KR20110130943A - A new cell-permeable peptide and its use - Google Patents

A new cell-permeable peptide and its use Download PDF

Info

Publication number
KR20110130943A
KR20110130943A KR1020100050518A KR20100050518A KR20110130943A KR 20110130943 A KR20110130943 A KR 20110130943A KR 1020100050518 A KR1020100050518 A KR 1020100050518A KR 20100050518 A KR20100050518 A KR 20100050518A KR 20110130943 A KR20110130943 A KR 20110130943A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
peptide
fusion
cells
protein
Prior art date
Application number
KR1020100050518A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101263212B1 (en
Inventor
전용필
Original Assignee
성신여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성신여자대학교 산학협력단 filed Critical 성신여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020100050518A priority Critical patent/KR101263212B1/en
Publication of KR20110130943A publication Critical patent/KR20110130943A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101263212B1 publication Critical patent/KR101263212B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PURPOSE: A cell-permeable peptide or mutant thereof is provided to a large molecular substance into cytoplasm or nucleus and each organ. CONSTITUTION: A cell-permeable peptide is denoted by amino acid of sequence number 1. A fused body contains the cell-permeable peptide and biologically active substance. The biologically active substance is DNA, RNA, protein, lipid, carbohydrate, or chemical compounds. The chemical compounds are an anticancer drug, therapeutic agent for immune disease, antibiotics, or factor for growth, development, or differentiation. A composition for intracellular delivery of biologically active substance contains the fused body as an active ingredient. A composition for gene therapy contains the fused body as an active ingredient.

Description

신규한 세포막 투과성 펩타이드 및 그의 용도{A new cell-permeable peptide and its use}A new cell-permeable peptide and its use

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포막을 통과하기 어려운 거대 분자의 생물학적 활성을 가지는 물질에 결합하여 상기 물질을 세포 내 또는 생체 내로 전달하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과성 펩타이드 또는 그의 변이체에 관한 것이다.
The present invention relates to a cell membrane permeable peptide or a variant thereof described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more specifically, to bind to a substance having a biological activity of a macromolecule that is difficult to pass through the cell membrane to bind the substance into cells or in vivo The present invention relates to a cell permeable peptide or variant thereof described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

세포막을 투과할 수 있는 성질을 가진 펩타이드인 세포막 투과성 펩타이드(cell-permeable peptide; CPP)는 대개 30 개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이중 지질막을 자유롭게 통과하는 성질을 가진 것으로 알려져 있다. CPP는 PTD(protein-transduction domains), MTS(membrane-translocating sequences) 이라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내로 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다(Endoh와 Ohtsuki, 2010; Joliot와 Prochiantz, 2004; Mogi와 Kondo, 2010).Cell-permeable peptides (CPPs), which are peptides having a property of penetrating cell membranes, are generally composed of up to 30 amino acids, and are known to have a property of freely passing a double lipid membrane. CPP, also called PTD (protein-transduction domains) and MTS (membrane-translocating sequences), is a form of binding to or mixed with a transporter that crosses the cell membrane to transport proteins, DNA, RNA, etc. into cells. It can transport into the cytoplasm, intracellular organelles, and nucleus (Endoh and Ohtsuki, 2010; Joliot and Prochiantz, 2004; Mogi and Kondo, 2010).

또한 CPP는 세포막에 반응하여 엔도사이토시스(endocytosis)나 또는 직접 세포막을 투과할 수 있는 성질을 갖고 있는 올리고펩타이드로 세포막을 투과할 수 있는 전기화학 및 물리화학적 특성을 갖는다 (Jung 등, 2007; Kwon 등, 2009; M등, 2009).CPP also has electrochemical and physicochemical properties that can penetrate cell membranes with oligopeptides that are capable of penetrating endocytosis or direct cell membranes in response to cell membranes (Jung et al., 2007; Kwon) Et al., 2009; M et al., 2009).

이러한 CPP는 약물 전달 시스템으로의 응용방법과 연관되어 연구가 되어와 의약학 분야에서 잘 알려져 있으며, 특이적인 생물학적 시스템에서 응용되어 유전자 발현을 조절하는 하나의 도구로서 연구가 많이 진행되어 사용되고 있다. 또한 질병 진단에 이용하고자 하는 노력이 경주되고 있다(Dietz, 2010; Gao 등, 2010; Hao 등, 2010; Standley 등, 2010).These CPPs have been studied in connection with their application to drug delivery systems and are well known in the medical field, and have been widely used as one tool for controlling gene expression by being applied to specific biological systems. Efforts have also been made to diagnose diseases (Dietz, 2010; Gao et al., 2010; Hao et al., 2010; Standley et al., 2010).

세포의 특성을 변형하기 위하여 기존에 주로 사용되어 왔던 방법은 유전자 변형을 통한 것으로 “인체에 적용”이라는 응용에서 기존 유전체의 변형이 가져올 암묵적 위험으로 그 한계성을 극명히 보이고 있다.The method that has been mainly used to modify the characteristics of the cell is genetic modification, and the application of the "applied to the human body" in the application of "modification of the existing genome, the danger that is clearly shown its limitations.

그러나 내인성 질병 또는 외인성 질병을 치료하는 방법 중 가장 핵심에 있는 것이 조직을 구성하고 있는 세포의 온전성을 유지하게 하는 것으로 다양한 방법으로 유전자의 발현 조절 즉 전사량의 조절, 단백질 합성량의 조절 또는 활성 조절하는 것이다. However, the most important method of treating endogenous or exogenous diseases is to maintain the integrity of the cells constituting the tissue. In various ways, the expression of genes, that is, the amount of transcription, the amount of protein synthesis or activity To adjust.

한편 유전자 변형을 통한 식량 증산이 각광을 한 때 받았으나 여러 예기치 않은 문제점들이 있을 수 있어 그리 환영받지 못하고 있는 실정이다. On the other hand, food production through genetic modification was received in the spotlight, but there are many unexpected problems that are not welcomed.

