KR20120004487A - 헵시딘 결합형 핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 헵시딘 결합 가능한 핵산에 관한 것이다.

Description

헵시딘 결합형 핵산 {HEPCIDIN BINDING NUCLEIC ACIDS}
본 발명은 헵시딘(hepcidin)에 결합하는 핵산, 각각 약제 및 진단제 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
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헵시딘 (Hepcidin; HEPC-HUMAN, SwissProt entry P81172)의 1차원 구조는 2000년에 확인되었다(Krause, 2000). 헵시딘은 항-미생물성 펩티드(peptides)를 조사한 또 다른 연구그룹에 의하여 독립적으로 발견되었다(Park, 2001). 상기 단백질의 동의어로는 간-발현성 항-미생물성 펩티드(liver-expressed antimicrobial peptide; 약어: LEAP-1) 및 추정성 간암 제어자(Putative liver tumour regressor; 약어: PLTR). 헵시딘은 시스테인-풍부(cysteine-rich) 양이온성 펩티드(cationic peptide)로서 분자량 2,790 달톤(Dalton)에 해당하는 25개 아미노산으로 구성된다. 8개의 시스테인기(The eight cysteines)들은 4개의 이황화 결합(disulfide bond)을 형성하여 분자에 안정하고 견고한 구조를 제공한다.
헵시딘의 3차원 구조는 NMR 분석법으로 측정되었다(Hunter, 2002). 상기 단백질은 헤어핀(hairpin) 모양의 굴곡부분에서 발견되는 특이적으로 근접한 이황화 결합을 갖는 뒤틀린 베타-시트(beta-sheet)로 구성된다(Hunter, 2002).
다른 포유동물 종과는 상이한 헵시딘의 아미노산 서열은 일반적으로 진화 중에 잘 보존되어 있다. 인간 헵시딘은 하기와 같은 동일한 아미노산의 백분율을 공유하고 있다 :
- Macaca mulatta (레서스 원숭이-Rhesus monkey) 100%
- Macaca fascularis (시노몰거스 원숭이-cynomolgus monkey) 100%
- Sus Scrofa (돼지-Pig) 84%
- Mus musculus (마우스-Mouse) 76%
- Rattus norvegicus (래트-Rat) 68%
25개 아미노산으로 구성된 생리활성 헵시딘(헵시딘-25이라고도 지칭함: hepcidin-25)에 더하여, 20개 및 22개 아미노산(각각, 헵시딘-20 및 헵시딘 22이라고도 지칭)으로 구성된 2개의 절단형의 불활성(inactive) 변이체도 동정되었다 (Rivera, 2005). 이러한 모든 펩티드들은 인간 및 래트(rat)에서는 84개 아미노산 전구 펩티드(prepropeptide), 마우스에서는 83개 아미노산 전구 펩티드(prepropeptide)를 기초로 하여 생산된다(Pigeon, 2001). 84개 아미노산인 헵시딘 펩티드 전구체는 제거된 전형적인 소포체 목표화(endoplasmic reticulum targeting) 24-아미노산 신호성 펩티드(signal peptide) 및 전구호르몬 전환효소 퓨린(prohormone convertase furin)을 위한 컨센서스 절단 부위(consensus cleavage site)를 포함한다(Valore, 2008). 이러한 진행 단계들은 혈액 및 소변에서 발견되는, 활성형 25 개 아미노산 펩티드 호르몬을 생산한다.
헵시딘은 철분 항상성(iron homeostasis)을 신호 조절하는 주요 단백질이다. 헵시딘-결핍증(hepcidin-deficiency) 및 헵시딘 과발현 마우스 모델(hepcidin overexpressing mouse models)에서 나타난 바와 같이 인체에서의 높은 수준의 헵시딘은 감소된 혈청 철분 수준을 초래하나 낮은 수준의 헵시딘은 증가된 혈청 철분 수준을 초래한다(Nicolas, 2001; Nicolas, 2002; Nicolas, 2003). 추가로, 헵시딘 활성 감소를 초래하는 헵시딘 유전자상의 변이는 심각한 철분 축적질환인 청소년 색소침착증(juvenile hemochromatosis)을 수반한다(Roetto, 2003). 헵시딘을 복강내 투여시에는 혈청 철분이 용량 의존적으로 장기간 감소함이 밝혀졌다(Rivera, 2005).
철분은 모든 생존 유기체의 성장 및 발달에 요구되는 필수 원소이다. 포유동물에서의 철분 함량은 이들이 저장되는 세포에서의 철분 흡수, 철분 재흡수 및 철분 분비과정에 의하여 조절된다. 철분은 대부분 장 세포에 의하여 십이지장 및 공장에서 흡수된다.
피드백 기전(feedback mechanism)은 철분 결핍증 환자의 철분 흡수를 증진시키고 철분 축적증 환자의 철분 흡수를 감소시킨다. 이러한 기전의 주요 화합물은 헵시딘 수용체(hepcidin receptor)로 작용하는 철분 수송체 페로포르틴(iron transporter ferroportin)이다(Abboud, 2000; Donovan, 2000; McKie, 2000). 페로포르틴(Ferroportin)은 마우스, 래트 및 인체들 간에 90% 서열 상동성을 갖는 철분 분비를 조절하는 571개 아미노산 단백질이다(McKie, 2000). 이러한 주요 철분 수송 단백질은 태반 합포체성 영양세포막 및 장 세포의 기저막상에 위치한다.
헵시딘은 상술한 세포 형들에 발현된 페로포르틴(ferroportin)과 결합함으로서 서로 상이한 세포 형태들로부터의 분비를 저해하고 이의 인산화(phosphorylation), 내부화(internalisation), 유비퀸화(ubiquitylation) 및 리소솜 분해(lysosomal degradation)를 유도하여 혈액으로의 페로포르틴 매개성 철분 분비를 감소시킨다(Nemeth, 2004; De Domenico, 2007). 혈장 철분이 헤모글로빈(haemoglobin) 합성에 소모됨에 따라 건장한 객체에서는 혈장 철분 수준은 감소하고 헵시딘 생산은 약화되게 된다.
급성 및 만성 전신성 염증상태에서 시토킨(cytokin)은 헵시딘 생산을 유도한다. 헵시딘 유전자 발현(Hepcidin gene expression)은 척추동물의 선천성 면역계의 급성 형태 반응을 유도하는, 감염증과 같은 염증성 자극 후에 유의적으로 증가되는 것으로 관찰되었다. 마우스에서 헵시딘 유전자 발현은 지질다당체(lipopolysaccharide; Constante, 2006), 투르펜틴(turpentine; Nemeth, 2004) 및 프러운트 완전 보체(Freund´s complete adjuvant; Frazer, 2004), 및 아데노바이러스 감염증(adenoviral infections)에 의하여 상위 조절(upregulated)되는 것으로 밝혀졌다. 인체에서 헵시딘 발현은 염증성 시토킨 인터류킨(inflammatory cytokine interleukine)-6 및 LPS에 의하여 유도된다(Nemeth, 2004). 헵시딘 발현 및 염증에서의 빈혈간의 강력한 상관관계가 박테리아성, 진규성 및 바이러스성 감염증을 포함한 만성 염증성 질환 환자에서 또한 발견된다. 증가된 농도의 헵시딘을 갖는 이러한 상태에서는 대식세포, 간조직성 저장소 및 십이지장으로부터 혈장으로의 철분 유출(efflux)을 저해한다. 저철혈증(Hypoferremia)이 심화되고 적혈구 생성(erythropoiesis)이 철분-제한적(iron-limited)이 되고 만성 염증 상태하의 빈혈을 초래한다(Weiss, 2005; Weiss, 2008; Andrews, 2008).
본 발명의 근본적인 해결 과제는 헵시딘과 특이적으로 상호작용하는 수단을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 해결 과제는 헵시딘과 특이적으로 상호작용하는 핵산(nucleic acid)에 근거한 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 해결 과제는 인간 또는 비-인간 질환들의 치료를 위한 약제 제조를 위한 수단을 제공하는 것으로, 상기 질환들은 병리 유전적 기전적으로 직접 또는 간접적으로 관련된 헵시딘에 의해서 특징된 것들이다.
본 발명의 보다 더 추가적인 해결 과제는 질병의 치료를 위한 진단제를 제조하기 위한 수단을 제공하는 것으로, 상기 질환들은 병리 유전적 기전적으로 직접 또는 간접적으로 관련된 헵시딘에 의해서 특징된 것들이다.
본원에서 열거되는 상기 또는 기타 해결과제들은 첨부된 독립항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 구현예는 종속항들로부터 획득가능하다.
나아가, 본 발명의 해결과제는 본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예로서, 헵시딘(hepcidin)에 결합가능한 핵산으로 해결가능하다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 핵산은 헵시딘(hepcidin)의 길항제(antagonist)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 핵산은 헵시딘-페로포르틴 계(hepcidin ferroportin system)의 저해제(inhibitor)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 핵산은 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치(terminal stretch), 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch) 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치(terminal stretch)를 포함하며, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 32 내지 40개 뉴클레오티드(nucleotide), 바람직하게는 32 내지 35 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치(terminal stretch), 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (central stretch) 및 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치(terminal stretch)를 포함하며, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 32 내지 40개 뉴클레오티드(nucleotide), 바람직하게는 32 내지 35 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 및 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 헵시딘과의 결합에 필수적인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’ 또는 5’ RKAUGGGAKAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 내지 제 7차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUUGGAGGAAR 3’, 바람직하게는 5’ GUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차, 및 제 8차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화 될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조(double-stranded structue)가 형성되며, 여기에서
상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5 내지 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5 내지 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 9차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 이중가닥 구조는 5개 내지 8개 염기쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 내지 제 10차 구현예, 바람직하게는, 첫 번째 측면의 제 8차 내지 제 10차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기 X1은 A 또는 존재하지 않으며, X2는 G 또는 존재하지 않으며, X3는 B 또는 존재하지 않으며, X4는 S 또는 존재하지 않으며; X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 내지 제 11차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVBX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
(c) X1은 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 내지 제 12차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 13차 구현예로서,
(a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGUGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGUGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GAUGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGUGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(e) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGUGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(f) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 내지 제 10차 구현예, 바람직하게는 제 8차 내지 제 10차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
(c) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 내지 제 12차 구현예 및 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 B 또는 존재하지 않고, X4는 S 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 15차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 16차 구현예로서,
(a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GCGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(e) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 7차 구현예 내지 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 상기 핵산은 서열번호(SEQ. ID. Nos). 115 내지 119, 서열번호 121, 서열번호 142, 서열번호 144, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 151, 서열번호 152, 서열번호 175 또는 서열번호 176 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 구현예 내지 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ GRCRGCCGGVGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’ 또는 5’ GRCRGCCGGARGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 내지 제 6차 구현예 및 제 18차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 19차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ GRCRGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’, 바람직하게는, 5’ GACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 19차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 20차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조(double-stranded structure)가 형성되며, 여기에서
상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 4 내지 7개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 4 내지 7개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 20차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 21차 구현예로서, 상기 이중가닥 구조는 4개 내지 7개 염기쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 21차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 22차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기 X1은 A 또는 존재하지 않으며, X2는 G 또는 존재하지 않으며, X3는 R 또는 존재하지 않으며, X4는 Y 또는 존재하지 않으며; X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 22차 구현예, 바람직하게는 제 19차 내지 제22차의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 23차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
(c) X1은 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 23차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차 구현예로서,
(a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCUCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCCCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCUUG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGCCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
(d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGACUUG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGUCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 22차 구현예, 바람직하게는 제 19차 내지 제 22차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 25차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않고, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
(c) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 22차 구현예 및 제 25차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 26차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCUCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 22차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 27차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기에서, 상기
X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R 또는 존재하지 않거나, X4는 Y 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 내지 제 22차 및 제 27차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는
상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 6차 구현예 및 제 18차 내지 제 28차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 29차 구현예로서, 상기 핵산은 서열번호 (SEQ. ID. Nos). 122 내지 126, 서열번호 154, 서열번호 159, 서열번호 163, 또는 서열번호 174 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 4차 구현예 내지 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5‘->3’ 방향으로 하기한 뉴클레오티드: 박스(Box) A, 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch) 및 박스(Box) B이며, 여기에서 상기 박스 A는 5’ WAAAGUWGAR 3’를 포함하고; 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch)는 10개 내지 18개 뉴클레오티드를 포함하고 상기 박스(Box) B는 5’ RGMGUGWKAGUKC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 31차 구현예로서, 상기 박스 A는 5’ UAAAGUAGAG 3’, 5’ AAAAGUAGAA 3’, 5’ AAAAGUUGAA 3’ 및 5’ GGGAUAUAGUGC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열; 바람직하게는 상기 박스 A 는 5’ UAAAGUAGAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 31 차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 32차 구현예로서,
상기 박스 B는 5’ GGCGUGAUAGUGC 3’, 5’ GGAGUGUUAGUUC 3’, 5’ GGCGUGAGAGUGC 3’, 5’ AGCGUGAUAGUGC 3’ 및 5’ GGCGUGUUAGUGC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열; 바람직하게는 상기 박스 B 는 5’ GGCGUGAUAGUGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 32차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 33차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch) 는 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 제 1차 연결 서브 스트레치(linking substretch), 뉴클레오티드의 제 2차 연결 서브 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브 스트레치를 포함하고, 여기에서 바람직하게는, 상기 제 1차 연결 서브 스트레치 및 제 3차 연결 서브 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 상기 혼성화에 의해 이중가닥 구조(double-stranded structure)가 형성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 33차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차 구현예로서, 상기 제 1차 연결 서브 스트레치 및 제 3차 연결 서브 스트레치는 상호 독립적으로 3개 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 32차 내지 제 34차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 35차 구현예로서, 상기 이중 가닥 구조는 3개 내지 6개의 염기쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 32차 내지 제 35차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 36차 구현예로서,
(a) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GGAC 3’, 5’ GGAU 3’ 및 5’ GGA 3’로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUCC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(b) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GCAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ CUGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(c) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GGGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GCCC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(d) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GAC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(e) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ ACUUGU 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GCAAGU 3’ 및 5’ GCAAGC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(f) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ UCCAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ CUGGA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
바람직하게는, 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GAC 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 33차 내지 제 36차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 제 37차 구현예로서, 상기 제 2차 연결 서브 스트레치 및 제 3차 연결 서브 스트레치는 상호 독립적으로 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 33차 내지 제 37차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ VBAAW 3’, 5’ AAUW 3’ 및 5’ NBW 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 39차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ VBAAW 3’, 바람직하게는, 5’ CGAAA 3’, 5’ GCAAU 3,’ 5’ GUAAU 3’ 및 5’ AUAAU 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 40차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ AAUW 3’, 바람직하게는, 5’ AAUU3’ 또는 5’ AAUA 3’, 보다 바람직하게는, 5’ AAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 41차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ NBW 3’, 바람직하게는, 5’ CCA 3’, 5’ CUA 3’, 5’ UCA 3’, 5’ ACA 3’, 5’ GUU 3’, 5’ UGA 3’ 및 5’ GUA 3’, 보다 바람직하게는 5’ CCA 3’, 5’ CUA 3’, 5’ UCA 3’, 5’ ACA 3’ 및 5’ GUU 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30 차 구현예 내지 제 41차 구현예의 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 42차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치는 5’ GGACBYAGUCC 3’, 5’ GGAUACAGUCC 3’, 5’ GCAGGYAAUCUGC 3’, 5’ GACAAUWGUC 3’, 5’ ACUUGUCGAAAGCAAGYU 3’, 5’ UCCAGGUUCUGGA 3’, 5’ GGGCUGAGCCC 3’, 5’ GCAGAUAAUCUGC 3’ 및 5’ GGACCAGUCC 3’으로 구성된 구으로부터 선택된, 바람직하게는, 5’ GGACCCAGUCC 3’, 5’ GGACCUAGUCC 3’, 5’ GGACUCAGUCC 3’, 5’ GCAGGUAAUCUGC 3’, 5’ GCAGGCAAUCUGC 3’, 5’ GACAAUUGUC 3’ 및 5’ GACAAUAGUC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30 차 구현예 내지 제 42차 구현예의 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 43차 구현예로서,
상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 상기 혼성화에 의해 이중가닥 구조(double-stranded structure)가 형성되고,
상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 4개 내지 7개의 뉴클레오티드를 포함하고,
상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 4개 내지 7개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 43차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차 구현예로서, 상기 이중 가닥 구조는 4개 내지 7개의 염기쌍으로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30 차 구현예 내지 제 44차 구현예의 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 45차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK 3’을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’을 포함하는 것이며,
여기에서 상기
X1은 G 또는 존재하지 않고, X2는 S 또는 존재하지 않고, X3는 V 또는 존재하지 않고, X4는 B 또는 존재하지 않고; X5는 S 또는 존재하지 않고 X6는 C 또는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 44차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 46차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 C이거나, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 C이거나, 또는
(c) X1은 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 46차 구현예, 바람직하게는 제 46차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 47차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCACUCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGUGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 45차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
여기에서, 상기
(a) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
(b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
(c) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 존재하지 않고, X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 45차 구현예 및 제 48차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 49차 구현예로서,
(a) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACAGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(b) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACACG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(c)상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUGCU 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ AGCACG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(d) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(e) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCCGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(f) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACCGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(g) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCAGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(h) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGGG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CCCAGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
(i) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCCGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30 차 구현예 내지 제 44차 구현예의 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 50차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK 3’을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’을 포함하는 것이며,
여기에서 상기
X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V 또는 존재하지 않고, X4는 B 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 30차 내지 제 45차 구현예 및 제 50차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 51차 구현예로서,
상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CACG 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 6차 및 30차 내지 51차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 52차 구현예로서, 상기 핵산은 서열번호(SEQ. ID. Nos). 29, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 137 내지 141 또는 서열번호 173 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 6차 및 30차 내지 51차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 52차 구현예로서, 상기 핵산은 서열번호(SEQ. ID. Nos) 127 내지 131중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 53차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차 구현예로서, 상기 헥산은 헵시딘과 결합가능하고, 여기에서 헵시딘은 인간 헵시딘(hepcidin)-25, 인간 헵시딘(human hepcidin)-22, 인간 헵시딘(human hepcidin)-20, 원숭이 헵시딘(monkey hepcidin)-25, 원숭이 헵시딘(monkey hepcidin)-22, 원숭이 헵시딘(monkey hepcidin)-20, 바람직하게는, 인간 헵시딘(human hepcidin)-25인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 54차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 55차 구현예로서, 상기 핵산은 헵시딘은 서열 번호 (SEQ. ID. No). 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 55차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 구현예로서, 상기 핵산은 변형체 (modification)를 포함하며, 여기에서 상기 변형체를 포함하는 핵산 분자(nucleic acid molecule)의 유기체에서의 배출율(excretion rate)이 상기 변형체를 포함하지 않은 핵산 분자와 비교시에 보다 감소된 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 55차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 57차 구현예로서, 상기 핵산은 변형체 (modification)를 포함하며, 여기에서 상기 변형체를 포함하는 핵산 분자(nucleic acid molecule)의 유기체에서의 잔류시간(retention time)이 상기 변형체를 포함하지 않은 핵산 분자와 비교시에 보다 증가된 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 내지 제 57차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차 구현예로서, 상기 변형체 (modification)는 생분해성(biodegradable) 및 비생분해성(non-biodegradable) 변형체를 포함하는 군으로부터 선택된 것, 바람직하게는 선형 폴리(에틸렌) 글리콜 [linear poly (ethylene) glycol], 쇄상 폴리(에틸렌) 글리콜 [branched poly (ethylene) glycol], 히드록시에틸 전분 (hydroxyethyl starch), 펩티드(peptide), 단백질(protein), 다당체(polysaccharide), 스테롤(sterol), 폴리옥시프로필렌 (polyoxypropylene), 폴리옥시아미데이트 (polyoxyamidate), 폴리 (2-히드록시에틸)-L-글루타민 [poly (2-hydroxyethyl)L-glutamine] 및 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)를 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 59차 구현예로서, 상기 변형체 (modification)는 쇄상 또는 가지상 PEG로 구성된 PEG기이며, 여기에서 상기 PEG 기의 분자량은 바람직하게는, 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da 및 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 60차 구현예로서, 상기 변형체 (modification)는 HES기이며, 여기에서 상기 HES 기의 분자량은 바람직하게는, 약 10,000 내지 약 200,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 170,000 Da 및 가장 바람직하게는 약 150,000 Da인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 내지 제 60차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 61차 구현예로서, 상기 변형체는 핵산과 링커 (linker)를 통해 결합된 것이고 상기 링커는 생분해성 링커인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 내지 제 61차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 62차 구현예로서, 상기 변형체는 핵산의 5‘-터미널 뉴클레오티드 및/또는 3’-터미널 뉴클레오티드 및/또는 5‘-터미널 뉴클레오티드 및 3’-터미널 뉴클레오티드 사이의 핵산의 뉴클레오티드에 결합되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 56차 내지 제 62차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 63차 구현예로서, 상기 유기체는 동물 또는 인체, 바람직하게는, 인체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 63차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 64차 구현예로서, 상기 핵산의 뉴클레오티드 또는 핵산을 형성하는 상기 뉴클레오티드는 L-뉴클레오티드(nucleotide)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 64차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 65차 구현예로서, 상기 핵산은 L-뉴클레오티드(nucleotide)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 65차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 66차 구현예로서, 상기 핵산은 헵시딘과 결합가능한 하나 이상의 결합 부위 (moiety)를 포함하고, 여기에서 상기 결합 부위는 L-뉴클레오티드로 구성된 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 내지 제 66차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 67차 구현예로서, 상기 핵산은 질환(diseases)의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 두 번째 측면으로서 본 발명의 해결과제는 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물에 의해 해결되며, 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 두 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 약학조성물은 상기 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것이다.
본 발명의 해결과제는 본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 세 번째 측면으로서, 약제 (medicament) 제조를 위한 상기 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 용도에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 약제는 인간용 약제 또는 수의학적 약제로서의 용도인 것이다.
본 발명의 해결과제는 본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 네 번째 측면으로서, 진단용 수단을 제조하기 위한 상기 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 용도에 의해 해결되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 약제는 빈혈증(anemia), 저철혈증(hypoferremia), 이식증(pica), 상승된 헵시딘 수준인 상태 (conditions with elevated hepcidin level), 상승된 철분 수준인 상태 또는 철분 과적증 상태 (conditions with elevated iron level or conditions with iron overload)의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 빈혈증은 철적아구성 빈혈증 (sideroblastic anemia), 소구성 저색소성 빈혈증(hypochromic microcytic anemia), 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증(anemia caused by chronic disease and/or disorder), 염증에 기인한 빈혈증(anemia caused by inflammation), 유전적 장애에 기인한 빈혈증(anemia caused by genetic disorders), 급성 감염증에 기인한 빈혈증(anemia caused by acute infections), 철분 대사 및/또는 항상성 유전자 변이에 기인한 빈혈증(anemia caused by mutation in genes of iron metabolism and/or homeostasis), 및 항암 치료법에 기인한 빈혈증(anemia caused by cancer treatment)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 만성 질환 및/장애는 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증 (anemia caused by chronic disease and/or disorder)은 만성 염증 (chronic inflammation), 암 (cancer), 자가면역질환 (auoimmune disease) 및/또는 장애(disorder), 만성 감염증 (chronic infection), 동맥경화증 (arteriosclerosis), 죽상경화증 (atherosclerosis), 및 간경화증 (cirrhosis of the liver)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. .
본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 만성 염증(chronic inflammation)은 만성신질환(chronic kidney disease), 만성 폐쇄성 폐질환( chronic obstructive pulmonary disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골관절염 (osteoarthritis), 당뇨병(diabetes), 비만증(obesity), 뇌혈관 질환 (cerebrovascular disease), 울혈성 심장질환(congestive heart disease), 심부전증(congestive heart failure), 심근경색증(myocardial infarction), 관상동맥질환 (coronary artery disease), 폐쇄성 말초 동맥 질환(peripheral occlusive arterial disease), 췌장염(pancreatitis) 및 맥관염(vasculitis)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 만성 신장 질환(chronic kidney disease)은 신장 질환(renal diseases), 만성 신부전증(chronic renal failure) 및 만성 신질환(chronic kidney failure)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고 상기 만성 신질환은 신장투석(kidney dialysis) 또는 신장 이식증(kidney transplantation)이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 자가면역질환(auoimmune disease) 및/또는 장애(disorder)는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 전신성홍반성 낭창(systemic lupus erythrematosus) 및 크론씨 질환(Chrohn’s disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 만성 감염증(chronic infection)은 바이러스성 감염증(viral infection), 바이러스성 병증(viral illness), 박테리아성 감염증(bacterial infection) 및 진균성 감염증(fungal infections)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 바이러스성 감염증 (viral infections)은 간염(hepatitis) 및 HIV 감염증(infection)을 포함하고 상기 박테리아성 감염증(bacterial infections)은 헬리코박터 파이로리 감염증 (H. pyelori infection)을 포함하는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 내지 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 상기 염증에 기인한 빈혈증 (anemia caused by inflammation)은 저색소성(microlytic) 정적혈구성(normocytic)이고/이거나 낮은 망상적혈구생산지수(reticulocyte production index) 및/또는 증가된 염증 마커(marker)로 특징화되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 유전적 장애(genetic disorders)는 캐슬만 질환(Castleman disease), 슈니츨러 증후군(Schnitzler’s syndrome), 철분 불응성 철분결핍성 빈혈증(iron refractory iron deficiency anemia; matriptase-2, TMPRSS6) 변이체(mutation), 무트란스페린혈증(atransferrinemia), 선천성 이적혈구생성 빈혈증(congenital dyserythropoietic anemia) 또는 이상 헤모글로빈증 (hemoglobinopathies)인 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 급성 감염증(acute infection)은 바이러스성 감염증(viral infection), 박테리아성 감염증(bacterial infection), 진균성 감염증(fungal infection)으로 구성된 군으로부터 선택된 질환, 바람직하게는 패혈증(sepsis)인 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 암(cancer)은 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 임파선암(lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 두경부 암(head-and-neck cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colarectal cancer), 비골수성 암(nonmyeloid cancers), 신세포암(renal cell carcinoma), 비소세포 폐암 (non-small-cell lung cancer), 종양(tumors) 및 뇌 종양(brain tumors)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 상기 약제는 상승된 철분 수준을 나타낸 상태(condition)를 치료하기 위한 것이며, 여기에서 상기 상태는 실조증(ataxia), 프리드리히 실조증(Friedrich’s ataxia), 노인황반변성증(age-related macular degeneration), 노년백내장(age-related cataract), 노인성 망막 질환(age-related retinal diseases) 및 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며 상기 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)은 바람직하게는 알츠하이머 질환(Alzheimer’s disease), 파킨슨 질환(Parkinson’s disease), 판토테네이트 키나제-수반 신경되행증(pantothenate kinase-associated neurodegeneration), 하지불안증후군(restless leg syndrome) 및 헌팅톤 질환 (Huntington’s disease)을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 약제는 철분 과적증(iron overload) 상태를 치료하기 위한 것이다(여기에서 헵시딘 혈장 수준은 상승되지 않음).
본 발명의 세 번째 측면의 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 상기 철분 과적증(iron overload)은 수혈성 철분 과적증(transfusional iron overload), 철분 중독증(iron intoxication), 폐혈철증(pulmonary hemosiderosis), 골감소증(osteopenia), 인슐린 저항증(insulin resistence), 아프리칸 철분 과적증(African iron overload), 할로보르단 스파츠 질환(Hallervordan Spatz disease), 과페레틴빈혈증 (hyperferritinemia), 세룰로플라스민결핍증(ceruloplasmin deficiency), 신생아혈색소착증(neonatal hemochromatosis) 및 지중해빈혈증(thalassemia), 알파지중해빈혈증(alpha thalassemia), 중간베타지중해빈혈증(thalassemia intermedia), 겸형 적혈구 빈혈증(sickle cell disease) 및 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome)을 포함한 적혈구 장애(red blood cell disorder)로 구성되는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 내지 제 15차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 상기 약제는 철분 킬레이트화 화합물(iron chelating compound)과 조합하여 사용되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 상기 철분 킬레이트화 화합물(iron chelating compound)은 쿠르쿠민(curcumin), 디페록사민(deferoxamine), 디페라시록스(deferasirox) 및 디페리프론(deferiprone)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 18차 구현예로서, 상기 약제는 추가적인 약제(medicament) 또는 치료법(method of treatment)가의 조합으로 또는 조합을 위하여 사용되는 것이며, 여기에서 상기 약제 또는 치료법은 추가적인 약학적 활성 화합물(pharmaceutically active compound) 또는 이러한 화합물의 투여를 포함하고, 여기에서 상기 추가적으로 활성형 화합물은 철분 보충제(iron supplements), 비타민 보충제(vitamin supplements), 적혈구 생성촉진제(red cell production stimulators), 항생제(antibiotics), 항염 생물학제(anti-inflammatory biologics), 면역계 억제제(suppressors of the immune system), 항-혈전용해제(anti-thrombolytics), 스타틴(statins), 혈관수축제(vasopressors) 및 근수축성 화합물 (inotropic compounds)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 해결과제는 그 다섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한 본 발명의 다섯 번째 측면으로서, 상기한 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산, 및 헵시딘을 포함하는 복합체(complex)에 의해 해결되는 데, 바람직하게는, 여기에서 상기 복합체는 바람직하게는, 결정성 복합체(crystalline complex)인 것이다.
본 발명의 다섯 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 다섯 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것이다.
본 발명의 해결과제는 그 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한 본 발명의 여섯 번째 측면으로서, 헵시딘의 검출(detection)을 위한 상기한 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 용도(use)에 의하여 해결되는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것이다.
본 발명의 해결과제는 그 일곱 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 일곱 번째 측면으로서, 하기 단계를 포함하는 헵시딘 길항제 (antagonist) 또는 헵시딘 효현제(agonist)를 스크리닝하는 방법에 의해 해결된다:
- 후보 헵시딘 길항제 및/또는 후보 헵시딘 효현제를 제공하는 단계,
- 상기 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산을 제공하는 단계,
- 헵시딘 길항제 및/또는 헵시딘 효현제의 존재 하에 신호를 제공하는 시험 계 (test system)를 제공하는 단계, 및
- 상기 후보 헵시딘 길항제가 헵시딘 길항제인지 여부 및/또는 상기 후보 헵시딘 효현제가 헵시딘 효현제인지 여부를 결정(determining)하는 단계.
본 발명의 일곱 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 일곱 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것이다.
본 발명의 해결과제는 그 여덟 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 여덟 번째 측면으로서, 상기한 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산을 포함하는, 헵시딘 검출을 위한 키트(kit)에 의하여 해결된다(여기에서, 바람직하게는 상기 헵시딘은 인간 헵시딘인 것이다).
