KR20110138922A - Method and device for producing high-density microalgae and high-concentrate fat solubles material by culturing microalgae - Google Patents

Method and device for producing high-density microalgae and high-concentrate fat solubles material by culturing microalgae Download PDF

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Abstract

PURPOSE: An apparatus for producing high density microalgae and high concentrate fat soluble materials is provided. CONSTITUTION: An apparatus for producing high density microalgae and high concentrate fat soluble materials comprises: a culture tub(10) for culturing microalgae containing fat soluble materials; a solvent tub(20) for storing extraction solvent dissolving the fat soluble materials; a mixture tank(30) for mixing the culture liquid of microalgae and the solvent; a fraction tank(40) which separates the mixture into fat soluble material-solvent and microalgae; a microalgae-circulation line(50) for circulating the microalgae to the culture tub; a solvent-circulation line(60) for circulating the fractioned fat soluble material-solvent; and a microalgae-containing device(70) for containing or treating the microalgae.

Description

미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치{Method and Device for Producing High-Density Microalgae and High-Concentrate Fat Solubles Material by Culturing Microalgae}Method and Device for Producing High Density Microalgae and Concentrated Fat-Soluble Substances through Microalgae Culture {Method and Device for Producing High-Density Microalgae and High-Concentrate Fat Solubles Material by Culturing Microalgae}

본 발명은 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미세조류를 배양하고 배양된 미세조류에 지용성물질 추출용매를 접촉하여 미세조류로부터 지용성물질을 분획함에 있어서, 미세조류의 배양과 분획 과정을 다수회 반복적으로 실행함으로써 고밀도의 미세조류와 농축된 지용성물질을 생산하는 방법 및 장치에 관한 것이다. The present invention relates to a method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat soluble substances through microalgae cultivation, and more particularly, to cultivate microalgae and contacting a fat soluble substance extraction solvent with the cultured microalgae, In the fractionation, the present invention relates to a method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances by repeatedly performing the culturing and fractionation process of microalgae.

최근 국내외적으로 미세조류 생명공학의 연구와 산업적 이용에 대한 기술개발이 활발해지면서 해양생물공학의 유망한 개척 분야로 인식되고 있다. 미세조류는 건강식품 및 대체에너지원으로 잘 알려져 있으며, 수산양식용 사료, 의약원료물질의 생산, 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다. Recently, as the research of microalgae biotechnology and technology development for industrial use have been active, it is recognized as a promising pioneering field of marine biotechnology. Microalgae are well known as health foods and alternative energy sources, and their use is being expanded to produce aquaculture feeds, produce pharmaceutical raw materials, and produce biochemicals.

조류(algae)는 육상식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭으로 분류학적 용어는 아니며, 매우 다양한 분류군을 지칭하는 일반 용어이다. 이들 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류(microalgae)라 하며, 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다. 조류는 지구상에서 전체 광합성의 90%를 담당하는 것으로 추정되며, 지구 생태계의 1차 생산자로 매우 중요한 위치를 점하고 있다. Algae is a generic term for all photosynthetic organisms except terrestrial plants, and is not a taxonomic term, but a general term for a wide variety of taxa. Among them, unicellular algae that can be observed under a microscope are called microalgae, and most of the phytoplankton belong to this. Algae are estimated to account for 90% of the total photosynthesis on Earth, and are very important as primary producers of the global ecosystem.

미세조류는 1차 대사산물인 지질, 단백질, 탄소화물 뿐만 아니라, 2차 대사산물인 생리활성물질도 매우 다양하게 함유하고 있다. 미세조류로부터 획득할 수 있는 가장 풍부한 물질은 단백질이나, 단백질은 주로 미세조류 자체를 이용한다는 측면에서 고려되어야 할 성분이고, 미세조류 생산 물질을 이용한다는 측면에서 본다면, 지질, 탄소화물, 색소, 비타민, 미네랄 및 특수 성분을 들 수 있다. Microalgae contain not only lipids, proteins and carbohydrates as primary metabolites but also bioactive substances as secondary metabolites. The most abundant material that can be obtained from microalgae is protein, but protein is a component that should be considered mainly in terms of using microalgae itself, and in terms of using microalgae producing materials, lipids, carbohydrates, pigments, vitamins, Minerals and special ingredients.

그 중에서도 가장 풍부한 물질 중의 하나가 지질이다. 지질은 비극성지질이나 극성지질로 구분되며, 미세조류에서만 발견되는 독특한 지질(chlorosulfolipid, trimethyl-hoserine 등)도 있다. 미세조류에서 지방의 축적은 대체로 질소원의 결핍에서 유도되고, 미세조류의 처리 방법에 따라서도 그 함량이 크게 달라진다. One of the most abundant of these is lipids. Lipids are classified as nonpolar or polar lipids, and there are also unique lipids (chlorosulfolipid, trimethyl-hoserine, etc.) found only in microalgae. Accumulation of fat in microalgae is largely derived from the lack of nitrogen sources, and its content varies greatly depending on the method of treating microalgae.

미세조류에서 지용성 물질은 지방산, 고도불포화지방산, 탄화수소, 엽록소, 아스타잔틴, 카로테노이드, 베타-카로틴, 비타민E, 루테인 등이 있다.Fat-soluble substances in microalgae include fatty acids, polyunsaturated fatty acids, hydrocarbons, chlorophyll, astaxanthin, carotenoids, beta-carotene, vitamin E and lutein.

단백질은 미세조류에서 풍부한 폴리머로서 대체로 다른 물질을 추출한 다음 남은 잔사의 대부분이 단백질이며, 식량이나 사료 등으로 널리 이용된다. Protein is a rich polymer from microalgae, and most of the residues left after extracting other substances are proteins, and are widely used for food and feed.

한편 다당류도 미세조류의 대표적인 폴리머인바, 일부 녹조와 남조류에서는 전분(starch)이 균체에 대량으로 축적하며, Chlorella sp. 중에서 호온성 조류종은 건조 균체의 50% 가량을 전분으로 축척하는 것으로 알려져 있으며, 일부 남조류는 생분해성이 있는 PHB (poly-β-hydroxybutyric acid)를 균체에 축적하는 것으로 밝혀져 있는데, 특정의 S. platensis종에서 균체의 60% 가량을 대수 증식기에 축적하는 것으로 알려져 있다. On the other hand, polysaccharides are a representative polymer of microalgae. Starch is accumulated in the cells in some algae and blue algae, and Chlorella sp. Among them, horned algae are known to accumulate about 50% of dry cells with starch, and some cyanobacteria have been found to accumulate biodegradable poly-β-hydroxybutyric acid (PHB) in cells. In platensis species, about 60% of the cells are known to accumulate in logarithmic growth stages.

지금까지 미세조류 배양은 단순히 미세조류를 배양액에 접종하여 대수기까지 배양하는 일괄배양(batch culture) 혹은 배양하는 과정에 물리적인 요소(영양분, pH, 산소농도, 이산화탄소 농도, 등)를 측정하여 미세조류 배양에 최적조건으로 보정하여 미세조류의 밀도를 최대화하는 과정을 포함하는 연속배양(continuous culture) 등의 연구가 활발히 진행되고 있다.Until now, microalgae cultivation has been carried out by measuring the physical factors (nutrients, pH, oxygen concentration, carbon dioxide concentration, etc.) in the batch culture or incubation process by simply inoculating the microalgae in the culture medium and culturing to the logarithmic season. Research on continuous culture including the process of maximizing the density of microalgae by calibrating to the optimum conditions for algae culture has been actively conducted.

미세조류로부터 유용물질의 일반적인 종래의 추출법은, 미세조류의 생장에 저해를 주는 과정인 원심분리, 여과 및 건조공정을 통해 최대한 수분을 제거한 다음 세포파쇄 공정을 걸쳐 유용물질을 분리·정제한다. Conventional conventional extraction of useful materials from microalgae removes water as much as possible through centrifugation, filtration, and drying, which inhibits the growth of microalgae, and then separates and purifies the useful material through cell disruption.

그러나 이러한 종래의 유용물질 추출법은 탈수과정 및 추출과정에서 미세조류가 파괴되어 다른 유용한 유용물질들이 유출 및 소실되어 재배양을 하거나 바이오매스를 재사용하는데 어려움이 있으며, 대규모 배양시 복잡한 공정단계로 높은 운전비용 등의 문제점을 가지고 있다. However, such a conventional useful material extraction method is difficult to redistribute or reuse the biomass due to the destruction of microalgae in the dehydration process and the extraction process, other useful materials are leaked and lost, high operation as a complex process step in large-scale cultivation There are problems such as cost.

본 발명자는 미세조류로부터 유용물질을 추출하는 종래 방법의 문제점을 해소하고자, 대한민국 특허출원 제10-2010-0043955호(2010. 05.11 출원)의 '미세조류 배양에 의한 바이오디젤 및 발효산물 생산 방법 및 장치'를 제안한 바 있다. The inventors of the present invention to solve the problem of the conventional method for extracting useful substances from microalgae, the method of producing biodiesel and fermented products by culturing microalgae of Korean Patent Application No. 10-2010-0043955 (2010. 05.11 application) Device '.

본 본 발명자의 방법과 장치는, 기존의 복잡하고 비용이 많이 드는 생산(추출) 방법과는 달리, 미세조류의 배양 및 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 접촉을 개선(증가)하여 지질과 미세조류를 높은 회수율로 획득할 수 있고, 운전비용이 저렴하며, 분획된 지질로부터 바이오디젤을 생산하고 분획된 미세조류는 재배양하거나 에탄올, 부탄올 및 유기산과 같은 유용 발효산물의 생산에 사용함으로써, 미세조류의 배양을 통해 바이오디젤과 발효산물을 동시에 생산함과 아울러 이산화탄소를 저감할 수 있는 방법과 장치이다. Unlike conventional complex and expensive production (extraction) methods, the method and apparatus of the present inventors improve the cultivation of microalgae and improve (increase) the contact of the microalgal culture solution and the fat-soluble material extraction solvent to increase the lipids and fines. Algae can be obtained with high recovery rate, low operating cost, produce biodiesel from fractionated lipids, and fractionated microalgae can be finely recultivated or used for the production of useful fermentation products such as ethanol, butanol and organic acids. It is a method and apparatus that can simultaneously produce biodiesel and fermented products and reduce carbon dioxide through algae culture.

본 발명의 목적은, 미세조류를 배지에 접종하고 배양하여 수확하는 복잡하고 비용이 많이 소요되는 종래의 배양, 수확 및 추출 방법과는 달리, 지용성물질을 함유한 미세조류배양액을 지용성물질 추출용매와 혼합하고, 이런 혼합액을 미세조류와 지용성물질-용매(지용성물질이 지용성물질 추출용매에 용해된 용액)로 분획한 후에, 분획된 미세조류를 재배양함과 아울러 재배양된 미세조류를 분획된 지용성물질-용매로 재분획하는 과정을 다수회 반복하는 과정을 통해, 최종적으로 목적하는 정도의 높은 밀도를 가진 미세조류와 함께 목적하는 정도로 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를 획득하여, 전자의 고밀도 미세조류는 바이오연료, 바이오화학물, 의약품, 건강기능성 식품 및 단백질가수분해산물 등의 생산에 사용할 수 있도록 하고, 후자의 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매로부터 추출된 농축된 지용성물질은 바이오디젤, 의약품, 건강기능성식품 등의 생산에 사용할 수 있도록 함으로써, 운전비용이 저렴하면서 이산화탄소를 저감할 수 있는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치를 제공하고자 하는 것이다. An object of the present invention, unlike the complicated and expensive conventional cultivation, harvesting and extraction method of inoculating the microalgae in the medium and cultivating and harvesting, the algae culture solution containing the fat-soluble material and the fat-soluble material extraction solvent and After mixing, the mixture is fractionated into a microalgae and a fat-soluble substance-solvent (a solution in which the fat-soluble substance is dissolved in a fat-soluble extractant), and then the cultured microalgae are re-cultured and the cultured microalgae are fractionated fat-soluble substances. By repeating the process of re-fractionation with a solvent many times, a fat-soluble substance containing a fat-soluble substance that is concentrated to a desired degree together with a microalgae having a high density of the desired degree is finally obtained. High-density microalgae can be used for the production of biofuels, biochemicals, pharmaceuticals, health foods and proteolytic products, The fat-soluble substance extracted from the fat-soluble substance-solvent containing the concentrated fat-soluble substance of porcine can be used for the production of biodiesel, medicine, health functional food, etc. It is to provide a method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through algae culture.