동물, 식물과 같은 다세포 생물에서의 세포 반응은 외부 신호에 의한 반응이 가장 큰 특징 중의 하나이다. 이에 따라 외부 신호를 세포질 또는 핵으로 전달하는 세포신호전달계가 매우 잘 조직되어 있다. Cell responses in multicellular organisms, such as animals and plants, are one of the biggest features of response by external signals. As a result, the cell signaling system for transmitting external signals to the cytoplasm or nucleus is very well organized.

최근 들어 이러한 잘 알려진 사실을 바탕으로 신호전달물질 조절을 통한 형질 발현, 치료 등을 하기 위한 노력이 경주되고 있다. 이에 따라 특정 신호전달 매개체의 활성을 조절하는 물질의 제약화가 시도되어 왔다(Nguyen 등, 2010). Recently, based on such well-known facts, efforts have been made to express, treat, and control the signaling material through regulation. Accordingly, attempts have been made to restrict the substances that modulate the activity of specific signaling mediators (Nguyen et al., 2010).

세포 내의 신호전달은 거의 모두가 단백질을 매개로 하여 진행된다. 다른 한편 단백질은 세포내외부, 그리고 환경의 변화에 의해 쉽게 그 기능을 상실하는 특징이 있다. 이는 단백질이 독성이나 생물체 특성의 변질 등을 유발하진 않는 매우 유용한 제약 대상물 또는 생물자원 개발 매개물로 사용될 수 있음을 의미한다.Intracellular signaling is almost entirely mediated through proteins. Proteins, on the other hand, are characterized by their loss of function easily due to changes in the environment, inside and outside the cell. This means that the protein can be used as a very useful pharmaceutical object or biological development medium that does not cause toxicity or alteration of biological properties.

따라서 생물학적인 활성이 있는 단백질을 원하는 세포 내로 운반함에 있어 독성이 거의 없으며, 세포 내의 각종 소기관으로 운반 물질을 운반하는 효율이 매우 높다는 장점으로 인해 CPP의 응용분야는 거의 무한대인 것으로 사료되고 있다.Therefore, the application of CPP is considered to be infinite because of the advantages of transporting biologically active proteins into desired cells with little toxicity and having a very high efficiency of transporting transport materials to various organelles within the cells.

대한민국 등록특허 제10-0935030호 “새로운 세포투과성 펩타이드 및 이를 이용한 생물학적 활성물질의 전달 방법”에는 거대 분자 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 세포 내 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있으므로 다양한 치료용 약물의 전달 시스템 및 약물 치료 기술에 유용하게 이용할 수 있는 소수성을 띄는 새로운 형태의 세포투과성 펩타이드 PLAC가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0811745호 “세포투과성 펩타이드 Ｐｅｐ １으로부터 설계된 신규한 항균 펩타이드 Ｐｅｐ 1 Ｋ 및 그의 용도”에는 다양한 균주 및 항생제에 내성을 가진 균주에서 강력한 항균활성을 나타낼 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에서 어떠한 용혈활성도 나타내지 않기 때문에 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있는 세포투과성 펩타이드 Pep-1-K가 개시되어 있다.Korean Patent No. 10-0935030 "New Cell Permeable Peptides and Methods for Delivery of Biologically Active Substances Using the Same" includes various therapeutic drugs because the macromolecular substance can be transported to each organ in cells and in vivo without damaging cells and substances. A new form of hydrophobic cell permeable peptide PLAC is disclosed that can be usefully used in delivery systems and drug treatment techniques of Korean patent application No. 10-0811745, “Novel antimicrobial peptide Peer 1 designed from cell permeable peptide Pe 1. And its uses ”include cell-penetrating peptides that can be useful as non-toxic antimicrobials, food preservatives and cosmetic additives because they exhibit potent antimicrobial activity in various strains and strains resistant to antibiotics and do not show any hemolytic activity in human red blood cells. The de Pep-1-K is disclosed.

또한 대한민국 등록특허 제10-0951719호 “세포투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자의 복합체 및 그 용도”에는 세포내 투과성 펩타이드와 형광표지 자성나노입자를 화학적으로 결합시킴으로써, 내포작용(endocytosis) 없이, 형광표지 자성나노입자를 세포 내로 안정하게 직접 도입시킬 수 있는 세포투과성 펩타이드-형광표지 자성나노입자 복합체 및 이를 함유하는 세포 영상용 조성물이 개시되어 있다. In addition, the Republic of Korea Patent No. 10-0951719 "Complex of cell-penetrating peptides and fluorescently labeled magnetic nanoparticles and uses thereof" chemically binds intracellular permeable peptides and fluorescently labeled magnetic nanoparticles, without endocytosis, fluorescence Disclosed are a cell permeable peptide-fluorescent label magnetic nanoparticle complex capable of stably and directly introducing a labeled magnetic nanoparticle into a cell and a composition for cell imaging containing the same.

이외에도 현재까지 많은 CPP가 보고되고 상업화되고 있으나 세포막을 통과하여 물질을 세포내로 이동하는 정도가 세포-특이적인 것들이 대부분이다. 또한 그 효과가 높지 않다. 최근 들어서는 이들 중 특정 CPP를 이용하여 체세포에서 배아줄기세포적 성격을 갖는 유도된 다능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)가 개발되기도 하였다(Kim 등., 2009). 따라서 기능성 단백질이나 DNA, RNA를 세포내로 운송하는데 있어서 세포 특이성이 없고, 효율성이 높은 새로운 CPP의 개발이 요구되어 왔다. In addition, many CPPs have been reported and commercialized so far, but most of them are cell-specific in the extent of transport of substances into cells through cell membranes. Also the effect is not high. Recently, induced pluripotent stem cells with embryonic stem cell characteristics in somatic cells have been developed using specific CPPs (Kim et al., 2009). Therefore, there has been a demand for the development of new CPPs with no cell specificity and high efficiency in transporting functional proteins, DNA, and RNA into cells.