본 발명의 해결과제는 본 발명의 아홉 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 아홉 번째 측면으로서, 하기 단계를 포함하고, 시료 내에서 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산을 검출하는 방법에 의해 해결된다:
(a) 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 시료를 제공하는(providing a sample) 단계;
(b) 포획 탐침 (capture probe) 및 검출 탐침 (detection probe)를 제공하는 단계로, 상기 포획 탐침은 최소한 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 첫 번째 부위에 부분적으로 상보적 (complementary)이며, 상기 검출 탐침은 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 두 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적이거나, 또는 호환적으로, 상기 포획 탐침은 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 두 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적이고 상기 검출 탐침은 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산의 첫 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적이다;
(c) 상기 포획 탐침 및 검출 탐침을 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산 또는 이들의 일부와 동시에 또는 순서에 상관없이 연속적으로 반응을 수행시키는 단계;
(d) 상기 포획 탐침이 (a) 단계에 의해 제공된 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산과 혼성화되는지 여부를 선택적으로 검출하는 단계; 및
(e) 상기 본 발명의 첫 번째 측면의 임의의 구현예에 따른 핵산 및 상기 포획 탐침 및 상기 검출 탐침으로 구성되는, (c)단계에서 생성된 복합체를 검출하는 단계.
본 발명의 아홉 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 아홉 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 검출 탐침은 검출 수단을 포함하고, 및/또는 상기 포획 탐침은 지지체, 바람직하게는 고체 지지체(solid support)에 고정화될 수 있는 것이다.
본 발명의 아홉 번째 측면의 제 1차 및 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 아홉 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 복합체의 일부가 아닌 어떠한 검출 탐침도 (e) 단계에서 복합체의 일부인 검출 탐침만이 검출되도록 반응으로부터 제거된 것이다.
본 발명의 아홉 번째 측면의 제 1차, 2차 및 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 아홉 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 (e) 단계는 상기 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 양상에 따른 핵산 또는 이들의 일부 존재 하, 및 상기 핵산 또는 이의 일부의 부재 하에서, 상기 포획 탐침과 검출 탐침이 혼성화될 시에 검출 수단에 의해 생성된 신호를 비교하는 단계를 포함하는 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 의한 핵산의 특징은 상기 핵산이 단독 또는 임의의 조합으로 사용되는 본 발명의 어떠한 측면으로 실현될 수 있다.
본 발명과 연계하여, 바람직하게는, 용어 “시료를 제공하는”은 인체 또는 돌물 신체의 치료 또는 진단과 상이할 뿐만 아니라 포함하지도 않는다.
인간 헵시딘-25(hepcidin-25)은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖고 pI 수치(8.2)를 나타내는 기본 단백질(basic protein)이다.
본 발명은 헵시딘에 특이적으로 고친화성(high-affinity)으로 결합하는 핵산을 생성 가능하다는 놀라운 사실에 기초한 것이다. 이러한 핵산들은 바람직하게는 본원에서, 본 발명에 따른 핵산 분자(nucleic acid molecules), 본 발명에 따른 핵산, 발명적 핵산(inventive nucleic acids) 또는 발명적 핵산 분자(inventive nucleic acids molecules)로도 지칭되는 것이다.
인간 헵시딘에 대한 짧고 높은 친화성으로 결합하는 핵산을 동정할 수 있다는 발견은 압타머(aptamers), 즉, 기본 단백질에 배향하는 목표 분자에 결합하는 핵산(nucleic acid)은, 이러한 종류의 목표가 그 비가 높으나 비-특이적인 신호-대 잡음 비(signal-to-noise ratio)를 발생한다는 점에서 일반적으로 그 생성이 매우 어렵다는 점을 보고한 이튼 등의 보고(Easton, Gold et al. 1997)를 감안하면 놀라운 발견이다. 이 높은 신호-대-잡음 비는 인간 헵시딘과 같은 기본 목표들을 위한 핵산에 의해 나타내는 높은 비-특이적 친화성(high non-specific affinity)에 기인한다.
특허청구범위 및 실시예 1에서 보다 상술하는 바와 같이, 본 발명자들은 보다 놀랍게도 해긴 핵산 분자와 결합하는 수개의 상이한 인간 헵시딘들을 동정할 수 있었으며, 여기에서 대부분의 상기 핵산들은 본원에서 박스(Boxes)로 또한 지칭되는 뉴클레오티드의 스트레치에 의하여 특정화될 수 있다. 다양한 인간 헵시딘-결합 핵산 분자는 각각 상기 박스 및 몇몇 구조적 특징들 및 요소들에 기초하여 분류될 수 있다. 그러므로 본원에서 정의되는 다양한 분류들은 형(type), 보다 상세하게는, A형(Type A), B형(Type B), 및 C형(Type C)으로 지칭된다.
헵시딘 결합 핵산들의 서로 상이한 형태는 서로 상이한 뉴클로오티드 스트레치를 포함한다. 따라서, 헵시딘 결합 핵산들의 서로 상이한 형태는 서로 상이한 헵시딘 펩티드에 서로 상이한 결합 양상을 나타낸다. 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 따른 헵시딘 결합 핵산들은 인간 헵시딘(hepcidin)-25, 인간 헵시딘-22, 인간 헵시딘-20, 시노몰거스 (cynomolgus) 헵시딘-25 및 마르모셋 헵시딘(marmoset hepcidin)-25과 결합한다.
본원에서 헵시딘(hepcidin)이라 지칭되는 경우에는 이러한 헵시딘은 역으로 지시되지 않는 한은 헵시딘-25임을 자명할 것이다.
본 발명에 따른 핵산 또는 이의 스트레치 또는 이의 일부(들)는 원칙상 상호 혼성화가 가능함도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 혼성화가 발생시에, 이중 가닥형(double-stranded) 구조가 생성된다. 이러한 혼성화가 특히. 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 발생되거나 발생되지 않을 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다. 또한 이러한 혼성화시에, 적어도 염기쌍에 대한 규칙에 기초하여, 이러한 혼성화 및 이중 가닥 구조가 형성될 수 있은 경우에 2개의 스트레치의 전장 길이 전체에 걸쳐 반드시 발생하지는 않는다. 본원에서 바람직하게는 개시한 바대로, 이중-가닥 구조는 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 염기쌍이 염기 쌍, 바람직하게는 와트슨-크리크(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따른 염기 쌍을 이루어지는, 분자 일부 또는 2개 이상의 분리된 가닥(seperated strands) 또는 단일 가닥의 2개의 공간적으로 분리된 스트레체에 의하여 생성된 구조인 것이다. 후그스텐(Hoogsten) 염기 쌍과 같은 기타 염기 쌍은 이러한 이중-가닥 구조로 또는 이 구조를 형성할 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본원에서 사용된 배열(arrangement)는 본원에서 개시된 핵산과 연관된 본원에서 개시된 구조적 또는 기능적 특징 또는 요소의 순서 (order) 또는 서열(sequence)을 의미한다.
본 발명의 핵산이 헵시딘과 결합 가능함은 당업계에 인지 가능할 것이다. 어떠한 이론에도 얽히지 않는 한도 내에서, 본 발명자들은 상기 헵시딘 결합이 본원에서 청구된 핵산 분자의 3차원 구조적 특성(trait) 또는 요소(element)와의 조합으로 기인하고, 이는 상기 흔적 또는 요소를 형성하는 뉴클레오티드의 1차원 서열을 배향(orientation) 또는 접힘(folding)시키는 형태를 유도함에 기인하는 것으로 추정하였다. 상기 개별적 특성 또는 요소는 그 변이 정도(degree of variation)가 개별적 특성 또는 요소들은 형성하고자 하는 요소 또는 특성의 3차원 구조에 따라 좌우되는, 다양하고 서로 상이한 개별 서열들에 의하여 생성 가능함이 입증되었다. 본원에서 청구된 핵산의 전체적인 결합특성은 다양한 요소 및 특성들의 상호 작용에 각각 기인하며, 이는 결국에는 청구된 핵산의 이의 타겟(target), 즉, 헵시딘(hepcidin)과의 상호 작용을 초래한다. 재차 어떠한 이론에도 제한되지 않는 바램으로서, B 형(type) 및 C형 헵시딘 결합 핵산으로 특징화되는 중간 스트레치(the central stretch), 및 A형 헵시딘 결합 핵산으로 특징화되는 제 1차 스트레치 박스(first stretch Box) A 및 제 1차 스트레치 박스 B 들이 헵시딘과 본원의 핵산과의 결합을 매개하는데 중요한 것으로 사료된다. 결국, 본 발명의 핵산은 헵시딘과의 상호작용 및 이의 검출에 적합하다. 또한, 본 발명에 따른 핵산이 헵시딘에 대한 길항제임은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 헵시딘에 수반 또는 기인한 어떠한 질환의 치료 및 예방에 적합하다. 이러한 과학적 근거는 헵시딘이 다양한 질환(diseases) 및 상태(conditions)와 관련되거나 수반된다는 것을 확립한 선행기술로부터 되는 뒷받침되며, 상기 문헌들은 본원에서 참고로 인용된다.
본 발명에 따른 핵산이 핵산분자임도 본 발명의 범위 내이다. 역으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어인 핵산 (nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)은 동의어로 사용된다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 핵산 및 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자를 형성하는 모든 연속적 뉴클레오티드들은 하나 또는 1개 이상의 공유결합에 의해 연계 또는 연결됨을 특징으로 하는 핵산을 포함하는 것이다. 보다 상세하게는, 상기 뉴클레오티드 각각은 2개의 다른 뉴클레오티드와, 바람직하게는 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합 또는 기타 결합을 통하여 연계 또는 연결되어 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 형성한다. 그러나, 이러한 배열(arrangement)에서 상기 2개의 터미널 뉴클레오티드, 즉, 바람직하게는 5‘ 터미널 및 3’ 터미널에서의 뉴클레오티드가 이러한 배열이 선형(linear)이고 원형 배열이 아니고 원형 분자라기보다는 선형이라는 전제하에서만 단일 뉴클레오티드에 각각 연계되는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 핵산 및 상기 핵산 분자는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 연속 뉴클레오티드의 개개 그룹내에서 개개 뉴클레오티드는 2개 이상의 다른 뉴클레오티드와 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합 또는 기타 결합을 통하여 연계 또는 연결되어 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 형성한다. 그러나, 이러한 배열에서, 상기 2개의 터미널성 뉴클레오티드들은, 즉, 바람직하게는 5‘ 터미널 및 3’터미널에서의 뉴클레오티드가 각각 단일 뉴클레오티드에만 연결된다. 그러나, 이러한 구현예로서, 상기 연속적 뉴클레오티드의 2개의 그룹은 1개 군의 1개의 뉴클레오티드 및 또 다른 또는 기타 그룹의 1개의 뉴클레오티드와 공유결합, 바람직하게는 상기 2개 뉴클레오티드중 1개의 당(sugar) 기와 상기 2개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드(nucleosides)의 것의 포스포르(phosphor) 기 사이에 형성된 공유결합을 통하여 서로 연계(link) 또는 연결(connect)되지 않는 것이다. 본 발명의 호환적인 구현예로서, 그러나 상기 연속적인 뉴클레오티드의 2개 그룹은 1개 군의 1개의 뉴클레오티드 및 또 다른 또는 기타 그룹의 1개의 뉴클레오티드와 공유결합, 바람직하게는 상기 2개 뉴클레오티드중 1개의 당(sugar) 기와 상기 2개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드(nucleosides)의 것의 포스포르(phosphor) 기 사이에 형성된 공유결합을 통하여 서로 연계(link) 또는 연결(connect)되는 것이다. 바람직하게는, 연속적인 뉴클레오티드의 2개 이상의 그룹은 어떠한 공유 결합을 통하여 연계되지 않는 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예로서, 2개 이상의 그룹은 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합과 상이한 공유 결합을 통하여 연계되는 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예로서, 2개 이상의 그룹은 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합인 공유 결합을 통하여 연계되는 것이다.
본 발명에 따른 핵산들은 또한 본원에 개시된 특정 서열들과 실질적으로 상동성(homologous)을 갖는 핵산들도 포함할 것이다. 본원에서 정의되는 용어 “실질적으로 상동성(substantially homologous)”은 최소한 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.
상기 상동성은 당업자에게 널리 알려진 바와 같이 결정될 수 있다. 보다 상세하게는, 서열 비교 알고리즘(sequence comparison algorithm)은 비교용 서열(reference sequence)과 관련된 시험용 서열(test sequence)에 대한 백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 계산하는 것이다. 상기 시험용 서열은 바람직하게는, 또 다른 핵산 분자에 대하여 상동성인지, 만약 그렇다면, 어느 정도까지 인지 여부를 시험되거나 시험될 서열 또는 핵산 분자이며, 상기 또 다른 핵산 분자는 또한 비교용 서열(reference sequence)이라고도 지칭된다. 하나의 구현예로서, 상기 비교용 서열은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 분자, 보다 바람직하게는 서열번호 29 내지 43; 서열번호 45 내지 48; 서열번호 110 내지 156; 서열번호 158 내지 176; 서열번호 179 내지 181 중의 어느 하나에 따른 서열을 갖는 핵산 분자이다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 스미스 및 워터맨 (Smith 및 Waterman, 1981)의 국부적 상동성 알고리즘법(local homology algorithm)에 의해, 니들맨 및 운츠 (Needleman 및 Wunsch, 1970)의 상동성 정렬 알고리즘법(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립맨 (Pearson 및 Lipman, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행법 (computerized implementations)(위스콘 제네틱 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 시각적 조사(visual inspection)에 의해서 수행될 수 있다.
백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 예로서는 기본 국소 정렬 조사 도구 분석법(basic local alignment search tool; 이하 “BLAST"이라 명명함)에 사용되는 알고리즘, 예를 들어, 알쯔슐 등의 문헌(Altschul et al. 1990 및 Altschul et al, 1997)에 개시된 알고리즘이다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for biotechnology Information; 이하 “NCBI”이라 명명함)을 통하여 공중에서 입수 가능하다. NCBI에서 입수가능한 스포트웨어, 예들 들어, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 이용하여 서열 동일성(sequence identity)을 결정하는데 사용되는 디폴트 함수(default parameters)는 맥기니스 등의 문헌(McGinnis et al, 2004)에 개시되어 있다.
본원에 기재된 용어 “발명적 핵산(inventive nucleic acid)” 또는 본 발명에 따른 핵산(nucleic acid according to the present invention)”은 본원에 개시된 핵산 또는 이들의 일부를 포함하는 핵산들, 바람직하게는 상기 핵산 또는 상기 핵산의 일부들이 인간 헵시딘의 결합과 관련되는 정도까지를 또한 포함하는 것이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 핵산은 본원에 개시된 핵산 분자, 또는 유도체 (derivatives) 및/또는 대사체 (metabolites)중의 하나이며, 여기에서 상기 유도체 및/또는 대사체는 바람직하게는 본원에 개시된 핵산 분자와 비교하여 절단된(truncated) 핵산이다.
절단(truncation)은 본원에서 개시된 상기 핵산의 어느 한쪽 또는 양쪽 터미널과 연관될 수 있다. 또한, 절단은 핵산의 뉴클레오티드 내 서열(inner sequence)과 관련될 수 있다, 즉, 5‘ 및 3’ 터미널 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)와 각각 관련될 수 있다. 게다가, 절단은 본원에서 개시된 핵산 서열로부터 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실(deletion)을 포함할 것이다. 절단은 발명적 핵산(들)의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 여기에서 상기 스트레치는 최소한 하나의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 결합은 당업자들에게 통상적인 실험법, 또는 본원에 개시된, 바람직하게는 실시예 부분에 개시된 방법을 사용 또는 적용함으로서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 D-핵산 또는 L-핵산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 발명적 핵산은 L-핵산이다. 추가적으로, 상기 핵산의 하나 내지 여러 부분은 D-핵산형으로 존재 가능하며, 또는 상기 핵산의 하나 이상 내지 여러 부분은 L-핵산형이다. 상기 핵산의 “일부(part)"라는 용어는 최소한 1개 이상의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 것이다. 이러한 핵산들은 일반적으로, 각각 “D 및 L-핵산”으로 지칭된다. 따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산들은 L-뉴클레오티드로 구성되고 최소 하나 이상의 D-뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 D-뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 이들의 일부를 한정하는 스트레치와는 별개의 다른 부분에 부착되는 것이며, 이 일부들은 핵산의 다른 부분과의 상호작용이 연관된 접촉의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 D-뉴클레오티드는 각각 본 발명의 임의의 핵산 및 임의의 스트레치의 터미널에 부착되는 것이다. 보다 바람직한 구현예로서, 상기의 D-뉴클레오티드는 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)로 작용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 PEG 또는 HES와 같은 변형체(modifications)를 부착할 수도 있다.
본원에서 그들의 핵산 서열로 온전히 그대로 개시된 개개 및 임의의 핵산(들)은 특정 뉴클레오티드 서열(들)에 한정되는 것도 또한 본 발명의 범위내이다. 환원하면, 용어 “포함하는(comprising)” 또는 “포함하다 (comprise(s))”는 이러한 구현예에서 ‘함유하는(containing)’ 또는 ‘구성하는 (consisting of)’의 의미로서 해석되어야 할 것이다.
또한, 본 발명에 따른 핵산은 비교적 긴 핵산(longer nucleic acid)의 일부분이며, 상기 비교적 긴 핵산은 최소한 본 발명의 한 부분이 본 발명에 따른 핵산 또는 그 일부분인 여러 부분을 포함한다는 것도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 D-핵산 또는 L-핵산 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에서는 이들의 임의 조합이 사용될 수 있을 것이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 단독 또는 상호 조합으로 전체로서 또는 특별한 조합으로서, 결합(binding), 바람직하게는 헵시딘과의 결합과는 다른 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용(interaction), 예를 들어, 고정화(immobilization), 가교결합(crosslinking), 검출(detection) 또는 증폭(amplification)등과 같은 작용을 허용하는 것이고, 여기에서 상기 다른 분자들은 바람직하게는 헵시딘과 상이한 것이다. 본 발명의 추가의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 몇 개의 본 발명의 핵산을, 독립적 또는 조합된 부위로서 포함한다. 이와 같은 본 발명의 여러 가지 핵산을 포함하는 핵산은 비교적 긴 핵산의 용어로서 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 L-핵산들은 L-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 L-뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본원에서 사용되는 D-핵산들은 D-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 D-뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.
본원에서 사용되는 용어 “핵산(nucleic acid)” 및 “핵산 분자(nucleic acid molecule)”는 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 호환가능한 방식으로 사용된다.
또한, 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 본원에서 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열은 5‘ → 3’ 방향이다.
본원에서 바람직하게 사용되기로는, 핵산의 임의의 위치는 서열(sequence), 스트레치(stretch) 또는 서브스트레치(substretch)의 5‘-터미널과 관련하여 결정되거나 지칭된다. 따라서, 제 2차(second) 뉴클레오티드는 상기 서열, 상기 스트레치 또는 상기 서브스트레치의 5’터미널으로부터 각각 계산된다. 또한 끝에서 두 번째 뉴클레오티드는 상기 서열, 상기 스트레치 또는 상기 서브스트레치의 3’터미널으로부터 계산된 두 번째 뉴클레오티드이다.
본 발명의 발명적 핵산이 D-뉴클레오티드, L-뉴클레오티드 또는 상기 두 형태 뉴클레오티드의 조합, 예를 들어 하나 이상의 L-뉴클레오티드 및 하나 이상의 D-뉴클레오티드로 구성되는 무작위 조합(random combination) 또는 하나 이상의 L-뉴L-뉴오티드 및 하나 이상의 D-뉴D-뉴오티드로 구성되는 스트레치의 한정된 서열로 구성되는가 여부에 상관없이, 상기 핵산은 데스옥시리보뉴클레오티드(desoxyribonucleotide(s)), 리보뉴클레오티드(ribonucleotide(s)) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
L-핵산과 같은 본 발명의 발명적 핵산을 고안하는 것은 여러 가지 장점을 갖는다. L-핵산은 자연 발생적 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나 D-핵산은 수용액상, 및 특히 핵산 분해 효소(nucleases)의 광범위한 분포에 기인하는 생체 조직(biological systems) 또는 생체 표본(biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연 발생적 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L-핵산에 대한 분해 능력이 없다. 이와 같은 이유로 L-핵산의 생물학적 반감기(biological halflife)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L-핵산의 분해능 결핍으로 인해, 핵산 분해 효소의 분해산물이 발생되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 헵시딘 존재와 관련한 질환 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L-핵산으로 한정되지 않는 것이다. 특이적으로 왓슨와 크릭의 염기 결합과는 다른 기전을 통한 목표 분자와 결합을 하는 L-핵산 또는 L-뉴클레오티드로 일부 또는 온전히 구성되는 압타머(aptamer), 특히 상기 목표물질(target molecule)과 압타머와의 결합과 관련되는 압타머의 일부분을 갖는 압타머를 또한 스피에겔머(spiegelmer)이라고 지칭된다. 압타머(aptamer)는 당업자에게 공지되어 있으며 이 중에서 문헌 “The Aptamer Handbook (eds. Klussmann, 2006)에 개시되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산으로 또한 지칭되는 발명적 핵산은 그 핵산이 D-핵D-핵 L-핵산 또는 D, L-핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명의 발명적 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조(defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 삼차 구조(tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명의 발명적 핵산은 서로 상보적인 또는 서로 일부가 상보적인 이중 가닥이 서로 혼성화된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함될 수도 있다.
본 발명의 발명적 핵산은 변형가능하다. 이러한 변형은 상기 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 변형의 예는 그 중에서도, 하기 문헌들, 즉, 벤카테산 외(Venkatesan, Kim et al, 2003), 커서(Kusser 2000); 아우럽 (Aurup, 1994); 쿤민 (Cummins, 1995); 이튼 (Eaton, 1995); 그린 (Green, 1995); 카와사키 (Kawasaki, 1993); 레스닉 (Lesnik, 1993); 및 밀러 (Miller, 1993)에 의해 서술되어 있다. 이러한 변형은 핵산을 구성하는 개별적인 뉴클레오티드의 2번 위치에서의 수소 원자, 불소 원자 혹은 OCH3 그룹 또는 NH2 그룹이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 LNA 뉴클레오티드로 구성된 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원에서 사용되는 “다중 분할된 핵산 (multipartite nucleic acid)”은 두 개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다. 상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드 (ligand)로 작용하는 기능적 부위(functional unit)를 형성한다. 이 두 개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산을 두 개의 가닥으로 분할시키는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫 번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산(overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성 방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할(cleavage) 및 합성(synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 2개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 2개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부분 사이에 어느 정도의 상보적 구역(complementarity)이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 혼성화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 구현예에서, 온전히 닫힌, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산을 위한 원형 구조가 보여진다, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산이 닫혀있으며, 바람직하게는 공유결합을 통해 닫혀있으며, 보다 더 바람직하게는 그와 같은 공유결합은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 서열을 5‘ 터미널 및 3’ 터미널 사이에 만들어진다는 점도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따른 핵산의 결합 상수(binding constant)에 대한 측정은 하기 실시예 4에 개시된 바와 같은 “표면-플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)”의 사용으로 측정될 수 있으며, 여기에서 본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산이 매우 좋은 Kd치 (Kd value) 범위를 갖는다는 것을 발견했다. 개별 핵산 분자 및 본원의 경우의 목표인 헵시딘 사이의 결합 강도를 표현하기 위하여 적합한 측정법은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 소위, “Kd치(Kd value)”이다.
본 발명에 따른 핵산은 특정한 Kd치에 의해 특징화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 Kd치는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 Kd치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 결합(nonspecific binding)으로 특정된다고 간주된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 Kd치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 μM 정도의 Kd치는 Kd치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 Kd치 하한선은 약 10 pM(picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 헵시딘과 결합하는 개별적인 핵산의 Kd치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두 번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 상위 값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 하위 값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이다. 보다 바람직한 상위 Kd값은 2.5 nM, 보다 바람직한 하위 Kd값은, 400pM이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 목표 분자에 여전히 결합할 수 있는 어떠한 제공된 길이를 갖을 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 바람직한 길이가 있다는 것은 당업계에 자명한 사실이다. 일반적으로, 길이는 15 내지 120 뉴클레오티드 사이이다. 본 발명에 따르는 핵산을 위한 길이가 15 내지 120 사이의 어떠한 정수가 가능하다는 것은 당업자에게 자명한 사실이다. 본 발명에 따르는 핵산의 길이를 위한 보다 더 바람직한 범위는 약 20 내지 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 20 내지 50 뉴클레오티드 및 약 30 내지 50 뉴클레오티드이다.
본원에서 개시된 본 발명의 핵산은 바람직하게는 높은 분자량 기 및/또는 동물 신체, 바람직하게는 인체 내에서 그들 중에 체류 시간을 통한 핵산 특성을 변형시키는 기를 포함함도 본 발명의 범주 내이다. 상기 변형의 특정 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 PEG화 반응(PEGylation) 및 HES화 반응(HESylation)이다. 본원에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))의 약어이고, HES는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)의 약자로 사용된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 PEG기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 HES기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 상기 변형체뿐만 아니라 상기 변형법을 이용하여 핵산을 변형하는 제조방법은 유럽특허출원 EP 1 306 382호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
바람직하게는, 높은 분자량 부위를 함유하거나 구성하고 있는 상기 변형체의 분자량은 약 2,000 내지 250,000 Da이며, 바람직하게는 20,000 내지 200,000 Da이다. 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 PEG의 경우에는, 약 20,000 내지 120,000 Da이며, 바람직하게는 40,000 내지 80,000 Da이다. 구체적으로 매우 높은 분자량 기인 HES의 경우에는 바람직하게는 약 20,000 내지 200,000 Da, 보다 더 바람직하게는 40,000 내지 150,000 Da이다, HES 변형의 제조방법은 예를 들어, 독일특허출원 제 DE 1 2004 006 249.8호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
특허출원 WO2005074993, WO2003/035665 및 EP1496076호에 서술된 바와 같이 PEG 및 HES 중 어느 하나도 쇄상 및 가지상 중 어느 하나로도 사용될 수 있다는 것도 본 발명의 범주 내이다. 그와 같은 변형은, 원칙적으로, 본 발명의 핵산 분자의 어떠한 위치에서 만들어질 수 있다. 바람직하게, 그와 같은 변형은 5'-터미널 뉴클레오티드, 3‘-터미널 뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자의 5’뉴클레오티드와 3‘뉴클레오티드 사이의 어떠한 뉴클레오티드 중 어느 하나에 만들어진다.
변형체 및 바람직하게는 PEG 및/또는 HES기는 본 발명의 핵산 분자에 직접적 또는 링커(linker) 중 하나에 부착될 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 핵산 분자가 하나 또는 그 이상의 변형체, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 PEG 및/또는 HES기를 포함함은 본 발명의 범주 내이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 독립적인 링커 분자(linker molecule)는 본 발명에 따르는 핵산에 하나 이상의 PEG기 또는 HES기를 부착한다. 본 발명과 관련되어 사용된 링커는 그 자체로 쇄상 또는 가지상이 될 수 있다. 이와 같은 링커는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 더 나아가 특허출원 WO2005074993, WO2003/035665 및 EP1496076호에 서술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 링커는 생분해성 링커(biodegradable linker)이다. 상기 생분해성 링커는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 링커의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 링커로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191, WO2005/099768들에 개시된 바와 같은 생분해성 링커들이며, 상기 링커는 본원에 개시된 바와 같은 1개 또는 2개 변형체, 핵산 및 이들 사이에 존재하는 생분해성 링커들로 구성된 중합성 올리고뉴클레오티드 전구약물(polymeric oligonucleotide prodrug)의 일부이다.
상기 변형체는 생분해성 변형체이고, 여기에서 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산에 링커와 직접 또는 이를 통하여 부착가능함도 본 발명의 범위 내이다. 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 변형체의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 변형체의 바람직한 구현예로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 및 WO2000/41647, 바람직하게는 WO2000/41647호 18 페이지, 4 내지 24줄들에 개시된 바와 같은 생분해성 변형체들이다.
상술한 변형체들 이외에도, 기타 변형체를 본 발명에 따른 핵산의 특성을 변형시키는데 사용가능하고 여기에서 상기 기타 변형체로는 단백질(proteins), 콜레스테롤과 같은 지질(lipid) 및 아밀라제(amylase), 덱스트란(dextran) 등과 같은 당 사슬(sugar chain)로 구성된 군으로부터 선택가능하다.
어떠한 이론에 국한되지 않은 범위 내에서, 중합체(polymer)와 같은 고분자량 기, 더욱 상세하게는, 본원에 개시된 바와 같은 중합체, 바람직하게는 생리학적으로 수용이 가능한 중합체를 갖는 본 발명에 따른 핵산을 변형시킴에 따라 배출 역학(excretion kinetic)은 변화될 것이다. 더욱 상세하게는, 이러한 변형된 발명적 핵산의 증가된 분자량 및 핵산, 특히 L형인 경우에 대사과정의 대상이 되지 않는 핵산으로 기인하는 경우에 동물세포, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 배출은 감소된다. 상기 배출은 신장을 통해 전형적으로 일어나므로, 본원 발명자들은 상기 변형된 핵산의 사구체의 여과속도가 이와 같은 높은 분자량의 변형을 거치지 않아 결과적으로 생체 내의 체류시간이 증가되는 이러한 고분자량의 변형체를 갖지 않은 핵산과 비교시에 현저하게 감소된다. 이와 연관지어, 본 발명에 따른 핵산의 특성이 상기와 같은 높은 분자량 변형에도 불구하고 불리한 영향을 받지 않음은 매우 두드러진 사실이다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산은 정상인 경우는 약학 활성 성분으로부터 기대할 수 없는 예를 들어 지체된 방출을 제공하기 위해 지체된 방출속도(sustained release)를 제공하는 약학적 제형이 필수적이지는 않다는 것과 같은 놀라운 특성을 갖는다. 오히려 높은 분자량 부위를 함유하고 있는 변형된 본 발명에 따른 핵산은 서방형(sustained release formulation)으로서 즉시 사용가능하다. 지금까지, 본원에 기재된 핵산의 변형체(들) 및 이리하여 변형된 핵산 분자 및 이를 포함하는 어떠한 조성물은 명확한, 바람직하게는 조절된 약물동력(pharmacokinetics) 및 그들의 생물분소(biodistribution). 이는 또한 조직으로의 순환(circulation) 및 분산(distribution)의 잔류시간(residence time)을 포함한다. 이와 같은 변형체는 특허출원 WO2003/035665호에 서술되어 있다.