본 발명에 따라, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 방법이 제공된다. According to the present invention, there is provided a method for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgae culture.

본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 방법은, 지용성물질을 함유하는 미세조류를 배양하는 과정; 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질 추출용매와 상기 미세조류 배양액을 혼합하여 상기 지용성물질 추출용매를 상기 미세조류 배양액에 접촉시킴으로써 상기 미세조류 배양액의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질 추출용매에 용해시키는 과정; 상기 지용성물질 추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 상기 미세조류를 분획하는 과정; 분획된 상기 미세조류를 재배양하는 과정; 분획된 상기 지용성물질-용매를 사용하여 재배양된 상기 미세조류를 재분획하는 과정; 상기 미세조류의 재배양 과정과 상기 재분획 과정을 2회 이상 다수회 반복적으로 실행한 후에, 농축된 상기 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매와 고밀도의 상기 미세조류를 최종적으로 분획하는 과정; 최종의 상기 분획과정 후에, 고밀도의 상기 미세조류를 수득하는 과정; 및 최종의 상기 분획과정 후에, 농축된 상기 지용성물질-용매를 수득하는 과정을 포함한다. The production method of high density microalgae and concentrated fat soluble substances through microalgae culturing according to the present invention comprises the steps of culturing the microalgae containing a fat soluble substance; Dissolving the fat-soluble substance in the microalgal culture solution in the oil-soluble substance extracting solvent by mixing the oil-soluble substance extracting solvent in which the fat-soluble substance is dissolved with the microalgal culture solution and contacting the oil-soluble substance extracting solvent with the microalgal culture solution; Fractionating the fat-soluble material-solvent and the microalgae in which the fat-soluble material is dissolved in the fat-soluble material extraction solvent; Culturing the fractionated microalgae; Refractionation of the microalgae cultured using the fractionated fat-soluble material-solvent; After the culturing of the microalgae and the re-fractionation process are repeatedly performed two or more times a plurality of times, finally fractionating the fat-soluble material-solvent containing the concentrated fat-soluble material and the high-algae of high density; After the final fractionation step, obtaining the microalgae of high density; And after the final fractionation step, obtaining the concentrated fat-soluble material-solvent.

바람직하게, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매를 혼합할 때, 상기 미세조류 배양액을 진동 분쇄하는 과정 및 혼합물을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시킨다. Preferably, when the microalgal culture medium and the lipophilic material extraction solvent are mixed, the microalgal culture medium and the lipophilic material are performed by performing at least one of the steps of vibrating and grinding the microalgal culture medium and stirring the mixture. Increase the contact of the extraction solvent.

바람직하게, 상기 지용성물질 추출용매는 탄화수소 용매이다. Preferably, the oil soluble extractant is a hydrocarbon solvent.

본 발명에 따라, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 장치가 제공된다. According to the present invention, there is provided an apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgae culture.

본 발명에 따른 장치는, 지용성물질을 함유하는 미세조류를 배양하는 배양조; 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질 추출용매를 저장하는 용매조; 상기 배양조로부터의 상기 미세조류의 배양액과 상기 용매조로부터의 상기 지용성물질 추출용매를 혼합하는 혼합조; 상기 혼합조로부터의 혼합물을, 상기 지용성물질 추출용매에 상기 미세조류 배양액의 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 상기 미세조류로 분획하는 분획조; 상기 분획조로부터의 분획된 상기 미세조류를 상기 배양조로 순환하는 미세조류-순환라인; 상기 분획조로부터의 분획된 상기 지용성물질-용매를 상기 용매조로 순환하는 용매-순환라인; 상기 미세조류-순환라인을 통해 상기 배양조에서 2회 이상 재배양한 후에 상기 분획조로부터 분획된 고밀도의 상기 미세조류를 수용 또는 처리하는 미세조류-수용장치; 및 상기 용매-순환라인을 통해 상기 분획조에서 2회 이상 재분획한 후에 상기 분획조로부터 분획한 농축된 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리하는 지용성물질-수용장치; 를 포함한다. Apparatus according to the present invention, the culture tank for culturing microalgae containing a fat-soluble substance; A solvent tank for storing a fat-soluble substance extraction solvent in which the fat-soluble substance is dissolved; A mixing tank for mixing the culture solution of the microalgae from the culture tank and the oil-soluble substance extraction solvent from the solvent tank; A fractionation tank for dividing the mixture from the mixing tank into an oil-soluble substance-solvent in which the oil-soluble substance of the microalgae culture solution is dissolved in the oil-soluble substance extraction solvent and the microalgae; A microalgae-circulating line circulating the microalgae fractionated from the fractionation tank into the culture tank; A solvent-circulation line for circulating the fractionated fat-soluble substance-solvent from the fractionation tank into the solvent bath; A microalgae-accommodating apparatus for accommodating or treating the microalgae of high density fractionated from the fractionation tank after culturing at least two times in the culture tank through the microalgae-circulation line; And a fat-soluble substance-receiving apparatus for receiving or treating the concentrated fat-soluble substance-solvent fractionated from the fractionation tank after re-fractionation two or more times in the fractionation tank through the solvent-circulation line; It includes.

바람직하게, 본 발명의 장치는, 상기 배양조의 상기 미세조류 배양액과 상기 용매조의 지용성물질 추출용매를 상기 혼합조로 일정량 공급하는 제1 연동펌프; 상기 분획조에서 분획된 상기 미세조류를 그 밀도에 따라 선택적으로 상기 미세조류-순환라인을 통해 상기 배양조로 이송하거나 상기 미세조류-수용장치로 이송하는 제2 연동펌프; 및 상기 분획조에서 분획된 상기 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 상기 용매조로 이송하거나 상기 지용성물질-수용장치로 이송하는 제3 연동펌프(4); 를 포함한다. Preferably, the apparatus of the present invention, the first peristaltic pump for supplying a predetermined amount of the microalgal culture solution of the culture tank and the solvent-soluble material extraction solvent of the solvent tank to the mixing tank; A second peristaltic pump for selectively transporting the microalgae fractionated in the fractionation tank to the culture tank through the microalgae-circulation line or to the microalgae-receiving device; And a third peristaltic pump (4) for transferring the fat-soluble material-solvent fractionated in the fractionation tank to the solvent tank or the fat-soluble material-receptor according to the concentration thereof. It includes.

바람직하게, 상기 혼합조에는, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키도록, 상기 미세조류 배양액을 진동 분쇄하는 진동분쇄장치 및 상기 혼합물을 교반하는 교반장치 중 적어도 하나의 장치를 더 포함한다. Preferably, the mixing tank, at least one of a vibratory grinding device for vibrating and grinding the microalgal culture solution and a stirring device for stirring the mixture to increase the contact between the microalgal culture solution and the fat-soluble substance extraction solvent It includes more.

상기 혼합조와 상기 분획조는 하나의 반응조로 통합할 수 있다. The mixing tank and the fractionation tank can be integrated into one reactor.

본 발명에서의 '지용성물질'은 인지질, 유리지방산, 지방산의 에스테르, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필(예를 들어, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 이소프레노이드-유도 화합물 및 기타 여러 가지의 지질을 포함하는 것이다. In the present invention, 'lipophilic substances' include phospholipids, free fatty acids, esters of fatty acids, triacylglycerols, sterols and sterol esters, carotenoids, xanthophylls (eg oxycarotenoids), hydrocarbons, isoprenoid-derived compounds, and It contains a variety of other lipids.

본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치는, 지용성물질을 함유한 미세조류 배양액을 지용성물질 추출용매와 혼합하고 혼합액을 미세조류와 지용성물질-용매로 분획한 후에, 분획된 미세조류를 재배양함과 아울러 재배양된 미세조류를 분획된 지용성물질-용매로 재분획하는 과정을 다수회 반복하는 과정을 통해, 고밀도의 미세조류와 함께 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를 획득하는 방법 및 장치이므로, 높은 생산 수율로 미세조류와 지용성물질을 획득할 수 있는 효과가 있다. The method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat soluble substances through microalgae culturing according to the present invention comprises mixing a microalgal culture solution containing a fat soluble substance with a fat soluble substance extraction solvent and dividing the mixed solution into a microalgae and a fat soluble substance-solvent. Afterwards, the oil-rich substances concentrated together with the high-density microalgae are included by culturing the fractionated microalgae and repeating the re-fractionation of the cultured microalgae into the fractionated fat-soluble material-solvent. Since it is a method and apparatus for acquiring a fat-soluble substance, it is effective to obtain a microalgae and a fat-soluble substance with a high production yield.

본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치는, 별도의 분리 전처리가 필요가 없이 고밀도 미세조류와 농축된 지용성물질을 수확할 수 있어 경제성이 매우 높으며, 미세조류의 세포비파괴 상태에서 농축된 지용성물질을 생산하면서 미세조류를 고밀도 배양할 수 있으므로, 바이오연료, 바이오화학물, 의약품, 건강기능성 식품 및 단백질가수분해산물 등의 생산에 사용할 수 있는 미세조류와, 바이오디젤, 의약품, 건강기능성식품 등의 생산에 사용할 수 있는 지용성물질의 생산성을 극대화할 수 있으며, 미세조류 배양에 이산화탄소가 사용됨에 따라 온실가스 저감에도 이바지할 수 있다. The method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat soluble substances through microalgae culturing according to the present invention can harvest high density microalgae and concentrated fat soluble substances without the need for separate pretreatment, and thus have very high economical efficiency. Microalgae can be grown at high density while producing concentrated fat-soluble substances in algae non-destructive state, and can be used for the production of biofuels, biochemicals, pharmaceuticals, health functional foods, and protein hydrolysates. It can maximize the productivity of fat-soluble substances that can be used for the production of diesel, pharmaceuticals, health functional foods, etc., and contribute to greenhouse gas reduction as carbon dioxide is used for microalgae cultivation.

본 발명에 따른 방법 및 장치는, 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 효과적인 접촉을 통해, 지용성물질과 미세조류의 생산 수율을 더욱 향상시킬 수 있다. The method and apparatus according to the present invention can further improve the production yield of the fat soluble substance and the microalgae through effective contact between the microalgal culture liquid and the fat soluble substance extraction solvent.

본 발명에 따른 방법 및 장치는, 탈수과정이 필요한 종래 기술의 배양, 수확 및 추출법과는 달리, 연동 펌프들을 이용한 반복적은 재배양 및 재분획 과정을 통해, 고밀도 미세조류와 농축된 지용성물질을 획득하는 방법이므로, 운전비용이 매우 저렴하다. The method and apparatus according to the present invention, unlike conventional culture, harvesting and extraction methods that require a dehydration process, obtains dense microalgae and concentrated fat-soluble substances through repeated culture and refraction processes using peristaltic pumps. Because of the way, the operating cost is very low.

본 발명에 따른 방법 및 장치는, 세포를 파괴시키지 않는 상태로 지용성물질을 추출하므로, 세포내 다른 유용 성분들의 유실을 방지할 수 있어 지용성물질이 추출된 미세조류의 유용성이 향상되며, 순환 반복 배양으로 미세조류의 생산성을 극대화시킬 수 있다. Since the method and apparatus according to the present invention extract the fat soluble substance without destroying the cells, it is possible to prevent the loss of other useful components in the cell, thereby improving the usefulness of the microalgae from which the fat soluble substance is extracted, and circulating repeated culture This can maximize the productivity of microalgae.