CPP 개발에 따른 장점은 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 세포내로 유입시킬 수 있다는 것이다. 특히 활성기간이 매우 제한적인 단백질을 쉽게 세포내로 이동시킴으로서 소기의 목적을 예상되는 위해성 없이 처치할 수 있는 매우 유용한 매개물이다. 다른 한편 재조합 형태, 또는 대상물과 혼합된 형태로 세포내로 대상물을 트랜스펙션할 수 있는 장점이 있다.The advantage of developing CPP is that it can efficiently introduce various types of modulators required for cell differentiation, cell characterization, or tissue and organ function regulation. In particular, it is a very useful mediator that can easily treat the intended purpose without anticipated risk by moving the protein having a very limited activity period into the cell easily. On the other hand there is an advantage that can be transfected into the cell in recombinant form, or mixed with the object.

그러나 이론적으로 또는 일부 실험에서 증명되고 있으나 위에서 언급되었듯이 기존 CPP들이 가지는 한계성이 있는데 이것이 문제점 이다. 즉 세포 특이적으로 물질 이동 효율이 다름과 유전자 변형에 사용되고 있는 다른 방법들에 비하여 효율이 떨어진다는 것이다. 최근에 발표된 유도만능줄기세포의 경우 매우 높은 농도의 CPP-기능성 단백질을 사용하였다. 현시점에서 기존의 문제점을 극복할 수 있고 부작용이 없는 전달매개물을 찾는 작업이 활발히 진행되고 있다.However, although it has been proved theoretically or in some experiments, as mentioned above, there are limitations of existing CPPs. In other words, the cell-specific efficiency of mass transfer differs from that of other methods used for genetic modification. For recently released induced pluripotent stem cells, a very high concentration of CPP-functional protein was used. At the present time, the work of finding a delivery medium that can overcome the existing problems and has no side effects is actively underway.

본 발명자들은 세포 분화, 세포 특성 유지 또는 조직과 기관의 기능 조절에 필요한 다양한 형태의 조절물질을 효율적으로 전달할 수 있는 전달매개물을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과 신규한 CPP를 동정하고 이를 통해 종래 전달물질이 갖는 문제점을 극복할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention sought to search for a delivery medium capable of efficiently delivering various types of modulators required for cell differentiation, maintaining cell characteristics, or regulating the function of tissues and organs. It was confirmed that the problem with the material can be overcome and completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 세포막 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide novel cell membrane permeable peptides.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a fusion in which the peptide has a biological activity.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention to provide a composition for intracellular delivery and a gene therapy composition using the fusion.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 생물학적 활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법을 제공하는 것이다..It is another object of the present invention to provide a method of delivering a target substance having biological activity using the fusion.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 융합체를 이용한 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a gene therapy method using the fusion.

상기와 같은 본 발명의 목적은 신규한 세포막 투과성 펩타이드를 yPF를 제조하고, 이를 이용하여 기능성 단백질에 결합시켜 재조합 단백질을 제조한 후, 이를 이용한 줄기세포, 세포주 및 조직세포에서의 트랜스팩션 실험 결과 yPF를 매개로 기능성 단백질이 세포내로 효과적으로 이동하였음을 확인함으로써 달성되었다.
The purpose of the present invention as described above is to produce a novel membrane membrane permeable peptide yPF, and to bind to a functional protein using this to produce a recombinant protein, the result of transfection experiments in stem cells, cell lines and tissue cells using the same This was accomplished by confirming that the functional protein effectively migrated into the cell.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 이의 변이체를 제공한다.The present invention provides cell membrane permeable peptides or variants thereof described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공한다.The present invention also provides a fusion of a cell membrane-penetrating peptide or a variant thereof and a substance having biological activity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 생물학적 활성물질의 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for intracellular delivery and a gene therapy composition of a biologically active substance comprising the fusion as an active ingredient.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector expressing a fusion protein in which a cell membrane permeable peptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and a target protein are fused.

또한, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드를 생물학적 활성을 갖는 목적 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of 1) preparing a delivery complex by combining the cell membrane permeable peptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a target substance having biological activity; And

2) 상기의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법을 제공한다.2) It provides a delivery method of a target substance having a biological activity consisting of the step of injecting the above delivery complex into a living body or cells.

아울러, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 목적 유전자와 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of 1) preparing a delivery complex by combining a cell membrane permeable peptide or a variant thereof described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a gene of interest; And

2) 상기의 전달 복합체를 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법을 제공한다.
2) It provides a gene therapy method comprising the step of injecting the delivery complex into a cell.

이하에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 세포막 투과성 펩타이드로 yPF로 명명하였다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체는 생물학적 활성을 갖는 물질에 결합하여 세포 내 또는 생체 내로 상기 물질을 전달하여 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내게 할 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.The peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention was named yPF as a cell membrane permeable peptide. The peptide or variant thereof may bind to a substance having biological activity and deliver the substance in a cell or in vivo to exhibit activity related to physiological phenomena or activity related to a therapeutic purpose. Since the cell membrane permeable peptide or variant thereof having a mass transfer function of the present invention is a very small peptide, it is possible to minimize biological interference with any active substance that may occur.

상기 변이체는 상기 펩타이드의 아미노산 단편 또는 일부가 치환 또는 결실되거나, 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형되거나, 친수성을 높이기 위해 아미노산 서열의 일부가 변형되거나, 아미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D- 아미노산으로 치환되거나 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편들일 수 있다. 상기 변이체는 세포막 투과성 및 세포 내 전달 기능을 보유하도록 변형될 수 있을 것이다.The variant may be a substitution or deletion of an amino acid fragment or part of the peptide, a part of the amino acid sequence is modified to a structure that can increase the stability in vivo, a part of the amino acid sequence is modified to increase the hydrophilicity, or a part of the amino acid Or fragments in which all are substituted with L- or D-amino acids or some of the amino acids are modified. The variant may be modified to retain cell membrane permeability and intracellular delivery function.