그러나, 본원에서 개시된 핵산은 임의의 변형 및 특히 예를 들어, PEG화 반응 또는 HES화 반응과 같은 비 고 분자량성 변형체를 포함하고 있지 않음도 본 발명의 범주 내이다. 이러한 구현예는, 상기 핵산이 신체 내에서의 임의의 목표 장기 또는 조직으로의 양호한 분포를 갖거나 투여 후에 체내로부터 핵산의 빠른 제거율이 요구되는 경우에 특히 바람직하다. 신체 내에서의 임의의 목표 장기 또는 조직으로의 양호한 분포를 갖는 본원의 핵산은 핵산의 전신 농도를 낮게 유지하면서 목표 조직에서는 효과적인 국소 농도를 달성하게 할 것이다, 이는 경제적 관점에서 유리할 뿐만 아니라, 기타 불필요한 조직으로의 상기 핵산 제제의 노출을 감소시켜 부작용의 잠재적인 위험을 감소시키게 할 것이다. 본원에서 개시한 바와 같은 핵산의 투여후 신체로부터의 빠른 제거율은 각각 본 발명에 따른, 본 발명의 따른 핵산 또는 이를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 실험 이미징(imaging) 또는 특이적 치료적 투약 요건(specific therapeutic dosing requirements)의 경우에서 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산으로 본원에서 또한 발명적 핵산으로 지칭되는, 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제들은 약제의 생성 또는 제조에 이용될 수 있다. 상기 약제는 적어도 하나 이상의 발명적 핵산을 포함하는데, 임의적으로 추가의 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 본 발명 핵산은 바람직하게는 핵산 그 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예로서, 상기 약제는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 글루코스 수용액, 바람직하게는 5% 포도당 염 조절 수용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 등을 들 수 있다. 상기 담체들은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다. 당업자에게 있어, 본 발명의 임의의 구현예, 사용 및 측면들 또는 약제는 또한 본 발명의 약학 조성물에게도 적용가능하고 그 반대도 인지 가능할 것이다.
치료 및/또는 예방을 위한 적응증 (indication), 질환(disease) 및 장애(disorders)의 본 발명과 관련되거나 또는 관련되어 제조된 핵산, 약학조성물 및 약제는 각각의 병원성 기전과 관련된 헵시딘의 전개, 직접적 또는 간접적 중 하나로부터 발생되는 것이다.
상기 도입부에서 언급한 바와 같이, 헵시딘은 헵시딘-결핍 및 헵시딘 과발현 마우스 모델 시험에서 나타난 바와 같이 높은 수준의 인간 헵시딘은 감소된 혈청 철분 수준을 초래하고 낮은 수준의 인간 헵시딘은 증가된 청 철분 수준을 초래하는 바와 같이, 철분 항상성을 신호화하는 주요한 역할을 수행한다. (Nicolas, 2001; Nicolas, 2002; Nicolas, 2003).
또한 본원에서 언급된 바와 같이, 페로포르틴(ferroportin)에 대한 헵시딘의 결합은 페로포르틴의 즉각적인 내재화 및 혈청 철분의 장기간 지속되는 감소현상을 유발하며 (Rivera, 2005), 여기에서 혈청 철분의 감소는 빈혈증의 원인이 된다. 빈혈은 순화하는 혈액에서의 헤모글로빈 (haemoglobin) 양의 절대적인 감소현상으로 정의되며 종종 낮은 헤모글로빈 현상으로 질병 증상을 나타내며 증으로 본질적으로 분리된 진단증상은 아니다. 빈혈은 적혈구의 생산 및/또는 수명을 손상시키는 부정적인 의료적 상태로부터 기인하다. 추가적으로 빈혈은 빈혈은 혈액 손실의 결과일 수 있다.
결국, 빈혈의 내재된 병리 기전에 기반으로 하여 빈혈의 진행을 이해하기 위해서 하기한 3개의 카테고리(category)로 분류하였다:
(a) 감소된 적혈구 생산(decreased red blood cell production),
(b) 증가된 적혈구 파괴(increased red blood cell destruction) 및
(c) 혈액 손실(blood loss)
그러나, 상기 3개의 카테고리들은- (1) 감소된 적혈구 생산 (2) 증가된 적혈구 파괴 (3)혈액 손실 서로 엄격하게 분리되지 않고 서로 동시적으로 또는 독립적으로 발생가능하다.
다수의 질환에서 상기 기전의 조합은 빈혈증을 유발할 수 있다. 따라서, 헵시딘의 중화는 빈혈증의 많은 상태에 유리할 수 있다.
본 발명의 헵시딘 결합 핵산이 인간 헵시딘과 상호작용 또는 결합됨에 따라당업자는 본 발명의 헵시딘 결합 핵산이 본원에서 개시된 바와 같이, 인간 및 포유동물의 어떠한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단을 위하여 사용가능한 것으로 이해되어야 할 것이다. 여기에서 본 발명의 핵산 분자들은 본원에서 개시된 임의의 질환(diseases), 장애(disorders) 또는 상태(conditions)의 치료 및 예방에 사용가능함도 인지되어야 한다.
하기한 바와 같이, 어떠한 이론에도 제한되지 않는 바램으로서, 다양한 질환(diseases), 장애(disorders) 또는 상태(conditions)과 관련하여 본원 발명에 따른 핵산 분자의 사용을 위한 본 발명의 핵산의 사용을 위한 제안사항이 제공되므로 실현가능한 본 발명의 핵산 분자의 청구된 치료적, 예방적 및 진단적 적용가능성을 제공한다. 어떠한 불필요한 반복을 피하게 위하여 상술한 바와 같은 당업자에 공지되고 본원에서 상술한 바와 같은, 헵시딘-페로포르틴(hepcidin-ferroportin) 상호작용의 전개로 기인하여 상기 상호작용은 청구된 치료적, 예방적 및 진단적 효과를 달성할 수 있도록 본 발명의 핵산 분자에 의하여 위치가 지정되어야 하는 것도 인지되어야 할 것이다.
따라서, 본 발명의 약제가 사용가능한 치료 및 예방을 위한 질환 및/또는 장애 및/또는 병에 걸린 상태(diseased conditions)는 이에 제한되지는 않으나, 빈혈증(anemia), 저철혈증(hypoferremia), 이식증(pica), 상승된 헵시딘 수준인 상태 (conditions with elevated hepcidin level), 상승된 철분 수준인 상태 또는 철분 과적증 상태 (conditions with elevated iron level or conditions with iron overload)을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 빈혈증은 철적아구성 빈혈증 (sideroblastic anemia), 소구성 저색소성 빈혈증(hypochromic microcytic anemia), 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증 (anemia caused by chronic disease and/or disorder), 염증에 기인한 빈혈증 (anemia caused by inflammation), 유전적 장애에 기인한 빈혈증 (anemia caused by genetic disorders), 급성 감염증에 기인한 빈혈증 (anemia caused by acute infections), 철분 대사 및/또는 항상성 유전자 변이에 기인한 빈혈증 (anemia caused by mutation in genes of iron metabolism and/or homeostasis)으로 구성된 군으로부터 선택된다,
빈혈증을 유발하는 다양한 만성 질환 및/장애는 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증 (anemia caused by chronic disease and/or disorder)은 만성 염증 (chronic inflammation), 암 (cancer), 자가면역질환 (auoimmune disease) 및/또는 자가면역 장애(autoimmune disorder), 만성 감염증 (chronic infection), 동맥경화증 (arteriosclerosis), 죽상경화증 (atherosclerosis), 및 간경화증 (cirrhosis of the liver)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 지금까지, 본 발명의 핵산으로 치료가능한 빈혈증은 상기한 임의의 다양한 만성 질환 및/장애로 기인하거나 수반된다. 게다가 빈혈증은 항암치료법, 특히 화학요법제(chemotherapy)에 기인한 것일 수 있다.
상기 만성 염증(chronic inflammation)의 세부그룹(subgroup)으로는 만성신질환 (chronic kidney disease), 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 골관절염 (osteoarthritis), 당뇨병 (diabetes), 비만증(obesity), 뇌혈관 질환 (cerebrovascular disease), 울혈성 심장질환 (congestive heart disease), 심부전증 (congestive heart failure), 심근경색증 (myocardial infarction), 관상동맥질환 (coronary artery disease), 폐쇄성 말초 동맥 질환 (peripheral occlusive arterial disease), 췌장염 (pancreatitis) 및 맥관염 (vasculitis)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 만성 신장 질환 (chronic kidney disease)은 신장 질환(renal diseases), 만성 신부전증 (chronic renal failure) 및 만성 신질환 (chronic kidney failure)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고 상기 만성 신질환은 신장투석(kidney dialysis) 또는 신장 이식증 (kidney transplantation)이다.
상기 암(cancer)의 세부그룹(subgroup)으로는 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 임파선암(lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 두경부 암(head-and-neck cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colarectal cancer), 비골수성 암(nonmyeloid cancers), 신세포암(renal cell carcinoma), 비소세포 폐암(non-small-cell lung cancer), 종양(tumors) 및 뇌 종양(brain tumors)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
상기 자가면역질환 (auoimmune disease) 및/또는 자가면역 장애(autoimmune disorder)의 세부그룹(subgroup)으로는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 전신성홍반성 낭창(systemic lupus erythrematosus) 및 크론씨 질환(Chrohn’s disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
상기 만성 감염증(chronic infection)의 세부그룹(subgroup)으로는 바이러스성 감염증(viral infection), 바이러스성 병증(viral illness), 박테리아성 감염증(bacterial infection) 및 진균성 감염증(fungal infections)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 이에 제한되지는 않으나 상기 바이러스성 감염증 (viral infections)은 간염(hepatitis) 및 HIV 감염증(infection)을 포함하고 상기 박테리아성 감염증(bacterial infections)은 헬리코박터 파이로리 감염증(H. pyelori infection)을 포함하는 것이다.
상기 만성 염증에 기인한 빈혈증(Anemia caused by inflammation)은 상기 염증에 기인한 빈혈증(anemia caused by inflammation)은 저색소성(microlytic) 정적혈구성(normocytic)이고/이거나 낮거나 정상인 망상적혈구생산지수(reticulocyte production index) 및/또는 총철결합력(total iron binding capacity; TIBC)로 특징화되는 것이다. 헵시딘, 급성상 단백질(acute phase proteins) 및 기타 염증성 마커(markers; 예를 들어, C-reative protein)은 염증에 기인한 빈혈증의 경우에 증가한다. 염증에 기인한 빈혈증은 또한 염증에 의한 빈혈증(anemia by inflammation)으로도 지칭한다.
빈혈증을 유발할 수 있는 상기 유전적 장애 (genetic disorders)는 캐슬만 질환(Castleman disease), 슈니츨러 증후군(Schnitzler’s syndrome), 철분 불응성 철분결핍성 빈혈증(iron refractory iron deficiency anemia; matriptase-2, TMPRSS6) 변이증(mutation), 무트란스페린혈증(atransferrinemia), 선천성 이적혈구생성 빈혈증(congenital dyserythropoietic anemia) 또는 이상 헤모글로빈증 (hemoglobinopathies)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
빈혈증을 유발할 수 있는 상기 다양한 급성 감염증 (acute infection)은 바이러스성 감염증 (viral infection), 박테리아성 감염증 (bacterial infection), 진균성 감염증 (fungal infection)으로 구성된 군으로부터 선택된 질환, 바람직하게는 패혈증 (sepsis)인 것이다.
용어 “상승된 헵시딘 수준인 상태(conditions with elevated hepcidin level)”은 포유동물, 바람직하게는, 인간에서의 상태를 지칭하며, 여기에서 신체에서의 헵시딘의 수준은 포유동물에 대한 정상 헵시딘 수준(정상시 약 120 ngl/mL)과 상승된 햅시딘 혈청 수준을 비교하는 것과 같은, 상기한 포유동물에 대한 포유동물에 대한 정상 헵시딘 수준과 비교시에 상승된 것을 의미한다. 상승된 혈청 수준은 다른 기타 방법 중에서 효소-연계 면역측정법(enzyme-linked immunoassay; 상업적으로 입수가능한 키트의 예: DRG Diagonstics, Marburg,Germany)으로 측정가능하다.
결국, 본 발명에 따른 약제가 바람직하게 사용될 수 있는 환자들로는, 이에 제한되지는 않으나, 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 기타 적혈구 자극 치료법(red cell stimulating therapies)을 처치받는 환자; 바람직하게는 에리스로포이에틴에 대하여 낮은 반응성(hypo-responsiveness)을 나타내는 환자; 보다 바람직하게는 만성 신질환 (chronic kidney disease) 또는 암 질환 환자(여기에서 상기 암은 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 임파선암 (lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 두경부 암(head-and-neck cancer), 유방암(breast cancer), 결장암(colarectal cancer), 비골수성 암(nonmyeloid cancers), 신세포암(renal cell carcinoma), 비소세포 폐암 (non-small-cell lung cancer), 종양(tumors) 및 뇌 종양(brain tumors)으로 구성된 군으로부터 선택된 암질환으로 고통받은 환자인 것이다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 약제는 추가적인 약학적 활성 화합물(further pharmaceutically active compound)을 포함하는 것이다. 상기 추가적인 약학적 활성 화합물은 바람직하게는 헵시딘 또는 페로포르틴의 활성, 농도 또는 발현을 조절가능한 것이다. 이러한 화합물은 바람직하게는, 프로-헵시딘 절단 프로테아제 저해제 (pro-hepcidin cleaving protease inhibitor), 프로-헵시딘 항체 (pro-hepcidin antibody), 페로포르틴-항체ferroportin-antibody)와 같은 페로포르틴-길항제(ferroportin-antagonist), JAK2 저해제(inhibitor), GDF15, BMP 조절제(modulator), 수용성 헤모쥬벨린(soluble haemojuvelin) 또는 TGF-베타(beta) 저해제(inhibitor)일 수 있다.
본 발명에 따른 핵산을 포함한 약제에 같이 또는 포함되는 기타 추가적인 약학적 활성 화합물은 빈혈증(anemia) 및/또는 염증성 상태(inflammatory conditions)을 치료하는 것으로 공지 및/또는 사용되는 것으로, 여기에서 상기 염증성 상태의 치료는 빈혈증에 긍정적으로 영향을 미치는 것들이다. 이러한 약학적 활성 화합물들은 철분 보충제(iron supplements), 비타민 보충제(vitamin supplements), 적혈구 생성촉진제(red cell production stimulators), 항생제(antibiotics), 항염 생물학제(anti-inflammatory biologics), 면역계 억제제(suppressors of the immune system), 항-혈전용해제(anti-thrombolytics), 스타틴(statins), 혈관수축제(vasopressors) 및 근수축성 화합물(inotropic compounds)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 철분 보충제(iron supplements)의 비-제한적인 예로는 황산 제일철(ferrous sulphate), 글루콘산제일철(ferrous gluconate), 철분 덱스트란(iron dextran), 글루콘산철 나트륨 (sodium ferric gluconate), 카르복시말토스철 (ferric carboxymaltose), 폴리말토스 수산화 철(iron-hydroxide polymaltose), 푸마르산철(iron fumarate), 사카로스철(iron saccharose) 및 수크로스-수산화 철( iron-hydroxide sucrose)을 들 수 있다.
상기 비타민 보충제(vitamin supplements)의 비-제한적인 예로는 비타민(vitamin) C, 엽산(folic acid), 비타민 B12, 비타민 B6 및 비타민 D을 들 수 있다.
상기 적혈구 생성촉진제(red cell production stimulators)의 비-제한적인 예로는 에리스로포이에틴(erythropoietin), 에포에틴(Epoetin), 다르베포에틴(Darbepoetin), CERA, HIF 프롤릴-히드록실라제 저해제(prolyl-hydroxylase inhibitors; 예를 들어, FG-2216 및 FG-4592) 및 기타 적혈구 생성 시약(erythropoiesis stimulating agents)을 들 수 있다.
상기 항생제(antibiotics)의 비-제한적인 예로는 아미노글리코시드(aminoglycosides), 베타-락탐계 항생제(beta-lactam antibiotics), 엡티드계 항생제(eptide antibiotics), 그리아제 저해제(gryase inhibitors), 린코사미드 (lincosamide), 매크롤리드계 항생제(macrolide antibiotics), 니트로이미다졸 유도체(nitroimidazole derivatives), 폴리펩티드계 항생제(polypeptide antibiotics), 설포나미드(sulfonamides), 테트라사이클린(tetracycline) 및 트리메토프림(trimethoprim)을 들 수 있다..
상기 항염 생물학제(anti-inflammatory biologics)의 비-제한적인 예로는
(a) IL-6-수용제 길항제 (receptor antagonists); [예를 들어, 토실리주맙(Tocilizumab)] 또는,
(b) TNF-길항제(antagonists) [예를 들어, 에타네르셉트(Etanercept), 인플릭시맙(Infliximab), 아달무맙(Adalimumab), 세르톨리주맙(Certolizumab)],
(c) IL-1 수용체 길항제(receptor antagonists)[예를 들어, 아나킨라(Anakinra)], 및
(d) CD20 결합 분자(binding molecules)[예를 들어, 리툭시맙(Rituximab) 및 이브리투맙(Ibritumab)]을 들 수 있다.
상기 면역계 억제제(suppressors of the immune system)의 비-제한적인 예로는 아자티오프린(azathioprin), 브레퀴나르(brequinar), 칼시뉴린 저해제 (calcineurin inhibitors), 클로람부실(chlorambucil), 시클로스포린(cyclosporin) A, 데옥시수페르구알린(deoxyspergualin), 레플루노미드 (leflunomide), 메토트렉세이트 (methotrexate), 미조리빈(mizoribin), 미코페놀레이트(mycophenolate) 메페틸 (mofetil), 라파마이신(rapamycin), 타클로리무스(tacrolimus) 및 탈리도미드 (thalidomide)을 들 수 있다.
상기 항-염증제(anti-inflammatory agents)의 비-제한적인 예로는 로플루밀라스트(roflumilast)과 같은 PDE4 저해제(inhibitors) 및 프레드니솔론 (prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 히드로코리티존(hydrocortisone), 덱사메타손(dexamethason), 트리암시놀론(triamcinolone), 베타메타손(betamethasone), 에페베르센트(effervescent), 부데소니드(budesonide), 시클레소니드(ciclesonide) 및 플루티카손(fluticasone)과 같은 코르티코스테로이드(corticosteroids)를 들 수 있다 .
상기 항-혈전용해제(anti-thrombolytics)의 비-제한적인 예로는 드로트레코진 알파(Drotrecogin alfa)과 같은 활성형 인간 단백질(activated human protein) C를 들 수 있다.
상기 스타틴(statins)의 비-제한적인 예로는 아트로바스타민(Atorvastatin), 세르바스타틴(Cerivastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 로바스타틴(Lovastatin), 메바스타틴(Mevastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 로수바스타틴(Rosuvastatin) 및 심바스타틴(Simvastatin)를 들 수 있다.
상기 혈관수축제(vasopressors) 및 근수축성 화합물(inotropic compounds) 의 비-제한적인 예로는 노르아드레날린(noradrenalin), 바소프레신(vasopressin) 및 도부타민(dobutamin)를 들 수 있다.
상승된 헵시딘 혈장 수준을 갖는 상태에 추가하여, 본 발명에 따른 핵산 분자는 상승된 철분 혈장 수준(elevated iron level) 환자 및/또는 철분 과적증 및 비상승된 헵시딘 혈장 수준 상태(conditions with iron overload and non-elevated hepcidin plasma level)를 길항하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자로 환자를 치료법은 세포내 철분 농도를 감소시키기 위하여 수행되고, 여기에서 상기 치료법은 바람직하게는 철분 킬레이트화 화합물(iron chelating compounds)과의 조합으로 수행하는 것이다. 본 발명에 따른 핵산에 의한 생리학적 헵시딘의 중성화(neutralisation)는 페로포르틴 발현을 방지하고 세포 내 저장소로부터 더 이상의 철분 분비를 유지하게 한다. 철분 킬레이트화 화합물과의 페로프포르틴 방지법은 소변을 통한 철분 제거를 방지하고 신체에서의 총 철분 양의 감소도 방지한다.
의료분야에서, 철분 과적증(iron overload)은 임의의 원인으로 인하여 신체에서의 철분 축적을 의미한다. 철분 과적증에 대한 특징으로는 인간의 경우에 전체ㅡ신체 양 (total body content)이 > 5 mg 철분인 경우이다. 철분 과적증을 혈색소침착증 (hemochromatosis)이라고도 지칭한다.
용어 “철분과적증 상태(conditions with iron overload) "은 포유동물, 바람직하게는 인간에서의 상태로, 포유동물 신체에서의 철분 수준이 포유동물에 대한 정상 철분 혈청 수준(인체의 경우는 약 20μmol/L)과 비교시에 상승되거나 또는 포유동물에서의 간에서의 정상 철분 수준과 비교시에 포유동물의 간에서의 증가된 수준을 의미한다. 상승된 혈청 철분 수준은 기타 여러 방법 중에서, 발색 측정법(colorimetric assay)을 이용한 혈청 철분 직접 측정법; 표준 트랜스페린 포화측정법 (standard transferrin saturation assay, 이는 혈액에서 철분을 운반하는 단백질과 얼마나 많은 철분이 결합되는지를 측정), 또는 표준 혈청 페리틴 측정법(standard serum ferritin assay, 예를 들어, Ferritin Blood Test ELISA kit form Calbiotech, USA) 등으로 측정가능하다. 예를 들어, 45% 이상의 트랜스페린 포화수준 (transferrin saturation levels)인 경우는 혈청중 철분이 비정상적으로 증가된 수준임을 의미한다. 기타 장기중에서 특히, 간 내에서의 상승된 철분 수준은 간 생검(liver biopsy) 또는 MRI 및/또는 SQUID과 같은 이미징 기법(imaging technique)으로 얻어지는 조직으로부터의 간 내 철분 함량 측정법으로 측정가능하다. 예를 들어, 뇌, 심장 등과 같은 기타 조직에서의 철분 수준 정도도 상기 기법 또는 기타 이미징 기법으로 측정가능하다.
상기 철분 과적증(Subgroups of iron overload)의 세부그룹(subgroup)은 수혈성 철분 과적증(transfusional iron overload), 철분 중독증(iron intoxication), 폐혈철증(pulmonary hemosiderosis), 골감소증(osteopenia), 인슐린 저항증(insulin resistence), 아프리칸 철분 과적증(African iron overload), 할로보르단 스파츠 질환(Hallervordan Spatz disease), 과페레틴빈혈증(hyperferritinemia), 세룰로플라스민결핍증(ceruloplasmin deficiency), 신생아혈색소착증(neonatal hemochromatosis) 및 지중해빈혈증(thalassemia), 알파지중해빈혈증(alpha thalassemia), 중간베타지중해빈혈증(thalassemia intermedia), 겸형 적혈구 빈혈증(sickle cell disease) 및 골수이형성증후군(myelodyplastic syndrome)을 포함한 적혈구 장애(red blood cell disorder)로 구성되는 군으로부터 선택된 것이다.
상승된 철분 수준을 수반하는 기타 장애/질환으로 고통받는 환자들은 본 발명에 따른 핵산 분자, 바람직하게는 철분 킬레이트화 화합물과의 조합에 의한 치료법으로 혜택을 받을 수 있을 것이다. 결론적으로, 본 발명에 따른 약제가 사용가능한 치료 및/또는 예방을 위한 질환 및/또는 장애 및/또는 병에 걸린 상태는 이에 제한되지는 않으나, 실조증(ataxia), 프리드리히 실조증(Friedrich’s ataxia), 노인황반변성증 (age-related macular degeneration), 노년백내장 (age-related cataract), 노인성 망막 질환(age-related retinal diseases) 및 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)[여기에서 상기 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease)은 알츠하이머 질환 (Alzheimer’s disease), 파킨슨 질환 (Parkinson’s disease), 판토테네이트 키나제-수반 신경퇴행증 (pantothenate kinase-associated neurodegeneration), 하지불안증후군(restless leg syndrome) 및 헌팅톤 질환 (Huntington’s disease)을 포함함]을 포함한 상승된 철분 수준을 나타내는 질환을 포함한다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 상기 약제는 철분과 결합하여 조직 또는 포유동물, 특히 신체에서의 순환 과정에서의 철분을 제거하는 추가적인 약학적 활성 화합물을 포함하는 것이다. 상기한 약학적 활성 화합물은 바람직하게는 철분 킬레이트화 화합물들로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명에 따른 핵산과 상기 화합물과의 조합(Combination)은 추가로 생리학적 헵시딘 농도를 감소시키고 결국 세포내 철분 과적증을 경감시킬 것이다.
본 발명의 비-제한적인 철분-킬레이트화 화합물(iron chelating compound)의 예로는 쿠르쿠민(curcumin), 디페록사민(deferoxamine), 디페라시록스(deferasirox) 및 디페리프론(deferiprone)을 들 수 있다.
최종적으로, 상기 추가적인 약학적 활성제(further pharmaceutically active agent)는 철분 대사(iron metabolism) 및/또는 철분 항상성(iron homoestasis)의 조절자일 수 있다. 호환적으로 또는 추가적으로 상기 추가적인 약학적 활성제는 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 제 2차 종(second species)들이다. 호환적으로, 상기 약제는 헵시딘과 상이한 목표 분자(target molecule)과 결합하거나 또는 본 발명에 따른 핵산중 하나와 상이한 기능을 발휘하는 적어도 하나 이상의 핵산을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 상기 하나 이상의 핵산은 본원에 개시된 하나 이상의 추가적인 약학 활성 화합물(들)과 유사하거나 동일한 기능을 발휘한다.
본원에서 본 발명의 약제로도 지칭되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 약제는 원칙상, 상기 질환의 치료를 위한 사용과 관련하여 개시한 임의의 질환을 예방하는 데에도 호환적으로 또는 추가적으로 사용된다는 점도 본 발명의 범위 내이다. 따라서, 상기 개개 질환에 대한 개개의 마커(markers)들은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는 상기 개개 마커는 헵시딘인 것이다.
본 발명의 약제의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 본원에 개시된 임의 질병, 바람직하게는 본 발명의 약제가 사용될 임의 질병에 대한 다른 치료법과 조합하여 사용할 수 있다.
"조합 치료법 (combination therapy)" (또는 "공동-치료법 (co-therapy)")는 본 발명의 약제 투여 및 이러한 치료제를 공동-작용 (co-action)함으로서 유리한 효과를 제공하기 위한 특정 치료 처방 (specific treatment regimen)의 부분으로서 최소한 2차 작용제를 포함, 즉, 본 발명의 약제 및 상기 2차 작용제와의 조합 투여를 포함한다. 상기 조합의 유리한 효과는, 이에 제한되지는 않으나, 치료제들의 조합으로 초래되는 약물동력학적 (pharmacokinetic) 또는 약물역학적 (pharmacodynamic) 공동-작용을 포함한다. 이러한 치료제들의 조합 투여는 전형적으로 한정된 일정 기간 (선택된 조합에 따라 보통 분, 시간, 일 또는 주 단위)이상 수행된다.
일반적이지는 않으나, "조합 치료법(combination therapy)"은 본 발명의 조합을 우발적 및 자발적으로 초래하는 분리된 단독요법 처방의 일부분으로서 2개 이상의 이러한 치료제 조합 투여를 포함하는 의도일 수 있다. "조합 치료법"은 상기 치료제 투여를 연속적인 순서, 즉 상기 이러한 치료제들의 투여뿐만 아니라 개개 치료제를 상이한 시각에 투여하거나 또는 2 개 이상의 치료제들을 실질적 동시 투여방법(substantially simultaneously manner)을 포함할 의도이다. 이러한 실질적 동시 투여 방법은 예를 들어, 고정된 비를 갖는 개개 치료제를 함유한 단일 캡슐 또는 개개 치료제의 다중, 단일 캡슐을 투여객체에 투여함으로써 달성가능하다.
각 치료제의 연속적 또는 실질적 동시 투여방법은 이에 제한되지는 않으나, 국소투여 경로(topocal routes), 경구투여 경로(oral routes), 정맥내투여경로(intraveneous routes), 근육내 투여 경로(intramuscular routes) 및 점막 조직을 통한 직접 흡수(direct absorption) 경로를 포함하는, 임의의 모든 적절한 경로로 영향을 미칠 수 있다. 상기 치료제들은 동일한 경로 또는 서로 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 첫 번째 치료제는 주사를 통해 투여되면서, 조합의 또 다른 치료 작용제는 국소적으로 투여될 수도 있다.
호환적으로, 예를 들어, 모든 치료제들은 국소적으로 투여될 수도 있거나 또는 모든 치료제들을 주사로 투여할 수도 있다. 투여되는 치료제의 순서는 별도로 지적하지 않은 한은 엄밀하게 중요하지 않다. 또한 “조합 치료”은 다른 생물학적 활성 성분들과 추가적인 상기한 치료제와의 조합 투여를 포함할 수도 있다. 상기 조합 치료가 추가적으로 비-약물 치료법(non-drug treatment)을 포함하는 경우는 상기 비-약물 치료법은 상기 치료제 미 비-약물 치료법의 조합상의 공동-작용이 유리한 효과를 유지할 수 있는 한 임의의 적절한 시간동안에도 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 사례에서, 상기 비-약물 치료법이 치료제의 투여로부터 일시적, 아마도 수일 또는 수주일 동안 제거될 때에도 상기 유리한 효과는 달성될 수 있다.
상기와 같이 일반적인 정의로 설시된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로 당업자에게 알려진 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 투여경로는 전신 투여법이며, 보다 바람직하게는 비경구적 투여법, 가장 바람직하게는 주사법이다. 호환적으로, 상기 약제는 국소 투여가 가능하다. 기타 투여 경로로는 근육 투여법, 복강 투여법, 피하 투여법, 경구 투여 또는 바람직하게는 효능을 유지하면서도 최소한 침투성을 갖는 투여 경로가 주어지는 선호도를 갖는 비강 투여법 (intranasal), 기관내 투여 (intratracheal) 또는 경폐 투여법 (pulmonary)들이다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥내 주사 또는 주입으로 사용된다. 추가적으로, 비경구 투여를 위한 하나의 접근법으로 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 일정한 투여용량을 유지하게 보장하는 지연성 방출 시스템 또는 서방성 방출 시스템의 적용 방법도 포함한다.
더 나아가, 본 발명의 바람직한 약제는 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 적절한 비강 매개물, 흡입기의 국소적 사용을 통해 경비 투여 형태, 또는 경피 투여 피부용 패취 (transdermal skin patches) 형태와 같은 형태를 이용한 경피 경로 (transdermanl route)를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템 (transdermal delivery system)의 형태로 투여되기 위해서는, 상기 용량 투여 (dosage administration)는 물론, 용량 처방 (dosage regimen) 내내 간헐적 보다는 연속적 투여용량일 것이다. 기타 바람직한 국소 제제로는 전형적으로 활성 성분 농도가 0.01% 내지 15% (w/w 또는 w/v)인, 크림제(creams), 연고제(ointments), 로션제(lotions), 분무제(sprays) 및 겔제(gels)를 포함한다.
