50:50 EtOH/DCM 혼합물 10ml에 용해하였다. 마이셀 형성을 위하여, 로터리 증발기(EYELA n-1000, Tokyo)를 이용하여 유기상을 제거하여 둥근 바닥 플라스크에 필름을 형성하였다. HCl (또는 NaOH)-Na2B4O7 완충용액 (1mM, pH 8.5)으로 상기 필름을 재수화하여 마이셀을 형성하였다. 마이셀 용액의 pH 값을 인산완충 생리식염수 (pH 8.0 - 6.0) 및 구연산 완충액 (pH 5.0 - 4.0)으로 조정하였다. P (Asp-g-Im) -PEG was dissolved in 10 ml of a 50:50 EtOH / DCM mixture. For micelle formation, the organic phase was removed using a rotary evaporator (EYELA n-1000, Tokyo) to form a film in a round bottom flask. The film was rehydrated with HCl (or NaOH) -Na 2 B 4 O 7 buffer (1 mM, pH 8.5) to form micelles. The pH value of the micelle solution was adjusted with phosphate buffered saline (pH 8.0-6.0) and citric acid buffer (pH 5.0-4.0).
2. 동적 광산란 (Dynamic Light Scattering; DLS)을 이용한 마이셀 입자의 크기분포도 측정2. Measurement of Size Distribution of Micell Particles Using Dynamic Light Scattering (DLS)
앞서 제조된 마이셀을 pH 6.0~8.0까지 변화시키면서 DLS(Dynamic Light Scattering, Zetanano)를 이용하여 크기 변화를 측정하였다. 보다 상세하게는, Multi Angle Sizing Option (BI-MAS)을 구비한 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)을 이용하여 광자상 관측정법(photon correlation spectroscopy, PCS)으로 입자의 유효 유체역학적 직경 (Deff)을 측정하였다. 90°의 산란각에서 자동온조조절 셀에서 크기를 측정하였다. 제작자에 의해 제공된 소프트웨어를 이용하여 Deff을 산출하였다. 고분자 마이셀 (0.1 중량%, 이온강도 : 0.15)은 보레이트 완충액 (pH 8.5)에서 현탁된 스탁 마이셀 현탁액으로부터 PBS 완충액에서 다양한 pH 값 (pH 8.0 - 6.0)에서 준비하였다. The size change was measured using DLS (Dynamic Light Scattering, Zetanano) while changing the previously prepared micelle to pH 6.0-8.0. More specifically, the effective hydrodynamic diameter (D) of the particles is determined by photon correlation spectroscopy (PCS) using Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK) with Multi Angle Sizing Option (BI-MAS). eff ) was measured. Sizes were measured in thermostat cells at a scattering angle of 90 °. D eff was calculated using the software provided by the manufacturer. Polymer micelles (0.1 wt.%, Ionic strength: 0.15) were prepared at various pH values (pH 8.0-6.0) in PBS buffer from the stock micelle suspension suspended in borate buffer (pH 8.5).
그 결과, 도 2와 같이 pH 7.0 이상에서는 일정한 크기를 갖는 마이셀이 존재하는 것을 알 수 있으나, pH 7.0 미만에서는 이미다졸 그룹이 이온화되면서 크기가 커지는 것을 확인할 수 있었다. As a result, it can be seen that micelles having a certain size exist at pH 7.0 or higher as shown in FIG. 2, but at pH below 7.0, imidazole groups are ionized to increase in size.
3. 제타전위 측정3. Zeta potential measurement
다양한 pH 값 (pH 8.0 - 4.0, 이온강도: 0.15)에서 P(Asp-g-Im)-PEG 용액 (0.1 mg/ml)의 제타 전위는 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)를 이용하여 측정하였다. 측정 전 P(Asp-g-Im)-PEG 용액을 실온에서 3시간 이상 동안 안정화시켰다. Zeta potential of P (Asp-g-Im) -PEG solution (0.1 mg / ml) at various pH values (pH 8.0-4.0, ionic strength: 0.15) was measured using Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK) It was. The P (Asp-g-Im) -PEG solution was stabilized at room temperature for at least 3 hours before measurement.
도 3과 같이 pH 7.0에서부터 이온화가 시작됨을 수치가 pH 7.0 이상의 값들 보다 약간 낮아짐으로써 알 수 있었으며, pH 4.0에서 완전히 +전하를 띄면서 남아있는 카르복실 관능기의 -전하까지 +전하로 치환되어 값을 나타냄을 알 수 있었다.It can be seen that the ionization starts from pH 7.0 as shown in Figure 3 is slightly lower than the value above pH 7.0, the value is replaced by the + charge to the -charge of the remaining carboxyl functional groups with a fully + charge at pH 4.0 It can be seen that.