본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 세포막 투과성 펩타이드(yPF)를 합성하였다. The present inventors synthesized the cell membrane permeable peptide (yPF) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 펩타이드가 세포 내로 유입가능성을 조사하기 위해 yPF-GFP의 재조합 단백질을 제조하고, 이들의 농도 비의존적 R1 배아 줄기세포 내, HeLa 세포 내 및 자궁 세포 내 트랜스펙션 실험을 실시한 결과, 도 2 내지 5에 나타낸 바와 같이, yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 각 세포 내로 이동하였음을 알 수 있었으며, yPF-GFP 트랜스펙션이 줄기세포, 세포주, 조직세포에서 온도를 이용하여 조절될 수 있음을 확인하였다.
In order to investigate the possibility of incorporation of the peptide into cells, recombinant proteins of yPF-GFP were prepared, and their concentration-independent transfection experiments were performed in R1 embryonic stem cells, HeLa cells, and intrauterine cells. As shown in Fig. 5, it was found that the functional protein GFP (green) was transferred into each cell through yPF, and yPF-GFP transfection can be controlled by using temperature in stem cells, cell lines, and tissue cells. It was confirmed that there is.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공한다.The present invention also provides a fusion of a cell membrane-penetrating peptide or a variant thereof and a substance having biological activity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 생물학적 활성은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타낸다. 또한 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물일 수 있다. 상기 화학화합물은 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 항생제 및 생물의 성장, 발달 또는 분화의 인자일 수 있다. 본 발명의 물질 전달기능을 가지는 세포막 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 융합체는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. The biological activity is delivered intracellularly or in vivo to indicate activity associated with physiological phenomena or activity associated with therapeutic purposes. In addition, the biologically active material may be DNA, RNA, protein, fat, carbohydrate and chemical compound. The chemical compound may be an anticancer agent, an immune disease agent, an antiviral agent, an antibiotic, and a factor of growth, development or differentiation of an organism. Since the cell membrane permeable peptide having a mass transfer function of the present invention is a very small peptide, it is possible to minimize biological interference with any active substance that may occur. Fusion of the peptide or a variant thereof with a biologically active substance is intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intranasal, nasal, mucosal It can be delivered in vivo by infusion by mucosal, inhalation and oral routes.

상기 융합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 융합체를 형성할 수 있다. 상기 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
When the fusion is intended to be delivered to specific cells, tissues or organs, the biologically active substance may be an extracellular partial protein of a ligand capable of selectively binding to a receptor specifically expressed in a specific cell, tissue or organ, or Fusion with monoclonal antibodies (mAb) and modified forms capable of specifically binding to these receptors or ligands can form fusions. The binding of the peptide to the biologically active material is by indirect linkage by cloning technique using an expression vector at the nucleotide level or by direct linkage by chemical or physical covalent or non-covalent bond of the biologically active material with the peptide. can do.

또한, 본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 생물학적 활성물질의 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for intracellular delivery and a gene therapy composition of a biologically active substance comprising the fusion as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 종래에 생물학적 활성물질이 쉽게 통과할 수 없었던 세포막을 통과하여 세포 내에 직접 작용할 수 있게 한다. 따라서 본 발명의 조성물은 약물전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.The composition of the present invention allows the biologically active substance to act directly in the cell through the cell membrane, which has not been able to easily pass through in the past. Therefore, the composition of the present invention can be a breakthrough in the development of drug delivery system (drug delivery system).

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.The composition of the present invention comprises 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the active ingredients.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may further comprise at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described effective ingredients for administration. The pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterilized water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome and one or more of these components. , A buffer solution, a bacteriostatic agent, and the like may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules, or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like, and may act specifically on target organs. Target organ specific antibodies or other ligands may be used in combination with the carriers so as to be used. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition, Mack Publishing Company, Easton PA). have.

상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.The composition comprising the fusion as an active ingredient is intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, nasal, mucosal, mucosal, It can be delivered in vivo by infusion, such as by inhalation and oral. Dosage varies depending on the subject's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of disease. The daily dosage is about 0.1 to 100 mg / kg for the compound, preferably 0.5 to 10 mg / kg, and more preferably administered once to several times a day.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체와 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector expressing a fusion protein in which a cell membrane permeable peptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and a target protein are fused.

상기 목적 단백질은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내는 것일 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 목적 단백질의 서열 및 상기 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 1개 이상의 글라이신, 프롤린, 아미노산 AAY를 포함하는 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 융합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.The target protein may be delivered in a cell or in vivo to exhibit activity related to physiological phenomena or activity related to a therapeutic purpose. The recombinant expression vector comprises a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a sequence of a target protein and a tag sequence for facilitating purification of the fusion protein, eg, continuous histidine codons, maltose binding protein codons and Myc. Codons, and the like, and may further include a fusion partner for increasing solubility of the fusion. In addition, in order to stabilize the overall structure and function of the fusion protein or flexibility of the protein encoded by each gene further comprises one or more spacer amino acids or sequences comprising glycine, proline, amino acid AAY can do. It may also include a sequence that is specifically cleaved by enzymes to remove unnecessary portions of the fusion protein, expression control sequences and markers or reporter gene sequences to confirm intracellular delivery, but is not limited thereto. no. The expression control sequence used in the recombinant expression vector of the present invention may be composed of a regulatory domain including a promoter specific for cells, tissues, and organs to which the target DNA and / or RNA is selectively delivered or expressed.

또한, 본 발명은 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포막 투과성 펩타이드 또는 그의 변이체를 생물학적 활성을 갖는 목적 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및In addition, the present invention comprises the steps of 1) preparing a delivery complex by combining a cell membrane permeable peptide or a variant thereof described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a target substance having biological activity; And

2) 상기의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법을 제공한다.2) It provides a delivery method of a target substance having a biological activity consisting of the step of injecting the above delivery complex into a living body or cells.

단계 1의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 그의 변이체와 생물학적 활성을 갖는 물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다.본 발명의 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달 시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.
The binding of step 1 may be by indirect linkage by cloning techniques with expression vectors at the nucleotide level or by direct linkage by chemical or physical covalent or non-covalent linkage of a substance having biological activity with a peptide or variant thereof. . In vivo or intracellular infusion of a delivery complex of the peptide or a variant thereof with a biologically active substance is intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, It may be carried out by injecting by nasal, mucosal, inhalation and oral routes. The delivery method of the present invention is not only cultured but also general in vivo delivery, i.e. animal cells, It can also be sufficiently extended for delivery to animal tissues and animals.