본 발명의 약제는 일반적으로, 이에 한정되지는 않으나, 약학적으로 허용된 매질에 용해 또는 분산된 본 발명의 핵산을 포함하는, 치료학적으로 유효량의 활성 작용제를 포함할 것이다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균성 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 저해제 및 그 유사체를 포함한다. 이러한 약학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 보조 활성 성분(supplementary active ingredient)도 또한 본 발명의 약제 내에 혼입될 수도 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 및 바람직하게는 약학적으로 허용된 담체 (vehicle)를 함유한다. 상기 담체는 당업계에 공지 및/또는 사용되는 임의의 담체 또는 임의의 결합제 (binder)일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 결합제 또는 담체는 본원에 개시된 약제의 제조와 관련되어 설시한 임의의 결합제 또는 담체이다. 추가적인 구현예로서, 상기 약학 조성물은 추가적인 약학 활성 성분을 포함하는 것이다.
약제 및 약학 조성물의 제조는 본원 개시 내용으로 보아 당업계에 종사하는 자에게 널리 알려진 것일 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 액제 또는 현탁제와 같은 주사가능 형태; 주사 전에 현탁제 또는 액제 내의 용액을 위해 적절한 고형 형태; 경구투여를 위한 정제 또는 기타 고형물; 시간 방출형 캡슐제; 또는 안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등을 포함하는 현재 통상적으로 사용되는 형태로 제조될 수 있다. 외과의사, 내과의사 또는 보건직이 수술분야내서 특정 부위를 치료하기 위해 사용하는, 예를 들어 염수-기초 세척제 (saline-based washes)와 같은 멸균된 제형의 사용도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치 (microdevice), 미세입자 (microparticle) 또는 스폰지를 통해 운반될 수도 있다.
제형에 있어서, 약제는 용량 제형과 양립될 수 있는 방법으로 투여될 수 있으며, 상기 함량은 약학적으로 효과적인 것이다. 상기 제형은 상술한 주사제 형태와 같은, 다양한 투여용량 형태로 용이하게 투여될 수 있으나 약물 방출형 캡슐 및 그 유사체도 또한 사용될 수 있다.
본원에서, 투여되는 활성 성분의 양 및 조성물의 부피는 치료할 개인 또는 객체 대상에 의존한다. 투여에 요구되는 활성 화합물의 특정한 함량은 치료자의 판단에 의존되며, 개개인마다 고유하다.
활성 화합물을 분산하기 위해 요구되는 약제의 최소 부피가 전형적으로 이용된다. 투여를 위한 적절한 용법 또한 다양하지만, 화합물을 일차적으로 투여함으로써 정형화되고 그 결과를 모니터하여 추가적인 간격으로 추가적으로 조절된 용량으로 투여가능하다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구투여를 위해, 상기 활성 약물 조성, 즉, 본 발명의 핵산 분자 및/ 또는 본원에서 일명, 치료제 (therapeutic agent) 또는 활성 화합물 (active compounds)로 지칭되는 임의의 추가적인 약학적 활성 작용제는 에탄올, 글리세롤, 물 및 그 유사체와 같은 경구, 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 운반체 (inert carrier)와 조합될 수 있다. 게다가, 요구되거나 또는 필요시에, 적당한 결합제 (binder), 윤활제 (lubricant), 붕해제 (disintegrating agents), 및 착색제 (coloring agents)를 또한 상기 혼합물 내로 혼입시킬 수 있다. 적당한 결합제로는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(magnesium aluminium silicate), 전분 반죽(starch paste), 젤라틴, 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리딘, 포도당 또는 베타-락토스 (beta-lactose)와 같은 천연 당류, 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸트 (tragacanth) 또는 알긴산 나트륨 (sodium alginate)와 같은 천연 및 합성 껌, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여 형태에서 사용되는 윤활제로는 나트륨 올레산염 (sodium oleate), 나트륨 스테아르산염 (sodium stearate), 마그네슘 스테아르산염 (magnesium stearate), 나트륨 안식향산염 (sodium benzoate), 나트륨 아세테이트 (sodium acetate), 염화 나트륨 (sodium chloride), 실리카 (silica), 활석 (talcum), 스테아르산 (stearic acid), 이의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함한다. 붕해제로는 제한없이, 전분, 메틸 셀루로스, 아가 (agar), 벤토나이트, 잔탄 껌 전분 (xanthan gum starches), 아가, 알긴산 (alginic acid) 또는 이의 나트륨염, 또는 비등성 혼합물 등을 포함한다. 희석제로는, 예를 들면, 유당, 덱스토로스(dextrose), 수크로스 (sucrose), 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/ 또는 글리신(glycine)을 포함한다.
본 발명의 약제는 이와 같은 지효성 및 서방성 정제 또는 캡슐, 환약, 분말, 과립제, 엘렉시르 (elixirs), 팅크제 (tinctures), 현탁제, 시럽제 및 유화액제(emulsion)와 같은 경구 투여 형태로 투여될 수도 있다. 좌약 (suppositories)은 지방성 유화액제 또는 현탁액제에서 유리하게 제조된다.
상기 약학조성물 또는 약제는 살균될 수 있거나 또는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 추가적으로, 그들은 또한 기타 치료적으로 유용한 성분들을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적 혼합법, 과립화법, 또는 코팅법에 따라 전형적으로 활성 성분의 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 1% 내지 50%을 함유하여 제조된다.
액제, 특히 주사용 조성물은, 예를 들어, 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 상기 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어, 물, 식염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 혼합될 수 있으며, 이로써 주사용 용액 또는 현탁액을 생성한다. 추가적으로, 주사전 액체 용해에 적절한 고형 형태는 제조될 수 있다.
고형 조성물을 위해서, 부형제(excipients)는 약제 등급의 만니톨, 유당, 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 포도당, 자당, 마그네슘 탄산염 등을 포함한다. 상기에서 정의된 활성 화합물(active compounds)은 좌약, 예를 들어 운반체로서, 예를 들어 프로필렌 글리콜 (propylene glycol)과 같은 폴리알킬렌 글리콜 (polyalkylene glycols)을 사용하여 제조될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 좌약은 지방성 유화제 또는 현탁액에서 유리하게 제조된다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 예를 들어 소형 단층 소포 (small unilamellar vesicles), 대형 단층 소포 (large unilamellar vesicles) 및 다층 소포 (multilamellar vesicles)과 같은 리포좀 전달 시스템 (liposome delivery system)의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀 (liposome)은 콜레스테롤, 스테아릴아민 (stearylamine) 또는 포스페티딜콜린 (phosphatidylcholines)을 포함하는 다양한 인지질 (phospholipids)로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 지질 성분의 필름이 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화한 지질층을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 상술하고 있는 핵산 분자는 당업계에 널리 알려진 제조방법을 이용하여 구성되는, 친유성 화합물 또는 비-면역성(non-immuogenic), 고분자량 화합물로 복합체 (complex) 형태로 제공될 수 있다. 추가적으로, 리포좀은 세포 독성을 내부적으로 매개하는 세포독성제(cytotoxic agent)를 목표 또는 운반하기 위하여 그 표면상에 상기 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 수반 복합체의 예는 미국 특허 번호 제 6,011,020호에서 제공된다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 표적 가능한 약물 운반체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 상기 중합체로는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 피란 공중합체 (pyran copolymer), 폴리히드록시프로필-메트아크릴아미드-페놀 (polyhydroxypropyl-methacrylamide-phenol), 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀 (polyhydroxyethylaspanamidephenol), 또는 팔미토일 잔기 (palmitoyl residue)로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신 (polyethylene oxide polylysine)을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 약물 방물 조절에 유용한 생분해성 중합체 (biodegradable polymer)류, 예를 들어, 폴리락트 산 (polylactic acid), 폴리엡실론 카프로 락톤 (polyepsilon capro lactone), 폴리히드록시 부티르산 (polyhydroxy butyric acid), 폴리오로토에스테르 (polyorthoesters), 폴리아세탈 (polyacetals), 폴리히드로피란 (polydihydropyrans), 폴리시아노아크릴레이트 (polycyanoacrylates) 및 히드로겔(hydro-gel)의 가교화 또는 양친매성 하이드로젤 블록 공중합체(block copolymer)와 결합될 수 있다.
요구된다면, 상기 투여될 약학조성물 및 약제는, 각각 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 미량의 비독성 보조 물질(non-toxic auxiliary substance) 및 나트륨 아세테이트(sodium acetate) 및 트리에탄올아민 올레이트(triethanolamine oleate)와 같은 기타 물질을 미량 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각을 이용하는 용량 처방(dosage regimen)은 환자의 유형, 종, 나이, 무게, 성 및 건강 상태; 치료될 상태 정도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 적용되는 특정 압타머 및 이들의 염을 포함한 다양한 요인에 따라 선정된다. 당업계에 숙련된 의사 또는 수의사는 병적 상태의 진행을 저해, 대항 또는 저지하기 위해 요구되는 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 효과적인 혈장 수준은 본원에 개시된 모든 질병의 치료에 있어서 바람직하게는 500 fM 내지 500μM의 범위이다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각은 바람직하게는 매일, 매 둘째 또는 셋째 날, 매주, 매 둘째 주당 단회 투여용법, 또는 매달 또는 매 셋째 달 단일 투여용법으로 투여될 수 있다.
본원에서 개시된 약제가 본원에 개시된 약학조성물을 구성한다는 것도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 유효량의 하나 이상의 핵산을 치료가 요구되는 객체에 투여함을 포함하는, 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예로서, 상기 객체는 질병으로부터 고통받거나 이와 같은 질병으로 진행될 위험성이 있으며, 여기에서 상기 질병은 본원에서 개시된 임의의 질병, 특히 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 임의의 핵산의 사용과 연관된 임의의 질병이다.
본 발명에 따른 길항제 뿐만 아니라 핵산이 약제로서 또는 약제 제조를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미용상 목적, 특히 염증성 국부 피부손상 (inflamed regional skin lesion)에서의 헵시딘의 전개와 관련된 목적으로 이용될 수 있음도 이해되어야 한다. 그러므로, 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 핵산, 약제 및/ 또는 약학조성물이 사용될 수 있는 추가적인 병적상태 (conditions) 또는 질병 (disease)은 염증성 국부 피부손상이다.
본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 진단용 (diagnostic) 또는 진단제 (diagnostic agent) 또는 진단 수단 (diagnostic means)은 직접적 또는 간접적으로 헵시딘, 바람직하게는 본원에 서술된 바와 같은 헵시딘, 보다 바람직하게는 본원에 서술된 다양한 장애 (disorder) 및 질병과 연관된 헵시딘을 검출하기에 적절하다. 상기 진단은 본원에 개시된 각각 임의의 장애 및 질병의 검출 (detection) 및/ 또는 추적조사 (follow-up)를 위해 적절한 것이다. 상기 검출은 본 발명의 핵산과 헵시딘의 결합을 통해 가능하다. 상기 결합은 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
각각의 방법 및 수단을 당업자에게 잘 알려져 있다. 다른 이들 중에서, 본 발명에 따른 핵산은, 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 헵시딘와 결합한 핵산의 검출을 허용하는 표지(label)를 포함한다. 상기 표지는 바람직하게는, 방사성 (radioactive), 효소(enzymatic) 및 형광성(fluorescent) 표지법을 포함하는 군으로부터 선택된다. 원칙적으로, 항체를 위해 개발된 알려진 모든 측정법은 본 발명에 따른 핵산을 위해 채택될 수 있는 반면에, 목표-결합 항체(target-binding antibody)는 목표-결합 핵산으로 치환된다. 비-표지 목표-결합 항체를 이용한 항체-어세이법(antibody-assay)에서, 상기 검출은 바람직하게는, 방사성, 효소 및 형광성 표지로 변형된 2차 항체에 수행되며, 그 Fc 단편(fragment)에 상기 목표-결합 항체가 결합된다. 핵산, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 경우에 있어서, 상기 핵산은 이러한 표지법에 의해 변형되며, 여기에서, 바람직하게 상기 표지는 비오틴(biotin), Cy-3 및 Cy-5을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 표지는 이러한 표지에 반하는 항체, 예를 들어, 항-비오틴 항체(anti-biotin antibody), 항-Cy3 항체 또는 항Cy5 항체 또는 - 표지가 비오틴인 경우에 있어서는- 상기 표지는 비오틴과 자연적으로 결합하는 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘 (avidin)에 의해 검출된다. 상기 항체, 스트렙타비딘 또는 아비딘은 차례로, 바람직하게는 개개 표지, 예를 들어 방사성, 효소 또는 형광성 표지 (2차 항체와 같은)와 함께 변형되는 것이다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 2차 검출 수단에 의해 검출 또는 분석되며, 여기에서 상기 검출은 분자 비콘 (molecular beacon)이다. 분자 비콘의 방법론은 당업자에게 널리 알려져 있다.
간단하게, 분자 비콘으로도 불리는 핵산 탐침 (nucleic acid probes)들은 검출될 핵산 시료와 역 상보적 (reverse complement)이며, 검출될 핵산 시료의 일부와 역 상보적이기에 혼성화된다. 핵산 시료와 결합함으로써 상기 분자 비콘의 형광성 기 (fluorophoric group)가 분리되며 이로 인해 형광 신호의 변화, 바람직하게는 강도의 변화를 초래한다. 이와 같은 변화는 잔존하는 핵산 시료 함량과 상호 관련되어 있다.
본 발명에 따른 핵산을 이용한 헵시딘의 검출은 특히, 본원에서 정의되는 바와 같은 헵시딘의 검출을 허용할 것이라고 인지될 것이다.
헵시딘의 검출과 관련하여, 바람직한 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 헵시딘의 존재를 시험할 시료를 제공하는 단계,
(b) 본 발명에 따른 핵산을 제공하는 단계,
(c) 핵산과 시료를, 바람직하게는 반응용기 내에서 반응시키는 단계,
상기 단계 (a)는 단계 (b) 이전에 수행, 또는 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 핵산이 헵시딘과 반응하는지 여부를 검출하는 공정으로 구성되는 추가적인 단계 (d)가 제공된다. 바람직하게는, 단계 (b)의 상기 핵산은 표면에 고정화된다. 상기 표면은 반응 튜브 (reaction tube), 플레이트의 웰, 또는 예를 들어 비드 (bead)와 같은 이러한 반응 용기 내에 포함된 장치 표면일 수 있다. 상기 표면에 대한 상기 핵산의 고정화는 당업자에게 잘 알려진 임의의 수단, 이에 한정되지는 않으나 비공유 또는 공유 결합으로도 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합(linkage)은 상기 표면과 상기 핵산 간의 공유 화합결합을 통해 성립된다. 그러나 상기 핵산이 표면에 간접적으로 고정화되는 것, 여기에서 상기 간접적 고정화는 추가적인 구성성분(further component) 또는 상호작용 파트너(interaction partner)의 쌍의 사용과 관련됨도 또한 본 발명의 범위 내이다. 상기의 추가적인 구성성분은, 바람직하게 상호작용 파트너로도 불리는 고정화될 핵산과 특이적으로 상호작용하여, 표면에 핵산 부착을 매개하는 화합물이다. 상기 상호작용 파트너는 바람직하게는 핵산, 폴리펩티드(polypeptide), 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게 상호작용 파트너는 항체, 보다 바람직하게는 단일 클론 항체(monoclonal antibody)이다. 호환적으로, 상기 상호작용 파트너는 핵산, 바람직하게는 기능성 핵산(functional nucleic acid)이다. 보다 바람직하게는, 상기 기능성 핵산은 압타머(aptamer), 스피에겔머(spiegelmer) 및 핵산에 최소한 부분적으로 상보적인 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 추가적인 구현예로서, 상기 표면으로의 상기 핵산의 상기 결합은 다중-분산형 상호작용 파트너(multi-partite interaction partner)에 의해서 중재된다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는, 바람직하게는 상호작용 파트너의 쌍 또는 첫 번째 멤버(member) 및 두 번째 멤버로 구성되는 상호작용 파트너이며, 여기에서 상기 첫 번째 멤버는 상기 핵산에 의해 포함되거나 부착되며, 두 번째 멤버는 상기 표면에 부착되거나 포함되는 것이다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는 바람직하게는 비오틴(biotin) 및 아비딘(avidin), 비오틴(biotin) 및 스트렙타비딘 (streptavidin) 및 비오틴(biotin) 및 뉴트라비딘(neutravidin)을 포함하는 상호작용 파트너의 쌍의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 상호작용 파트너의 쌍의 첫 번째 멤버는 비오틴(biotin)이다.
상기 방법의 바람직한 결과는 헵시딘 및 상기 핵산의 고정화 복합체 (immobilised complex)의 형성이며, 보다 바람직하게는 상기 복합체는 검출되는 것이다. 상기 복합체로부터 상기 헵시딘이 검출되는 것은 구현예의 범위 내이다.
이러한 요건에 상응하는 각각의 검출 방법은 예를 들어, 상기 헵시딘의 해당/해당(들)에 특이적인 임의의 검출 방법이다. 특히 바람직한 검출 수단은 당업자들에게 있어서 그 제조법이 잘 알려진, 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 검출 수단 (detection means)이다.
본 발명에 따른 헵시딘의 검출을 위한 방법은 또한 시료를 단계 (c)를 수행하는데 바람직하게 사용되는 반응 용기로부터 제거하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 본 발명의 추가적인 구현예로서, 표면상, 바람직하게는 상기에서 정의된 표면상에서 헵시딘의 상호작용 파트너를 고정화하는 단계를 또한 포함하는 것이며, 여기에서 상기 상호작용 파트너는 본원에서 정의되며, 바람직하게는 각각 방법과 관련하여 상기와 같은, 보다 바람직하게는 그 다양한 구현예에서 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 것이다. 이 구현예로서, 특히 바람직한 검출 수단은 본 발명에 따른 핵산이며, 여기에서 상기 핵산은 표지되거나 또는 표지되지 않은 것이다. 상기 핵산이 표지된 경우에는, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 상기 검출은 또한 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 본원에 개시된 다양한 구현예에서의 구현예를 포함하는 군으로부터 선택된 이차 검출 수단 (second detection means)의 사용도 관여될 수 있다. 상기 검출 수단은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 특이적이다. 보다 바람직한 구현예로서 상기 이차 검출 수단 (second detection means)은 분자 비콘 (molecular beacon)이다. 상기 핵산 또는 상기 이차 검출 수단 중 어느 하나 또는 이들 모두는 바람직한 구현예로서 검출용 표지 (detection label)를 포함하는 것이다. 상기 검출용 표지는 바람직하게는 비오틴, 브로모-디속시우리딘 표지 (bromo-desoxyuridine label), 디곡시게닌 표지 (digoxigenin label), 형광 표지 (fluorescence label), UV-표지 (UV-label), 방사성-표지 (radio-label) 및 킬레이트제 분자 (chelator molecule)를 포함하는 군으로부터 선택됨이 바람직하다. 호환적으로, 상기 이차 검출 수단은 바람직하게는 상기 핵산이 함유 (contained), 포함 (comprised) 또는 부착 (attached)되어 있는 검출용 표지 (detection label)와 상호작용하는 것이다. 특히 바람직한 조합은 하기와 같다:
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 비오틴에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 아비딘 (avidin) 또는 아비딘 운반 분자 (avidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 스트렙타비딘 (streptavidin) 또는 스트렙타비딘 운반 분자 (streptavidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 뉴트라비딘 (neutravidin) 또는 뉴트라비딘 운반 분자 (neutravidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 브로모-디속시우리딘 (bromo-desoxyuridine)이고 이차 검출 수단은 브로모-디속시유리딘 (bromo-desoxyuridine)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 디곡시게닌 (digoxigenin)이고 이차 검출 수단은 디곡시게닌 (digoxigenin)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 킬레이트제 (chelator)이고 이차 검출 수단은 방사성 핵종 (radio-nuclide)이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 검출용 표지는 상기 핵산에 부착되는 것이다. 이와 같은 조합 (combination)의 종류는 상기 표지에 상기 핵산이 부착되는 구현예에서도 적용가능하다는 것으로 이해되어야 할 것이다. 이와 같은 구현예로서, 상기 검출용 표지는 상기 상호작용 파트너(interaction partner)에 부착되는 것이 바람직하다.
마지막으로, 상기 이차 검출 수단은 3차 검출 수단(third detection means), 바람직하게는 3차 검출 수단은 효소이며, 보다 바람직하게는 이차 검출 수단의 검출에서 효소 반응을 나타내는 3차 검출 수단을 이용하여 검출되거나, 또는 상기 3차 검출 수단은 방사능 검출용 수단, 보다 바람직하게는 방사성 핵종(radio-nuclide)에 의해 방출되는 방사능을 이용한 방사능 검출용 수단을 이용하여 검출함도 또한 본 발명의 범위 내이다. 바람직하게는, 3차 검출 수단은 2차 검출 수단을 특이적으로 검출 및/ 또는 상호작용하는 것이다.
또한 본 발명의 하나의 구현예로서, 표면상에 고정화되는 헵시딘의 상호작용 파트너 (interaction partner) 및 본 발명에 따른 핵산을, 바람직하게는 헵시딘와 상호작용 파트너 (interaction partner) 간에 형성된 상기 복합체에 첨가하는 것이며, 상기 시료는 반응으로부터, 보다 바람직하게는 단계 (c) 및/또는 단계 (d)가 수행되는 반응 용기 (reaction vessel)로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 형광성 기 (fluorescence moiety)를 포함하며, 상기 형광성 기(fluorescence moiety)의 형광은 상기 핵산과 헵시딘 및 유리형 헵시딘 간의 복합체 형성면에서 상이하다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 핵산은 본 발명에 따른 핵산 유도체(derivative)이며, 여기에서 상기 핵산 유도체는 아데노신 (adenosine)을 대체하는 하나 이상의 형광성 유도체 (fluorescent derivative)를 포함한다. 바람직한 구현예로서, 상기 아데노신의 형광성 유도체는 에테노아데노신 (ethenoadenosine)이다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 유도체 및 상기 헵시딘으로 구성되는 복합체를 형광도 (fluoreacence)를 이용하여 검출하는 것이다.
상기 방법의 구현예로서, 신호 (signal)는 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 발생되며, 상기 신호는 바람직하게는 시료 내의 헵시딘의 농도와 상호관련성을 갖는 것이다.
본 발명의 바람직한 측면으로서, 상기 어세이법(assay)은 96웰 플레이트에서 수행될 수 있으며, 그 구성성분들이 상술된 바와 같은 반응 용기 내에서 고정화되며 상기 웰들은 반응 용기 역할을 하는 것이다.
상기 발명적 핵산은 나아가 신약 설계 (drug design)를 위한 출발 물질 (starting material)로서 사용될 수 있다. 기본적으로 두 가지 가능한 접근 방법이 있다. 그 하나는 화합물 라이브러리 스크리닝법 (screening of compound libraries)으로서, 저분자량 화합물 라이브러리가 바람직하다. 본 발명의 구현예로서 상기 스크리닝법은 고 처리량 스크리닝법 (high throughput screening)이다. 바람직하게 고 처리량 스크리닝법은 목표 기초 어세이법으로서 화합물의 신속하며, 효율적인 시행-및-착오 평가법 (trial-and-error evaluation)이다. 가장 바람직하게는 상기 분석법은 변색 분석법 (colormatic measurement)에 의해 수행되는 것이다. 이와 관련하여 사용된 라이브러리는 당업계에 잘 알려져 있다.
선택적으로, 본 발명에 따른 상기 핵산은 이론적 신약 설계법 (rational design of drugs)에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이론적 신약 설계법은 약학적 선두 구조 (pharmaceutical lead structure)의 설계이다. X선 결정학 (Xray crystallography) 또는 핵자기공명분광법 (nuclear magnetic resonance spectroscopy)의 전형적인 방법으로 동정되는 목표물질의 삼차원 구조로부터 시작하여, 컴퓨터 프로그램들이 다수의 상이한 화학구조를 담고 있는 데이터베이스를 통한 검색에 이용된다. 컴퓨터를 통해 선별이 이뤄지며, 동정된 화합물들은 실험실에서 연속적으로 시험될 수가 있다.
상기 이론적 신약 설계법은 본 발명에 따른 임의의 핵산으로부터 시작될 수 있으며, 화학구조, 바람직하게는 본 발명 핵산 구조와 유사하거나 또는 발명적 핵산 구조의 결합 매개 부위와 동일한 삼차원 구조로 전개된다. 어떠한 경우라도, 그러한 구조는 발명적 핵산과 동일 내지 유사한 결합 특성을 나타낸다. 상기 이론적 신약 설계법상의 추가적 단계 또는 대체 단계의 일환으로서, 신경전달물질에 결합하는 핵산의 일부 결합부위의 바람직한 삼차원 구조는 뉴클레오티드 및 핵산들과는 상이한 화학물질군에 의하여 모방 설계된다. 이러한 모방 설계법에 의해, 상기 핵산과 상이한 화합물이 설계될 수 있다. 상기 화합물들은 바람직하게는 저분자 물질 또는 펩티드이다.
화합물 라이브러리 스크리닝법의 경우에, 당업자에게 알려진 경쟁적 어세이법을 사용하여, 적절한 헵시딘 유사체, 헵시딘 효현제 또는 헵시딘 길항제 등의 화합물들이 발견될 수 있다. 상기 경쟁적 어세이법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 본 발명의 발명적 핵산, 바람직하게는 L-핵산에 결합하는 목표물질인 스피에겔머 (spiegelmer)는 고체상 (solid phase)에 결합된다. 헵시딘 유사체를 동정하기 위하여 표지된 헵시딘을 어세이법에 추가가능하다. 잠재적 효능을 갖는 유사체는 스피에겔머와 결합하는 헵시딘 분자와 경쟁하여 각각 표지에 의해 획득되는 신호상의 감소를 수반할 것이다. 효현제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 세포 배양 어세이법의 사용과 관련될 수 있다.
본 발명에 따른 키트 (kit)는 적어도 하나 이상의 발명적 핵산을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 키트는 최소한 하나 또는 그 이상의 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군으로는 예를 들어, 헵시딘, 특히, 발명적 핵산이 바람직하게는 액상 형태에서 선택되거나 결합되는 것일 수 있다. 음성대조군으로는 예를 들어, 헵시딘과 유사한 생물리학적 특성을 갖으나, 발명적 핵산에 의해 인식되지는 않는 펩티드일 수 있다. 게다가, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 건조, 동결건조 또는 액체에 용해된 형태로 다양한 성분들이 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 하나 이상의 성분이 번갈아 포함될 수 있는 하나 이상의 컨테이너 (container)를 포함할 수도 있다. 보다 구체적인 구현예로서, 상기 키트는 키트를 사용하는 방법에 관한 사용자 정보를 제공하는 지시내용 또는 지시내용 용지 및 이의 다양한 요소를 포함하는 것이다.
본 발명에 따르는 핵산의 약학적 및 생물분석적 검출은 인간 및 비인간적인 체내의 다양한 액, 조직 및 기관의 약물동력적 (pharmacokinetic) 및 생물역학적 (biodynamic) 분석도의 평가를 위해 기초가 된다. 이와 같은 목적을 위해, 본원에 개시되거나 당업자에게 알려진 모든 검출 방법은 이용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 측면에서는, 본 발명에 따른 핵산의 검출을 위한 샌드위치 혼성화 에세이법 (sandwich hybridisation assay)이 제공된다. 검출 에세이법 내에서, 포획 탐침 (capture probe) 또는 검출 탐침 (detection probe)이 이용된다. 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 첫 번째 부분에 상동성이며, 검출 탐침은 두 번째 부분에 상동성이다. 포획 및 검출 탐침 모두는 DNA 뉴클레오티드, 변형된 DNA 뉴클레오티드, 변형된 RNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, LNA 뉴클레오티드 및/ 또는 PNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
그러므로, 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 5' 말단에 상동하는 서열 스트레치를 포함하며, 검출 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 3'-말단에 상동하는 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우에 있어서, 포획 탐침은 5‘-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정화되고, 상기 포획 탐침은 이의 5’-말단에 직접적으로 또는 표면 또는 매트릭스와 5‘-말단 사이의 링커 (linker)를 통해 고정화된다. 그러나, 원칙적으로 링커는 포획 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
선택적으로, 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 3‘-말단에 상동적인 서열 스트레치를 포함하며 검출 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 5’-말단에 상동적인 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우에 있어서, 포획 탐침은 3‘-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정화되고, 상기 포획 탐침은 이의 3’-말단에 직접적으로 또는 표면 또는 매트릭스와 3‘-말단 사이의 링커 (linker)를 통해 고정화된다. 그러나, 원칙적으로 링커는 포획 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산에 혼성화 (hybridisation)할 수 있는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 숫자는 다양하며, 본 발명 자체에 따르는 포획 및/ 또는 검출 탐침 및/ 또는 핵산의 뉴클레오티드 숫자에 의존할 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산에 혼성화하는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 총체적인 숫자는 본 발명에 따르는 핵산에 의해 포함되는 뉴클레오티드의 숫자의 최대치일 것이다. 검출 및 포획 탐침의 뉴클레오티드의 최소 개수 (2 내지 10 뉴클레오티드)는 본 발명에 따르는 핵산의 5‘-말단 또는 3’-말단에 각각 혼성화이 가능하다. 본 발명에 따르는 핵산과 분석되는 샘플 내에 일어나는 다른 핵산 사이의 높은 특이성 및 선택성을 파악하기 위해서는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 총체적인 개수는 본 발명에 따르는 핵산에 의해 포함되는 뉴클레오티드의 숫자가 최대치 또는 되어야할 것이다.
더군다나, 검출 탐침은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 검출될 수 있는 마커 분자 (marker molecule) 또는 표지를 운반한다. 표지 또는 마커 분자는 원칙적으로 검출 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 또는 마커는 검출 탐침의 5‘-말단 또는 3’-말단에 위치하며, 상기 검출 탐침 내의 뉴클레오티드 사이에서 본 발명에 따른 핵산에 상동적이며, 상기 표지 링커는 삽입될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따르는 핵산의 검출방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:
본 발명에 따르는 핵산은 포획 탐침에 한쪽 끝과 검출 탐침과는 다른 쪽 끝으로 혼성화한다. 그 이후 결합되는 않은 검출 탐침은 예를 들어, 한번 또는 여러번의 세척 과정을 통해 제거된다. 바람직하게 표지 또는 마커 분자를 지니는 결합된 검출 탐침의 함량은 예를 들어, 본원에서 참고로만 이용되는 WO/2008/052774에 상술한 바와 같이 연속적으로 측정될 수 있다.
본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 정의되는 치료는 추가적 또는 선택적 예방 및/ 또는 추적치료 (follow-up)을 포함한다.
본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 역으로 지시되지 않는 한, 정의되는 용어 질환 및 장애는 교환가능한 방법으로 사용될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 정의되는 용어 “포함하다(comprise)"는 바람직하게는 이와 같은 정의에 의해 따르거나 서술되는 주제를 한정하고자 함이 아니다. 그러나, 호환적인 구현예로서, 정의되는 용어 “포함하다(comprises)"는 함유하다 (containing)는 의미로 이해될 것이며, 그러므로 그와 같은 정의로 따르거나 서술되는 주제를 한정되어야 할 것이다.
다양한 서열번호들, 본 발명에 따르는 핵산 분자의 화학적 본질 및 본원에서 사용된 목표 분자 헵시딘, 이들의 실질적인 서열 및 내부적으로 사용하는 참고번호는 하기 표에 요약되어 있다.