도1은 본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법이 적용되는 예시적인 장치의 블록도,
도2는 지용성물질 추출용매가 미세조류의 생존에 미치는 영향을 보여주는 그래프,
도3은 미세조류로부터 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질 추출용매(알칸)와 진동분쇄의 효과를 보여주는 그래프,
도4는 본 발명에 의해 추출한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS 분석 결과 그래프. 1 is a block diagram of an exemplary apparatus to which the method for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgae culture according to the present invention is applied;
2 is a graph showing the effect of the fat-soluble substance extraction solvent on the survival of microalgae,
3 is a graph showing the effects of a fat-soluble substance extraction solvent (alkanes) and vibration grinding on the extraction of fat-soluble substances from microalgae,
Figure 4 is a graph of the GC-TOF-MS analysis of the biodiesel extracted by the present invention.

이하, 본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치를 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다. Hereinafter, a method and apparatus for producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgae culture according to the present invention will be described in detail. The following examples are illustrative of the present invention but are not intended to limit the scope of the present invention.

먼저, 도1을 참조하여 본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 장치를 설명한다. First, with reference to Figure 1 describes a high-density microalgae and concentrated fat-soluble material production apparatus through the microalgae culture according to the present invention.

도1에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 장치(1)는, 배양조(10), 용매조(20), 혼합조(30), 분획조(40), 미세조류-순환라인(50), 용매-순환라인(60), 미세조류-수용장치(70) 및 지용성물질-수용장치(80)를 포함한다. As illustrated in FIG. 1, the apparatus 1 according to the present invention includes a culture tank 10, a solvent tank 20, a mixing tank 30, a fractionation tank 40, and a microalgae-circulating line 50. , Solvent-circulation line 60, microalgae-receiving device 70 and fat-soluble material-receiving device 80.

상기 배양조(10)는 미세조류를 배양 및 공급하는 장치이다. 배양조(10)는 미세조류를 포함한 미생물을 배양시키기에 적당한 시스템을 폭넓게 사용할 수 있다. 배양조(10)에는, 연못, 인공적인 노지 배양시설물, 바이오리액터(bioreactors), 플라스틱 백(plastic bags), 튜브(tubes), 발효조(fermentors), 쉐이크 플라스크(shake flasks), 공기압 리프트 칼럼(air lift columns) 등이 포함되며, 미세조류를 배양할 수 있는 것이라면 그 형식에 제한이 없다. 배양은 독립영양배양 혹은 종속영양배양을 단독으로 하거나 독립영양배양 후 종속영양배양 또는 종속영양배양 후 독립영양배양으로 할 수 있다. The culture tank 10 is a device for culturing and supplying microalgae. The culture tank 10 can be widely used a system suitable for culturing microorganisms including microalgae. The culture tank 10 includes ponds, artificial open field culture facilities, bioreactors, plastic bags, tubes, fermenters, shake flasks, and pneumatic lift columns. lift columns), and there is no limit to the type of microalgae that can be cultured. The culture may be independent or heterotrophic culture alone, or after independent culture, heterotrophic culture or after heterotrophic culture.

상기 용매조(20)는 미세조류 배양액에 함유된 미세조류의 지용성물질을 추출하기 위한 지용성물질 추출용매를 저장 및 공급하는 장치이다. The solvent tank 20 is a device for storing and supplying a fat-soluble material extraction solvent for extracting the fat-soluble material of the microalgae contained in the microalgal culture.

상기 혼합조(30)는, 배양조(10)로부터의 미세조류 배양액과 용매조(20)로부터의 지용성물질 추출용매를 균일하게 혼합하는 장치이다. 바람직하게, 혼합조(30)는 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매를 5:1비율로 혼합한다. The mixing tank 30 is a device for uniformly mixing the microalgal culture solution from the culture tank 10 and the fat-soluble substance extraction solvent from the solvent tank 20. Preferably, the mixing tank 30 mixes the microalgal culture solution and the fat-soluble substance extraction solvent in a 5: 1 ratio.

바람직하게, 배양조(10)의 미세조류 배양액과 용매조(20)의 지용성물질 추출용매는 제1 연동펌프(2)를 통해 정해진 유량으로 혼합조(30)로 이송된다. Preferably, the microalgae culture medium of the culture tank 10 and the solvent-soluble solvent for extracting the fat-soluble substance of the solvent 20 are transferred to the mixing tank 30 at a predetermined flow rate through the first peristaltic pump 2.

이를 위해, 배양조(10)로부터의 라인(11)과 용매조(20)로부터의 라인(21)은 각각 제1 연동펌프(2)에 연결되고, 제1 연동펌프(2)로부터의 라인(33)은 혼합조(30)에 각각 연결되며, 혼합조(30)로부터의 라인(34)은 분획조(40)에 연결된다. To this end, the line 11 from the culture vessel 10 and the line 21 from the solvent vessel 20 are each connected to the first peristaltic pump 2 and the line from the first peristaltic pump 2 ( 33 is respectively connected to the mixing vessel 30, and the line 34 from the mixing vessel 30 is connected to the fractionation vessel 40.

바람직하게, 혼합조(30)에는 진동분쇄장치(31)를 장착하여 미세조류 배양액을 진동 분쇄할 수 있다. 진동분쇄장치(31)는, 초음파의 고에너지 공명 또는 음향 방사(acoustical radiation)로 배양액을 처리하는 것이다. 진동분쇄는 분자 집합체를 분리하거나 투과시키기 위해 분자집합체를 분쇄한다. 진동분쇄는 미세조류 배양액을 작은 입자로 만들어 미세조류가 더 많은 지용성물질 추출용매에 노출(접촉)되도록 하여 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다. Preferably, the mixing tank 30 is equipped with a vibration grinding device 31 may be subjected to vibration grinding of the microalgal culture solution. The vibration pulverizing device 31 treats the culture liquid by high energy resonance or acoustic radiation of ultrasonic waves. Vibratory grinding breaks up molecular aggregates to separate or permeate them. Vibration pulverization improves the extraction efficiency of fat-soluble substances by making microalgal culture liquid into small particles so that the microalgae are exposed (contacted) to more fat-soluble substance extraction solvent.

진동분쇄장치(31)와 함께 또는 진동분쇄장치(31)를 대신하여 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 혼합물을 교반하여 주는 교반장치(32)를 설치할 수 있으며, 교반장치(32)도 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시켜 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다. An agitator 32 for agitating the mixture of the microalgal culture solution and the fat-soluble substance extraction solvent together with or in place of the vibration mill 31 may be installed. The extraction efficiency of fat-soluble substances is improved by increasing the contact between the culture solution and the solvent-soluble substance.

상기 분획조(40)는, 혼합조(30)로부터의 혼합물을, 지용성물질-용매(미세조류 배양액의 지용성물질이 지용성물질 추출용매에 용해된 용액)와 미세조류로 분획하기 위한 장치이다. 즉, 분획조(40)에서는 혼합조(30)로부터의 혼합물이 상층의 지용성물질-용매(층), 중간의 물(층), 및 하층의 미세조류(층)로 분획된다. The fractionation tank 40 is an apparatus for fractionating the mixture from the mixing tank 30 into a fat-soluble substance-solvent (a solution in which a fat-soluble substance of a microalgal culture solution is dissolved in a fat-soluble substance extraction solvent) and a microalgae. That is, in the fractionation tank 40, the mixture from the mixing tank 30 is fractionated into the upper fat-soluble substance-solvent (layer), the middle water (layer), and the lower microalgae (layer).

도1에 도시된 구체예에 있어서는, 혼합조(30)와 분획조(40)를 별도의 분리된 구성으로 구축한 예를 도시하였지만, 점선으로 표시된 바와 같이 혼합조(30)와 분획조(40)를 그 기능이 통합된 하나의 반응조(90)로 통합 구성하는 것도 가능하다. In the specific example shown in FIG. 1, although the mixing tank 30 and the fractionation tank 40 were shown in the example which constructed in separate structure, the mixing tank 30 and the fractionation tank 40 as shown by the dotted line. ) Can be integrated into one reactor (90) in which the function is integrated.

상기 미세조류-순환라인(50)은, 분획조(40)에서 하층에 분획된 미세조류를 다시 배양조(10)로 순환하는 라인이다. The microalgae-circulation line 50 is a line for circulating the microalgae fractionated in the lower layer in the fractionation tank 40 back to the culture tank 10.

상기 용매-순환라인(60)은, 분획조(40)에서 상층에 분획된 지용성물질-용매를 다시 용매조(20)로 순환하는 라인이다. The solvent-circulation line 60 is a line for circulating the oil-soluble substance-solvent fractionated in the upper layer in the fractionation tank 40 back to the solvent bath 20.

분획조(40)의 미세조류는 미세조류-순환라인(50)을 통해 배양조(10)로 재공급되고, 분획조(40)의 지용성물질-용매는 용매-순환라인(60)을 통해 용매조(20)로 재공급된 후에, 미세조류는 배양조(10)에서 재배양되고, 재배양된 미세조류와 용매조(20)의 지용성물질-용매가 다시 혼합조(30)에 공급되어 혼합된 다음에, 혼합물은 다시 분획조(40)에 공급되어 분획되는 과정이 반복되며, 이런 미세조류 재배양 과정과 재분획 과정은 미세조류가 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화되고 지용성물질-용매에 용해된 지용성물질이 목적하는 정도로 농축될 때까지 2회 이상 다수회 반복된다. The microalgae of the fractionation tank 40 are resupplied to the culture tank 10 through the microalgae-circulation line 50, and the fat-soluble material-solvent of the fractionation tank 40 is the solvent through the solvent-circulation line 60. After re-supplying to the tank 20, the microalgae are cultivated in the culture tank 10, and the cultured microalgae and the fat-soluble substance-solvent of the solvent tank 20 are supplied to the mixing tank 30 again and mixed. Then, the mixture is fed back to the fractionation tank 40 and the process of fractionation is repeated, and this microalgal culture and refraction process are densified to the desired density of the microalgae and dissolved in a fat-soluble material-solvent. Repeated two or more times until the fat-soluble substance is concentrated to the desired degree.

상기 미세조류-수용장치(70)는 미세조류-순환라인(50)을 순환하면서 반복적으로 재배양된 미세조류가 분획조(40)에서 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화 되었을 때, 해당 고밀도 미세조류를 분획조(40)로부터 배출하여 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다. The microalgae-receiving device 70 circulates the microalgae-circulating line 50 when the microalgae repeatedly cultured are densified to the desired density in the fractionation tank 40. It is a device for discharging from the fractionation tank 40 to temporarily receive or to perform the desired treatment for the subsequent desired treatment.

예를 들어, 미세조류-수용장치(70)에서는 고밀도 미세조류를 에탄올 발효, 부탄올 발효, 유기산 발효 등 각종 처리를 하여 미세조류로부터 바이오연료, 바이오화학물, 의약품, 건강기능성식품 및 단백질가수분해산물 등 각종 유용물질을 생산하거나, 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다. For example, in the microalgae-receiving device 70, various processes such as ethanol fermentation, butanol fermentation, and organic acid fermentation are performed on the high-algae microalgae from bioalgae, biochemicals, medicines, health functional foods, and protein hydrolysates. Produce various useful materials or temporarily receive them before sending them to the processing device for producing such useful materials.

예를 들어, 미세조류-수용장치(70)에서 에탄올 발효와 같은 각종 발효를 실행하는 경우라면 미세조류-수용장치(70)는 발효조가 되고, 미세조류-수용장치(70)가 발효조로 보내기 전에 일시적으로 고밀도 미세조류를 저장하는 경우라면 미세조류-수용장치(70)는 저장조가 된다. For example, when the microalgae-receiving device 70 performs various fermentations such as ethanol fermentation, the microalgae-receiving device 70 becomes a fermentation tank, before the microalgae-receiving device 70 sends the fermentation tank to the fermentation tank. In the case of temporarily storing high density microalgae, the microalgae-receiving device 70 becomes a storage tank.