본 발명에 따른 세포막 투과성 펩타이드는 거대 분자 물질을 세포 및 물질의 손상 없이 그 기능을 유지한 상태로 세포막을 투과하여 세포 비특이적으로 세포질 또는 핵질 및 생체 내 각 장기로 운반할 수 있으므로 다양한 치료용 약물의 전달 시스템 및 약물 치료 기술에 유용하게 이용할 수 있다.
The cell membrane-penetrating peptides according to the present invention can penetrate the cell membrane and transport it to each organ in the cytoplasm or nucleus and in vivo, while maintaining the function of macromolecular substances without damaging the cells and substances. It can be usefully used in delivery systems and drug treatment techniques.

도 1은 본 발명에 따른 세포막 투과성 펩타이드 yFP를 이용하여 제조한 재조합 단백질을 나타낸 도이다.
도 2는 yPF-GFP의 농도 비의존적 R1 배아 줄기세포 내 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상을 나타낸 도로서, A : R1 배아 줄기세포를 1,000ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다.
도 3은 HeLa 세포 내로 농도 비의존적 yPF-GFP 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로서. A : Hela 세포주를 100ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다.
도 4는 자궁 세포 내로 농도 비의존적 yPF-GFP 트랜스펙션 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로써, A : 자궁 내막세포를 100ng/mL GFP에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; B : 1 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이며; C : 10 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이고; D : 100 ng/mL yPF에서 배양한 후 세포내 이동을 관찰한 상이다. yPF를 매개로 기능 단백질인 GFP (녹색)가 세포내로 이동하였음을 알 수 있다. 핵물질은 PI(적색)로 대비 염색하였다. 주황색은 녹색과 적색이 겹친 것을 나타낸다.
도 5는 yPF-GFP 트랜스펙션이 줄기세포, 세포주, 조직세포에서 온도를 이용한 조절되는 결과를 나타낸 공초점현미경 상으로써, yPF-GFP (10 ng/mL)를 함유한 배양액에서 R1 배아 줄기세포(A), HeLa 세포주(B), 자궁내막 기질세포(C)를 37℃와 4℃에서 6시간 배양한 후 공초점현미경을 이용하여 yPF를 매개로한 GFP의 트랜스펙션 여부를 확인하였다. 37℃에서는 모든 세포 종류에서 yPF를 매개로 GFP가 세포내로 트랜스펙션 되었으나 4℃에서는 모든 세포 종류에서 GFP가 (녹색) 세포내로 트랜스펙션 되지 않음을 확인하였다. 일부 세포에서는 PI로 핵물질을 대비 염색하였다. 주황색은 녹색과 적색이 겹친 것을 나타낸다.1 is a diagram showing a recombinant protein prepared using a membrane permeable peptide yFP according to the present invention.
Figure 2 is a confocal microscope image showing the results of transfection in the concentration-independent R1 embryonic stem cells of yPF-GFP, A: R1 embryonic stem cells were cultured in 1,000ng / mL GFP after intracellular migration Observed phase; B: Intracellular migration was observed after culturing in 1 ng / mL yPF; C: Intracellular migration after culturing at 10 ng / mL yPF; D: Intracellular migration was observed after culturing at 100 ng / mL yPF. It can be seen that the functional protein GFP (green) migrated into cells through yPF.
3 is a confocal microscope image showing concentration independent yPF-GFP transfection results into HeLa cells. A: Intracellular migration was observed after Hela cell line was cultured in 100ng / mL GFP; B: Intracellular migration was observed after culturing in 1 ng / mL yPF; C: Intracellular migration after culturing at 10 ng / mL yPF; D: Intracellular migration was observed after culturing at 100 ng / mL yPF. It can be seen that the functional protein GFP (green) migrated into cells through yPF.
4 is a confocal microscope image showing the concentration-independent yPF-GFP transfection results into uterine cells, where A: endometrial cells were cultured at 100 ng / mL GFP and observed intracellular migration; B: Intracellular migration was observed after culturing in 1 ng / mL yPF; C: Intracellular migration after culturing at 10 ng / mL yPF; D: Intracellular migration was observed after culturing at 100 ng / mL yPF. It can be seen that the functional protein GFP (green) migrated into cells through yPF. Nuclear material was counterstained with PI (red). Orange indicates that green and red overlap.
FIG. 5 is a confocal microscope image showing that yPF-GFP transfection is regulated using temperature in stem cells, cell lines, and tissue cells. R1 embryonic stem cells in a culture solution containing yPF-GFP (10 ng / mL) (A), HeLa cell line (B) and endometrial stromal cells (C) were cultured at 37 ° C. and 4 ° C. for 6 hours, and then confocal microscopy confirmed the transfection of GFP mediated by yPF. At 37 ° C, GFP was transfected intracellularly through yPF in all cell types, but at 4 ° C, GFP was not transfected into (green) cells in all cell types. In some cells, the nuclear material was counterstained with PI. Orange indicates that green and red overlap.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1 : 세포막 투과성 Example 1 Cell Membrane Permeability 펩타이드Peptide yPFyPF 의 합성 및 분리정제Synthesis and separation

본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 세포막 투과성 펩타이드 yPF를 합성하였다.In this example, the cell membrane permeable peptide yPF having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was synthesized.

yPF을 합성하기 위하여 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 94℃에서 7분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 70℃ 그리고 54℃로 점진적으로 온도를 낮추어 DNA 2중가닥을 만들었다. pET-20b 벡터를 변형한 pET-20b-delXho에 끼워 넣기 위하여 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide) 이외의 제한효소 특이 서열을 5‘과 3’에 넣었다. 이후 대장균(E. coli)에 넣어(형질변화(transformaiton)) 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다. In order to synthesize yPF, a sense and antisense oligodeoxy nucleotide appropriate to the amino acid sequence were synthesized, respectively, and then left at 94 ° C. for 7 minutes to remove secondary or tertiary structures formed (denaturation). ) DNA double strands were made by gradually lowering the temperature to 70 ° C and 54 ° C. In order to insert the pET-20b vector into the modified pET-20b-delXho, restriction enzyme specific sequences other than sense and antisense oligodeoxy nucleotides were placed in 5 'and 3'. It was then amplified in E. coli (transformaiton) mass amplification. Then, the integrity of the sequence was confirmed and expressed in E. coli.