서열
번호		 RNA/펩티드 서열 내적참고
(internalreference)
1 L-peptide DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT Human hepcidin, human hepcidin-25
2 L-peptide DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT Hepcidin-25 of Macaca mulatta (rhesus monkey)
3 L-peptide DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT Hepcidin-25 of Macaca fascularis (cynomolgus monkey)
4 L-peptide DTHFPICIFCCGCCRKAICGMCCKT Hepcidin-25 of Sus scrofa (pig)
5 L-peptide DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT Hepcdin-25 of Mus musculus (mouse)
6 L-peptide DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT Hepcidin-25 of Rattus norvegicus (rat)
7 D-peptide DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT-Biotin Biotinylated human D-hepcidin-25
8 L-peptide ICIFCCGCCHRSKCGMCCKT human hepcidin-20
9 L-peptide FPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT human hepcidin-22
10 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-C5-001
11 D-RNA GCACUUGUAAAGUAGAGGGACCCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-B5-001
12 D-RNA GCAUUCGUAAAGUAGAGGGACCCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-A5-001
13 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCUAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGGGUGC 223-A3-001
14 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCUAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-F5-001
15 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACUCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-G4-001
16 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGAUACAGUCCGGCGUGAUAGUGACGAGUGC 223-A4-001
17 D-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGCAGGUAAUCUGCGGAGUGUUAGUUCCACACG 229-C2-001
18 D-RNA CGCGUGUAAAGUAGAGGCAGGUAAUCUGCGGAGUGUUAGUUCCACACG 229-B4-001
19 D-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGCAGGCAAUCUGCGGAGUGUUAGUUCCACACG 229-E2-001
20 D-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACACG 229-B1-001
48 L-RNA 5’-40-kDa-PEG- GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-C5-001-5’-PEG
49 D-RNA AGGCGUAAAGUAGAGGGGCUGAGCCCGGCGUGUUAGUGCCGCCU 238-A1-001
50 D-RNA AGGCGUAAAGUAGAGGGACGUAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGCCU 238-E2-001
51 D-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGCAGAUAAUCUGCGGAGUGUUAGUUCCACACG 237-A7-001
52 D-RNA CGUGAAAAGUAGAAACUUGUCGAAAGCAAGCAGCGUGAUAGUGCCACG 236-G2-001
53 D-RNA CGUGAAAAGUUGAAAUUUGUUGGAAUCAAGCAGGGAUAUAGUGCCACG 236-D1-001
54 D-RNA AGCGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGUGCGCU 238-D2-001
55 D-RNA AGCGUGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUGCU 238-D4-001
56 D-RNA AGUGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGGGUUGGAGGAAGGAUGCGCU 238-H1-001
57 D-RNA AGUGUGUCAUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAAGGCAUGCU 238-A2-001
58 D-RNA AGCGUGCCGGAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGUGCGCU 238-G2-001
59 D-RNA AGCGUGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUAGGAGGAAGGGUACGCU 238-G4-001
60 D-RNA AGCGCGCCGUAUGGGAGAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCGCU 238-G3-001
61 D-RNA AGGCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGCCU 238-C4-001
62 D-RNA AGGCUCGGACGGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGGGCCU 238-E3-001
63 D-RNA AGGCCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGGGCCU 238-F2-001
64 D-RNA AGGCUUGGGCGGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGAGCCU 238-A4-001
65 D-RNA AGACUUGGGCAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGAGUCU 238-E1-001
66 D-RNA CGGGCGCCAUAGACCGUUAUUAAGCACUGUAACUACCGAACCGCGCCCG 237-A5-001
67 D-RNA CGGGCGCCAUAGACCGUUAACUACAUAACUACCGAACCGUGCCCG 237-C5-001
68 D-RNA CGGGCGCUACCGAACCCACUAAAACCAGUGCAUAGACCGCGCCCG 236-F2-001
69 D-RNA CGGGCGCUACCGAACCGUCACGAAGACCAUAGACCGCGCCG 236-G4-001
70 D-RNA CGAGCGCAACCGAACCUCUACCCAGACAUAGACCGCGCCCG 236-E3-001
71 D-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-C5-008
72 D-RNA GUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAC 229-B1-003
73 D-RNA GCGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACGC 229-B1-004
74 D-RNA GCGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCGC 229-B1-005
75 D-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAC 229-B1-006
76 D-RNA GCCGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACGGC 229-B1-007
77 D-RNA GCGGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACCGC 229-B1-008
78 D-RNA GCUGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCAGC 229-B1-009
79 D-RNA GCUGGGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCCCAGC 229-B1-010
80 D-RNA GCGGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCCGC 229-B1-011
81 D-RNA GCGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-002
82 D-RNA GCGCGCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-003
83 D-RNA GGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCC 238-D4-004
84 D-RNA GGCGCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCC 238-D4-005
85 D-RNA GGUGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUC 238-D4-006
86 D-RNA GGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUC 238-D4-007
87 D-RNA GCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-008
88 D-RNA GCGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-009
89 D-RNA GGCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-010
90 D-RNA GGCGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-011
91 D-RNA GGCGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-012
92 D-RNA GGCGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-013
93 D-RNA GGCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGCC 238-C4-002
94 D-RNA GCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGC 238-C4-003
95 D-RNA CUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGG 238-C4-004
96 D-RNA GCCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGC 238-C4-005
97 D-RNA GGCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-006
98 D-RNA GCGGAGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAUCCGU 238-C4-007
99 D-RNA AGGCUGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGGCCU 238-C4-008
100 D-RNA GGCCUGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAAGGCU 238-C4-009
101 D-RNA GCGCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGCGC 238-C4-010
102 D-RNA GCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGC 238-C4-011
103 D-RNA GGCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGCC 238-C4-012
104 D-RNA GGCCGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGGCC 238-C4-013
105 D-RNA GCGCGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGCGC 238-C4-014
106 D-RNA GGCCGGACAGCCGGAGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-024
107 D-RNA GGCCGGACAGCCGGCGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-025
108 D-RNA GGCCGGACAGCCGGGAGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-062
109 L-RNA 5’UCCAGGUUCUGGA 　
110 L-RNA AGGCGUAAAGUAGAGGGGCUGAGCCCGGCGUGUUAGUGCCGCCU 238-A1-001
111 L-RNA AGGCGUAAAGUAGAGGGACGUAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGCCU 238-E2-001
112 L-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGCAGAUAAUCUGCGGAGUGUUAGUUCCACACG 237-A7-001
113 L-RNA CGUGAAAAGUAGAAACUUGUCGAAAGCAAGCAGCGUGAUAGUGCCACG 236-G2-001
114 L-RNA CGUGAAAAGUUGAAAUUUGUUGGAAUCAAGCAGGGAUAUAGUGCCACG 236-D1-001
115 L-RNA AGCGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGUGCGCU 238-D2-001
116 L-RNA AGCGUGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUGCU 238-D4-001
117 L-RNA AGUGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGGGUUGGAGGAAGGAUGCGCU 238-H1-001
118 L-RNA AGUGUGUCAUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAAGGCAUGCU 238-A2-001
119 L-RNA AGCGUGCCGGAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGUGCGCU 238-G2-001
120 L-RNA AGCGUGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUAGGAGGAAGGGUACGCU 238-G4-001
121 L-RNA AGCGCGCCGUAUGGGAGAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCGCU 238-G3-001
122 L-RNA AGGCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGCCU 238-C4-001
123 L-RNA AGGCUCGGACGGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGGGCCU 238-E3-001
124 L-RNA AGGCCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGGGCCU 238-F2-001
125 L-RNA AGGCUUGGGCGGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACUAUACGAGCCU 238-A4-001
126 L-RNA AGACUUGGGCAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGAGUCU 238-E1-001
127 L-RNA CGGGCGCCAUAGACCGUUAUUAAGCACUGUAACUACCGAACCGCGCCCG 237-A5-001
128 L-RNA CGGGCGCCAUAGACCGUUAACUACAUAACUACCGAACCGUGCCCG 237-C5-001
129 L-RNA CGGGCGCUACCGAACCCACUAAAACCAGUGCAUAGACCGCGCCCG 236-F2-001
130 L-RNA CGGGCGCUACCGAACCGUCACGAAGACCAUAGACCGCGCCG 236-G4-001
131 L-RNA CGAGCGCAACCGAACCUCUACCCAGACAUAGACCGCGCCCG 236-E3-001
132 L-RNA GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-C5-008
133 L-RNA GUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAC 229-B1-003
134 L-RNA GCGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACGC 229-B1-004
135 L-RNA GCGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCGC 229-B1-005
136 L-RNA CGUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAC 229-B1-006
137 L-RNA GCCGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACGGC 229-B1-007
138 L-RNA GCGGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACCGC 229-B1-008
139 L-RNA GCUGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCAGC 229-B1-009
140 L-RNA GCUGGGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCCCAGC 229-B1-010
141 L-RNA GCGGCGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCGCCGC 229-B1-011
142 L-RNA GCGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-002
143 L-RNA GCGCGCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-003
144 L-RNA GGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCC 238-D4-004
145 L-RNA GGCGCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCC 238-D4-005
146 L-RNA GGUGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUC 238-D4-006
147 L-RNA GGUGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCAUC 238-D4-007
148 L-RNA GCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-008
149 L-RNA GCGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-009
150 L-RNA GGCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-010
151 L-RNA GGCGCCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-011
152 L-RNA GGCGUCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-012
153 L-RNA GGCGUCGUAUGGGAUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGCC 238-D4-013
154 L-RNA GGCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGCC 238-C4-002
155 L-RNA GCUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGC 238-C4-003
156 L-RNA CUCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGG 238-C4-004
157 L-RNA 5’GACAAUAGUC 　
158 L-RNA GCCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGGC 238-C4-005
159 L-RNA GGCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-006
160 L-RNA GCGGAGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAUCCGU 238-C4-007
161 L-RNA AGGCUGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGGCCU 238-C4-008
162 L-RNA GGCCUGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAAGGCU 238-C4-009
163 L-RNA GCGCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGCGC 238-C4-010
164 L-RNA GCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGC 238-C4-011
165 L-RNA GGCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGCC 238-C4-012
166 L-RNA GGCCGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGGCC 238-C4-013
167 L-RNA GCGCGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUAGCGC 238-C4-014
168 L-RNA GGCCGGACAGCCGGAGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-024
169 L-RNA GGCCGGACAGCCGGCGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-025
170 L-RNA GGCCGGACAGCCGGGAGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-062
171 L-RNA 5’-NH2-GCUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAGC 229-B1-002-5’-Amino
172 L-RNA 5’-NH2-GCACUCGUAAAGUAGAGGGACCCAGUCCGGCGUGAUAGUGCCGAGUGC 223-C5-001-5’-Amino
173 L-RNA 5’-PEG-GCUGUGUAAAGUAGAGGACAAUUGUCGGCGUGAUAGUGCCACAGC 229-B1-002-5’-PEG
174 L-RNA 5’-PEG-GGCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-006-5’_PEG
175 L-RNA 5’-PEG-GCGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-002-5’-PEG
176 L-RNA 5'-PEG-GCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-008-5’-PEG, NOX-H94
177 L-RNA 5'-CCAUACGGCGC-C18-C18-NH2- 5'CP-11_NOX-H94
178 L-RNA 5'-Biotin-C18-C18-GCGCCCUUCCUCC 3'DP-13_NOX-H94
179 L-RNA 5’-NH2-GCGCGCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGCGCGC 238-D4-002-5’-Amino
180 L-RNA 5’-NH2-GCGCCGUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAGGGCGC 238-D4-008-5’-Amino
181 L-RNA 5’-NH2-GGCCGGACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUACGGCC 238-C4-006-5’-Amino
182 L-RNA 5’RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 　
183 L-RNA 5’RKAUGGGAKAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 　
184 L-RNA 5’GUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAG 　
185 L-RNA 5’GRCRGCCGGVGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 　
186 L-RNA 5’GRCRGCCGGARGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 　
187 L-RNA 5’GACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUA 　
188 L-RNA 5’WAAAGUWGAR 　
189 L-RNA 5’RGMGUGWKAGUKC 　
190 L-RNA 5’GGGCUGAGCCC 　
191 L-RNA 5’GCAGAUAAUCUGC 　
192 L-RNA 5’GGACCAGUCC 　
193 L-RNA 5’GGACCCAGUCC 　
194 L-RNA 5’GGACCUAGUCC 　
195 L-RNA 5’GGACUCAGUCC 　
196 L-RNA 5’GCAGGUAAUCUGC 　
197 L-RNA 5’GCAGGCAAUCUGC 　
198 L-RNA 5’GACAAUUGUC 　
199 L-RNA 5’UAAAGUAGAG 　
200 L-RNA 5’AAAAGUAGAA 　
201 L-RNA 5’AAAAGUUGAA 　
202 L-RNA 5’GGGAUAUAGUGC 　
203 L-RNA 5’GGCGUGAUAGUGC 　
204 L-RNA 5’GGAGUGUUAGUUC 　
205 L-RNA 5’GGCGUGAGAGUGC 　
206 L-RNA 5’AGCGUGAUAGUGC 　
207 L-RNA 5’GGCGUGUUAGUGC 　
208 L-RNA 5’GGACBYAGUCC 　
209 L-RNA 5’GGAUACAGUCC 　
210 L-RNA 5’GCAGGYAAUCUGC 　
211 L-RNA 5’GACAAUWGUC 　
212 L-RNA 5’ACUUGUCGAAAGCAAGYU 　
본 발명은 나아가 구현예 및 장점들이 적용됨을 나타내는 도면, 실시예 및 서열목록에 의해 기술된다.
본 발명은 헵시딘과 특이적으로 상호작용하는 핵산(nucleic acid)에 근거한 수단을 제공함으로써, 병리 유전적 기전적으로 직접 또는 간접적으로 관련된 헵시딘에 의해서 특징된 인간 또는 비-인간 질환들의 치료를 위한 약제 제조 및 진단제를 제조하기 위한 수단을 제공한다.
도 1 및 2은 A형 헵시딘 결합 핵산들의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 3는 A형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001 유도체를 표시한 것이며;
도 4는 A형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001 유도체를 표시한 것이며;
도 5은 B형 헵시딘 결합 핵산들의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 6는 B형 헵시딘 결합 핵산 238-D4-001 유도체를 표시한 것이며;
도 7은 C형 헵시딘 결합 핵산들의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 8는 C형 헵시딘 결합 핵산 238-C4-001 유도체를 표시한 것이며;
도 9은 기타 헵시딘 결합 핵산들의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 10은 헵시딘 결합 핵산들 223-C5-001, 229-B1-002, 238-C4-006, 238-D4-001 및 238-D4-008의 인간 헵시딘-25, 시노몰거스 헵시딘-25, 마모세트 헵시딘-25, 마우스 헵시딘-25 및 래트 헵시딘-25에 대한 결합 데이타를 표시한 것이며;
도 11은 헵시딘 결합 핵산들 223-C5-001, 229-B1-002, 238-C4-006, 238-D4-001 및 238-D4-008의 인간 헵시딘-25, 헵시딘-22 및 헵시딘-20에 대한 결합 데이타를 표시한 것이며;
도 12은 헵시딘 결합 핵산들 223-C5-001-5’-PEG, 229-B1-002-5’-PEG, 238-C4-006-5’-PEG, 238-D4-002-5’-PEG 및 238-D4-008-5’-PEG의 인간 헵시딘-25에 대한 결합 데이타를 표시한 것이며;
도 13은 37°C에서 비오틴화 인간 D-헵시딘-25 에 결합하는 A 형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001 압타머의 KD 수치를 나타낸 비아코아(Biacore) 센소그램 (sensorgram)을 나타내며 (여기에서, 비오틴화 인간 D-헵시딘-25은 시간에 대한 반응(RU)라고 표시된 바와 같은, 37°C에서 스트렙타비딘 접합 센서 칩(strepatavidin conjugated sensor chip) 상에서의 스트렙타비딘 결합 공정에 의하여 고정화됨);
도 14 및 15은 헵시딘 결합들 사이를 상호 비교하고 가장 우수한 헵시딘 결합 핵산들을 동정하기 위한 랭킹 실험(ranking experiments) 결과를 나타낸 도이며 (여기에서 A형 헵시딘 결합 핵산 233-C5-001은 표지되고 상기 핵산 결합 233-C5-001의 비오틴화 인간 D-헵시딘-25과의 결합은, 비오틴화 인간 D-헵시딘-25 농도에 대한 233-C5-001의 결합(“경쟁적 풀-다운 어세이법”)이라고 각각 표시되는 바와 같은, 37°C에서 10, 50 또는 250 nM 비-표지된(non-labeled) 경쟁자(competitor) RNA, 상이한 형(type) 헵시딘 결합 핵산들의 존재하에 수행됨);
도 16은 37°C에서 비오틴화 인간 D-헵시딘-25 에 결합하는 A 형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001 압타머의 KD 수치를 나타낸 비아코아 (Biacore) 센소그램 (sensorgram)을 나타내며 (여기에서, 비오틴화 인간 D-헵시딘-25은 시간에 대한 반응(RU)라고 표시된 바와 같은, 37°C에서 스트렙타비딘 접합 센서 칩(strepatavidin conjugated sensor chip) 상에서의 스트렙타비딘 결합 공정에 의하여 고정화됨);
도 17A/17B은 스피에겔머들, 223-C5-001-5’-PEG, 및 238-D4-008-5’-PEG (=NOX-H94)의 패로포르틴의 철분-유도 상위-조절(iron-induced up-regulation)에 대한 인간 헵시딘-25 효과에 대한 영향을 나타낸 도이며 (여기에서, 인간 헵시딘 또는 헵시딘 + 개개 스페에겔머로 자극 후에 J774.1 세포들로부터 얻은 용해물은 전기영동(SDS-gel electrophoresis)으로 분리하고 마우스 페로포르틴 항체를 이용한 분석법(Western Blot)으로 분석함);
도 18은 생체 내 헵시딘 활성에 대한 스피에겔머,23-C5-001-5’-PEG의 효과를 나타낸 도이며 (여기에서 상기 인간 헵시딘에 의해 유도된 혈청 철분 감소는 인간 헵시딘 주사 전에 스피에겔머 23-C5-001-5’-PEG의 적용으로 완전하게 차단됨);
도 19은 37°C에서 비오틴화 인간 L-헵시딘에 결합하는 헵시딘 결합 핵산NOX-H94 (=238-D4-008-5’-PEG) 스피에겔머의 KD 수치를 나타낸 비아코아 (Biacore) 센소그램 (sensorgram)을 나타내며 (여기에서, 비오틴화 인간 L-헵시딘은 시간에 대한 반응(RU)라고 표시된 바와 같은, 37°C에서 스트렙타비딘 접합 센서 칩(strepatavidin conjugated sensor chip) 상에서의 스트렙타비딘 결합 공정에 의하여 고정화됨);
도 20은 생체 내 헵시딘 활성에 대한 스피에겔머, NOX-H94 (=238-D4-008-5’-PEG) 의 효과를 나타낸 도이며 (여기에서 상기 인간 헵시딘에 의해 유도된 혈청 철분 감소는 인간 헵시딘 주사 전에 스피에겔머 NOX-H94 (=238-D4-008-5’-PEG)의 적용으로 완전하게 차단됨);
도 21은 염증성 빈혈증에 대한 동물 실험 모델(시노몰거스 원숭이)에서의 스피에겔머, NOX-H94 (=238-D4-008-5’-PEG) 의 효과를 나타낸 도이며 (여기에서 IL-6 주사는 비-인간 영장류에서의 빈혈을 초래하는 연속적인 헵시딘 분비를 유도하며; 실험 내에서, 인간 IL-6은 혈청 철분 농도를 운송체/IL-6 처치 마우스(vehicle/IL-6 treated mice) 군의 사전선량(predose) 수치의 27 %로 감소하였고, 이러한 혈청 철분상의 감소는 인간 IL-6 주사 전에 스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG를 적용함으로서 완전하게 차단됨).
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 인간 헵시딘과 결합하는 핵산
목표로서 비오틴화 인간 D-헵시딘-25을 이용하여, 인간 헵시딘과 결합하는 몇가지 핵산, 특히 인간 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22, 및 인간 헵시딘-20은 도 1 내지 도 9에 묘사된 핵산 서열을 제조할 수 있다. 상기 핵산은 압타머, 즉, 비오틴화 인간 D-헵시딘으로 수행되는 직접 풀-다운(pull down) 어세이법을 이용한 D-핵산 수준 (실시예 3), 경쟁적 풀-다운(pull down) 어세이법을 이용한 D-핵산 수준 (실시예 3) 및/또는 비오틴화 인간 D-헵시딘-25 또는 스피에겔머, 즉, 경쟁적 풀-다운(pull down) 어세이법 (실시예 3), 표면 플라즈몬 공명 기기 (surface plasmon resonance measurement) (실시예 4), 시험관내(in vitro) 어세이법 (실시예 5) 수준, 및/또는 생체 내(in vivo) 어세이법 (실시예 6 및 7)에서의 인간 헵시딘-25의 자연 배위를 갖는 L-핵산 (L-MCP)으로 특징화된다. 상기 스피에겔머 및 압타머는 실시예 2에 개시된 바와 같이 합성하였다.
따라서 생성된 핵산은 3개의 서로 다른 서열 모티프(sequence motiffs)를 나타내고, 이 3개 주요 형태는 도 1 내지 도 8 (4 형)에 표시된 바와 같은 A 형(Type), B 형, 및 C 형 헵시딘 결합 핵산으로 정의되어 있다. 서로 관련될 수 없고 본원에서 개시된 서로 다른 서열 모티프에 결합하는 추가적인 헵시딘 결합 핵산들을 도 7에 동정되고 표시되어 있다.
핵산 서열 모티프를 정의하기 위하여, 모호한 핵산을 IUPAC 생략표기법을 이용하여 하기와 같이 이용하였다:
S- 강(strong)- G 또는 C; W- 약(weak)- A 또는 U; R- 퓨린(purine)- G 또는 A; Y- 피리미딘(pyrimidine)- C 또는 U; K- 케토(keto)- G 또는 U; M- 이미노(imino)- A 또는 C; B- A가 아닌(not A)- C 또는 U 또는 G; D- C가 아닌(not C)- A 또는 G 또는 U; H- G가 아닌(not G)- A 또는 C 또는 U; V- U가 아닌(not U)- A 또는 C 또는 G; N- 모두(all)- A 또는 G 또는 C 또는 U.
역으로 지시되지 않는다면, 임의의 핵산 서열 또는 스트레치(streches) 및 박스(boxes)의 서열을 각각 5‘→3’ 방향으로 정의된다.
1.1. A 형 헵시딘 결합 핵산 (Type A hepcidin binding nucleic acids)
도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 A 형 헵시딘 결합 핵산들은 1개의 뉴클레오티드의 중간 스트레치를 포함하고 상기 중간 스트레치는 적어도 (1) 잠재적으로 헵시딘 결합 모티프(motif)를 한정하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 스트레치 (본원에서는 뉴클레오티드의 박스로 지칭; 본원에서는 진하게 밑줄 및 이태리체로 표시함); (2) 뉴클레오티드 박스(box) A의 제 1차 스트레치; 및 (3) 뉴클레오티드 박스(box) B의 제 2차 스트레치들을 포함한다.
상기 뉴클레오티드 박스 A의 제 1차 스트레치 (first stretch) 및 뉴클레오티드 박스 B의 제 2차 스트레치 (stretch)들은 서로 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch)에 의하여 연결되어 있다.
상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치 내에서 몇몇 뉴클레오티드들은 서로 혼성화될 수 있고, 혼성화가 되면 이중가닥 구조가 생성된다. 그러나, 상기 혼성화는 분자 내에서 필수적이지는 않다.
일반적으로, A 형 헵시딘 결합 핵산은 뉴클레오티드의 5’-편(end) 및 3’-편 터미널 스트레치(terminal stretch): 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치(terminal stretch)를 포함한다. 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치(terminal stretch)들은 서로 혼성화될 수 있고, 혼성화가 되면 이중가닥 구조가 생성된다. 그러나, 상기 혼성화는 분자내에서 필수적이지는 않다.
A 형 헵시딘 결합 핵산들인 박스 A, 박스 B의 뉴클레오티드의 5개 스트레치, 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch), 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치(terminal stretch)들은 서로 상이하게 배열될 수 있다, 즉 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 박스(Box) A 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch of nucleotides) 박스(Box) B 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 또는 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 박스(Box) B 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch of nucleotides) 박스(Box) A 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides).
그러나, A 형 헵시딘 결합 핵산들인 박스 A, 박스 B의 뉴클레오티드의 5개 스트레치, 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch), 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치(terminal stretch) 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치(terminal stretch)들은 서로 상이하게 배열될 수도 있다, 즉 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 박스(Box) A 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch of nucleotides) 박스(Box) B 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 또는 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 박스(Box) B 뉴클레오티드의 연결 스트레치 (linking stretch of nucleotides) 박스(Box) A 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides).
뉴클레오티드의 정의된 박스들 또는 스트레치들의 서열들은 A 형 헵시딘 결합 핵산 등 사이에 상이할 수 있는데, 이는 인간 헵시딘, 특히 인간 헵시딘-25에 대한 결합 친화성에 영향을 미친다. 서로 상이한 A 형 헵시딘 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 하기한 바와 같은 이의 박스 A, B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 인간 헵시딘, 특히 인간 헵시딘에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다.
본 발명에 따른 A 형 헵시딘 결합 핵산들은 도 1 내지 4에 표시하였다. 이들 모두는 이들의 인간 헵시딘-25, 보다 구체적으로, 비오틴화 인간 D-헵시딘(hepcidin)-25 및 비오틴화 인간 L-헵시딘-24 각각에 결합하는 결합력을 압타머 및/또는 스피에겔머로 시험하였다. 인간 헵시딘-25에 대한 결합 친화력 특성을 갖는 A형 헵시딘 결합 핵산은 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001이다. 인간 헵시딘-25에 대한 평형 결합 상수(equilibrium binding constant KD) 는 표면 플라즈몬 공명기기로 측정되었다 (압타머 서열로 측정시: KD = 1.2nM, 도 13; 스피에겔머 서열로 측정시: KD = 2.7 nM, 도 11). 인간 헵시딘-25에 추가하여, 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001는 인간 헵시딘-20과 거의 동일한 결합 친화력으로 결합하였다 (도 11).
A 형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001의 유도체들인 223-C5-002, 223-C5-007 및223-C5-008 들은 A 형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001과 비교하여 경쟁적 풀-다운 어세이법(competitive pull-down assay)상에서 감소된 결합 치환력을 나타냈다 (도 3). 사실상, 헵시딘 결합 핵산 223-C5-006은 인간 헵시딘-25에 대하여 223-C5-001과 유사한 결합양상을 동일한 어세이 조건하에서 나타냈다 (도 3).
A 형 헵시딘 결합 핵산들인 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-F5-001, 223-G4-001, 223-A4-001, 229-C2-001, 229-B4-001, 229-E2-001, 229-B1-001 229-G1-001, 229-C4-001, 238-A1-001, 238-E2-001, 237-A7-001, 236-G2-001, 236-D1-001, 229-D1-001 및 229-E1-001들을 압타머 형태로서 A 형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001과 비교하여 경쟁적 풀-다운 어세이법에서 시험하였고, 여기에서 먼저 방사선 표지된 압타머인 223-C5-001의 결합 친화력을 직접 풀-다운 어세이법(direct pull-down assay)을 이용하여 측정하였다. 핵산 229-E1-001에 대한 A형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001의 결합 경쟁은 관찰되지 않았다 (도 2 및 15). 이러한 관찰 결과는 핵산 229-E1-001이 인간 헵시딘-25에 대하여 없거나 배우 낮은 결합 친화력을 갖는 것으로 추정된다. A 형 헵시딘 결합 핵산들인 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-A4-001, 229-C2-001, 229-B4-001, 229-E2-001, 229-C4-001, 238-A1-001, 238-E2-001, 237-A7-001, 236-G2-001 및 236-D1-001들은 A 형 헵시딘 결합 핵산 223-C5-001과 비교시에 경쟁적 풀-다운 어세이법 상에서 감소된 결합 친화력을 나타냈다 (도 1, 14 및 15). A 형 헵시딘 결합 핵산들 223-F5-001, 223-G4-001, 229-G1-001 및 229-D1-001 들은 223-C5-001과 유사한 결합 친화력을 나타냈다 (도 1, 2, 14 및 15). 비오틴화 인간 D-헵시딘-25에 대한 보다 좋은 결합 친화력을 A 형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001에서 발견할 수 있었다 (도 1 및 15). 따라서 A형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001이 추가로 특성화되었다. A형 헵시딘 결합 핵산229-B1-001에 대한 평형 결합 상수 (equilibrium binding constant KD) 는 표면 플라즈몬 공명기기로 측정되었다 (압타머 서열로 측정시: KD = 0.5nM, 도 16; 스피에겔머 서열로 측정시: KD = 1.25 nM, 도 11, 데이터 표시안함).
A 협 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001의 유도체들인 229-B1-003, 229-B1-004, 229-B1-005 및 229-B1-006들은 A 형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-001과 비교하여 경쟁적 풀-다운 어세이법에서 감소된 결합 친화력을 나타냈다 (도 4). 사실상, A형 헵시딘 핵산들인 229-B1-002, 229-B1-007, 229-B1-008, 229-B1-009, 229-B1-010 및 229-B1-011들은 동일한 실험법을 수행시에 229-B1-001과 비교시에 인간 헵시딘-25에 대한 결합력 면에서 동등 또는 약간 상승된 결합력을 나타냈다(도 4).
A 형 결합 핵산 229-B1-002에 대하여 동정하였다. A 형 결합 핵산 229-B1-002의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다 (스피엘겔머 서열으로 측정시 KD=1.47nM, 도 10 및 11).
게다가 A 형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-002의 결합 특이성/선택성을 하기 헵시딘 분자들로 시험하였다: 인간 헵시딘-25, 시노몰거스(cynomolgus) 헵시딘-25, 마우스 헵시딘(mouse hepcidin)-25, 래트 헵시딘(rat hepcidin)-25, 인간 헵시딘-22 및 인간 헵시딘-20 (도 10 및 11). A 형 헵시딘 결합 핵산 229-B1-002은 인간 헵시딘-25, 시노몰거스(cynomolgus) 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22 및 인간 헵시딘-20와 유사한 결합력을 나타냈으나, 마우스 헵시딘(mouse hepcidin)-25, 및 래트 헵시딘(rat hepcidin)-25과는 결합하지 않았다. (도 10 및 11).