4. 임계 마이셀 형성 농도(CMC) 분석4. Critical micelle formation concentration (CMC) analysis
Scinco FS-2 형광분석기를 이용하여 앞서 제조된 마이셀을 pH 6.0~pH 8.0까지 CMC를 측정하였다. 이러한 형광분석기는 excitation (339nm) 및 emission (374nm) 광선용 편광판이 장착되어 있다. 피렌이 형광 탐침으로 사용되었다. 마이셀 시료를 PBS 완충액을 이용하여 8.0 내지 6.0의 다양한 pH 범위 값에서 준비하고, 파이렌을 혼합하며(파이렌 농도는 6.0×10-7M), 밤새도록 실온에서 교반하였다. 모든 측정은 air-equilibrated 용액을 이용하여 실온에서 수행되었다. CMC 값은 마이셀 농도의 log10 값에 대하여 emission 분석 프로파일의 I3(3번째 피크의 강도)에 대한 I1(첫번째 피크의 강도)의 비율을 플롯하여 결정하였다. CMC 값은 이들 그래프 상의 낮은 고분자 농도의 교차점으로서 정의하였다. Using the Scinco FS-2 fluorescence spectrometer, the previously prepared micelles were measured for CMC up to pH 6.0-pH 8.0. The fluorometer is equipped with polarizing plates for excitation (339 nm) and emission (374 nm) rays. Pyrene was used as the fluorescent probe. Micelles samples were prepared at various pH range values of 8.0 to 6.0 using PBS buffer, pyrene mixed (pyrene concentration 6.0 × 10 −7 M) and stirred overnight at room temperature. All measurements were performed at room temperature using air-equilibrated solutions. CMC values were determined by plotting the ratio of I 1 (the intensity of the first peak) to I 3 (the intensity of the third peak) of the emission analysis profile against the log 10 value of the micelle concentration. CMC values were defined as the intersection of low polymer concentrations on these graphs.
그 결과, 도 4와 같이 본 발명의 블록 공중합체는 pH 7.4에서는 안정한 마이셀을 형성하였으며, pH 7.0에서는 이미다졸 링이 깨지면서 농도의 변화가 생기는 것을 확인할 수 있었다. 이는 낮은 pH (pH 7.0 이하)에서 이미다졸에 존재하는 3차 아민의 이온화도 증가로 인해 고분자가 수용성으로 변하게 되어 상기 공중합체가 마이셀을 형성할 수 없게 되며, pH 7.4에서는 고분자 이온화도가 저하되어 소수성 특징을 나타냄으로써 자기 조립에 의한 마이셀을 형성하는 것을 의미한다.As a result, as shown in Figure 4, the block copolymer of the present invention formed a stable micelle at pH 7.4, it was confirmed that the change in concentration occurs as the imidazole ring is broken at pH 7.0. This is due to an increase in the degree of ionization of the tertiary amine present in the imidazole at low pH (below pH 7.0), resulting in the polymer becoming water soluble and the copolymer being unable to form micelles. By expressing this means forming the micelle by self-assembly.
5. 마이셀의 형상5. Shape of micelles
P(Asp-g-Im)-PEG 마이셀의 형상을 관찰하기 위하여, 글래스 슬라이드 상에 pH 7.4 또는 pH 6.0에서 희석된 P(Asp-g-Im)-PEG 용액 (0.1 g/l)을 주조하고 진공상에서 건조하여 준비하였다. 이때, 형상은 전계방사형주사현미경 (field emission scanning electron microscope; FE-SEM, Hitachi-4800, Japan)을 이용하여 측정하였다.To observe the shape of P (Asp-g-Im) -PEG micelles, cast a P (Asp-g-Im) -PEG solution (0.1 g / l) diluted at pH 7.4 or pH 6.0 on a glass slide and Prepared by drying in vacuo. At this time, the shape was measured by using a field emission scanning electron microscope (FE-SEM, Hitachi-4800, Japan).
그 결과, 도 5와 같이 크기분포도(size distribution)와 비교하여 비슷한 크기의 결과와 마이셀의 형태가 변하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5, the results of the similar size and the shape of the micelle were changed as compared with the size distribution.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
Claims (12)
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, m은 10 내지 45의 정수이고, n은 15 내지 35의 정수이며, m과 n의 합이 18 내지 60의 정수임.The pH-reactive block copolymer of claim 1, wherein the block copolymer is a compound represented by the following Chemical Formula 1:
[Formula 1]
In Formula 1, m is an integer of 10 to 45, n is an integer of 15 to 35, the sum of m and n is an integer of 18 to 60.
ii) 제1단계에서 얻어진 아스파르트산 고분자를 활성화된 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 반응시키는 단계(제2단계);
iii) 제2단계에서 얻어진 반응물에서 미활성 벤젠을 제거하는 단계(제3단계); 및
iv) 제3단계에서 얻어진 반응물에 이미다졸 고리를 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 pH 반응성 블록 공중합체 제조방법.i) synthesizing aspartic acid polymer by ring-opening polymerization using N-carboxyhydride (NCA) of aspartic acid (first step);
ii) reacting the aspartic acid polymer obtained in the first step with activated polyethylene glycol (PEG) (second step);
iii) removing unactivated benzene from the reactants obtained in the second step (third step); And
iv) introducing the imidazole ring into the reactant obtained in the third step.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서, m은 10 내지 45의 정수이고, n은 15 내지 35의 정수이며, m과 n의 합이 18 내지 60의 정수임.The method of claim 8, wherein the pH-reactive block copolymer is a compound represented by Formula 1 below.
[Formula 1]
In Formula 1, m is an integer of 10 to 45, n is an integer of 15 to 35, the sum of m and n is an integer of 18 to 60.
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