상기 지용성물질-수용장치(80)는 용매-순환라인(60)을 순환하면서 분획조(40)에서 분획 및 재분획된 지용성물질-용매의 지용성물질이 분획조(40)에서 목적하는 정도의 농도로 농축되었을 때, 지용성물질이 농축된 지용성물질-용매를 분획조(40)로부터 배출하여 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다. The fat-soluble material-receiving device 80 is a concentration of the desired amount of the fat-soluble material of the fat-soluble material-solvent fractionated and re-fractionated in the fractionation tank 40 while circulating the solvent-circulation line 60. When the fat-soluble substance is concentrated, the fat-soluble substance-solvent with which the fat-soluble substance is discharged from the fractionation tank 40 is temporarily received for a later desired treatment or a device for the desired treatment.

예를 들어 지용성물질-수용장치(80)는, 지용성물질-용매로부터 지용성물질을 추출하고 지용성물질로부터 바이오디젤을 추출하는 등 각종 처리를 하여 지용성물질로부터 바이오디젤, 의약품, 건강기능성식품 등의 각종 유용물질을 생산하거나 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다. For example, the fat-soluble substance-receiving device 80 performs various treatments such as extracting a fat-soluble substance from a fat-soluble substance-solvent and extracting biodiesel from the fat-soluble substance, and then various kinds of biodiesel, medicine, health functional food and the like from the fat-soluble substance. Temporarily receive the material prior to producing it or sending it to a processing device for producing such material.

예를 들어, 지용성물질-수용장치(80)에서 지용성물질-용매로부터 지용성물질을 추출하고 추출된 지용성물질로부터 바이오디젤을 생산하는 경우라면 지용성물질-수용장치(80)는 증류-바이오디젤 생산조가 되고, 증류-바이오디젤 생산조로 지용성물질-용매를 보내기 전에 일시 저장하는 경우라면, 지용성물질-수용장치(80)는 저장조가 된다. For example, if the fat-soluble substance-receptor 80 extracts the fat-soluble substance from the fat-soluble substance-solvent and produces biodiesel from the extracted fat-soluble substance, the fat-soluble substance-receptor 80 is a distillation-biodiesel production tank. If the fat-soluble material-storage device is temporarily stored before sending the fat-soluble material-solvent to the distillation-biodiesel production tank, the fat-soluble material-receiving device 80 becomes a storage tank.

바람직하게, 본 발명의 장치(1)는, 분획조(40)에서 분획된 미세조류를 그 밀도에 따라 선택적으로 미세조류-순환라인(50)을 통해 배양조(10)로 이송하거나 미세조류-수용장치(70)로 이송하는 제2 연동펌프(3)를 포함한다. 이를 위해, 분획조(40)와 배양조(10) 사이의 미세조류-순환라인(50)에는 제2 연동펌프(3)가 설치되고, 제2 연동펌프(3)로부터 추가의 라인(71)은 미세조류-수용장치(70)에 연결된다. Preferably, the device 1 of the present invention, the microalgae fractionated in the fractionation tank 40 is selectively transferred to the culture tank 10 or the microalgae-through the microalgae-circulation line 50 according to the density thereof. It includes a second peristaltic pump (3) to be transferred to the receiving device (70). To this end, a second peristaltic pump 3 is installed in the microalgae-circulation line 50 between the fractionation tank 40 and the culture tank 10, and an additional line 71 from the second peristaltic pump 3. Is connected to the microalgae-receiving device 70.

이와 같은 제2 연동펌프(3)의 작용으로 분획조(40)의 미세조류의 밀도가 목적하는 밀도에 이르지 못하면 미세조류는 반복적으로 배양조(10)로 순환되어 반복적으로 재배양되고, 목적하는 밀도에 이르면 미세조류-수용장치(70)로 이송된다. If the density of the microalgae of the fractionation tank 40 does not reach the desired density due to the action of the second peristaltic pump 3, the microalgae are repeatedly circulated to the culture tank 10 and repeatedly cultured. When the density is reached, the microalgae-receiving device 70 is transferred.

바람직하게, 본 발명의 장치(1)는 분획조(40)에서 분획된 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 용매조(20)로 이송하거나 지용성물질-수용장치(80)로 이송하는 제3 연동펌프(4)를 포함한다. 이를 위해, 분획조(40)와 용매조(20) 사이의 용매-순환라인(60)에 제3 연동펌프(4)가 설치되고, 제3 연동펌프(4)로부터 추가의 라인(81)이 지용성물질-수용장치(80)에 연결된다. Preferably, the device (1) of the present invention transfers the fat-soluble material-solvent fractionated in the fractionation tank 40 to the solvent tank 20 or to the fat-soluble material-receiving device 80 according to the concentration thereof A pump 4. To this end, a third peristaltic pump 4 is installed in the solvent-circulation line 60 between the fractionation tank 40 and the solvent bath 20, and an additional line 81 from the third peristaltic pump 4 is provided. Fat-soluble material-receiving device (80).

이와 같은 제3 연동펌프(4)의 작용으로 분획조(40)의 지용성물질-용매의 지용성물질의 농도가 목적하는 농도에 이르지 못하면 지용성물질-용매는 계속 용매조(20)로 순환되어 분획에 재사용되고, 목적하는 농도에 이르면 지용성물질-수용장치(80)로 이송된다.
If the concentration of the fat-soluble substance-solvent of the fraction tank 40 does not reach the desired concentration by the action of the third peristaltic pump 4, the fat-soluble substance-solvent continues to be circulated to the solvent tank 20 to the fraction. It is reused and conveyed to fat-soluble material-receiving device 80 when the desired concentration is reached.

이하, 도1 내지 도4를 참조하여 본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법을 설명한다. Hereinafter, a method of producing high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgal culture according to the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 4.

1. 미세조류 고밀도 배양1. Microalgae high density culture

배양조(10)에서 배양하는 미세조류로는, 규조류, 와편모조강, 착편모조류, 남조강, 홍조강, 녹조강 등을 포함한다.The microalgae cultivated in the culture tank 10 include diatoms, coarse-grained imitation steel, flaky imitation algae, southern algae, red algae, green algae and the like.

예를 들어 본 발명에는 Chlorella protothecoides를 이용할 수 있다. C. protothecoides는 대부분의 미세조류보다 10배 이상의 세포 밀도로 배양이 가능하여 바이오매스 확보 차원에 매우 적절하다. C. protothecoides는 종속영양상태인 이상적인 조건에서 최대 35 gfw/L의 수율로 바이오매스를 수확할 수 있으며, 바이오매스의 55%를 지용성물질로 저장할 수 있다. For example, Chlorella protothecoides can be used in the present invention. C. protothecoides can be cultured at 10 times higher cell density than most microalgae, which is very suitable for securing biomass. C. protothecoides can harvest biomass at yields up to 35 gfw / L under ideal conditions in heterotrophic conditions, and store 55% of the biomass as fat-soluble.

미세조류에 의한 지용성물질의 비교적 일정한 생산 속도를 가정하면, 보다 높은 생물량 밀도는 부피당 생산되는 유용물질의 총량을 보다 많게 할 것임은 당연하다. 미세조류를 성장시키기 위한 현재의 통상적인 발효 방법은 약 50 내지 약 80 g/L 또는 그 미만의 생물량 밀도를 생성한다. Assuming a relatively constant production rate of fat-soluble substances by microalgae, it is natural that higher biomass densities will result in higher total amounts of useful substances produced per volume. Current conventional fermentation methods for growing microalgae produce a biomass density of about 50 to about 80 g / L or less.

본 발명자는 본 발명의 방법을 적용함으로써, 현재 공지된 생물량 밀도보다 유의하게 더 높은 생물량 밀도를 달성할 수 있음을 발견하였다. The inventors have found that by applying the method of the present invention, biomass density significantly higher than currently known biomass density can be achieved.

바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 약 100 g/L, 더 바람직하게 적어도 약 130 g/L, 더 바람직하게 적어도 약 150g/L, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 170 g/L, 가장 바람직하게는 200 g/L 를 초과하는 미세조류의 생물량 밀도를 달성한다. Preferably, the process of the invention comprises at least about 100 g / L, more preferably at least about 130 g / L, more preferably at least about 150 g / L, even more preferably at least about 170 g / L, most preferably 200 Achieve biomass density of microalgae in excess of g / L.

따라서, 그러한 높은 미세조류의 생물량 밀도에서, 미세조류의 유용물질 생산 속도가 약간 감소되더라도, 부피당 전체 유용물질 생산 속도는 현재 공지된 공정보다 유의하게 더 높다.Thus, at such high microalgae biomass densities, the overall algal production rate per volume is significantly higher than currently known processes, although the algal yield production rate is slightly reduced.

본 발명에서 미세조류의 배양은 기존 방법으로 미세조류를 배양한 후, 미세조류 배양액을 지용성물질 추출용매와 혼합 및 분획하고, 분획된 미세조류를 재배양하는 한편, 재배양된 미세조류를 지용성물질-용매(미세조류 배양액의 지용성물질이 지용성물질 추출용매에 용해된 용액)와 혼합 및 재분획하는 재배양 및 재분획 과정을 반복적으로 수행하며, 이로써 미세조류 배양액의 미세조류가 50 ~ 200 gdw/L 밀도가 될 정도로 미세조류를 고밀도 배양하여 높은 생산성을 확보한다. In the present invention, the culture of the microalgae, after culturing the microalgae by the conventional method, mixed and fractionated the microalgae culture solution with the fat-soluble material extraction solvent, and cultivated the fractionated microalgae, the cultured microalgae fat-soluble material Repeatedly cultivation and re-fractionation of mixing and re-fractionation with the solvent (solution in which the oil-soluble substance of the microalgal broth is dissolved in the oil-soluble substance extraction solvent) is repeated, thereby reducing the microalgae of the microalgal broth to 50 to 200 gdw / High productivity is secured by culturing microalgae to the extent that L density becomes high.

C. protothecoides는 글루코오스 또는 옥수수 감미료 가수분해물(CSH)에 종속 영양적으로 성장할 수 있다. 종속영양성장은 지용성물질 함량을 증가시키고, 태양 에너지에 대한 직접적 의존성을 감소시킬 수 있다. C. protothecoides로부터 생산된 바이오디젤의 에너지 밀도는 석유 기반 디젤과 실질적으로 동등하다. Chlorella는 분자생물적인 방법으로 엔지니어링하기 용이하고 강화된 CO2로 대규모 포토바이오렉터에서 배양이 가능하다. C. protothecoides can be heterotrophically grown on glucose or corn sweetener hydrolysates (CSH). Heterotrophic growth can increase fat-soluble content and reduce direct dependence on solar energy. The energy density of biodiesel produced from C. protothecoides is substantially equivalent to that of petroleum-based diesel. Chlorella is easy to engineer by molecular biological methods and can be cultured in large-scale photobiotors with enhanced CO 2 .

2. 미세조류에서 지용성물질의 추출2. Extraction of fat-soluble substances from microalgae

미세조류를 이용한 바이오매스 및 유용물질 생산에 관련된 주요 비용은 큰 부피의 배양액으로부터 미세조류를 수확하는 과정에서 발생한다. 미세조류 배양액으로부터 미세조류를 수확하고 건조한 후 파괴하여 지용성물질을 추출하는 과정을 포함하는 종래의 지용성물질 생산 방법에서, 이런 과정에 소요되는 비용이 전체 비용의 40-60%를 차지한다. The main costs associated with the production of biomass and useful materials using microalgae arise from the harvesting of microalgae from large volumes of culture. In the conventional fat-soluble material production method, which includes harvesting the microalgae from the microalgae culture, drying and destroying to extract the fat-soluble material, the cost of this process accounts for 40-60% of the total cost.