A 형 핵산 229-E1-001를 제외하고, 본 발명에 따른 모든 A 형 헵시딘 결합 핵산들은 제 1차 스트레치(the first stretch) 박스 A를 포함한다. A 형 헵시딘 핵산 229-D1-001에서, 박스(Box) A는 3’-편(end)이 제 2차 터미널 스트레치(the second terminal stretch)의 5’-편(end)과 연결되었다 (도 2). 모든 기타 A 핵산들에서, 박스(Box) A 는 5’-편이 제 1차 터미널 스트레치의 3’-편에 연결되었다 (도 1 내지 4). 박스 A를 포함한 A 형 헵시딘 결합 핵산들은 박스 A에 대해서 서열 5’ WAAAGUWGAR 3’을 공유한다. 박스 A 에 대해서 5’ AAAAGUAGAA 3’ 및 5’ AAAAGUUGAA 3’ 서열을 각각 포함하는 A형 헵시딘 결합 핵산들 229-C4-001/236-G2-001 및 236-D1-001 이외에도, 모든 기타 A형 헵시딘 결합 핵산의 박스 Box A의 서열은 5’ UAAAGUAGAG 3’이다.
A 형 헵시딘 결합 핵산 236-D1-001를 제외하고 (도 2 참조), 모든 A형 헵시딘 결합 핵산들은 5’ RGMGUGWKAGUKC 3’ 서열을 갖는 박스 B를 포함한다. A 형 헵시딘 결합 핵산 236-D1-001은 다른 기타 A 형 헵시딘 결합 핵산들의 박스 공통 서열(consensus sequence; 5’ GGGAUAUAGUGC 3’)과 상이한 박스 B를 포함한다. 상슬한 바와 같이, 박스 A를 포함하지 않는 핵산 229-E1-001은 인간 헵시딘-25와 결합하지 않거나 약하게 결합하므로, 박스 B이외에도 박스 A 는 인간 헵시딘-25과의 결합, 특히 인간 헵시딘-25과의 고치환력 결합에 필수적인 것으로 판단된다. A 형 헵시딘 결합 핵산229-D1-001에서, 박스 B 는 5’-편이 제 1차 터미널 스트레치의 3-편(end)에 연결된다 (도 2). 모든 기타 A 형 헵시딘 결합 핵산에서, 박스(Box) B 헵시딘 결합 핵산 229-E1-001에 대해서만 제외 - 3’-편(end)이 제 2차 터미널 스트레치의 5’-편(end)에 연결된다 (도 1, 3 및 4). 박스(Box) B와 상이한 서열을 갖는 헵시딘 결합 핵산들은 인간 헵시딘-25에 높은 결합 친화력을 나타냈다:
a) 229-B1-001 및 유도체, 223-C5-001 및 유도체, 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-F5-001, 223-G4-001, 223-A4-001, 238-E2 : 5’ GGCGUGAUAGUGC 3’;
b) 229-B4-001,229-C2-001, 229-E2-001: 5’ GGAGUGUUAGUUC 3’;
c) 229-G1-001: 5’ GGCGUGAGAGUGC 3’;
d) 229-C4-001, 236-G2-001: 5’ AGCGUGAUAGUGC 3’
e)238-A1-001: 5’ GGCGUGUUAGUGC 3’
f) 236-D1-001: 5’ GGGAUAUAGUGC 3’.
박스(Box) A 및 박스 B를 포함한 헵시딘 결합 핵산들은 10 내지 18개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch)에 의하여 상호 연결된다. 뉴클레오티드의 연결 스트레치(linking stretch)는 5’>3’방향으로, 뉴클레오티드의 제 1 차 연결 서브스트레치 (first linking substretch), 뉴클레오티드의 제 2차 연결 서브스트레치(second linking substretch) 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브스트레치(third linking substretch of nucleotides)을 포함하고, 여기에서, 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 연결 서브스트레치(first linking substretch) 및 제 3차 연결 서브스트레치(third linking substretch)는 상호 선택적으로 혼성화되고, 혼성화가 되면 이중-가닥 구조(double-stranded structure)를 형성한다. 그러나, 상기 혼성화는 상기 분자에 필수적이지는 않다. 만일 뉴클레오티드의 제 1차 연결 서브스트레치 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브스트레치가 서로 혼성화된다면, 서로 혼성화가 되지 않은 뉴클레오티드의 루프(loop)(즉, 제 2차 서브스트레치) 사이에서 생성된다. 헵시딘 결합 핵산 연결 스트레치의 상기 뉴클레오티드 제 1차 연결 서브스트레치 및 뉴클레오티드 제 3차 연결 서브스트레치는 3개 (229-B1-001 및 유도체, 229-G1-001 참고), 4개 (223-C5-001 및 유도체, 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-F5-001, 223-G4-001, 223-A4-001, 229-C2-001, 229-B4-001, 229-E2-001, 238-A1-001, 238-E2-001, 237-A7-001 참조), 5개 (229-D1-001) 또는 6개 (229-C4-001, 236-G2-001) 뉴클레오티드를 포함한다. A 형 결합 핵산 236-D1-001은 18 개 뉴클레오티드들의 뉴클레오티드 연결 스트레치를 포함하며, 여기에서, 상기 뉴클레오티드 연결 스트레치의 특이적 서열은 뉴클레오티드의 제 1 차 연결 서브스트레치 (first linking substretch), 뉴클레오티드의 제 2차 연결 서브스트레치 (second linking substretch) 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브스트레치(third linking substretch of nucleotides)로 분류화되지 않는다.
헵시딘 결합 핵산들인 223-C5-001 및 이의 유도체들, 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-F5-001, 223-G4-001, 238-E2-001 및 223-A4-001에서 나타난 바와 같이, 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 1차 서브스트레치는 5’ GGAC 3’ 또는 5’ GGAU 3’ 또는 5‘ GGA 3’ 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 3차 서브스트레치는 comprises the nucleotide sequence of 5’ GUCC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 1차 및 제 3차 스트레치의 기타 조합들로는:
(a) 5’ GCAG 3’ 및 5’ CUGC 3’ (229-C2-001, 229-B4-001, 229-E2-001, 237-A7-001) 또는
(b) 5’ GAC 3’ 및 5’ GUC 3’ (229-B1-001 및 이의 유도체, 229-G1-001) 또는
(c) 5’ ACUUGU 3’ 및 5’ GCAAGU 3’ (229-C4-001) 또는
(d) 5’ ACUUGU 3’ 및 5’ GCAAGC 3’ (236-G2-001) 또는
(e) 5’ UCCAG 3’ 및 5’ CUGGA 3’ (229-D1-001) 또는
(f) 5’ GGGC 3’ 및 5’ GCCC 3’ (238-A1-001)을 들 수 있다.
도 1, 2, 3 및 4에 나타난 바와 같이, 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 2차 서브스트레치는 3 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 서로 상이한 서열들은 매우 이질성(heterogeneous)을 갖는다: 5’ CGAAA 3’, 5’ GCAAU 3’, 5’ GUAAU 3’, 5’ AAUU 3’, 5’ AUAAU 3’, 5’ AAUA 3’, 5’ CCA 3’, 5’ CUA 3’, 5’ UCA 3’, 5’ ACA 3’, 5’ GUU 3’, 5’ UGA 3’ 및 5’ GUA 3’. 헵시딘 결합 핵산의 연결스트레치의 제 2차 서브스트레치는 하기한 일반적 서열(generic sequence)로 요약될 수 있디: 5’ VBAAW 3’, 5’ AAUW 3’ 또는 5’ NBW 3’.
그러나, 가장 우수한 결합력을 갖는 헵시딘 결합 핵산들은 하기 서열을 갖는 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 2차 서브스트레치를 포함한다:
(a) 5’ AAUU 3’ (229-B1 및 이의 유도체)
(b) 5’ CCA 3’ (223-C5 및 이의 유도체)
(c) 5’ CUA 3’ (223-F5-001)
(d) 5’ UCA 3’ (223-G4-001)
(e) 5’ AAUA 3’ (229-G1-001).
상술한 바와 같이, 연결 스트레치의 제 1차 및 제 3차 서브스트레치의 뉴클레오티드 서열은 상호 관련성을 갖는다. 게다가, 뉴클레오티드 연결 스트레치의 제 2차 서브스트레치의 뉴클레오티드 서열은 헵시딘 결합 핵산 뉴클레오티드의 연결 스트레치의 하기 서열 또는 일반적 서열을 초래하는 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 3차 서브스트레치의 특이적 염기쌍과 관련된다:
(a) 5’ GGACBYAGUCC 3’ (223-C5-001, 223-C5-002, 223-C5-006, 223-C5-007, 223-B5-001, 223-A5-001, 223-A3-001, 223-F5-001, 223-G4-001, 238-E2-001), 바람직하게는 5’ GGACCCAGUCC 3’, 5’ GGACCUAGUCC 3’ 또는 5’ GGACUCAGUCC 3’ 또는 5’ GGACGUAGUCC 3’, 보다 바람직하게는 5’ GGACCCAGUCC 3’, 5’ GGACCUAGUCC 3’ 또는 5’ GGACUCAGUCC 3’; 또는
(b) 5’ GGAUACAGUCC 3’ (223-A4-001); 또는
(c) 5’ GCAGGYAAUCUGC 3’ (229-C2-001, 229-B4-001, 229-E2-001), 바람직하게는 5’ GCAGGUAAUCUGC 3’ 또는 5’ GCAGGCAAUCUGC 3’, 보다 바람직하게는 5’ GCAGGUAAUCUGC 3’; 또는
(d) 5’ GACAAUWGUC 3’ (229-B1-001 및 유도체 229-G1-001), 바람직하게는 5’ GACAAUUGUC 3’ 또는 5’ GACAAUAGUC 3’; 또는
(e) 5’ ACUUGUCGAAAGCAAGY 3’ (229-C4-001, 236-G2-001); 또는
(f) 5’ UCCAGGUUCUGGA 3’ (229-D1-001); 또는
(g) 5’ GGGCUGAGCCC 3’ (238-A1-001); 또는
(h) 5’ GCAGAUAAUCUGC 3’ (237-A7-001); 또는
(i) 5’ GGACCAGUCC 3’ (223-C5-008).
상기한 바와 같이, A 형 결합 핵산 236-D1-001의 뉴클레오티드의 연결 스트레치는 뉴클레오티드의 제 1 차 연결 서브스트레치(first linking substretch), 뉴클레오티드의 제 2차 연결 서브스트레치(second linking substretch) 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브스트레치(third linking substretch of nucleotides)로 분류화되지 않는다. 그러나 A 형 결합 핵산 236-D1-001의 뉴클레오티드의 연결 스트레치 서열은 5’ AUUUGUUGGAAUCAAGCA 3’이다.
A 형 헵시딘 결합 핵산들의 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들은 4개 (예를 들어, 229-C4-001), 5개, (예를 들어. 223-C5-007), 6개 (예를 들어, 229-B1-001) 또는 7개 (예를 들어. 223-C5-001) 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 상기 스트레치들은 선택적으로 상호 혼성화되고, 혼성화가 되면 이중-가닥 구조(double-stranded structure)를 형성한다. 상기 이중가닥 구조는 4 내지 7개 염기쌍으로 구성될 수 있다. 그런, 상기 혼성화가 분자에서 필수적이지는 않다.
시험된 모든 헵시딘 결합 핵산 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들을 조합하면, 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 제 2차 터미널 스트레치에 대한 일반식은 5’ X1X2X3BKBK 3’(뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레티치) and 5’ MVVVX4X5X6 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치)이며, 여기에서
X1는 G 또는 존재하지 않고, X2는 S 또는 존재하지 않고, X3 는V 또는 존재하지 않고, X4 는 B 또는 존재하지 않고, X5 는 S 또는 존재하지 않고 X6는 C 또는 존재하지 않다. 바람직하게는
(a) X1는 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B, X5는 S, 및 X6는 C 또는
(b) X1는 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B, X5는 S, 및 X6는 C 또는
(d) X1는 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B, X5는 S, 및 X6는 존재하지 않거나
(e) X1는 존재하지 않고,X2는 S, X3는 V, X4는 B, X5 는 S, 및 X6는 존재하지 않거나
(f) X1는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V, X4는 B, X5는 S, 및 X6는 존재하지 않거나
(g) X1는 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B, X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않거나
(h) X1는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V 또는 존재하지 않고, X4는 B 또는 존재하지 않고, X5는 존재하지 않고, X6는 존재하지 않다.
그러나, 가장 우수한 결합 친화력을 나타내는 햅시딘 결합 핵산은 뉴클레오티드의 하기한 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치의 조합들을 포함한다:
(a) 223-C5-001, 223-F5-001, 223-G4-001: 5’ GCACUCG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGAGUGC 3’ (뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치);
(b) 229-B1-002: 5’ GCUGUG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CACAGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치);
(c) 229-B1-001, 229-G1-001: 5’ CGUGUG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CACACG 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치);
(d) 229-D1-001: 5’ CGUGCU 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ AGCACG 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치);
(e) 223-C5-006: 5’ CGCGCG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGCGCG 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치)
(f) 229-B1-007: 5’ GCCGUG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CACGGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치)
(g) 229-B1-008: 5’ GCGGUG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CACCGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치)
(h) 229-B1-009: 5’ GCUGCG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGCAGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치)
(i) 229-B1-010: 5’ GCUGGG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CCCAGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치)
(j) 229-B1-011: 5’ GCGGCG 3’ (뉴클레오티드 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGCCGC 3’(뉴클레오티드 제 2차 터미널 스트레치).
스피에겔머 형태로 햅시딘 결합 핵산들의 기능성 향상을 입증하기 위하여, A 형 헵시딘 결합 핵산들 223-C5-001 및 229-B1-002들을 5’-편에 아미노기(Amino-group)를 포함하는 스피에겔머 형태로 합성하였다. 아미노-변형 스피에겔머들(amino-modified spiegelmers)인 223-C5-001-5’-아미노(Amino) 및 229-B1-002-5’-아미노(Amino)기에 40 kDa PEG-부위(moiety)를 A 형 헵시딘 결합 핵산들인 223-C5-001-5’-PEG 및 229-B1-002-5’-PEG과 결합시켰다. 스피에겔머의 합성 및 PEG화(PEGyation)는 실시예 2에 개시되었다.
스피에겔머들인 223-C5-001-5’-PEG 및 229-B1-002의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다(도 12):
223-C5-001-5’-PEG: KD=4.44 nM;
229-B1-002-5’-PEG: KD=1.92 nM.
스피에겔머 223-C5-001-5’-PEG를 헵시딘의 기능을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 시험법으로 저해/길항하는지 여부를 시험하였다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 스피에겔머223-C5-001-5’-PEG는 시험관내에서 페로포르틴(ferroportin)의 헵시딘-유도 하위조절 (hepcidin-induced downregulation)를 저해한다. 스피에겔머 223-C5-001-5’-PEG의 생체 시험적 사용을 위한 적용가능성을 염증성 빈혈에 대한 동물실험 모델에서 시험하고, 여기에서 혈청 철분 감소현상을 유도하기 위한 인간 헵시딘-25의 공지된 특성을 이용하였다 (실시예 5).
1.2. B 형 헵시딘 결합 핵산 (Type B hepcidin binding nucleic acids)
도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 상기 B 형 헵시딘 결합 핵산들은 잠재적으로 헵시딘 결합 모티프(motif)를 한정하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch)를 포함한다.
일반적으로, B 형 헵시딘 결합 핵산들은 뉴클레오티드의 5’-편(end) 및 3’-편 터미널 스트레치들에: 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 제 2차 터미널 터미널 스트레치를 포함한다. 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 터미널 스트레치들은 상호 혼성화될 수 있으며, 여기에서 혼성화되면 이중-가닥 구조를 형성한다. 그러나 상기 혼성화가 분자에서 필수적이지는 않다.
B 형 헵시딘 결합 핵산들의 3개 스트레치들, 즉, 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (the first terminal stretch of nucleotides), 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides) 및 제 2차 터미널 스트레치 (the second terminal stretch of nucleotides)들은 상호 상이하게 배열될 수 있다: 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (central stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 또는 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (central stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides).
상기 한정된 스트레치들의 서열들은 인간 헵시딘, 특히 인간 헵시딘-25에 대한 결합 친화력에 영향을 미치는, B 형 헵시딘 결합 핵산들 사이에 상이할 수 있다. 서로 상이한 B 형 헵시딘 결합 핵산들에 대한 결합분석법에 기초하여 , 하기에 개시된 바와 같이 뉴클레오티드의 중간 스트레치 및 이의 뉴클레오티드 서열은 개별적이고 인간 헵시딘-25에 대한 결합에 특히 바람직하게는 전체로서 필수적이다.
본 발명에 따른 B 형 헵시딘 결합 핵산들을 도 5 및 6에 나타냈다. 이들 모두를 인간 헵시딘-25, 보다 구체적으로는, 각각 비오틴화 (biotinylated) 인간 D-헵시딘-25 및 비오틴화 인간 L-헵시딘-25에 결합하는 능력을 시험하기 위하여 압타머 (aptamers) 또는 스피에겔머 (spiegelmers) 형태로 각각 시험하였다.
B 형 헵시딘 결합 핵산들인 238-D2-001, 238-D4-001, 238-H1-001, 238-A2-001, 238-G2-001, 238-G4-001, 238-G3-001 을 A 형 헵시딘 결합 핵산인 229-B1-001과 대비하여 경쟁적 풀-다운 어세이법(competitive pull-down assay)에서 압타머 형태로 시험하였다. B 형 헵시딘 결합 핵산 238-G4-001만이 A 형 헵시딘 결합 핵산인 229-B1-001과 대비하여 경쟁적 풀-다운 어세이법(competitive pull-down assay)에서 감소된 결합 친화력을 나타냈다 (도 5). B 형 헵시딘 핵산들인 238-D2-001, 238-D4-001, 238-H1-001, 238-A2-001, 238-G2-001 및 238-G3-001들은 A 형 헵시딘 결합 핵산인 229-B1-001과 대비하여 개선된 결합 친화력을 나타냈다 (도 5). B 형 헵시딘 핵산 238-D4-001을 추가로 동정하였다. 스피에겔머 238-D4-001의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다 (KD=0.51nM; 도 5).
B 형 헵시딘 결합 핵산 238-D4-001 유도체들인 238-D4-003, 238-D4-005, 238-D4-007, 238-D4-009, 238-D4-010, 238-D4-011, 및 238-D4-013 들은 경쟁적 풀-다운 어세이법 (또는 표면 플라즈몬 공명측기기 측정법에서)에서 B형 헵시딘 결합 핵산인 238-D4-001과 대비하여 개선된 결합 친화력을 나타냈다 (도 6). 사실상, 헵시딘 결합 핵산들인 238-D4-002, 238-D4-004, 238-D4-006, 238-D4-008 및 238-D4-012은 238-D4-001과 동일한 어세이법 조건으로 시험한 결과 인간 헵시딘과 유사한 결합력을 나타냈다 (도 6). 스피에겔머 238-D4-002, 238-D4-006 및 238-D4-008의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다. 238-D4-001 유도체들의계산된 평형 결합 상수 KD는 238-D4-001 자체와 동일한 범위를 나타냈다 (도 6).
게다가, B 형 헵시딘 결합 핵산들인 238-D4-001 및 238-D4-008 들의 결합 선택성(binding selectivity)을 하기 헵시딘 분자들과 같이 시험하였다: 인간 헵시딘-25, 시노몰거스 헵시딘-25, 마모세트(marmoset) 헵시딘-25 (238-D4-008에 대해서만), 마우스 헵시딘-25, 래트(rat) 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22 ( 238-D4-008에선 아님) 및 인간 헵시딘-20 (도 10 및 11). B 형 헵시딘 결합 핵산 238-D4-001 및 238-D4-008은 인간 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22, 인간 헵시딘-20 및 시노몰거스 헵시딘-25에 대해서는 유사한 결합력을; 마모세트 헵시딘-25에는 보다 낮은 결합력을 나타냈고 마우스 헵시딘-25 및 래트 헵시딘-25에는 결합하지 않았다 (도 10 및 11).
본 발명에 따른 B 형 헵시딘 결합 핵산들은 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch)에 대해서 5’ RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’ 또는 5’ RKAUGGGAKAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’ 서열을 공유한다. 인간 헵시딘-25에 대한 동일한 결합 친화력을 나타내는 B 형 헵시딘 결합 핵산 238-D4-001 및 이의 유도체들은 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch of nucleotides)에 대해서 5’ GUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAG 3’ 서열을 포함하는 공통 서열(consensus sequence)을 공유한다.
B 형 헵시딘 결합 핵산들의 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들은 5개 (238-D4-004, 238-D4-005, 238-D4-008, 238-D4-009), 6개 (238-D4-002, 238-D4-003, 238-D4-006, 238-D4-007, 238-D4-010, 238-D4-011, 238-D4-012, 238-D4-013) 또는 8개 (238-D2-001, 238-D4-001, 238-H1-001, 238-A2-001, 238-G2-001, 238-G4-001, 238-G3-001) 뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서, 상기 스트레치들은 상호 선택적으로 혼성화되고, 혼성화되면 이중-가닥 구조를 형성한다. 상기 이중-가닥 구조는 5 내지 8개 염기쌍으로 구성가능하다. 그러나 상기 혼성화가 분자에서 필수적이지는 않다.
시험된 모든 B형 헵시딘 결합 핵산들의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들을 조합시, 뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치들의 일반식은 5’ X1X2X3SBSBC3’(뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GVBVBX4X5X6 3’(뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치)이며, 여기에서 상기 X1은 A 또는 존재하지 않고, X2는 G 또는 존재하지 않고, X3는 B 또는 존재하지 않고, X4 는 S 또는 존재하지 않고, X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않고, 바람직하게는
(a) X1는 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S, X5는 C, 및 X6는 U 또는
(b) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S, X5는 C, 및 X6는 U 또는
(c) X1는 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S, X5는 C, 및 X6는 존재하지 않거나
(d) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S, X5는 C, 및 X6는 존재하지 않거나
(e) X1는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 B, X4는 S, X5는 C, 및 X6는 존재하지 않거나
(f) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S, X5는 존재하지 않고, X6 는 존재하지 않거나
(g) X1 는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고,,X3 B 또는 존재하지 않고, X4는 S 또는 존재하지 않고, X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는다.
그러나, 가장 우수한 결합력을 갖는 B 형 헵시딘 결합 핵산은 하기한 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들의 조합을 포함한다:
(a) 238-D2-001: 5’ AGCGUGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGUGCGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(b) 238-D4-001: 5’ AGCGUGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCAUGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(c) 238-H1-001: 5’ AGUGUGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GAUGCGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(d) 238-A2-001: 5’ AGUGUGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCAUGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(e) 238-G2-001: 5’ AGCGUGCC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGUGCGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(f) 238-G3-001: 5’ AGCGCGCC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCGCGCU 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치).
(g) 238-D4-002: 5’ GCGCGC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GCGCGC 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치)
(h) 238-D4-006: 5’ GGUGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCAUC 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치)
(i) 238-D4-012:5’ GGCGUC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCGCC 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치)
(j) 238-D4-008: 5’ GCGCC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GGCGC 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치)
(k) 238-D4-004:5’ GGCGC 3’ (뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ GCGCC 3’ (뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치)
스피에겔머 형태로 B 형 헵시딘 결합 핵산의 기능성 향상을 입증하기 위하여, 헵시딘 결합 핵산들 238-D4-002 및 238-D4-008들을 이의 5’-말단(end)에 아미노-기를 포함하는 스피에겔머 형태로 합성하였다. 아미노-변형된(amino-modified) 스피에겔머들인 238-D4-002-5’-아미노(Amino) 및 238-D4-008-5’-아미노(Amino)에게 40 kDa PEG-부위(moiety)를 결합시켜 헵시딘 결합 핵산들인 238-D4-002-5’-PEG 및 238-D4-008-5’PEG을 초래하도록 하였다. 상기 스피에겔머의 합성 및 PEG화는 실시예 2에 개시되었다.
스피에겔머들인238-D4-002-5’-PEG 및 238-D4-008-5’-PEG의 평형 결합 상수 KD 는 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다 (도 12) :
238-D4-002-5’-PEG: 0.53 nM,
238-D4-008-5’-PEG: 0.64 nM.
스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG를 헵시딘의 기능을 시험관 내(in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 시험법으로 저해/길항하는지 여부를 시험하였다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG는 시험관내에서 페로포르틴(ferroportin)의 헵시딘-유도 하위조절 (hepcidin-induced downregulation)를 저해한다. 스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG의 생체 내 시험적 사용을 위한 적용가능성을 염증성 빈혈에 대한 동물실험 모델에서 시험하고, 여기에서 혈청 철분 감소현상을 유도하기 위한 인간 헵시딘-25의 공지된 특성을 이용하였다 (실시예 5, 도 20). 추가적으로, 스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG의 염증성 빈혈에 대한 효과를 또 다른 동물 실험 (시아노몰거스 원숭이)으로 시험하였으며, 여기에서, IL-6는 비-인간 영장류에서의 빈혈을 초래하는 헵시딘 분비를 연속적으로 유도하였다. 상기 실험에서 인간 IL-6는 혈청 철분 농도의 감소를 초래하였다 (실시예 6, 도 21).
1.3. C 형 헵시딘 결합 핵산 ( Type C hepcidin binding nucleic acids )
도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 C 형 헵시딘 결합 핵산들은 잠재적으로 헵시딘 결합 모티프(motif)를 한정하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch)를 포함한다.
일반적으로, C 형 헵시딘 결합 핵산들은 뉴클레오티드의 5’-말단(end) 및 3’-편 터미널 스트레치들에: 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 제 2차 터미널 스트레치를 포함한다. 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치들은 상호 혼성화될 수 있으며, 여기에서 혼성화되면 이중-가닥 구조를 형성한다. 그러나 상기 혼성화가 분자에서 필수적이지는 않다.
C 형 헵시딘 결합 핵산들의 3개 스트레치들, 즉, 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (the first terminal stretch of nucleotides), 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides) 및 제 2차 터미널 스트레치 (the second terminal stretch of nucleotides)들은 상호 상이하게 배열될 수 있다: 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (central stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 또는 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (central stretch of nucleotides) 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides).
상기 한정된 스트레치들의 서열들은 인간 헵시딘, 특히 인간 헵시딘-25에 대한 결합 친화력에 영향을 미치는, C 형 헵시딘 결합 핵산들 사이에 상이할 수 있다. 서로 상이한 C 형 헵시딘 결합 핵산들에 대한 결합분석법에 기초하여 , 하기에 개시된 바와 같이 뉴클레오티드의 중간 스트레치 및 이의 뉴클레오티드 서열은 개별적이고 인간 헵시딘-25에 대한 결합에 특히 바람직하게는 전체로서 필수적이다.
본 발명에 따른 C 형 헵시딘 결합 핵산들을 도 7 및 8에 나타냈다. 이들 모두를 인간 헵시딘-25, 보다 구체적으로는, 각각 비오틴화 (biotinylated) 인간 D-헵시딘-25 및 비오틴화 인간 L-헵시딘-25에 결합하는 능력을 시험하기 위하여 압타머 (aptamers) 또는 스피에겔머 (spiegelmers) 형태로 각각 시험하였다.
C 형 헵시딘 결합 핵산들인 238-C4-001, 238-E3-001, 238-F2-001, 238-A4-001 및 238-E1-001을 A 형 헵시딘 결합 핵산인 229-B1-001과 대비하여 경쟁적 풀-다운 어세이법 (competitive pull-down assay)에서 압타머 형태로 시험하였다. C 형 헵시딘 결합 핵산들이 A 형 헵시딘 결합 핵산인 229-B1-001과 대비하여 증진된 결합 친화력을 나타냈다 (도 7). C 형 헵시딘 핵산 238-C4-001을 추가로 동정하였다. 스피에겔머 238-C4-001의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다 (KD=0.9nM; 도 7).
C 형 헵시딘 결합 핵산 238-C4-001 유도체들인 238-C4-003, 238-C4-004, 238-C4-005, 238-C4-007, 238-C4-008, 238-C4-009, 238-C4-011, 238-C4-012, 238-C4-013, 238-C4-014, 238-C4-024, 238-C4-025 및 238-C4-062 들은 경쟁적 풀-다운 어세이법 (또는 표면 플라즈몬 공명측기기 측정법에서)에서 헵시딘 결합 핵산들인 238-C4-001 또는 238-C4-006 과 대비하여 감소된 결합 친화력을 나타냈다 (도 8). 핵산 238-C4-063은 헵시딘과 결합을 나타내지 않았다. 사실상 헵시딘 결합 핵산들인 238-C4-002, 238-C4-006 및 238-C4-010은 238-C4-001과 동일한 어세이법 조건으로 시험한 결과 인간 헵시딘-25과 유사한 결합력을 나타냈다 (도 8). 스피에겔머 238-C4-002 및 238-C4-006의 평형 결합 상수 KD를 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다. 238-C4-001 유도체들의 계산된 평형 결합 상수 KD는 238-C4-001 자체와 동일한 범위를 나타냈다 (도 8).
게다가, C 형 헵시딘 결합 핵산인 238-C4-006의 결합 특이성(specificity)/선택성(binding selectivity)을 하기 헵시딘 분자들과 같이 시험하였다: 인간 헵시딘-25, 시노몰거스 헵시딘-25, 마모세트(marmoset) 헵시딘-25, 마우스 헵시딘-25, 래트(rat) 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22 및 인간 헵시딘-20 (도 10 및 11). C 형 헵시딘 결합 핵산 238-C4-006은 인간 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22, 인간 헵시딘-20 및 시노몰거스 헵시딘-25에 대해서는 유사한 결합력을; 마모세트 헵시딘-25, 마우스 헵시딘-25 및 래트 헵시딘-25에는 결합하지 않았다 (도 10 및 11).
인간 헵시딘-25에 결합하지 않는 핵산 238-C4-063을 제외하고, 본 발명에 따른 C 형 헵시딘 결합 핵산들은 뉴클레오티드의 중간 스트레치(central stretch)에 대해서 5’ GRCRGCCGGVGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’ 또는 5’ GRCRGCCGGVAGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’ 서열을 공유한다. 동일한 결합 친화력을 나타내는 C형 헵시딘 결합 핵산 238-C4-001 및 이의 유도체들 238-C4-002, 238-C4-005, 238-C4-010 및 C형 헵시딘 결합 핵산들 238-E3-001, 238-F2-001, 238-A4-001, 238-E1-001들은 5’ GRCRGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’, 및 바람직하게는, 5’ GACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUA 3’서열을 포함하는 공통 서열(consensus sequence)을 공유한다.
C 형 헵시딘 결합 핵산들의 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들은 4개 (238-C4-004, 238-C4-011, 238-C4-012, 238-C4-013, 238-C4-014), 5개 (238-C4-003, 238-C4-005, 238-C4-006, 238-C4-007, 238-C4-008, 238-C4-009, 238-C4-010, 238-C4-024, 238-C4-025, 238-C4-062), 6개 (238-C4-002) 또는 7개 (238-C4-001, 238-E3-001, 238-F2-001, 238-A4-001, 238-E1-001) 뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서, 상기 스트레치들은 상호 선택적으로 혼성화되고, 혼성화되면 이중-가닥 구조를 형성한다. 상기 이중-가닥 구조는 4 내지 7개 염기쌍으로 구성가능하다. 그러나 상기 혼성화가 분자에서 필수적이지는 않다.