상기에서 합성한 세포막 투과성 펩타이드 yPF의 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.The amino acid sequence of the cell membrane permeable peptide yPF synthesized above is shown in Table 1 below.

펩타이드Peptide 아미노산 서열Amino acid sequence yPFyPF ATCLELLGLFLLLPRPVPAATCLELLGLFLLLPRPVPA

실시예 2 : Example 2: yFPyFP 를 이용한 재조합 Recombination using GFPGFP 단백질의 제조 Preparation of Protein

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 yFP가 세포 내로 유입가능한 지여부를 알아보기 위하여, 기능성 단백질의 일예로써 GFP(Green Fluorescent Protein) 단백질을 이용하여, GFP의 N-말단에 상기 yPF가 위치하고 C-말단에 6His가 오도록 재조합 GFP 단백질을 제조하였다(도 1 참조). In the present embodiment, to determine whether yFP prepared in Example 1 can be introduced into cells, the yPF is located at the N-terminus of GFP using GFP (Green Fluorescent Protein) protein as an example of a functional protein. Recombinant GFP protein was prepared to have 6His at the C-terminus (see FIG. 1).

yPF-GFP 재조합 단백질을 얻기 위하여 도 1과 같이 yPF 다음에 GFP 핵산 유전자 서열을 넣었다. GFP는 일반 상용되는 서열에 사용된 발현 벡터에 넣기 위해 필요한 제한효소 염기서열을 갖는 프라이머(primer)를 이용하여 증폭하였다. 이후 제한효소를 처리한 후 도 1에 표시한 것처럼 끼워 넣었다.       In order to obtain a yPF-GFP recombinant protein, the GFP nucleic acid gene sequence was added after yPF as shown in FIG. 1. GFP was amplified using a primer having a restriction enzyme sequence necessary to be inserted into an expression vector used in a commonly used sequence. After processing the restriction enzyme was inserted as shown in FIG.

이어서 E. coli를 이용하여 상기 재조합 GFP 단백질을 일반적 방법으로 대량 합성하여 Histidine이 특이적을 결합하는 니켈 컬럼(QIAGEN)을 이용하여 순수 분리하였다. 이후 가장 널리 사용되는 브레드포드 방법을 이용하여 단백질 정량을 수행하였다. 간단히 단백질은 PBS에 분주 후 -50℃ 냉동고에 보관하고 사용 시 녹여 사용하였다.
Subsequently, the recombinant GFP protein was synthesized in bulk using E. coli in a general manner and purely separated using a nickel column (QIAGEN) to which Histidine specifically binds. Protein quantification was then performed using the most widely used Bradford method. After briefly, the protein was dispensed into PBS, stored in a -50 ° C freezer, and dissolved in use.

실험예Experimental Example 1 :  One : yPFyPF -- GFPGFP 의 농도 Concentration 비의존적Independent R1R1 배아 줄기세포 내  Within embryonic stem cells 트랜스펙션Transfection

본 실험예에서는 상기 실시예 2에서 제조한 재조합 GFP 단백질을 이용하여 yPF-GFP의 농도가 GFP의 수송에 직접적 영향이 있는 가를 확인하기 위하여, R1 배아 줄기세포를 구입하여 생쥐배아줄기세포배양액을 이용하여 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24-well 배양접시에 멸균된 커버슬립을 넣고 0.1% gelatin으로 도포한 후 R1세포(한양대학교 의과대학 생화학교실)를 심고 80%찰때가지 배양하였다. 이후 yPF-GFP 농도를 각각 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL로 달리 함유한 배양액에서 6시간 배양하였다. 이후 PBS로 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 공초점현미경을 이용하여 세포막을 통과하여 세포내로 침투한 yPF-GFP 제조합 단백질의 존재 유무를 분석 하였다. 대조군으로 1,000 ng/mL GFP를 상기와 동일하게 처리하고 관찰하였다. In this experimental example, to determine whether the concentration of yPF-GFP directly affects the transport of GFP using the recombinant GFP protein prepared in Example 2, R1 embryonic stem cells were purchased and mouse embryonic stem cell culture solution was used. Incubated in a 37 ℃ incubator supplied with 5% CO 2 . Sterilized coverslips were placed in 24-well plates and coated with 0.1% gelatin. R1 cells (Department of Biochemistry, Hanyang University College of Medicine) were planted and cultured for 80%. Then, yPF-GFP concentrations were incubated for 6 hours in a culture solution containing 1ng / mL, 10ng / mL, and 100ng / mL, respectively. Then washed 10 times with PBS and fixed with methanol. Confocal microscopy was used to analyze the presence or absence of yPF-GFP synthesized protein that penetrated into the cell through the cell membrane. As a control, 1,000 ng / mL GFP was treated and observed in the same manner as above.

도 2에서 알 수 있듯이, 상대적으로 GFP를 1,000ng/mL로 높은 농도에서 R1 배아 줄기세포에 처리할 경우에도 GFP가 세포 내에서 관찰되지 않았다(도 2A). 그러나 yPF를 N-말단에 부착한 경우 1 ng/mL 농도에서 고 농도에 이르기 까지 세포 내로 기능단백질인 GFP가 이동하여 있음이 관찰되었다. 처리한 농도간 유의한 차이는 관찰되지 않았다.As can be seen in Figure 2, even when treated to R1 embryonic stem cells at a relatively high concentration of GFP 1,000ng / mL GFP was not observed in the cells (Fig. 2A). However, when yPF was attached to the N-terminus, it was observed that GFP, a functional protein, was transferred into cells from 1 ng / mL concentration to high concentration. No significant difference was observed between the treated concentrations.