또한 본 발명자의 대한민국 특허출원 제10-2010-0043955호의 방법에서는 지용성물질 추출용매로 일회 분획한 후에 지용성물질-용매에서 지용성물질을 추출하는 것이므로 많은 양의 지용성물질 추출용매가 필요하나, 본 발명은 분획된 지용성물질-용매를 다시 사용하여 재배양된 미세조류를 재분획함으로써 지용성물질을 농축한 후에 추출하는 방법이므로, 지용성물질 추출용매의 사용량을 줄일 수 있다. In addition, in the method of Korean Patent Application No. 10-2010-0043955 of the present inventors, since the fat-soluble material is extracted from the fat-soluble material-solvent after fractionation with a fat-soluble material extraction solvent, a large amount of the fat-soluble material extracting solvent is required. Since the fractionated fat-soluble material-solvent is used again to concentrate and extract the fat-soluble material by re-fractionation of the cultured microalgae, the amount of the fat-soluble material extraction solvent can be reduced.

또한, 종래의 방법은 지용성물질을 추출한 후 세포가 파괴되어 지용성물질을 제외한 다른 생체분자를 수확하기 어려우나, 본 발명은 저비용의 비파괴적인 재순환 배양에 의해 종래의 문제점을 완화 및 극복한다. In addition, the conventional method is difficult to harvest other biomolecules other than the fat-soluble material after the cells are destroyed after extracting the fat-soluble material, the present invention alleviates and overcomes the conventional problems by low-cost non-destructive recycle culture.

본 발명에 사용하는 지용성물질 추출용매는, 지용성물질에 대해 선택성이 높고, 생물학적으로 적합하여 세포 활성에 커다란 손실 없이 세포와 접촉할 수 있는 용매로서, 일반적으로 옥탄올 개수(log Poct, 옥탄올 물 분할 계수의 로그)가 5이상이다(Dodecanone은 이 규칙에서 예외이다). 옥탄올 개수 4-5인 용매 중에 헥산(hexane), 헵탄(heptane)은 세포에 유독하고, 데칸올(decanol), 다이펜틸 에테르(dipentyl ether)는 세포에 무해하다. The fat-soluble extracting solvent used in the present invention is a solvent that is highly selective for the fat-soluble substance and is biologically suitable so that it can come into contact with the cells without a significant loss of cell activity. Generally, the number of octanols (log Poct, octanol water Log of partition coefficient) is greater than or equal to 5 (Dodecanone is an exception to this rule). Hexane and heptane are toxic to cells in a solvent having an octanol number of 4-5, and decanol and dipentyl ether are harmless to cells.

본 발명에 적용할 수 있는 예시적인 지용성물질 추출용매로서는, 1,12-도데칸디오익 산 디에틸 에테르(1,12-dodecanedioic acid diethyl ether), n-헥산(n-hexane), n-헵탄(n-heptane), n-옥탄(n-octane), n-도데칸(n-dodecane), 초산 도데실(dodecyl acetate), 데칸(decane), 다이헥실 에테르(dihexyl ether), 이소파(isopar), 1-도데칸올(1-dodecanol), 1-옥탄올(1-octanol), butyoxyethoxyehteane, 3-옥타논(3-octanone), 고리형 파라핀(cyclic paraffins), 바솔(varsol), 이소파라핀(isoparaffins), 분지형의 알칸(branched alkane), 올레일 알코올(oleyl alcohol), dihecylether, 2-도데칸(2-dodecane) 등이 포함된다. Exemplary fat-soluble extracting solvents applicable to the present invention include 1,12-dodecanedioic acid diethyl ether, n-hexane, n-heptane (n-heptane), n-octane, n-dodecane, n-dodecane, dodecyl acetate, decane, dihexyl ether, isopar ), 1-dodecanol, 1-octanol, butyoxyethoxyehteane, 3-octanone, cyclic paraffins, varsol, isoparaffin ( isoparaffins, branched alkane, oleyl alcohol, dihecylether, 2-dodecane and the like.

본 발명에 사용되는 지용성물질 추출용매는, C4-C16 탄화수소 1개 이상을 포함할 수 있고, C10, C11, C12, C13, C14, C15 또는 C16 개의 탄화수소를 포함할 수 있다. The fat-soluble extracting solvent used in the present invention may include one or more C4-C16 hydrocarbons, and may include C10, C11, C12, C13, C14, C15 or C16 hydrocarbons.

진동분쇄장치(31)에 의한 세포 손상 없는 미생물에의 초음파조사는, 저주파에서 양-의존적(dose-dependent)이다. 주파수가 증가하면, 긴 조사시간에도 미생물이 생존한다. 세포 활성에 영향이 없고 지용성물질의 추출을 최적화할 수 있는 주파수 법위(20 kHz ~ 1 MHz)에서 적절하게 세분된 주파수범위 및 다른 노출시간에 따른 강도를 결정하는 연구를 수행하여 다양한 다른 주파수, 강도와 노출되는 시간 등이 추출 효율에 영향을 줌을 알았다. Ultrasonic irradiation to the microorganisms without cell damage by the vibration crushing device 31 is dose-dependent at low frequencies. As the frequency increases, the microorganisms survive long irradiation times. Various frequency and intensity studies have been conducted to determine the appropriately subdivided frequency range and intensity over different exposure times at a frequency regime (20 kHz to 1 MHz) that has no effect on cell activity and can optimize the extraction of fat-soluble substances. And the exposure time influenced the extraction efficiency.

적정주파수 범위(20 kHz ~ 60 kHz)에서 다른 노출시간에 따른 이상적인 강도로 미세조류에 손상 없이 지용성물질의 추출을 최적화하기 위해 이용될 수 있다. 즉, 주파수, 강도와 노출시간 등이 지용성물질 추출효율에 영향을 미친다. 세포 크기, 세포 형상, 세포벽 조성물 그리고 생리학적 상태가 세포와 초음파의 상호작용에 복합적으로 영향을 주기 때문에 이상적인 지용성물질의 추출을 위해 20 kHz와 1 MHz, 20-100 kHz, 20-60 kHz, 30-50 kHz, 또는 40 kHz 등의 다양한 주파수 중 이상적인 주파수를 결정하여 사용할 수 있다. 지용성물질 추출용매와 진동분쇄의 적절한 조합으로, 거의 100%까지 지용성물질(세포 총 지방산의 10%)의 추출효율을 달성할 수 있다. It can be used to optimize the extraction of fat-soluble substances without damaging the microalgae with an ideal intensity over different exposure times in the appropriate frequency range (20 kHz to 60 kHz). In other words, frequency, intensity and exposure time affect the extraction efficiency of fat-soluble substances. Since cell size, cell morphology, cell wall composition and physiological state are complex effects on the interaction between cells and ultrasound, 20 kHz and 1 MHz, 20-100 kHz, 20-60 kHz, 30 The ideal frequency can be determined from various frequencies such as -50 kHz or 40 kHz. With a suitable combination of lipophilic extraction solvent and vibration pulverization, extraction efficiency of lipophilic materials (10% of total cell fatty acids) can be achieved up to nearly 100%.

진동분쇄 대신에 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용액 혼합물을 교반할 경우에도 미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가(개선)시킴으로써, 진동분쇄와 같이 지용성물질 추출효율을 향상시킬 수 있다. 물론 진동분쇄와 교반을 함께 실행하는 것도 가능하다.
Even when the microalgal culture solution and the fat-soluble substance extract solution mixture are stirred instead of the vibration milling, by increasing (improving) the contact between the microalgal culture medium and the fat-soluble substance extraction solvent, the fat-soluble substance extraction efficiency, such as vibration grinding, can be improved. It is of course also possible to carry out vibration grinding and stirring together.

이하, 구체적인 실시예에 의해 본 발명에 따른 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법을 설명한다. Hereinafter, the high density microalgae and the concentrated fat-soluble material production method through the microalgae culture according to the present invention by specific examples.

실시예 1. 미세조류의 배양Example 1 Cultivation of Microalgae

Chlorella protothecoides를 프로테오스 사면한천(proteose agar slant)에 유지하면서 본 발명에 사용하였다. Chlorella protothecoides were used in the present invention while maintaining in proteose agar slant.

기본배지의 성분은 1 리터당 KH2P04(0.7g), K2HPO4(0.3g), MgSO4·7H2O( 0.3g), FeSO4·7H2O(3mg). 우레아(1g), Arnon's A Solution(1 ml), thiamine hvdrochloride(l0㎍), pH 6.3이었다. 배양은 5 % CO2, 20도, 15,000 lux 형광등에서 실행하였다. The basic medium consisted of KH 2 P0 4 (0.7g), K 2 HPO 4 (0.3g), MgSO 4 · 7H 2 O (0.3g), FeSO 4 · 7H 2 O (3mg) per liter. Urea (1 g), Arnon's A Solution (1 ml), thiamine hvdrochloride (10 μg), pH 6.3. The culture was carried out in 5% CO 2 , 20 degrees, 15,000 lux fluorescent lamp.

Arnon's A5 용액의 조성은 리터당 H3BOS3(2.9 g), MnCl2·4H2O(1.8 g), ZnSO4·7H2O(0.22 g), CuSO4· 5H2O(0.08 g), MoO3(0.018 g) 이었다. The composition of the Arnon's A5 solution consists of H 3 BOS 3 (2.9 g), MnCl 2 · 4H 2 O (1.8 g), ZnSO 4 · 7H 2 O (0.22 g), CuSO 4 · 5H 2 O (0.08 g), MoO 3 (0.018 g).

Chlorella protothecoides의 종속영양 배양은 기본배지에서 0.1% 우레아 대신에 0.01% 우레아 및 4.0% 포도당을 첨가하여 수행했다. Heterotrophic cultures of Chlorella protothecoides were performed in basal medium with 0.01% urea and 4.0% glucose instead of 0.1% urea.

실시예 2. 미세조류에 미치는 지용성물질 추출용매의 효과Example 2 Effect of Fat-Soluble Extraction Solvent on Microalgae

C. protothecoides 배양액에 C10 내지 C16 알칸(alkanes)의 지용성물질 추출용매를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 분획된 C. protothecoides 용액 1 ml을 1/100,000배 희석하여 1.5% 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니를 계수하여 지용성물질 추출용매가 C. protothecoides의 생존에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과는 도2와 같으며, 지용성물질 추출용매가 세포의 생존에 아무런 영향이 없었음을 알 수 있다. After treatment with C. protothecoides culture solution for 5 minutes at 5: 1 ratio of C10 to C16 alkanes fat soluble extractant, 1 ml of fractionated C. protothecoides solution was diluted 1 / 100,000-fold and smeared on 1.5% agar plate. The colonies formed were counted to evaluate the effect of the soluble extractant on the survival of C. protothecoides. The results are shown in FIG. 2, and the soluble extractant did not affect cell survival. .

실시예 3. 미세조류의 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질 추출용매 및 초음파의 효과Example 3 Effects of Fat-Soluble Extraction Solvent and Ultrasonic on Extracting Fat-Soluble Compounds from Microalgae

C. protothecoides의 생장율이 로그구간에 있는 배양액과 헥산(hexane)과 데칸(decane) 용매(지용성물질 추출용매)를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 수조에서 2초간 40 kHz로 진동 분쇄하였다. C. The growth rate of protothecoides in the log section was treated with 5: 1 ratio for 5 minutes at the hexane and decane solvents (fat soluble extractant), followed by vibration pulverization at 40 kHz for 2 seconds in a water bath. .

지용성물질 추출용매로 추출된 지용성물질은 비누화되었으며 유리 지방산을 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 그 결과는 도3과 같으며, 10%의 총세포 지방산이 5분간의 지용성물질 추출용매 혼합과 추가적인 2초간의 진동 분쇄로 추출되었다. 짧은 진동 분쇄가 지용성물질 추출 정도를 75% 정도 증가시켰다. The fat-soluble substance extracted with the fat-soluble substance was saponified, and the free fatty acid was measured by LC-MS analysis based on C17. The results are shown in Figure 3, 10% total cell fatty acid was extracted by mixing the solvent-soluble extractant for 5 minutes and vibration grinding for an additional 2 seconds. Short vibration grinding increased the extraction of fat-soluble substances by 75%.