시험된 모든 C형 헵시딘 결합 핵산들의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들을 조합시, 뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치들의 일반식은 5’ X1X2X3SBSN3’(뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ NSVSX4X5X6 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치)이며, 여기에서 상기 X1은 A 또는 존재하지 않고, X2는 G 또는 존재하지 않고, X3는 R 또는 존재하지 않고, X4 는 Y 또는 존재하지 않고, X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않고, 바람직하게는
(a) X1는 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y, X5는 C, 및 X6는 U 또는
(b) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y, X5는 C, 및 X6는 U 또는
(c) X1는 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y, X5는 C, 및 X6 는 존재하지 않거나
(d) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y, X5는 C, 및 X6는 존재하지 않거나
(e) X1는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R, X4는 Y, X5는 C, 및 X6는 존재하지 않거나
(f) X1는 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y, X5는 존재하지 않고, X6는 존재하지 않거나
(g) X1는 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R 또는 존재하지 않고, X4는 Y 또는 존재하지 않고, X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는다.
그러나, 가장 우수한 결합력을 갖는 C 형 헵시딘 결합 핵산은 하기한 뉴클레오티드의 제 1차 및 제 2차 터미널 스트레치들의 조합을 포함한다:
(a) 238-C4-001, 238-E3-001: 5’ AGGCUCG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGGGCCU 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치),
(b) 238-F2-001: 5’ AGGCCCG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGGGCCU 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치),
(c) 238-A4-001: 5’ AGGCUUG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGAGCCU 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치),
(d) 238-E1-001: 5’ AGACUUG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGAGUCU 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치),
(e) 238-C4-002: 5’ GGCUCG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGGGCC 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치),
(f) 238-C4-006: 5’ GGCCG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGGCC 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치)
(g) 238-C4-010: 5’ GCGCG 3’ (뉴클레오티드들의 제 1차 터미널 스트레치) 및 5’ CGCGC 3’ (뉴클레오티드들의 제 2차 터미널 스트레치).
스피에겔머 형태로 C 형 헵시딘 결합 핵산의 기능성 향상을 입증하기 위하여, 헵시딘 결합 핵산 238-C4-006 을 이의 5’-편(end)에 아미노-기를 포함하는 스피에겔머 형태로 합성하였다. 아미노-변형된(amino-modified) 스피에겔머인 238-C4-006-5’-아미노(Amino)에게 40 kDa PEG-부위(moiety)를 결합시켜 C 형 헵시딘 결합 핵산들인 238-C4-006-5’-PEG.을 초래하도록 하였다. 상기 스피에겔머의 합성 및 PEG화는 실시예 2에 개시되었다.
스피에겔머인 238-C4-006-5’-PEG의 평형 결합 상수 KD 는 표면 플라즈몬 공명기기로 측정하였다 (도 12) :0.76nM.
1.4. 기타 헵시딘 결합 핵산 ( Other hepcidin binding nucleic acids )
도 9에 도시된 바와 같이, A형, B형, 및 C형 헵시딘 결합 핵산들과 관련성이 없는 기타 헵시딘 결합 핵산들은 개시되었다. 이러한 헵시딘 핵산들의 결합 친화력은 A형 헵시딘 결합 핵산 229-G1-001과 비교하여 결쟁정 결합 시험법뿐만 아니라 플라즈몬 공명기기 측정법에 의하여 측정되었다. 모든 핵산들은 A형 헵시딘 결합 핵산 229-G1-001에 비하여 보다 미약한 결합 친화력을 나타냈다 (도 9).
실시예 2. 압타머 및 스피에겔머들의 합성 및 유도체화
소규모 합성법
압타머(d-RNA nucleic acids) 및 스피에겔머들(l-RNA nucleic acids)은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(Phosphoramidite) 화학법 [M.J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Moleculr Biology, Vol. 20 올리고뉴클레오티드 및 유사체를 위한 지시서(Protocols for oligonucleotides and analogs), Ed. S. Agrawal, p 81-114, 마우스a Press Inc. 1993]을 이용한 합성기 (ABI 394 synthesizer; Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA)로 고체-상 합성법 (solid-phase synthesis)으로 생산하였다. D- 및 L- 입체 배위를 갖는 rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, 및 rU- 포스포라미다이트들은 회사 (ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 압타머 및 스피에겔머 등은 겔 전기영동법 (Gel electrophoresis)로 정제하였다.
대규모 합성법 및 개량
스피에겔머들은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(Phosphoramidite) 화학법 (M.J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Moleculr Biology, Vol. 20 올리고뉴클레오티드 및 유사체를 위한 지시서(Protocols for oligonucleotides and analogs), Ed. S. Agrawal, p 81--114, Humana Press Inc. 1993)을 이용한 합성기 (100 synthesizer; Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg)로 고체-상 합성법 (solid-phase synthesis)으로 생산하였다. L-rA (N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU- 포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 5'-아미노-변형체 (amino-modifier)는 회사 (American International Chemicals Inc. Framingham, MA, USA)에서 구입하였다. 상기 비-변형 (unmodified) 스피에겔머의 합성은 L-riboG, L-riboC, L-riboA 또는 L-riboU 개량 CPG (공극 크기, 1000 Å, Link Technology, Glasgow, UK)로 출발하였다. 결합을 위하여 (사이클 당 15 분), 0.3 M 아세토니트릴 중 벤질티오테트라졸 (benzylthiotetrazole; CMS-Chemicals, Abingdon, UK) 및 3.5 당량의 개개 아세토니트릴 중 0.1 M 포스포라미다이트 용액을 사용하였다. 산화-캡핑 사이클 (oxidation-capping cycle)이 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 추가적인 표준 용매 및 시약들은 회사(Biosolve, Valkenswaard, NL)에서 구입하였다. 스피에겔머는 DMT-ON 합성되고; 탈보호화한 후에, Source 15RPC 배양액 (Amersham)을 이용한 프렙 (preparative) RP-HPLC (Wincott F. 등.(1995) Nucleic Acids Res 23: 2677)를 통하여 정제하였다. 상기 5’DMT-기는 80% 초산으로 제거되었다 (실온에서 30분). 연속적으로, 수용성 2 M NaOAc 용액을 가하고 상기 스피에겔머는 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore,Bedford, MA)을 이용한 탄젠셜-유동 여과법 (tangential-flow filtration)으로 탈염을 수행하였다.
스피에겔머의 PEG 화 반응( PEGylation of spiegelmers )
생체 내 (in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간 (plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 스피에겔머를 40 kDa 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 기에 5’-말단에 공유 결합시켰다.
스피에겔머의 5'- PEG 화 반응
PEG화 반응을 위하여 (구체적인 기술적인 PEG화 반응의 방법은 유럽특허 출원 제 1 306 382호를 참고), 정제한 5‘-아미노 개량화 스피에겔머(3’-amino modified Spiegelmer)는 물 (2.5 ml), DMF (5 ml) 및 완충액 A (buffer A; 초산ㆍ1 수화물 [7 g], 붕산 [3.54 g], 인산 [2.26 ml] 및 1 M NaOH [343 ml]를 혼합하고 물을 가하여 1 L의 최종 용량을 만들고; 1 M 염산으로 pH (=8.4)로 적정하였다)의 혼합물에 용해시켰다.
상기 스피에겔머 용액의 pH는 1M NaOH으로 8.4로 적정하였다. 그리고, 40 kDa PEG-NHS 에스테르 ((Jenkem Technology, Allen,TX,USA))를 최대 수율이 75-85%에 도달하도록 0.25 당량의 6 부분 (portions)으로 매 30분씩 37℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH를 상기 PEG-NHS 에스테르의 첨가 중에 1 M NaOH로 8-8.5를 유지토록 하였다.
상기 반응 혼합물을 4 ml 우레아 (urea) 용액 (8 M), 4 ml 완충액 B (수중 0.1 M 트리에틸 암모니움 아세테이트)와 혼합하고 15분간 95℃로 가열하였다. 그리고, 상기 PEG화 스피에겔머를 아세토니트릴 경사법(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)을 이용하여 소스(Source) 15RPC 배양액 (Amersham)으로 RP-HPLC로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C로 용출시키고 PEG화 스피에겔머는 10-15% 완충액 C로 용출시켰다. 95% 이상의 순도 (HPLC로 측정)를 갖는 목적물 분획을 수집하고 40ml 3M NaOAc와 혼합하였다. 상기 PEG화 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법(tangential-flow filtration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore, Bedford, MA)으로 탈염을 수행하였다.
실시예 3. 헵시딘에 대한 결합 상수의 측정(풀-다운 어세이법 )
직접 풀-다운 어세이법( Direct pull - down assay )
헵시딘 결합 핵산들의 친화력은 비오틴화 인간 d-헵시딘-25 (서열 번호 7)에 대하여 압타머 (d-RNA 핵산들) 형태로 풀-다운 어세이 포메트 (pull-down assay format)으로 37℃에서 각각 측정하였다. 압타머들은 [γ-32P]-표지 ATP (Hartmann Analytic, Braunschweig, 독일)을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; Invitrogen, Karlsruhe, 독일)에 의해 5’포스페이트 표지화되었다.
표지 압타머의 특이적 방사능은 200,000 - 800,000 cpm/pmol이었다. 압타머들은 선택용 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4; 137 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 0.1% [w/vol] Tween-20) 중에서 다양한 양의 비오틴화 인간 D-헵시딘과 저농도에서 평형을 도달토록 2-12시간 동안 37℃에서 20 pM에서 변성 (denaturation) 및 재생 (renaturation)후에 배양되었다. 선택용 완충액은 사용된 플라스틱 용기 또는 고정화 매트릭스 (matrix) 표면으로의 결합 파트너들의 흡수를 억제하기 위하여 10㎍/ml 인간 혈청 알부민 (human serum albumin; Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일), 및 10㎍/ml 효모 RNA (Ambion, Austin, 미국)를 첨가하였다. 비오틴화 인간 D-헵시딘의 농도 범위는 32 pM 내지 500 nM으로 조정하고; 총 반응 부피는 1 ml였다. 비오틴화 인간 D-헵시딘 및 비오틴화 인간 D-헵시딘-압타머 복합체는 12㎕ 총 부피에서 선택용 완충액으로 예비-평형화(pre-equilibrated) 및 재현탁된 6㎕ 뉴트아비딘(NeutrAvidin) 또는 스트렙타딘 울트라링크(Streptavidin Ultralink) 첨가 입자 (Plus particles) ((Thermo Scientific, Rockford, USA))상에 고정화시켰다. 상기 입자들을 열 혼합기에서 각각의 온도로 30분간 현탁 상태로 유지하였다. 고정화된 방사능은 상등액을 분리하고 적절한 세척 후에 신틸레이션 계수기 (scintillation counter)로 정량화하였다. 상기 결합의 백분율은 비오틴화 인간 D-헵시딘 농도에 따라 구도되었고 해리상수 (dissociation constants)는 1:1 화학양론으로 추정되는 소프트웨어 알고리즘(software algorithms)을 이용하여 계산되었다 (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey 영국).
압타머 경쟁적 풀-다운 어세이법( Aptamer Competitive pull - down assay )
서로 상이한 헵시딘 결합 핵산의 압타머들을 서로 비교하기 위하여, 경쟁적 서열화 어세이법(competitive ranking assay)이 수행되었다. 상기 목적을 위하여 입수 가능한 가장 근접한 압타머를 방사선으로 표지하고(상기 참조) 표준물질로 제공하였다. 변성 및 재생과정 후에, 경쟁 없이 뉴트라비딘 아가로스 (NeutrAvidin agarose; Thermo Scientific사) 또는 스트렙타비딘 울트라링크 플러스 (Streptavidin Ultralink Plus; Thermo Scientific사) 상에 고정화 후에 세척하고 5-10% 인간 D-헵시딘-25에 결합하도록 하기 위하여 0.8 ml 선택용 완충액으로 37℃에서 배양하였다. 과량의 변성 및 재생된 비표지 (non-labeled) D-RNA 압타머 변이체(aptamer variants)들을 표지된 표준 물질 압타머와 함께 평형 결합반응(parallel binding reactions)을 수행하도록 여러 농도 (예를 들어 10, 50, 및 250 nM)로 첨가하였다. 시험될 상기 압타머들은 목표 결합을 위해 상기 표준 물질 압타머들과 경쟁하였고, 결국, 이들의 결합 특성에 따라서 상기 결합 신호를 감소시켰다. 본 어세이법에서 가장 활성이 강한 압타머는 추후의 압타머 변이체의 비교분석시험을 위해 새로운 표준물질로 제공될 수 있을 것이다.
스피에겔머 경쟁적 풀-다운 어세이법( Spiegelmer Competitive pull - down assay )
추가적으로, 경쟁적 풀-다운 어세이법을 헵시딘 겨합 스피에겔머들의 친화력을 분석하기 위하여 수행하였다. 이러한 목적으로, 비오틴화 인간 L-헵시딘-25에 결합된 스피에겔머을 적용하였다. 스피에겔머의 5-말단(end)에 D-입체배위의 2개의 추가 구아노신 기(guanosine residues)에 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)에 의해 스피에겔머의 방사성 표지(labeliing)를 수행하였다 (상술). 변성 및 재생과정 후에, 상기 표지된 스피에겔머 및 경쟁자 분자(competitor molecule)의 5-배 희석액(0.032 내지 500nM 범위; 헵시딘 또는 스피에겔머의 절단된(truncated) 형태와 같은 헵시딘의 상이한 종류들-하기 참조)을 2-4시간 동안 37℃에서 0.8ml 선택용 완충액중 일정량의 비오틴화 인간 L-헵시딘과 같이 배양하였다. 선택된 펩티드 농도는 가장 적은 경쟁자 농도에서 약 5 - 10% 방사선 표지된 스피에겔머의 최종 결합이 되도록 주의하여야 한다. 경쟁적 풀-다운 어세이법의 하나에서, 과량의 변성 및 재생된 비표지 (non-labeled) L-RNA 스피에겔머 변이체(spiegelmer variants)들을 경쟁자로 제공되었고, 반면에 비변형된(unmodified) 및 PEG화 형태도 시험하였다. 또 다른 어세이법 시도로서, 다양한 종류 (인간 L-헵시딘-25, 시노몰거스 L-헵시딘-25, 마모세트 L-헵시딘-25 또는 래트 L-헵시딘-25와 같은) 유래의 비-비오틴화(non-biotinylated) L-헵시딘-25 또는 비-비오틴화(non-biotinylated) N-터미널 절단된 l-헵시딘-20 및 L-헵시딘-22들은 스피에겔머 결합에 대해서 비오틴화(biotinylated) L-헵시딘과 경쟁하였다. 1.5 - 3㎕ 스트렙타비딘 울트라링크 플러스매트릭스 (Streptavidin Ultralink Plus matrix; Thermo Scientific, Rockford, USA) 상에 비오틴화 L-헵시딘-25 및 결합된 스피에겔머들을 고정화, 세척 및 신틸레이션 판독(scintillation counting)을 한 후에(상기), 결합된 방사선 표지된 스피에겔머의 정상화 백분율(normalized percentage)를 상응하는 경쟁자 분자 농도 구배로 구도화하였다. 얻어진 해리 상수(dissociation constant)는 소프트웨어(GraFit Software)를 적용하여 계산하였다.
실시예 4. 표면 플라즈몬 공명 측정법( Surface Plasmon Resonance Measurement )에 의한 결합력 분석
바이아코아 2000 기기 (Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 비오틴화 인간 D-헵시딘-25에 대한 헵시딘 결합 핵산의 압타머 및 비오틴화 인간 L-헵시딘-20, 인간, 래트 및 마우스 L-헵시딘-25에 대한 헵시딘 결합 핵산의 스피에겔머들의 결합력 분석을 수행하였다.
기기는 37°C의 지속온도로 맞추었다. 개개 실험 시작 전에, 비아코아(Biacore)를 제조사의 사용지시 내용에 따라 DESORB 방법을 이용하여 세척하였다. 유지용 칩(maintenance chip)을 도킹(docking)시킨 후에, 기기를 연속적으로 DESORB 용액 1 (0.5% 소듐 도데실 설페이트, SDS), DESORB 용액 2 (50 mM 글리신, pH 9.5) 및 최종적으로 가스제거(degassed) 물(MilliQ water)을 제공받았다. 연속적으로 SANATIZE 방법을 0.1M NaOCl으로 수행하고 다음에 상기 시스템에 물(MilliQ water)을 제공하였다.
인간, 래트 및 마우스 L-헵시딘 25뿐만 아니라 비오틴화(biotinylated) 인간 D-헵시딘 25, 인간 L-헵시딘 20 (모든 펩티드는 BACHEM에서 구입, 통상적 합성법) 을 스크류 록 바이알(screw lock vial) 중 1mM 농도로 1 mg/ ml 지방산-제거 BSA와 함께 물에 용해하고 사용 전까지 4°C에서 보관하였다.
센서 칩(sensor chip)을 카르복실메틸화(carboxymethylated) 덱스트란 메트릭스(dextran matrix) (Sensor Chip CM5, GE, BR-1000-14)로 도킹(docking)시킨 후에, 비아코아 기기(Biacore instrument)에 물(MilliQ water)을 제공한 후에 HBS-EP 완충액 (0.01 M HEPES 완충액 [pH 7.4], 0.15 M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20; GE, BR-1001-88)를 제공하고 안정된 기저선이 관찰될 때까지 평형화시켰다. 유동 세포들 (FCs)을 유동세포 4로 시작하여 유동세포 1로 다른 유동 세포들에 대한 펩티드들의 오염을 방지시키기 위하여 고정화시켰다.
수중 0.4M EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(GE,BR-1000-50) 및 수중 0.1M NHS (N-히드록시숙시니미드(GE,BR-1000-50)의 100 1:1 혼합물을 유속 (10/min)에서 QUICKINJECT 코멘드 (command)를 이용하여 주사하였다. 유동 세포의 활성화를 NHS/EDC 주사 후 (전형적으로CM5 칩에 대하여 500-600 RU) RU상의 증가율을 측정하였다.
수용성 뉴트라비딘(Neutravidin)을 1 mg/ml 농도로 물에 용해시키고, 50㎍ /ml으로 HBS-EP로 희석시키고 연속적으로 유속 (10/min)에서 MANUALINJECT 코맨드 (command)을 이용하여 주사하였다. 공유결합성으로 고정화된 뉴트라비딘의 관찰된 최대양은 약 10.000 15.000 RU이다. 유동 세포들을 10㎕/min의 유속으로 70㎕ 1 M 에탄올아민 염산염(ethanolamine hydrochloride) (GE, BR-1000-50)을 주사하여 차단하고; 전형적으로 비-공유결합성으로 결합된(Non-covalently coupled) 펩티드/단백질을 이러한 공정으로 제거된다. 비-공유결합성으로 결합된 뉴트라비딘을 10-30㎕ 50 mM NaOH 용액을 주사하여 제거하였다. 비오틴화 인간 D-헵시딘 25, 인간 L-헵시딘 20, 뿐만 아니라 인간, 래트 및 마우스 L-헵시딘 25를 HBS-EP 완충액으로 10-20 nM 최종농도로 희석하고 즉시 진탕하였다. 1000㎕ 상기 시료를 Ø 9 mm(직경) 유리 바이알 (Glass Vials, Ø 9 mm, GE, BR-1002-07)로 옮기고 유속 (10㎕/min)에서 MANUALINJECT 코맨드 (command)을 이용하여 주사하였다. 결합 시험을 위하여, 5000 반응 단위(response units; RU)까지의 비오틴화 인간 D-헵시딘 25, 인간 L-헵시딘 20 뿐만 아니라 인간, 래트 및 마우스 L-헤시딘 25를 동력학적 평가를 위하여, 500 - 1500 RU 범위를 유동 세포에 고정화시켰다. 연속적으로 유동세포를 비오틴화 인간 D-헵시딘 25, 인간 L-헵시딘 20 뿐만 아니라 인간, 래트 및 마우스 L-헵시딘과 비아코아 튜빙(Biacore tubing) 및 기타 표면과의 비특이적 상호 방응으로 기인한 비오틴화 인간 D-헵시딘 25, 인간 L-헵시딘 20 뿐만 아니라 인간, 래트 및 마우스 L-헵시딘의 오염을 방지하고자 1 M NaCl (Ambion, Cat.No.AM9759)으로 세척하였다. FC1 는 유동세포를 조절하기 위한 차단용 대조군(blocked control)으로 제공되었다.
최종적으로, 모든 센서 유동세포들 (sensor flow cells; FC1로부터 시작하여 FC4까지)을 20㎕/분의 유속으로 HBS-EP 완충액중에서 1:10으로 희석한 20㎕ 포화 비오틴 용액(biotin solution; Biotin, Sigma-Aldrich B-4501 Lot 68H1373)을 주사함으로서 차단되었다. 상기 센서 칩(sensor chip)에 가스제거 유출 완충액 (running buffer; 20mM Tris pH 7.4; 150mM NaCl; 5mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2 및 0.1% Tween20)을 2회 제공하고 기저선이 안정할 때까지 30㎕/m에서 평형화시켰다.
전형적으로 분석적 목적으로, 헵시딘 결합 핵산의 압타머/스피에겔머들을 100μM (UV 측정법으로 정량) 스톡 농도(stock concentration)로 물로 희석하고, 수조 또는 열 교환기에서 30초간 95°C로 가열하고 균질한 용해물을 얻기 위하여 얼음으로 냉각시켜 반응를 중지시켰다.
동력학적 매개변수 및 해리 상수를 유출 완충액으로 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63 , 7.8 , 3.9 및 0 nM 으로 희석시킨 일련의 압타머 주사로 측정하였다. 모든 실험에서, 분석을 회합 시간(association time) 360초 및 해리시간(dissociation time) 360초씩으로 30㎕/분의 유속으로 정의한 킨젝트 커맨드 (Kinject command)를 사용하여 37°C에서 수행하였다. 상기 어세이법은 이중으로 조정하고 반면에 FC1은 (차단된) 표면 대조군(surface control)으로 사용하고 (개개 압타머 농도의 부피 기여도) 및 분석대상물이 없는 일련의 완충액 주사는 완충액 자체의 부피 기여도를 결정한다. 데이터 분석 및 해리 상수 (dissociation constants; KD) 계산은 랑무어 (Langmuir) 1:1 화학양론적 적정 알고리즘 (stochiometric fitting algorithm)을 이용한 소프트웨어 (BIAevaluation 3.0 BIACORE AB, Uppsala, Sweden)으로 완성되었다.
실시예 5. 헵시딘 결합 스피에겔머에 의한 페로포르틴의 인간 및 마우스 헵시딘 -유도 하위 조절의 저해
방 법
J774.1 세포 (마우스 단핵구-대식세포, 구입처: DSMZ, Braunschweig)를 10% 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유한 글루타맥스(Glutamax; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)와 함께 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium: DMEM)에서 37°C 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 실험을 위하여 세포를 2ml 배지에서 7.3x105 세포/웰(well)(2x105cells/cm2)이 농도로 12-웰 플레이트에 접종하였고 37°C 및 5% CO2 조건하에서 몇 시간동안 배양하였다. 세포부착 후에, 세포를 1 부분(part) 의 수중 0.3M FeCl3과 2 부분의 0.3M NTA (nitrilotriacetate)를 혼합하고 DMEM으로 1:10으로 희석함으로서 제조된 20㎕ Fe-NTA-용액을 철분과 함께 첨가하였다.
세포를 상기한 바와 같이 하룻밤 배양하였다. 그 다음날, 자극용 용액(stimulation solution)을 인간 헵시딘을 함유한 DMEM에서 제조하고 목적하는 스피에겔머인 경우는 (하기에 첨가할 스피에겔머 개시) 개개를 의도된 최종농도(5X)로 제조하여 30분 동안 37°C에서 전배양(preincubation)을 수행하였다. 0.5ml 상기 용액을 12-웰 플레이트에 첨가하였다. 자극 3시간 후에, 배지를 제거하고 세포들을 1ml 빙-냉 인산 완충액 염(phosphate buffered saline; PBS)으로 재빨리 세척하였다. 그리고 세포를 1ml 냉 PBS로 웰에서 훔쳐 닦아 내고 미리-냉각된 에펜도르프 튜브(Eppendorftube)에서 회수하였다. 4°C에서 500g로 5분간 원심분리한 후에, 상등액을 제거하고 펠렛을 75㎕ 용해 완충액(lysis buffer) (Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100 및 프로테아제-저해제(프로테아제 저해제 칵테일 정제, Roche#11873580001)로 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 드라이 아이스로 냉동시키고, 해동하고, 완전하게 진탕하고 4°C에서 1000g로 10분간 원심분리를 수행하였다. 상기 용해 상등액들을 회수하여 다음 분석에 사용하기 전까지 80°C에서 보관하였다.
단백질 측정을 빈신코니닌 산 방법(bicinchoninic acid method)을 이용하여 수행하였다. 20㎍ 단백질을 함유한 용해물 양을 2X 시료 완충액 (125 mM Tris/HCl, pH 6.8; 20% 글리세롤; 4% SDS; 0.02% 브로모페놀블루)과 혼합하고 37°C에서 10분간 배양하였다. 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gels) 상에서 분리하고 HybondECL 미트로셀룰로오스(nitrocellulose) 또는 Hybond-P PVDF 멤브레인(membranes) (GE Healthcare, Munich, 독일)상에서 전기블롯(electroblotting)으로 전달하였다. 블롯을 수행한 후에, 상기 멤브레인을 단밸질 적재 및 운반을 위한 대조군으로서 시약(Ponceau-red; 0.2% 3% 트리클로로아세트산 중)으로 염색하였다. 페로포르틴(Ferroportin)을 진단기기 (토끼 항-마우스 페로포르틴 항체; rabbit anti-mouse ferroportin antibody; Alpha Diagnostics, #MTP11-A); 및시약 (LumiGloR chemiluminescent reagent; Cell Signaling Technology, Frankfurta. M., 독일) 및 필름(HyperfilmTM ECL chemiluminescence films; GE Healthcare, Munich, 독일)을 이용하여 항-토끼-IgG-HRP-접합체(conjugate)( (New England Biolabs, Frankfurt a.M., 독일)로 검출하였다.
결 과
인간 헵시딘 또는 헵시딘 + 개개 스페에겔머로 자극 후에 J774.1 세포들로부터 얻은 용해물을 전기영동(SDS-gel electrophoresis)으로 분리하고 마우스 페로포르틴 항체를 이용한 분석법(Western Blot)으로 분석하였다.
Fe/NTA로 J774.1 세포를 처리하면 페로포르틴 발현의 실질적인 상위-조절 ( up-regulation)을 초래한다. 이러한 효과는 3시간 동안 100 nM 인간 헵시딘-25로 상기 세포를 자극시킴으로서 상당히 역전된다. 이러한 렙시딘 효과는 헵시딘을 스피에겔머 226-C5-001-5’-PEG, 238-D4-008-5’-아미노(Amino) 및 238-D4-008-5’-PEG (=NOX-H94)으로 전-배양시 차단된다.
도 17A: 처치하지 않은 세포 (레인(lane) 1)에서 간신히 검출되는 페로포르틴 (화살머리; arrowhead)은 Fe/NTA으로 처치에 의하여 상위-조절된다 (레인 2, 3). 100 nM 인간 헵시딘-25 (HEP)는 페로포리틴의 하위 조절(down regulation)을 초래하고 (레인 4, 5) 이어한 효과는 스피에겔머 226-C5-001 (C5-PEG)에 의하여 강력하게 조절가능하다 (레인 6, 7).
도 17B: 인간 헵시딘은 Fe/NTA 처치된 J774.1 세포에서 페로포르틴의 하위 조절을 초래한다 (레인 6, 7). 이러한 효과는 인간 헵시딘-25은 스피에겔머 NOX-H94 (레인 12 - 15) 및 238-D4-008-5’-PEG (=NOX-H94)의 아미노-변형된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 매개체 (intermediate)인 스피에겔머 HEP-238-D4-008 (레인 8 - 11)에 의하여 강력하게 저해될 수 있다.
실시예 6. 헵시딘 결합 스피에겔머의 생체내 ( in vivo ) 활성
만성 질환에 의한 빈혈에 대한 최근 개념은 헵시딘 합성 및 분비가 간세포에서의 전구-염증 시토킨(pro-inflammatory cytokines), 특히 IL-6에 의하여 자극된다는 것이다. 헵시딘은 철분 수송체(iron transporter)인 페로포르틴을 발현하는 서로 다양한 세포들과 결합한다. 이러한 상호 반응은 헵시딘-페로포르틴 복합체 (hepcidin-ferroportin complex)의 내부화(internalisation) 및 분해를 유도하고 혈청 철분 감소증을 초래한다. 혈청 철분의 만성 감소증 (chronic reduction)은 적혈구생성작용을 부정적으로 손상시키고 결국은 빈혈증으로 나타난다. 마우스에서의 혈청 철분 감소증을 유발하는 인간 헵시딘-25의 공지된 특성을 (Rivera, 2005) 염증성 빈혈 실험 모델로서 사용되었다. 스피에겔머들의 활성을 시험하기 위하여, 저철혈증 (hypoferremia)의 생체내 상태를 인간-헵시딘 -25로 C57BL/6 마우스에서 유도하였다. 이러한 실험 모델에서 스피에겔머들을 특성화하기 위하여 동물들에게 hu-헵시딘(hepcidin)의 효과를 차단시키기 위해 상기 스피에겔머로 예방적 처치를 수행하였다.
방 법
항-헵시딘 스피에겔머 (anti-hepcidin spiegelmer)(10-20ml/kg 체중) 또는 운송체(vehicle)(5% 글루코스, 10-20ml/kg 체중)을 암컷 C57Bl/6 마우스 (Elevage Janvier, 프랑스, 6주령, n=6-7/군)에게 단회 정맥주사를 수행하였다.
30분 후에, 1-2mg/kg 체중의 양으로 합성 인간 헵시딘-25 (Bachem, WeilamRhein, 독일, Cat No. H-5926)을 복강주사하였다(10ml/kg 체중). 혈액을 헵시딘-주사 2시간후에 채혈하였다. 혈청 및 혈장 시료를 철분 측정 (iron determination) 및 완전 혈액 판독(blood count)을 위해 각각 수득하였다. 개개 동물에 대해서, 혈청 철분(serumiron), 헤모글로빈(haemoglobin), 헤마토크릿(hematocrit), 백혈구판독(whitebloodcellcount), 적혈구 판독(erythrocyte count), 적혈구 판독(thrombocyte count), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume), 및 평균 적혈구혈색소(mean corpuscular haemoglobin) 수치들을 측정하였다.