이러한 결과는 매우 효율적으로 yPF를 이용하여 기능 단백질을 세포내로 이동시킬 수 있음을 보여준다.
These results show that yPF can be used to efficiently transfer functional proteins into cells.

실험예Experimental Example 3 :  3: HeLaHeLa CellCell 세포 내로 농도  Concentration into cells 비의존적Independent yPFyPF -- GFPGFP 트랜스펙션Transfection

본 실험예에서는 yPF가 세포 종류 특히 세포주에서 효율적으로 기능 단백질을 수송하는 가를 알아보았다. 이를 위해, 세포주 중의 하나인 HeLa 세포주를 대상으로 yPF-GFP가 효율적으로 세포내로 이동할 수 있는 가를 조사하였다. In this experimental example, it was examined whether yPF efficiently transports functional proteins in cell types, especially cell lines. To this end, we investigated whether yPF-GFP can efficiently move into cells in HeLa cell line, one of the cell lines.

HeLa 세포(강원대학교 의과대학)는 DMEM 배양액을 이용하여 배양하였다. 공초점현미경을 이용하여 관찰하기 위하여 커버슬립을 이용하여, 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. 24-well 배양접시에 멸균된 커버슬립을 넣고 HeLa세포를 심고 80%찰때가지 배양하였다. 이후 yPF-GFP 제조합단백질 농도를 각각 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL로 달리 함유한 배양액에서 6시간 배양하였다. 이후 PBS로 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 메탄올을 이용하여 고정하고 공초점현미경을 이용하여 세포막을 통과하여 세포내로 침투한 yPF-GFP의 존재 유무를 분석 하였다.HeLa cells (College of Medicine, Kangwon National University) were cultured using DMEM medium. In order to observe using a confocal microscope, the cover slip was incubated in a 37 ° C. incubator supplied with 5% CO 2 . Sterile coverslips were placed in a 24-well dish and HeLa cells were planted and cultured until 80% filled. Then, yPF-GFP prepared protein concentrations were incubated for 6 hours in a culture medium containing 1ng / mL, 10ng / mL, and 100ng / mL, respectively. Then washed 10 times with PBS and fixed with methanol. The presence of yPF-GFP was fixed by using methanol and infiltrated into the cell through the cell membrane by confocal microscopy.

도 3A는 CPP가 결합되어 있지 않은 GFP를 100 ng/mL로 6시간 처리한 후 같은 방법으로 준비하고 공초점현미경을 이용하여 세포내 트랜스펙션 여부를 분석한 결과로 세포내에서 관찰되지 않음을 알 수 있다. 그러나 배아줄기세포에서와 마찬가지로 yPF가 결합된 yPF-GFP를 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL로 처리할 경우 농도 비의존적으로 세포내로 트랜스펙션 되었음을 알 수 있다(도 3B-D 참조).3A was treated in 100 ng / mL CFP-free GFP for 6 hours, and then prepared in the same manner. As a result of analyzing intracellular transfection using a confocal microscope, it was not observed in the cells. Able to know. However, as in embryonic stem cells, the treatment of yPF-GFP with yPF-binding at 1 ng / mL, 10 ng / mL, and 100 ng / mL showed that the cells were transfected in a concentration-independent manner (Fig. 3B-). See D).

이러한 결과는 yPF가 매우 경제적으로 줄기세포 뿐만이 아니라 세포주에 기능 단백질을 트랜스펙션할 수 있는 매개자로 사용될 수 있음을 보여주는 것이다.
These results show that yPF can be used very economically as a mediator for transfecting not only stem cells but also functional proteins in cell lines.

실험예Experimental Example 3 : 자궁 세포 내로 농도  3: concentration into uterine cells 비의존적Independent yPFyPF -- GFPGFP 트랜스펙션Transfection

본 실험예에서는 조직을 적취 후 조직 세포를 배양할 경우 외부에서 유전자 발현 변형을 유도하는 물질의 수송이 세포 주에 비하여 그 효율이 낮다는 문제점을 해결하는데 있어 CPP원리를 적용하고자 yPF-GFP를 자궁내막세포에 세포주나 배아 줄기세포에서처럼 효율적으로 트랜스펙션 될 수 있을지를 알아보았다. In this experimental example, yPF-GFP was applied to the uterine uterus to apply the CPP principle to solve the problem that the efficiency of transporting a substance that induces gene expression alteration is lower than that of the cell line when the tissue cells are cultured after the tissue is collected. We examined whether endothelial cells could be transfected as efficiently as cell lines or embryonic stem cells.

이를 위하여 생쥐 자궁 내막 기질세포를 자궁에서 수획하여 체외 배양하면서 yPF를 매개로 기능성 단백질이 세포내로 효율적으로 트랜스펙션하는가를 알아보았다. 한편, 핵의 위치를 표지하기 위하여 PI (적색)으로 염색하였다. To this end, mouse endometrial stromal cells were harvested from the uterus and cultured in vitro to determine whether the functional protein was efficiently transfected into cells through yPF. On the other hand, staining with PI (red) in order to label the position of the nucleus.

도 4에 나타낸 바와 같이, 세포를 100 ng/mL GFP를 함유한 배양액서 배양하더라도 GFP가 세포내로 트랜스펙션되어 있지 않았다(도 4A). 하지만 yPF를 N 말단에 갖고 있는 재조합 단백질인 yPF-GFP는 농도 비의존적으로 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 처리 농도 모두에서 자궁내막 기질세포로 트랜스펙션되어 있음을 관찰할 수 있다. 또한 R1 배아줄기세포와 HeLa 세포주에서처럼 세포질을 통하여 핵질까지 이동되어 있음이 관찰되었다.
As shown in FIG. 4, even when cells were cultured in a culture solution containing 100 ng / mL GFP, GFP was not transfected into cells (FIG. 4A). However, it was observed that yPF-GFP, a recombinant protein having yPF at the N-terminus, was transfected into endometrial stromal cells at concentrations of 1 ng / mL, 10 ng / mL, and 100 ng / mL. Can be. It was also observed that the cells migrated through the cytoplasm to the nucleus as in R1 embryonic stem cells and HeLa cell lines.