실시예 4. 미세조류 고밀도 배양 및 농축된 지용성물질-용매 혼합물의 분획Example 4 Microalgae High Density Culture and Fractionation of Concentrated Fatty-Soluble-Solvent Mixture

5L의 배양조(10)에서 교반속도, 150 rpm, 조도 15,000 lux 하 혹은 암반응하 에서 C. protothecoides를 로그구간까지 배양하였다. C. protothecoides were incubated in a 5 L culture tank (10) under agitation speed, 150 rpm, roughness 15,000 lux or under a dark reaction to a log section.

배양조(10)의 미세조류 배양액과 용매조(20)의 데칸(decane) 용매(지용성물질 추출용매)를 혼합조(30)로 이송하되 5:1비율로 이송하고, 이들을 혼합하여 5분간 방치한 후 진동분쇄장치(31)로 2초간 40 kHz로 진동 분쇄하였다. The microalgal culture solution of the culture tank 10 and the decane solvent (lipophilic material extraction solvent) of the solvent tank 20 are transferred to the mixing tank 30, but are transferred at a 5: 1 ratio, and mixed and left for 5 minutes. After that, the vibration mill was vibrated at 40 kHz for 2 seconds.

미세조류 배양액과 지용성물질 추출용매의 혼합물을 분획조(40)로 이송하여 60분간 분획하여, 지용성물질-용매(층), 물(층) 및 미세조류(층)가 상하로 분획됨을 확인하였다. The mixture of the microalgal culture solution and the fat-soluble material extraction solvent was transferred to the fractionation tank 40 and fractionated for 60 minutes, and it was confirmed that the fat-soluble material-solvent (layer), water (layer) and microalgae (layer) were partitioned up and down.

이후 미세조류(층)는 미세조류-순환라인(50)을 통해 배양조(10)로 이송하고 배양액을 첨가하여 재배양하였고, 지용성물질-용매(층)는 용매-순환라인(60)을 통해 용매조(20)로 이송하였다. Then, the microalgae (layers) were transferred to the culture tank 10 through the microalgae-circulation line 50 and cultured by adding the culture solution, and the fat-soluble material-solvent (layer) was passed through the solvent-circulation line 60. Transfer to the solvent bath (20).

미세조류 지용성물질 추출 후에 미세조류의 재배양을 수행하여 분석한 결과, 즉 지용성물질 추출로 지용성물질 추출용매에 의해 저해를 받은 미세조류 배양액을 배양조(10)로 이송하여 재배양한 결과, 성장 속도가 0.028 g/h로 나타났다. As a result of analyzing the microalgae culture after extraction of the microalgae fat-soluble substance, that is, the microalgae culture solution inhibited by the solvent-soluble extraction solvent by the extraction of the fat-soluble substance was transferred to the culture tank (10) and grown, The rate was found to be 0.028 g / h.

배양조에서의 일반적인 발효조 배양의 경우 성장 속도가 약 0.033 g/h 인 것과 비교하면 동시 추출 후 균주의 재배양하는 것에는 문제가 없다는 결과를 얻었다. In the case of general fermenter culture in the culture tank, there was no problem in culturing the strain after the simultaneous extraction compared to the growth rate of about 0.033 g / h.

상기 배양, 혼합 및 분획 과정을 일일 일회씩 2~20회 반복하여 미세조류 50~200 gdw/L 밀도로 배양하고 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를 확보하였다. 이와 같은 분획 및 배양 과정을 반복함에 따라 미세조류 밀도 및 지용성물질이 매 단계마다 2~3 배 증가하여 포화됨을 확인하였다.The culture, mixing and fractionation process was repeated 2 to 20 times once daily to incubate at a density of 50 to 200 gdw / L of microalgae to obtain a fat-soluble material-solvent containing concentrated fat-soluble material. As the fraction and the culture process was repeated, it was confirmed that the microalgae density and fat-soluble substance increased by 2 to 3 times at each step and saturated.

실시예 5. 분획된 지용성물질-용매에서 지방산의 추출Example 5 Extraction of Fatty Acids from Fractionated Fat-Soluble-Solvents

지용성물질인 지방산의 추출은 지용성물질-수용장치(80)의 예에 해당하는 둥근 바닥형 플라스크가 부착된 Buchi 210/215 회전식 증발기(rotovapor)(스위스, Buchi사)를 사용하였다. 분획된 지용성 물질-용매를 증발기로 이송하여 둥근 바닥형 플라스크 안에 위치하게 하였다. 차가운 원수는 응축 장치로 유입되고 증류 플라스크의 오일 배스는 174℃에 세팅하였다. The extraction of fatty acid as a fat soluble substance was performed using a Buchi 210/215 rotovapor (Buchi, Switzerland) with a round bottom flask corresponding to an example of the fat soluble substance-receptor 80. The fractionated fat-soluble substance-solvent was transferred to an evaporator and placed in a round bottom flask. Cold raw water flowed into the condenser and the oil bath of the distillation flask was set at 174 ° C.

증류가 시작했을 때, 가스 데칸(decane)이 기구를 통과하여 콘덴서에 유입되고 액체 상태로 수용 플라스크에 모였다. 증류가 종결될 때, 수용 플라스크에 회수된 데칸(decane)의 부피 및 증류 플라스크 내에 남겨진 미세조류 지용성물질의 부피를 측정하고 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 회수된 데칸용매는 용매조(20)로 이송하여 재사용하였다.When distillation started, gas decane passed through the instrument into the condenser and collected in the receiving flask in liquid form. At the end of the distillation, the volume of decane recovered in the receiving flask and the volume of microalgal solubles remaining in the distillation flask were measured and measured by LC-MS analysis using C17 as a standard. The recovered decane solvent was transferred to the solvent bath 20 and reused.

실시예 6. 미세조류 지방산에서 바이오디젤 추출Example 6 Biodiesel Extraction from Microalgal Fatty Acids

메탄올과 가성소다를 교반하여 메톡시드(methoxide)를 제조하고, 제조된 메톡시드를 교반기에 투입하고 교반하여, 추출된 미세조류 지용성물질과 메톡시드를 반응시켜 바이오디젤과 글리세린 및 비누 고형성분을 형성하였다. 이들 생성물들을 원심분리기에 공급하여 원심 분리시키고, 각각의 비중 차이에 의해 상부에는 바이오디젤이 위치되고 하부에는 비중이 무거운 글리세린 및 비누 성분이 위치되게 상하 분리시켰다. Methanol and caustic soda were stirred to prepare methoxide, and the prepared methoxide was added to a stirrer and stirred to react the extracted microalgae fat-soluble substance with methoxide to form biodiesel, glycerin, and soap solid component. It was. These products were fed to a centrifuge and centrifuged, and the top and bottom were separated so that the biodiesel was positioned at the top and the heavy glycerine and soap components were located at the bottom by the difference in specific gravity.

이와 같이 분리되어 하부에 위치된 글리세린과 비누 성분은 별도의 글리세린 저장탱크로 배출하였고, 상부에 위치된 바이오디젤과 바이오디젤 량의 2배 정도의 물을 교반기에 투입하여 교반시킴으로써, 바이오디젤 안에 포함되어 있는 글리세린과 비누성분 및 메탄올 성분이 물에 용해시키고, 이와 같이 교반된 용액을 다시 원심분리기에 투입하여 분리시킴으로써 물에 용해된 글리세린 등의 잡성분이 분리하였고, 이들 잡성분을 포함한 폐수용액은 별도의 배출라인을 통하여 글리세린 저장탱크로 배출하였으며, 최종적으로 히터장치인 증류기를 작동시켜 바이오디젤 속에 잔류하는 1~2% 정도의 물을 증발시켜 날려 보내는 증류공정을 실시하여 최종적으로 바이오디젤을 수확하였다. The separated glycerin and soap components separated in this way were discharged into separate glycerin storage tanks, and the biodiesel contained in the biodiesel was added to the stirrer by stirring with water of about twice the amount of biodiesel and biodiesel placed at the top. The glycerin, soap component and methanol component dissolved in water were dissolved in water, and the stirred solution was put into a centrifuge again to separate miscellaneous components such as glycerin dissolved in water, and the wastewater solution containing these miscellaneous components was The product was discharged to a glycerin storage tank through a separate discharge line. Finally, a biodiesel was harvested by performing a distillation process by evaporating 1 ~ 2% of water remaining in the biodiesel by operating a distiller, which is a heater. It was.

수확한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS(Gas Chromatography/Time of flight/Mass spectrometry; GC-6890N,. Agilent Technologies, USA) 분석을 한 결과는 도4와 같다. Analysis of GC-TOF-MS (Gas Chromatography / Time of Flight / Mass spectrometry; GC-6890N, Agilent Technologies, USA) analysis of the harvested biodiesel is shown in FIG.

실시예 7. 분획된 지용성물질-용매에서 베타-카로틴의 분석Example 7 Analysis of Beta-Carotene in Fractionated Fat-Soluble-Solvents

상기에서 분획된 지용성물질-용매에 있는 베타-카로틴의 함량을 워터스 스페리소브(Waters Spherisorb) S5 ODS2 카트리지 칼럼(4.6x250 mm)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard Series model 1100)를 사용하여 측정하였다.The content of beta-carotene in the fractionated fat-soluble material-solvent was measured using HPLC (Hewlett Packard Series model 1100) equipped with a Waters Spherisorb S5 ODS2 cartridge column (4.6x250 mm).

색소를 분리하기 위해 용매를 1.0ml/분의 속도로 흘려주면서 0 내지 1분 사이에는 아세토니트릴 90%, 증류수 9.99% 및 트리에틸아민이 0.01%, 2 내지 14분에는 아세토니트릴 86%, 증류수 8.99%, 트리에틸아민 0.01 % 및 에틸아세테이트5%로 하였으며, 15 내지 21분 동안은 100% 에틸아세테이트를 사용하였다. 포스트 런(post-run)은 처음 시작한 용매로 9분간 하였다. 레퍼런스(Jin et al., 2001 Biochim Biophys Acta 1506:244-2597)를 550nm로 한 경우 베타-카로틴 색소는 445nm에서 검출되었으며, 베타-카로틴(DHI water and environment사, Denmark)을 정량한 표준곡선을 기초로 베타-카로틴의 양을 측정한 그 결과 8.72x10-10μM이었다.Solvent was flowed at a rate of 1.0 ml / min to separate the dye, 90% acetonitrile, 9.99% distilled water and 0.01% triethylamine in 0 to 1 minute, 86% acetonitrile in 2 to 14 minutes, distilled water 8.99 %, Triethylamine 0.01% and ethyl acetate 5%, 100% ethyl acetate was used for 15 to 21 minutes. Post-runs were run for 9 minutes with the first solvent. When the reference (Jin et al., 2001 Biochim Biophys Acta 1506: 244-2597) was set at 550 nm, the beta-carotene pigment was detected at 445 nm, and a standard curve for quantifying beta-carotene (DHI water and environment, Denmark) was used. The amount of beta-carotene was measured on a basis of 8.72 × 10 −10 μM.

실시예 8. 분획된 미세조류의 에탄올 발효Example 8 Ethanol Fermentation of Fractionated Microalgae

미세조류-수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다. 분획된 미세조류를 각각 제시된 양을 함유하는 GS-2 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다. A fermenter, an example of the microalgae-receiving device 70, was constructed using a microbial fermenter (INNO 200603, Innobio, Korea). Clostridium phytofermentans were grown in culture tubes containing GS-2 medium each containing the fractions of the fractionated microalgae.

GS-2 배지는 효모 추출물 6.0, 우레아 2.1, K2HPO4 2.9, KH2PO4 1.5, MOPS 10.0, 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0, 시스테인 하이드로클로라이드 2.0(각각 g/L로 표시됨)을 포함한 것이었다. 배지의 초기 pH는 7.5 이고, 초기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 농도는 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL이고, 30℃의 N2 분위기 하에서 배양하였다. GS-2 medium contained yeast extract 6.0, urea 2.1, K 2 HPO 4 2.9, KH 2 PO 4 1.5, MOPS 10.0, trisodium citrate dihydrate 3.0, cysteine hydrochloride 2.0 (represented in g / L, respectively) . The initial pH of the medium was 7.5, the initial Clostridium phytofermentans concentration was 0.8-1.1 × 10 7 cells / mL, and the cells were cultured under N 2 atmosphere at 30 ° C.