합성 인간-헵시딘-25 주사는 혈청 철분의 급속한 감소를 초래한다. 주사 1시간 후에, 상기 혈청 철분 농도는 운송체 처치 마우스(vehicle treated mice) 군의 수치의 56 %로 감소하였다. 이러한 생채내 실험 결과는 보다 높은 농도의 헵시딘을 유사한 실험을 한 약 25%의 감소율을 보고한 문헌(Ribera et al.)에 공개된 데이터와 일치한다. 혈청 철분상의 감소는 도 9에 나타낸 바와 같이, 인간 헵시딘주사 전에 스피에겔머 223-C5-001-5’-PEG를 적용함으로서 거의 완전하게(대조군 대비 98%) 차단된다. 동일한 효과가 도 20에 나타난 바와 같이, 239-D4-008-5’-PEG 적용시에도 관찰되었다.
실시예 7. 인간 인터루킨( interleukin )-6으로 자극시킨 시노몰거스 ( cynomolgus ) 원숭이에서의 헵시딘 결합 스피에겔머의 활성
만성 질환에 의한 빈혈에서 인터류킨(interleukin)-6의 주요한 역할이 IL-6 수용체 항체 토실리주맙(tocilizumab) 처치에 의하여 입증되었다. 이러한 항체의 처치는 캐슬만 병(Castleman disease) 환자(Nishimoto,2008) 및 시노몰거스 원숭이에서의 관절염 실험 모델에서 모두 유효성을 나타냈다 (Hashizume,2009). 비-인간 영장류에서의 빈혈증을 초래하는 연속적인 헵시딘 분비를 유도하는 IL-6의 공지된 특성은 염증성 빈혈에 대한 또 다른 실험 모델로서 이용되었다(Asano,1990;Klug1994). 매개변수인 헤모글로빈(haemoglob), 혈청 철분 양을 항-헵시딘 스피에겔머(anti-hepcidin spiegelmers)로서의 유효성을 나타내는 최종기준으로 선택하였다. 인간-재조합(human-recombinant) IL-6으로 시노몰거스 원숭이에게 저철혈증 (hypoferremia)을 유도하였다. 이 실험 모델은 다른 모든 실험에서 합성 인간 헵시딘에서 사용된 바와 같이, 항-헵시딘 스피에겔머가 내인성 헵시딘과도 결합함을 입증하는 데 중요하다. 스피에겔머들의 활성을 시험하기 위하여, 저철혈증의 생체내 상태가 인간-재조합(human-recombinant) IL-6으로 시노몰거스 원숭이에게 유도되어다. 상기 실험 모델에서의 스페에겔머를 특성화하기 위하여, 동물들에게 시노몰거스-헵시딘(cynomolgus-hepcidin)의 효과를 차단시키기 위해 상기 스피에겔머로 예방적 처치를 수행하였다.
방 법
항-헵시딘 스피에겔머 (anti-hepcidin spiegelmer)(1ml/kg 체중) 또는 운송체(vehicle)(5% 글루코스, 1ml/kg 체중)을 숫컷 시노몰거스 원숭이(Roberto C. Hartelust, Tilburg, 네덜란드, 34 내지 38, n=3/군)에게 단회 정맥주사를 수행하였다.
30분 후에, 1-2mg/kg 체중의 양으로 10㎍/kg 양의 재조합 인간 IL-6 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, 독일)을 피하주사하였다(1ml/kg 체중). 혈액을 IL-6 주사 8시간 후에 채혈하였다. 혈청 및 혈장 시료를 철분 측정 (iron determination) 및 완전 혈액 판독(blood count)을 위해 각각 수득하였다. 개개 동물에 대해서, 혈청 철분(serum iron), 헤모글로빈(haemoglobin), 헤마토크릿(hematocrit), 백혈구판독(white blood cell count), 적혈구 판독(erythrocyte count), 적혈구 판독(thrombocyte count), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume), 및 평균 적혈구혈색소(mean corpuscular haemoglobin) 수치들을 측정하였다.
결 론
재조합 인간 IL-6 주사는 혈청 철분의 감소를 초래한다. 주사 8시간 후에, 상기 혈청 철분 농도는 운송체/IL-6 처치 마우스(vehicle/IL0-6 treated mice) 군의 사전선량(predose) 수치의 27 %로 감소하였다. 이러한 혈청 철분상의 감소는 도 21에 나타낸 바와 같이, 인간 IL-6 주사 전에 스피에겔머 238-D4-008-5’-PEG를 적용함으로서 완전하게 차단된다.
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aaaugaggag uuggaggaag ggcauc 46 <210> 147 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 147 ggugucguau gggauaagua aaugaggagu uggaggaagg gcauc 45 <210> 148 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 148 gcgccguaug ggauuaagua aaugaggagu uggaggaagg gcgc 44 <210> 149 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 149 gcgccguaug ggauaaguaa augaggaguu ggaggaaggg cgc 43 <210> 150 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 150 ggcgccguau gggauuaagu aaaugaggag uuggaggaag ggcgcc 46 <210> 151 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 151 ggcgccguau gggauaagua aaugaggagu uggaggaagg gcgcc 45 <210> 152 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 152 ggcgucguau gggauuaagu aaaugaggag uuggaggaag ggcgcc 46 <210> 153 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 153 ggcgucguau gggauaagua aaugaggagu uggaggaagg gcgcc 45 <210> 154 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 154 ggcucggaca gccgggggac accauauaca gacuacgaua cgggcc 46 <210> 155 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 155 gcucggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac gggc 44 <210> 156 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 156 cucggacagc cgggggacac cauauacaga cuacgauacg gg 42 <210> 157 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 157 gacaauaguc 10 <210> 158 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 158 gcccggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac gggc 44 <210> 159 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 159 ggccggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac ggcc 44 <210> 160 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 160 gcggagacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauau ccgu 44 <210> 161 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 161 aggcugacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauag gccu 44 <210> 162 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 162 ggccugacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauaa ggcu 44 <210> 163 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 163 gcgcggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac gcgc 44 <210> 164 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 164 gccggacagc cgggggacac cauauacaga cuacgauacg gc 42 <210> 165 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 165 ggcggacagc cgggggacac cauauacaga cuacgauacg cc 42 <210> 166 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 166 ggccgacagc cgggggacac cauauacaga cuacgauagg cc 42 <210> 167 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 167 gcgcgacagc cgggggacac cauauacaga cuacgauagc gc 42 <210> 168 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 168 ggccggacag ccggaggaca ccauauacag acuacgauac ggcc 44 <210> 169 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 169 ggccggacag ccggcggaca ccauauacag acuacgauac ggcc 44 <210> 170 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 170 ggccggacag ccgggaggac accauauaca gacuacgaua cggcc 45 <210> 171 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 171 gcuguguaaa guagaggaca auugucggcg ugauagugcc acagc 45 <210> 172 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 172 gcacucguaa aguagaggga cccaguccgg cgugauagug ccgagugc 48 <210> 173 <211> 45 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 173 gcuguguaaa guagaggaca auugucggcg ugauagugcc acagc 45 <210> 174 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 174 ggccggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac ggcc 44 <210> 175 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 175 gcgcgcguau gggauuaagu aaaugaggag uuggaggaag gcgcgc 46 <210> 176 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 176 gcgccguaug ggauuaagua aaugaggagu uggaggaagg gcgc 44 <210> 177 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 177 ccauacggcg c 11 <210> 178 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 178 gcgcccuucc ucc 13 <210> 179 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 179 gcgcgcguau gggauuaagu aaaugaggag uuggaggaag gcgcgc 46 <210> 180 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 180 gcgccguaug ggauuaagua aaugaggagu uggaggaagg gcgc 44 <210> 181 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 181 ggccggacag ccgggggaca ccauauacag acuacgauac ggcc 44 <210> 182 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 182 rkaugggaku aaguaaauga ggrguwggag gaar 34 <210> 183 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 183 rkaugggaka aguaaaugag grguwggagg aar 33 <210> 184 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 184 guaugggauu aaguaaauga ggaguuggag gaag 34 <210> 185 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 185 grcrgccggv ggacaccaua uacagacuac kaua 34 <210> 186 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 186 grcrgccgga rggacaccau auacagacua ckaua 35 <210> 187 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 187 gacagccggg ggacaccaua uacagacuac gaua 34 <210> 188 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 188 waaaguwgar 10 <210> 189 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 189 rgmgugwkag ukc 13 <210> 190 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 190 gggcugagcc c 11 <210> 191 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 191 gcagauaauc ugc 13 <210> 192 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 192 ggaccagucc 10 <210> 193 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 193 ggacccaguc c 11 <210> 194 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 194 ggaccuaguc c 11 <210> 195 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 195 ggacucaguc c 11 <210> 196 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 196 gcagguaauc ugc 13 <210> 197 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 197 gcaggcaauc ugc 13 <210> 198 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 198 gacaauuguc 10 <210> 199 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 199 uaaaguagag 10 <210> 200 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 200 aaaaguagaa 10 <210> 201 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 201 aaaaguugaa 10 <210> 202 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 202 gggauauagu gc 12 <210> 203 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 203 ggcgugauag ugc 13 <210> 204 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 204 ggaguguuag uuc 13 <210> 205 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 205 ggcgugagag ugc 13 <210> 206 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 206 agcgugauag ugc 13 <210> 207 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 207 ggcguguuag ugc 13 <210> 208 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 208 ggacbyaguc c 11 <210> 209 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 209 ggauacaguc c 11 <210> 210 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 210 gcaggyaauc ugc 13 <210> 211 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 211 gacaauwguc 10 <210> 212 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <223> L-RNA <400> 212 acuugucgaa agcaagyu 18

Claims (99)

  1. 헵시딘에 결합가능한 핵산.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 핵산은 헵시딘의 길항제인 핵산.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 핵산은 헵시딘-페로포르틴 계의 저해제인 핵산.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치, 뉴클레오티드의 중간 스트레치 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치를 포함하며, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 32 내지 40개 뉴클레오티드, 바람직하게는 32 내지 35 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치, 뉴클레오티드의 중간 스트레치 및 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치를 포함하며, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 32 내지 40개 뉴클레오티드, 바람직하게는 32 내지 35 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 헵시딘과의 결합에 필수적인 것인 핵산.
  7. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’ 또는 5’ RKAUGGGAKAAGUAAAUGAGGRGUWGGAGGAAR 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  8. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ RKAUGGGAKUAAGUAAAUGAGGRGUUGGAGGAAR 3’, 바람직하게는 5’ GUAUGGGAUUAAGUAAAUGAGGAGUUGGAGGAAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조(double-stranded structue)가 형성되며, 여기에서
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5 내지 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5 내지 8개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 5개 내지 8개 염기쌍으로 구성되는 것인 핵산.
  11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기 X1은 A 또는 존재하지 않으며, X2는 G 또는 존재하지 않으며, X3는 B 또는 존재하지 않으며, X4는 S 또는 존재하지 않으며; X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않는 것인 핵산.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVBX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
    (c) X1은 A, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  13. 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGUC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGUGCGCU 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUGCU 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGUGUGUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GAUGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGUGUGUC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (e) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGUGCC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGUGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (f) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGCGCGCC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGCGCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  14. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 B, X4는 S; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
    (c) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 B, X4는 S; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  15. 제 7항 내지 제 11항 및 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSBC3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GVBVYX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 B 또는 존재하지 않고, X4는 S 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  16. 제 15항에 있어서,
    (a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCGC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GCGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGUGUC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCAUC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCGUC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GGCGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (e) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCGC 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ GCGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  17. 제 7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 115 내지 119, 서열번호 121, 서열번호 142, 서열번호 144, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호. 151, 서열번호 152, 서열번호 175 또는 서열번호 176 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  18. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ GRCRGCCGGVGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’ 또는 5’ GRCRGCCGGARGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  19. 제 4항 내지 제 6항 및 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5’ GRCRGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACKAUA 3’, 바람직하게는, 5’ GACAGCCGGGGGACACCAUAUACAGACUACGAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며, 여기에서
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 4 내지 7개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 4 내지 7개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 이중가닥 구조는 4개 내지 7개 염기쌍으로 구성되는 것인 핵산.
  22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기 X1은 A 또는 존재하지 않으며, X2는 G 또는 존재하지 않으며, X3는 R 또는 존재하지 않으며, X4는 Y 또는 존재하지 않으며; X5는 C 또는 존재하지 않고 X6는 U 또는 존재하지 않는 것인 핵산.
  23. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 U이거나, 또는
    (c) X1은 A, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  24. 제 18항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCUCG 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (b) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCCCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCCU 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (c) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGGCUUG 3’ 의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGCCU 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는,
    (d) 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ AGACUUG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGUCU 3’.의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  25. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않고, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R, X4는 Y; X5는 C이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
    (c) X1은 존재하지 않고, X2는 G, X3는 R, X4는 Y; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  26. 제 18항 내지 제 22항 및 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCUCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  27. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3SBSN3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ NSVSX4X5X6 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
    여기에서, 상기
    X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 R 또는 존재하지 않거나, X4는 Y 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  28. 제 18항 내지 제 22항 및 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GGCCG 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGGCC 3’의 뉴클레오티드를 포함하거나 또는
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  29. 제 1항 내지 제 6항 및 제 18항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,상기 핵산은 서열번호 122 내지 126, 서열번호 154, 서열번호 159, 서열번호 163, 또는 서열번호 174 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  30. 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 중간 스트레치는 5‘->3’ 방향으로 하기한 뉴클레오티드: 박스 A, 뉴클레오티드의 연결 스트레치 및 박스 B이며 여기에서 상기 박스 A는 5’ WAAAGUWGAR 3’을 포함하고; 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치는 10개 내지 18개 뉴클레오티드를 포함하고 상기 박스 B는 5’ RGMGUGWKAGUKC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 박스 A는 5’ UAAAGUAGAG 3’, 5’ AAAAGUAGAA 3’, 5’ AAAAGUUGAA 3’ 및 5’ GGGAUAUAGUGC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열; 바람직하게는 상기 박스 A 는 5’ UAAAGUAGAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서, 상기 박스 B는 5’ GGCGUGAUAGUGC 3’, 5’ GGAGUGUUAGUUC 3’, 5’ GGCGUGAGAGUGC 3’, 5’ AGCGUGAUAGUGC 3’ 및 5’ GGCGUGUUAGUGC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열; 바람직하게는 상기 박스 B 는 5’ GGCGUGAUAGUGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  33. 제 30항 내지 제 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치는 5‘->3’ 방향으로 뉴클레오티드의 제 1차 연결 서브 스트레치, 뉴클레오티드의 제 2차 연결 서브 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브 스트레치를 포함하고, 여기에서 바람직하게는, 상기 제 1차 연결 서브 스트레치 및 제 3차 연결 서브 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 상기 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되는 것인 핵산.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 연결 서브 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 3차 연결 서브 스트레치는 상호 독립적으로 3개 내지 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 이중 가닥 구조는 3개 내지 6개의 염기쌍으로 구성되는 것인 핵산.
  36. 제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GGAC 3’, 5’ GGAU 3’ 및 5’ GGA 3’로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUCC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (b) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GCAG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ CUGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (c) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GGGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GCCC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (d) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GAC 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (e) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ ACUUGU 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GCAAGU 3’ 및 5’ GCAAGC 3’ 으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (f) 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ UCCAG 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ CUGGA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    바람직하게는, 상기 뉴클레오티드의 1차 연결 서브스트레치는 5’ GAC 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 3차 연결 서브스트레치는 5’ GUC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  37. 제 33항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2차 연결 서브 스트레치는 3개 내지 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  38. 제 33항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ VBAAW 3’, 5’ AAUW 3’ 및 5’ NBW 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ VBAAW 3’, 바람직하게는, 5’ CGAAA 3’, 5’ GCAAU 3,’ 5’ GUAAU 3’ 및 5’ AUAAU 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  40. 제 38항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ AAUW 3’, 바람직하게는, 5’ AAUU3’ 또는 5’ AAUA 3’, 보다 바람직하게는, 5’ AAUA 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  41. 제 38항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 2차 연결 서브스트레치는 5’ NBW 3’, 바람직하게는, 5’ CCA 3’, 5’ CUA 3’, 5’ UCA 3’, 5’ ACA 3’, 5’ GUU 3’, 5’ UGA 3’ 및 5’ GUA 3’, 보다 바람직하게는 5’ CCA 3’, 5’ CUA 3’, 5’ UCA 3’, 5’ ACA 3’ 및 5’ GUU 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  42. 제 30항 내지 제 41항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 연결 스트레치는 5’ GGACBYAGUCC 3’, 5’ GGAUACAGUCC 3’, 5’ GCAGGYAAUCUGC 3’, 5’ GACAAUWGUC 3’, 5’ ACUUGUCGAAAGCAAGYU 3’, 5’ UCCAGGUUCUGGA 3’, 5’ GGGCUGAGCCC 3’, 5’ GCAGAUAAUCUGC 3’ 및 5’ GGACCAGUCC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된, 바람직하게는, 5’ GGACCCAGUCC 3’, 5’ GGACCUAGUCC 3’, 5’ GGACUCAGUCC 3’, 5’ GCAGGUAAUCUGC 3’, 5’ GCAGGCAAUCUGC 3’, 5’ GACAAUUGUC 3’ 및 5’ GACAAUAGUC 3’으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  43. 제 30항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치 및 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 서로 선택적으로 혼성화될 수 있으며, 여기에서 상기 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되고,
    상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 4개 내지 7개의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 4개 내지 7개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 이중 가닥 구조는 4개 내지 7개의 염기쌍으로 구성되는 것인 핵산.
  45. 제 30항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK3 3’을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’을 포함하는 것이며,
    여기에서 상기 X1은 G 또는 존재하지 않고, X2는 S 또는 존재하지 않고, X3는 V 또는 존재하지 않고, X4는 B 또는 존재하지 않고; X5는 S 또는 존재하지 않고 X6는 C 또는 존재하지 않는 것인 핵산.
  46. 제 30항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는5’ X1X2X3BKBK3 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 C이거나, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 C이거나, 또는
    (c) X1은 G, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  47. 제 30항 내지 제 46항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 46항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ GCACUCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CGAGUGC 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  48. 제 30항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK3 3’의 뉴클레오티드를 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’의 뉴클레오티드를 포함하며,
    여기에서, 상기
    (a) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
    (b) X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V, X4는 B; X5는 S이며 X6는 존재하지 않거나, 또는
    (c) X1은 존재하지 않고, X2는 S, X3는 V, X4는 B; X5는 존재하지 않고, X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  49. 제 30항 내지 제 45항 및 제 48항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACAGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (b) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACACG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (c)상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUGCU 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ AGCACG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (d) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ CGCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (e) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCCGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (f) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCGGUG 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CACCGC 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (g) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGCG 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCAGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (h) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ GCUGGG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CCCAGC 3’ 의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는,
    (i) 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는5’ GCGGCG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ CGCCGC 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
  50. 제 30항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 터미널 스트레치는 5’ X1X2X3BKBK3 3’을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 제 2차 터미널 스트레치는 5’ MVVVX4X5X6 3’을 포함하는 것이며,
    여기에서 상기
    X1은 존재하지 않고, X2는 존재하지 않고, X3는 V 또는 존재하지 않고, X4는 B 또는 존재하지 않고; X5는 존재하지 않고 X6는 존재하지 않는 것인 핵산.
  51. 제 30항 내지 제 45항 및 제 50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 1차 터미널 스트레치는 5’ CGUG 3’의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 뉴클레오티드의 2차 터미널 스트레치는 5’ CACG 3’의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
  52. 제 1항 내지 제 6항 및 제 30항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 39 내지 41, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호. 137 내지 141 또는 서열번호 173 중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  53. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 127 내지 131중 어느 하나에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  54. 제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 헵시딘과 결합가능하고, 여기에서 헵시딘은 인간 헵시딘-25, 인간 헵시딘-22, 인간 헵시딘-20, 원숭이 헵시딘-25, 원숭이 헵시딘-22, 원숭이 헵시딘-20, 바람직하게는, 인간 헵시딘-25인 것인 핵산.
  55. 제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 54항에 있어서,
    상기 핵산은 헵시딘은 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 핵산.
  56. 제 1항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 변형체를 포함하며, 여기에서 상기 변형체를 포함하는 핵산 분자의 유기체에서의 배출율이 상기 변형체를 포함하지 않은 핵산 분자와 비교시에 보다 감소된 것인 핵산.
  57. 제 1항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 변형체를 포함하며, 여기에서 상기 변형체를 포함하는 핵산 분자의 유기체에서의 잔류시간이 상기 변형체를 포함하지 않은 핵산 분자와 비교시에 보다 증가된 것인 핵산.
  58. 제 56항 또는 제 57항에 있어서,
    상기 변형체는 생분해성 및 비생분해성 변형체를 포함하는 군으로부터 선택된 것, 바람직하게는 선형 폴리(에틸렌) 글리콜, 쇄상 폴리(에틸렌) 글리콜, 히드록시에틸 전분, 펩티드, 단백질, 다당체, 스테롤, 폴리옥시프로필렌 , 폴리옥시아미데이트, 폴리 (2-히드록시에틸)-L-글루타민 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 핵산.
  59. 제 58항에 있어서,
    상기 변형체는 쇄상 또는 가지상 PEG로 구성된 PEG기이며, 여기에서 상기 PEG 기의 분자량은 바람직하게는, 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 80,000 Da 및 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인 것인 핵산.
  60. 제 58항에 있어서,
    상기 변형체는 HES기이며, 여기에서 상기 HES 기의 분자량은 바람직하게는, 약 10,000 내지 약 200,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 약 170,000 Da 및 가장 바람직하게는 약 150,000 Da인 것인 핵산.
  61. 제 56항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형체는 핵산과 링커를 통해 결합된 것이고 상기 링커는 생분해성 링커인 것인 핵산.
  62. 제 56항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형체는 핵산의 5‘-터미널 뉴클레오티드 및/또는 3’-터미널 뉴클레오티드 및/ 또는 핵산의 5‘-터미널 뉴클레오티드 및 3’-터미널 뉴클레오티드 사이의 핵산 뉴클레오티드에 결합되는 것인 핵산.
  63. 제 56항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기체는 동물 또는 인체, 바람직하게는, 인체인 것인 핵산.
  64. 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산의 뉴클레오티드 또는 핵산을 형성하는 상기 뉴클레오티드는 L-뉴클레오티드인 것인 핵산.
  65. 제 1항 내지 제 64항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 L-뉴클레오티드인 것인 핵산.
  66. 제 1항 내지 제 65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 헵시딘과 결합가능한 하나 이상의 결합 부위를 포함하고, 여기에서 상기 결합 부위는 L-뉴클레오티드로 구성된 것인 핵산.
  67. 제 1항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한 것인 핵산.
  68. 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물 (여기에서 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 군으로부터 선택됨).
  69. 제 68항에 있어서,
    상기 약학조성물은 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것인 약학조성물.
  70. 약제 제조를 위한 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  71. 제 70항에 있어서,
    상기 약제는 인간용 약제 또는 수의학적 약제로서의 용도인 것인 용도.
  72. 진단용 수단을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  73. 제 70항에 있어서,
    상기 약제는 빈혈증, 저철혈증, 이식증, 상승된 헵시딘 수준인 상태, 상승된 철분 수준인 상태 또는 철분 과적증 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 것인 용도.
  74. 제 73항에 있어서,
    상기 빈혈증은 철적아구성 빈혈증, 소구성 저색소성 빈혈증, 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증, 염증에 기인한 빈혈증, 유전적 장애에 기인한 빈혈증 , 급성 감염증에 기인한 빈혈증, 철분 대사 및/또는 항상성 유전자 변이에 기인한 빈혈증, 및 항암 치료법에 기인한 빈혈증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 용도.
  75. 제 74항에 있어서,
    상기 만성 질환 및/장애는 만성 질환 및/ 장애에 기인한 빈혈증은 만성 염증, 암, 자가면역질환 및/또는 장애, 만성 감염증, 동맥경화증 , 죽상경화증 , 및 간경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 용도.
  76. 제 75항에 있어서,
    상기 만성 염증은 만성신질환, 만성 폐쇄성 폐질환, 다발성 경화증 , 골관절염, 당뇨병, 비만증, 뇌혈관 질환, 울혈성 심장질환, 심부전증, 심근경색증 , 관상동맥질환, 폐쇄성 말초 동맥 질환, 췌장염 및 맥관염으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 만성 신장 질환은 신장 질환, 만성 신부전증 및 만성 신질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고 상기 만성 신질환은 신장투석 또는 신장 이식증인 용도.
  77. 제 75항에 있어서,
    상기 자가면역질환 및/또는 장애는 류마티스성 관절염, 과민성 대장 증후군, 전신성홍반성 낭창 및 크론씨 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 용도.
  78. 제 75항에 있어서,
    상기 만성 감염증은 바이러스성 감염증, 바이러스성 병증, 박테리아성 감염증 및 진균성 감염증으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 바이러스성 감염증은 간염 및 HIV 감염증을 포함하고 상기 박테리아성 감염증은 헬리코박터 파이로리 감염증을 포함하는 것인 용도.
  79. 제 74항에 있어서,
    상기 염증에 기인한 빈혈증은 저색소성 정적혈구성이고/이거나 낮은 망상적혈구생산지수 및/또는 증가된 염증 마커로 특징화되는 것인 용도.
  80. 제 74항에 있어서,
    상기 유전적 장애는 캐슬만 질환, 슈니츨러 증후군, 철분 불응성 철분결핍성 빈혈증 (matriptase-2, TMPRSS6) 변이체, 무트란스페린혈증, 선천성 이적혈구생성 빈혈증 또는 이상 헤모글로빈증인 것인 용도.
  81. 제 74항에 있어서,
    상기 급성 감염증은 바이러스성 감염증, 박테리아성 감염증, 진균성 감염증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환, 바람직하게는 패혈증인 것인 용도.
  82. 제 75항에 있어서,
    상기 암은 간세포암종, 임파선암, 다발성 골수종, 두경부 암, 유방암, 결장암, 비골수성 암, 신세포암, 비소세포 폐암, 종양 및 뇌 종양으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 용도.
  83. 제 73항에 있어서,
    상기 약제는 상승된 철분 수준을 나타낸 상태를 치료하기 위한 것이며, 여기에서 상기 상태는 실조증, 프리드리히 실조증, 노인황반변성증 , 노년백내장, 노인성 망막 질환 및 신경퇴행성질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며 상기 신경퇴행성질환은 바람직하게는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 판토테네이트 키나제-수반 신경퇴행증, 하지불안증후군 및 헌팅톤 질환을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 용도.
  84. 제 73항에 있어서,
    상기 약제는 철분 과적증 상태를 치료하기 위한 것인 용도(여기에서 헵시딘 혈장 수준은 상승되지 않음).
  85. 제 84항에 있어서,
    상기 철분 과적증은 수혈성 철분 과적증, 철분 중독증, 폐혈철증 , 골감소증, 인슐린 저항증, 아프리칸 철분 과적증, 할로보르단 스파츠 질환, 과페레틴빈혈증, 세룰로플라스민 결핍증, 신생아혈색소착증 및 지중해빈혈증, 알파지중해빈혈증, 중간베타지중해빈혈증, 겸형 적혈구 빈혈증 및 골수이형성증후군을 포함한 적혈구 장애로 구성되는 군으로부터 선택된 것인 용도.
  86. 제 82항 내지 제 85항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약제는 철분 킬레이트화 화합물과 조합하여 사용되는 것인 용도.
  87. 제 86항에 있어서,
    상기 철분 킬레이트화 화합물은 쿠르쿠민, 디페록사민, 디페라시록스 및 디페리프론으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  88. 제 70항에 있어서,
    상기 약제는 추가적인 약제 또는 치료법과의 조합으로 또는 조합을 위하여 사용되는 것이며, 여기에서 상기 약제 또는 치료법은 추가적인 약학적 활성 화합물 또는 이러한 화합물의 투여를 포함하고, 여기에서 상기 추가적으로 활성형 화합물은 철분 보충제, 비타민 보충제, 적혈구 생성촉진제, 항생제, 항염 생물학제, 면역계 억제제, 항-혈전용해제, 스타틴, 혈관수축제 및 근수축성 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  89. 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 및 헵시딘을 포함하는 복합체(여기에서 상기 복합체는 바람직하게는, 결정성 복합체임).
  90. 제 89항에 있어서,
    상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것인 복합체.
  91. 헵시딘의 검출을 위한 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  92. 제 91항에 있어서,
    상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것인 용도.
  93. (1) 후보 헵시딘 길항제 및/또는 후보 헵시딘 효현제를 제공하는 단계; (2) 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 제공하는 단계; (3) 헵시딘 길항제 및/또는 헵시딘 효현제의 존재 하에 신호를 제공하는 시험 계를 제공하는 단계, 및; (4) 상기 후보 헵시딘 길항제가 헵시딘 길항제인지 여부 및/또는 상기 후보 헵시딘 효현제가 헵시딘 효현제인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 헵시딘 길항제 또는 헵시딘 효현제를 스크리닝하는 방법.
  94. 제 93항에 있어서,
    상기 헵시딘은 인간 헵시딘, 원숭이 헵시딘으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 인간 헵시딘인 것인 방법.
  95. 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는, 헵시딘 검출을 위한 키트(여기에서, 바람직하게는 상기 헵시딘은 인간 헵시딘임).
  96. (a) 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 시료를 제공하는 단계; (b) 포획 탐침 및 검출 탐침을 제공하는 단계(상기 포획 탐침은 최소한 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 첫 번째 부위에 부분적으로 상보적이며, 상기 검출 탐침은 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 두 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적이거나, 또는 호환적으로, 상기 포획 탐침은 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 두 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적이고 상기 검출 탐침은 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 첫 번째 부위에 최소한 부분적으로 상보적임); (c) 상기 포획 탐침 및 검출 탐침을 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 이들의 일부와 동시에 또는 순서에 상관없이 연속적으로 반응을 수행시키는 단계; (d) 상기 포획 탐침이 (a) 단계에 의해 제공된 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산과 혼성화되는지 여부를 선택적으로 검출하는 단계; 및 (e) 상기 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 상기 포획 탐침 및 상기 검출 탐침으로 구성되는, (c)단계에서 생성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내에서 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 검출하는 방법.
  97. 제 96항에 있어서,
    상기 검출 탐침은 검출 수단을 포함하고, 및/또는 상기 포획 탐침은 지지체, 바람직하게는 고체 지지체에 고정화될 수 있는 것인 방법.
  98. 제 96항 또는 제 97항에 있어서,
    상기 복합체의 일부가 아닌 어떠한 검출 탐침도 (e) 단계에서 복합체의 일부인 검출 탐침만이 검출되도록 반응으로부터 제거된 것인 방법.
  99. 제 96항 내지 제 98항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (e) 단계는 제 1항 내지 제 67항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 이들의 일부 존재 하, 및 상기 핵산 또는 이의 일부의 부재 하에서, 상기 포획 탐침과 검출 탐침이 혼성화될 시에 검출 수단에 의해 생성된 신호를 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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