분획된 미세조류의 발효 완료시 에탄올 농도를 결정하였다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 에탄올 발효와 동시에 수소를 발생시켰다. 에탄올 농도는 RI 검출기가 장착된 HPLC (Breeze HPLC system, Waters Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, 칼럼은 Aminex HPX-87H(3007.8㎜, Bio-rad)를 사용하였다. Ethanol concentration was determined at the completion of fermentation of the fractionated microalgae. Clostridium phytofermentans generated hydrogen simultaneously with ethanol fermentation. Ethanol concentration was analyzed using HPLC equipped with RI detector (Breeze HPLC system, Waters Co., USA) and the column was Aminex HPX-87H (3007.8 mm, Bio-rad).

분획된 미세조류 밀도가 10 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.23 ~ 0.26%(v/v) 이었다. 분획된 미세조류 밀도가 20g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.42 ~ 0.54%(v/v)이었다. 분획된 미세조류 밀도가 40 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.92 ~ 1.20%(v/v)이었다. 에탄올 증류는 증류조를 이용하여 수행하였다.When the fractionated microalgal density was 10 g / L, the concentration of ethanol was 0.23 to 0.26% (v / v). When the fractionated microalgal density was 20 g / L, the concentration of ethanol was 0.42 to 0.54% (v / v). When the fractionated microalgal density was 40 g / L, the concentration of ethanol was 0.92-1.20% (v / v). Ethanol distillation was performed using a distillation tank.

이런 결과는, 분획된 미세조류의 밀도가 증가함에 따라 에탄올의 농도가 증가하기 때문에, 더 높은 밀도의 분획된 미세조류가 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 작용을 저해하지 않음을 나타낸다. 결국, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분획된 미세조류 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가 없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 에탄올로 발효시킴을 알 수 있다. This result indicates that higher density of the fractionated microalgae does not inhibit the action of Clostridium phytofermentans because the concentration of ethanol increases as the density of fractionated microalgae increases. As a result, it can be seen that Clostridium phytofermentans ferment these cellulose feedstocks with ethanol without chemical pretreatment of fractionated microalgal feedstocks and addition of cellulase or other enzymes.

실시예 9. 에탄올의 추출Example 9 Extraction of Ethanol

에탄올 발효로 생성된 발효산물을 증류기로 이송하여 에탄올 증류하였다. 이때 에탄올의 증발이 이루어지도록 오일배스를 작동시켜 에탄올의 증발온도 이상으로 가열시켰다. 가열시 물의 증발온도보다 높을 경우 수분이 증발되어 에탄올과 섞여 에탄올의 농도가 저하될 수 있으므로, 기화온도는 섭씨 78.3∼85℃ 사이에서 형성시켜 일정시간동안 가열하며, 고농도의 에탄올을 기화시킨 후 별도의 에탄올저장탱크에서 응축하여 저장하였다.Fermentation products produced by ethanol fermentation were transferred to a distiller to distill ethanol. At this time, the oil bath was operated to evaporate ethanol and heated above the evaporation temperature of ethanol. If the water is higher than the evaporation temperature during heating, water may evaporate and be mixed with ethanol to reduce the concentration of ethanol. Therefore, the vaporization temperature is formed between 78.3∼85 ℃ and heated for a certain time, and the high concentration of ethanol is vaporized separately. Condensation was carried out in an ethanol storage tank.

실시예 10. 분획된 미세조류의 부탄올 발효Example 10 Butanol Fermentation of Fractionated Microalgae

미세조류-수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다. A fermenter, an example of the microalgae-receiving device 70, was constructed using a microbial fermenter (INNO 200603, Innobio, Korea).

Clostridium thermocellum을 DSM 배지에서 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 혐기배양하였다. 분획된 미세조류를 5L의 발효조(50)로 이송하고 상기 C. thermocellum 배양액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 3일간 배양하여 당화시켰다[Biotechnology Letters Vol 7 No 7 509-514 (1985)]. 접종한 후에, 상기 배양액에는 질소 기체를 주입하여 혐기성 조건을 유지하였다.Clostridium thermocellum was anaerobicly cultured with DSM medium at a temperature of 60 ° C., anaerobic conditions and 150 rpm. The fractionated microalgae were transferred to 5 L fermentation tank 50 and inoculated with the C. thermocellum culture solution (5%, v / v), and then cultured for 3 days with stirring at a temperature of 60 ° C., anaerobic conditions and 150 rpm, and saccharified. Biotechnology Letters Vol 7 No 7 509-514 (1985). After inoculation, the culture solution was injected with nitrogen gas to maintain anaerobic conditions.

부탄올 발효를 위해 포자상태의 현탁액으로 있는 Clostridium acetobutylicum에 섭씨 80도에서 10분 동안 열을 가하였다. 그 후 배지 내에서 온도 37℃의 온도에서 혐기배양 하였다.For butanol fermentation, Clostridium acetobutylicum, a spore suspension, was heated for 10 minutes at 80 degrees Celsius. Thereafter, the cells were anaerobicly cultured at a temperature of 37 ° C.

상기 발효기에 상기 C. acetobutylicum 배양액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 37℃, 혐기성조건, 180 rpm 교반하면서 혐기성 부탄올 발효를 하였다. 발효 과정 중에, 주기적으로 시료를 채취하여 미생물의 생장 및 부탄올 농도 분석을 수행하였다. After inoculating the C. acetobutylicum culture solution (5%, v / v) to the fermenter, anaerobic butanol fermentation was carried out while stirring at a temperature of 37 ° C., anaerobic conditions and 180 rpm. During the fermentation process, samples were taken periodically to analyze the growth and butanol concentration of the microorganisms.

사용한 DSM 배지는 리터당 1.3 g의 (NH4)2SO4, 2.6 g의 MgCl2·6H2O, 1.43 g의 KH2PO4, 7.2 g의 K2HPO4·3H2O, 0.13 g의 CaCl2·6H2O, 1.1 mg의 FeSO4·7H2O, 6.0 g의 sodium β-glycerophosphate, 4.5 g의 이스트 추출물(yeast extract), 10 g의 탄소원(필터 페이퍼, 셀룰로스로 가공된 덩어리 또는 셀로바이오스), 0.25 g의 환원된 글루타티온 및 1 mg의 레사주린(resazurin)을 포함하였다. pH는 1 M HCl 혹은 1 M NaOH으로 5.0에서 8.0까지 조정하였다. The DSM medium used was 1.3 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.6 g MgCl 2 · 6H 2 O, 1.43 g KH 2 PO 4 , 7.2 g K 2 HPO 4 · 3H 2 O, 0.13 g CaCl 2 · 6H 2 O, 1.1 mg of FeSO 4 · 7H 2 O, 6.0 g of sodium β-glycerophosphate, 4.5 g of yeast extract, 10 g of carbon source (filter paper, cellulose processed mass or cellobiose ), 0.25 g of reduced glutathione and 1 mg of resazurin. pH was adjusted from 5.0 to 8.0 with 1 M HCl or 1 M NaOH.

C. acetobutylicum 배양 배지는 0.75 g의 KH2PO4, 0.75 g의 K2HPO4, 0.4 g의 MgSO4·H2O, 0.01 g의 MnSO4·H2O, 0.01 g의 FeSO4·7H2O, 0.5 g의 시스테인; 5 g의 이스트 추출물, 2 g의 아스파라긴·H2O, 2 g의 (NH4)2SO4을 포함했다. C. acetobutylicum culture medium is 0.75 g of KH 2 PO 4, 0.75 g of K 2 HPO 4, 0.4 g of MgSO 4 · H 2 O, 0.01 g MnSO 4 · H 2 O, 0.01 g FeSO 4 · 7H 2 of 0, 0.5 g of cysteine; 5 g of yeast extract, 2 g of asparagine.H 2 O, 2 g of (NH 4 ) 2 SO 4 were included.

상기 연속 공정 후 미생물이 생산한 아세톤, 부탄올 및 에탄올은 FID(Flame Ionization Detector)가 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent technology 6890N Network GC system)를 이용하여 정량하였으며, 컬럼은 HP-INNOWAX (30 cm x 250㎛ x 0.25㎛, Agilent technology)를 사용하였다. 시료 주입부 및 검출부의 온도는 250℃로, 오븐은 50℃에서 10℃/분의 속도로 170℃까지 상승하도록 설정하였다. 발효액에는 부탄올 13 g/L, 아세톤 8 g/L, 에탄올 0.5g/L 이 함유되었다.Acetone, butanol and ethanol produced by the microorganisms after the continuous process were quantified using gas chromatography (Agilent technology 6890N Network GC system) equipped with Flame Ionization Detector (FID), and the column was HP-INNOWAX (30 cm x 250). Agilent technology) was used. The temperature of the sample injection part and the detection part was set to 250 degreeC, and the oven was raised to 50 degreeC from 50 degreeC to 10 degreeC / min. The fermentation broth contained 13 g / L butanol, 8 g / L acetone and 0.5 g / L ethanol.

실시예 11. 부탄올의 추출Example 11 Extraction of Butanol

이온성 액체인 BMIM-TFSI 이미드[1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 비스(트리플루오로메틸설포닐)][1-butyl-3-methyl imidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl) imide], 및 BMIM-PF6(1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 헥사플루오로포스페이트)(1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate)를 이용하여 부탄올을 추출하였다. 상기 발효기에 있는 발효액에 BMIM-TFSI(시그마 알드리치, 미국) 동량으로 혼합한 혼합액, 및 상기 발효액 동량으로 BMIM-PF6(시그마 알드리치, 미국)을 혼합한 혼합액을 각각 볼텍싱하여 부탄올을 추출하였다. 이때 일반적인 이온성 액체 제조 방법을 사용하여 제조한 것을 이용하는 것도 가능하다. 실험 결과 BMIM-TFSI를 사용한 경우에는 60±1%의 부탄올이 추출되었고, BMIM-PF6를 이용한 경우에는 64±%의 부탄올이 추출되었음을 확인하였다.Ionic liquid BMIM-TFSI imide [1-butyl-3-methyl imidazolium bis (trifluoromethylsulfonyl)] [1-butyl-3-methyl imidazolium bis (trifluoromethylsulfonyl) imide], and BMIM-PF6 Butanol was extracted using (1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate) (1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate). Butanol was extracted by vortexing a mixed solution obtained by mixing the same amount of BMIM-TFSI (Sigma Aldrich, USA) into the fermentation broth in the fermentor, and a mixed solution of BMIM-PF6 (Sigma Aldrich, USA) in the same amount as the fermentation broth. It is also possible to use what was manufactured using the general ionic liquid manufacturing method at this time. As a result, it was confirmed that 60 ± 1% butanol was extracted using BMIM-TFSI, and 64 ±% butanol was extracted using BMIM-PF6.

실시예 12. 분획된 미세조류에서 유기산 발효Example 12 Organic Acid Fermentation in Fractionated Microalgae

미세조류-수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오 사, 한국)를 이용하여 구성하였다. 젖산발효균주인 Lactobacillus brevis subsp. brevis)는 PYG 배양액(배지조성은 1 리터당 펩톤 20.0g, 포도당 5.0g, 이스트파우터 10.0g, NaCl 0.08g, Cysteine hydrochloride 0.5g, Calcium chloride 0.008g, MgSO4 0.008g, K2HPO4 0.04g, KH2PO4 0.04g, Sodium bicarbonate 0.4g, pH 7.1-7.3)을 포함하는 배양기에서 증식시킨 후, 원심분리방법으로 수확하여 0.085% 식염수로 세척하였다. 이를 이송된 미세조류가 있는 발효조(50)에 접종하였다. 배지의 초기 pH는 7.2 이고, 초기 젖산발효균주 0.8 ~ 1.1×108 세포/mL이고, 30℃의 N2 가스를 주입하면서 배양하였다. 분획된 미세조류의 발효 완료시 유기산인 말산(malate), 젖산(lactate), 초산(acetate), 구산(citrate) 및 낙산(butyrate) 농도를 결정하였다. A fermenter, an example of the microalgae-receiving device 70, was constructed using a microbial fermenter (INNO 200603, Innobio, Korea). Lactobacillus brevis subsp. brevis ) is a PYG culture medium (20.0 g of peptone per liter, medium 5.0 g, glucose, yeast powder 10.0 g, NaCl 0.08 g, Cysteine hydrochloride 0.5 g, Calcium chloride 0.008 g, MgSO 4 0.008 g, K 2 HPO 4 0.04 g, 0.04 g of KH 2 PO 4 , 0.4 g of sodium bicarbonate, pH 7.1-7.3), and then grown by centrifugation and washed with 0.085% saline. It was inoculated into a fermentation tank (50) with the transferred microalgae. The initial pH of the medium was 7.2, the initial lactic acid fermentation strain was 0.8-1.1 × 10 8 cells / mL, and cultured with injection of N 2 gas at 30 ° C. Upon completion of the fermentation of the fractionated microalgae, the concentrations of organic acids, such as malate, lactate, acetic acid, citrate and butyrate were determined.

유기산인 말산, 젖산, 초산 및 구산의 농도는 Platinum EPS C18 유기산 분석 컬럼 (250mm X 4.6mm, 5μm)이 있는 HPLC (HP placard, Japan)로 측정하였으며 pH 2.4에서 0.05 M KH2PO4로 하였다. 낙산은 CP 58 Wax (FFAP) (30 cm X 0.25mm ID, 0.25μm) 컬럼을 사용하여 가스 크로마토크래프 (HP placard, Japan)로 분석하였다.The concentrations of the organic acids, malic acid, lactic acid, acetic acid, and guic acid, were determined by HPLC (HP placard, Japan) with a Platinum EPS C18 organic acid analysis column (250 mm x 4.6 mm, 5 μm) and set at 0.05 M KH 2 PO 4 at pH 2.4. Butyric acid was analyzed by gas chromatograph (HP placard, Japan) using a CP 58 Wax (FFAP) (30 cm × 0.25 mm ID, 0.25 μm) column.

그 결과는 말산, 젖산, 초산, 구산 및 낙산이 각각 870.30±13.15, 746.16+8.91, 4,233.23+76.06, 318.04+47.75 및 1.99+1.99 mM의 농도로 존재하였다. The results showed that malic acid, lactic acid, acetic acid, guic acid and butyric acid were present at concentrations of 870.30 ± 13.15, 746.16 + 8.91, 4,233.23 + 76.06, 318.04 + 47.75 and 1.99 + 1.99 mM, respectively.

이런 결과는, 젖산발효균주가 분획된 미세조류 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 젖산으로 발효시킴을 알 수 있다.These results show that the fermentation of these cellulose feedstocks is lactic acid without chemical pretreatment of the microalgal feedstock fractionated and the addition of cellulase or other enzymes.

실시예 13. 젖산의 추출Example 13. Extraction of Lactic Acid

상기 발효액에 Ca(OH)2를 첨가하여 pH10로 조정한 후 가열함으로써, 젖산칼슘(Ca-lactate)의 용해도를 증가시키고, 젖산균을 사멸시키고, 단백질을 응고시켰다. 이를 고온에서 여과하여 젖산칼슘으로 회수하고 냉각하여 젖산칼슘을 침전시켰다. 고온에서 젖산칼슘을 용해시킨 후, 황산을 처리하여 CaSO4가 침전되어 젖산을 회수하였다. Ca (OH) 2 was added to the fermentation broth to adjust the pH to 10 and then heated to increase the solubility of calcium lactate, kill the lactic acid bacteria, and coagulate the protein. This was filtered at high temperature, recovered with calcium lactate and cooled to precipitate calcium lactate. After dissolving calcium lactate at high temperature, sulfuric acid was treated to precipitate CaSO 4 to recover lactic acid.

1: 본 발명의 장치 2: 제1 연동펌프
3: 제2 연동펌프 4: 제3 연동펌프
10: 배양조 11, 21, 33, 34, 71, 81: 라인
20: 용매조 30: 혼합조
31: 진동분쇄장치 32: 교반장치
40: 분획조 50: 미세조류-순환라인
60: 용매-순환라인 70: 미세조류-수용장치
80: 지용성물질-수용장치 90: 반응조 1: Device 2 of the present invention: First peristaltic pump
3: second peristaltic pump 4: third peristaltic pump
10: culture tank 11, 21, 33, 34, 71, 81: line
20: solvent bath 30: mixing bath
31: vibration grinding device 32: stirring device
40: fractionation tank 50: microalgae-circulation line
60: solvent-circulation line 70: microalgae-receptor
80: fat-soluble material-receiving device 90: reactor

Claims (5)

지용성물질을 함유하는 미세조류를 배양하는 과정;
상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질 추출용매와 상기 미세조류 배양액을 혼합하여 상기 지용성물질 추출용매를 상기 미세조류 배양액에 접촉시킴으로써 상기 미세조류 배양액의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질 추출용매에 용해시키는 과정;
상기 지용성물질 추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 상기 미세조류를 분획하는 과정;
분획된 상기 미세조류를 재배양하는 과정;
분획된 상기 지용성물질-용매를 사용하여 재배양된 상기 미세조류를 재분획하는 과정;
상기 미세조류의 재배양 과정과 상기 재분획 과정을 2회 이상 다수회 반복적으로 실행한 후에, 농축된 상기 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매와 고밀도의 상기 미세조류를 최종적으로 분획하는 과정;
최종의 상기 분획과정 후에, 고밀도의 상기 미세조류를 수득하는 과정; 및
최종의 상기 분획과정 후에, 농축된 상기 지용성물질-용매를 수득하는 과정;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 방법. Culturing the microalgae containing fat-soluble substances;
Dissolving the lipophilic material of the microalgal culture solution in the lipophilic material extraction solvent by mixing the lipophilic material extraction solvent in which the lipophilic material is dissolved and the microalgal culture solution and contacting the lipophilic material extraction solvent with the microalgal culture solution;
Fractionating the fat-soluble material-solvent and the microalgae in which the fat-soluble material is dissolved in the fat-soluble material extraction solvent;
Culturing the fractionated microalgae;
Refractionation of the microalgae cultured using the fractionated fat-soluble material-solvent;
After the culturing of the microalgae and the re-fractionation process are repeatedly performed two or more times a plurality of times, finally fractionating the fat-soluble material-solvent containing the concentrated fat-soluble material and the high-algae of high density;
After the final fractionation step, obtaining the microalgae of high density; And
After the final fractionation step, obtaining the concentrated fat-soluble substance-solvent;
Method for producing a high-density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgal culture, comprising a. 제1항에 있어서, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매를 혼합할 때, 상기 미세조류 배양액을 진동 분쇄하는 과정 및 혼합물을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 방법. The microalgal culture medium according to claim 1, wherein when the microalgal culture medium and the lipophilic material extraction solvent are mixed, at least one of the steps of vibrating and grinding the microalgal culture solution and stirring the mixture, Method for producing a high-density microalgae and concentrated fat-soluble material through microalgal culture, characterized in that for increasing the contact of the fat-soluble material extraction solvent. 지용성물질을 함유하는 미세조류를 배양하는 배양조(10);
상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질 추출용매를 저장하는 용매조(20);
상기 배양조(10)로부터의 상기 미세조류의 배양액과 상기 용매조(20)로부터의 상기 지용성물질 추출용매를 혼합하는 혼합조(30);
상기 혼합조(30)로부터의 혼합물을, 상기 지용성물질 추출용매에 상기 미세조류 배양액의 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 상기 미세조류로 분획하는 분획조(40);
상기 분획조(40)로부터의 분획된 상기 미세조류를 상기 배양조(10)로 순환하는 미세조류-순환라인(50);
상기 분획조(40)로부터의 분획된 상기 지용성물질-용매를 상기 용매조(20)로 순환하는 용매-순환라인(60);
상기 미세조류-순환라인(50)을 통해 상기 배양조(10)에서 2회 이상 재배양한 후에 상기 분획조(40)로부터 분획된 고밀도의 상기 미세조류를 수용 또는 처리하는 미세조류-수용장치(70); 및
상기 용매-순환라인(60)을 통해 상기 분획조(40)에서 2회 이상 재분획한 후에 상기 분획조(40)로부터 분획한 농축된 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리하는 지용성물질-수용장치(80);
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질의 생산 장치. A culture tank 10 for culturing microalgae containing a fat-soluble substance;
A solvent bath 20 for storing a fat-soluble substance extraction solvent in which the fat-soluble substance is dissolved;
A mixing tank 30 for mixing the culture solution of the microalgae from the culture tank 10 and the oil-soluble substance extraction solvent from the solvent tank 20;
A fractionation tank (40) for fractionating the mixture from the mixing tank (30) into a fat-soluble substance-solvent in which the fat-soluble substance of the microalgal culture solution is dissolved in the fat-soluble substance extracting solvent;
A microalgae-circulating line circulating the microalgae fractionated from the fractionation tank 40 to the culture tank 10;
A solvent-circulating line (60) circulating the fractionated fat-soluble substance-solvent from the fractionation tank (40) to the solvent tank (20);
Microalgae-receiving apparatus for accommodating or processing the microalgae of high density fractionated from the fractionation tank 40 after culturing at least two times in the culture tank 10 through the microalgae-circulation line ( 70); And
A fat-soluble substance-receiving apparatus for receiving or treating the concentrated fat-soluble substance-solvent fractionated from the fractionation tank 40 after re-fractionation two or more times in the fractionation tank 40 through the solvent-circulation line 60. 80;
A device for producing a high density microalgae and concentrated fat-soluble substances through microalgae culture, comprising: a. 제3항에 있어서,
상기 배양조(10)의 상기 미세조류 배양액과 상기 용매조(20)의 지용성물질 추출용매를 상기 혼합조(30)로 일정량 공급하는 제1 연동펌프(2);
상기 분획조(40)에서 분획된 상기 미세조류를 그 밀도에 따라 선택적으로 상기 미세조류-순환라인(50)을 통해 상기 배양조(10)로 이송하거나 상기 미세조류-수용장치(70)로 이송하는 제2 연동펌프(3); 및
상기 분획조(40)에서 분획된 상기 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 상기 용매조(20)로 이송하거나 상기 지용성물질-수용장치(80)로 이송하는 제3 연동펌프(4);
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 장치. The method of claim 3,
A first peristaltic pump (2) for supplying a predetermined amount of the microalgal culture solution of the culture tank (10) and the fat-soluble substance extraction solvent of the solvent tank (20) to the mixing tank (30);
The microalgae fractionated in the fractionation tank 40 is selectively transferred to the culture tank 10 or the microalgae-receiving device 70 through the microalgae-circulation line 50 according to its density. A second peristaltic pump 3; And
A third peristaltic pump 4 transferring the fat-soluble material-solvent fractionated in the fractionation tank 40 to the solvent tank 20 or to the fat-soluble material-receiving device 80 according to its concentration;
It characterized in that it comprises a, high density microalgae and concentrated fat-soluble material production apparatus through microalgal culture. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 혼합조(30)에는, 상기 미세조류 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키도록, 상기 미세조류 배양액을 진동 분쇄하는 진동분쇄장치(31) 및 상기 혼합물을 교반하는 교반장치(32) 중 적어도 하나의 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 장치. The vibration grinding device (31) according to claim 3 or 4, wherein the mixing tank (30) includes: a vibration grinding device (31) for vibrating and grinding the microalgal culture solution to increase the contact between the microalgal culture solution and the fat-soluble substance extraction solvent; It characterized in that it further comprises at least one device of the stirring device (32) for stirring the mixture, high density microalgae and concentrated fat-soluble material production apparatus through microalgal culture.
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