실험예Experimental Example 4 :  4 : yPFyPF -- GFPGFP 트랜스펙션의Transfection 온도의존적 조절 Temperature dependent control

세포의 특성을 변형하는 목적을 효과적으로 달성하기 위해서는 외부에서 전달하고자하는 물질의 트랜스펙션을 조절할 수 있어야하며, 기관, 조직, 세포의 저온 보존은 의학적 수의학적 및 기초과학적 관점에서 발전되어 임상 및 기초 연구에서 일반적으로 사용되고 있다.In order to effectively achieve the purpose of modifying the characteristics of the cell, it is necessary to be able to control the transfection of the substance to be delivered externally, and the cryopreservation of organs, tissues, and cells has been developed from the medical veterinary and basic science point of view, so that the clinical and basic It is commonly used in research.

따라서 본 실험에서는 줄기세포, 세포주 및 조직세포에서 yPF-GFP 트랜스펙션을 온도의존적으로 조절할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 이를 위해 4℃를 유지하는 배양기를 이용하여 yPF-GFP를 함유한 배양액에서 각 세포들을 6시간 배양하였다. 배양한 이후 PBS를 이용하여 10회 세척하고 메탄올을 이용하여 고정하였다. 그리고 필요에 따라 핵물질을 PI(적색)로 염색하여 핵의 위치를 분명히 보이도록 하였다. 이후 공초점현미경을 이용하여 세포내로 이동되었는지를 확인하였다.Therefore, in this experiment, we investigated whether temperature-dependent control of yPF-GFP transfection in stem cells, cell lines and tissue cells. To this end, each cell was incubated for 6 hours in a culture solution containing yPF-GFP using an incubator maintained at 4 ℃. After incubation, washed 10 times with PBS and fixed with methanol. And if necessary, the nuclear material was stained with PI (red) to clearly show the position of the nucleus. After that, it was confirmed whether the cells were moved by using a confocal microscope.

도 5에 나타낸 바와 같이, yPF를 매개로하여 기능 단백질의 하나인 GFP가 온도 의존적으로 세포내로 트랜스펙션 됨을 확인하였다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that GFP, one of the functional proteins, was transfected into cells in a temperature-dependent manner through yPF.

Claims (11)

서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 세포투과성 펩타이드.A cell permeable peptide set forth in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 제 1항의 펩타이드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체.The fusion of the peptide of claim 1 and a substance having a biological activity. 제 2항에 있어서, 생물학적 활성을 갖는 물질은 DNA, RNA, 단백질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합체.The fusion compound according to claim 2, wherein the substance having biological activity is any one selected from the group consisting of DNA, RNA, protein, fat, carbohydrate and chemical compound. 제 3항에 있어서, 화학화합물은 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 항생제 및 생물의 성장, 발달 또는 분화의 인자를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합체.4. The fusion compound according to claim 3, wherein the chemical compound is any one selected from the group comprising an anticancer agent, an immune disease agent, an antiviral agent, an antibiotic and a factor of growth, development or differentiation of an organism. 제 2항에 있어서, 특정 세포, 조직 또는 장기의 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합체.3. The fusion of claim 2, further comprising a ligand that selectively binds to a receptor of a particular cell, tissue or organ. 제 2항의 융합체를 유효성분으로 포함하는 생물학적 활성물질의 세포내 전달용 조성물.A composition for intracellular delivery of a biologically active substance comprising the fusion of claim 2 as an active ingredient. 제 2항의 융합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 조성물.Gene therapy composition comprising the fusion of claim 2 as an active ingredient. 제 1항의 펩타이드와 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 발현하는 재조합 발현벡터.A recombinant expression vector expressing a fusion protein in which the peptide of claim 1 is fused with a target protein. 제 8항에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 펩타이드를 코딩하는 DNA와 목적 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터.The recombinant expression vector according to claim 8, comprising DNA encoding the peptide set forth in SEQ ID NO: 1 and DNA encoding the target protein. 1) 제 1항의 펩타이드를 생물학적 활성을 갖는 목적 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
2) 상기의 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적활성을 갖는 목적 물질의 전달 방법.1) preparing a delivery complex by combining the peptide of claim 1 with a target substance having biological activity; And
2) A method for delivering a target substance having a biological activity, comprising the step of injecting the above-mentioned delivery complex into a living body or cell of a mammal other than a human. 1) 제 1항의 펩타이드를 목적 유전자와 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
2) 상기의 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법.1) combining the peptide of claim 1 with a gene of interest to prepare a delivery complex; And
2) Gene therapy method comprising the step of injecting said delivery complex into cells of mammals except humans.
KR1020100050518A 2010-05-28 2010-05-28 A new cell-permeable peptide and its use KR101263212B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100050518A KR101263212B1 (en) 2010-05-28 2010-05-28 A new cell-permeable peptide and its use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100050518A KR101263212B1 (en) 2010-05-28 2010-05-28 A new cell-permeable peptide and its use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110130943A true KR20110130943A (en) 2011-12-06
KR101263212B1 KR101263212B1 (en) 2013-05-10

Family

ID=45499550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100050518A KR101263212B1 (en) 2010-05-28 2010-05-28 A new cell-permeable peptide and its use

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101263212B1 (en)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014010971A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 주식회사 카엘젬백스 Cell-penetrating peptide, conjugate comprising same and composition comprising same
WO2016006744A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 주식회사 프로셀테라퓨틱스 Peptide-sirna complex for transdermal delivery using intracellular molecular transport peptide, and use thereof
US9540419B2 (en) 2012-05-11 2017-01-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US9572900B2 (en) 2012-09-19 2017-02-21 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US9572858B2 (en) 2013-10-23 2017-02-21 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating and preventing benign prostatic hyperplasia
US9631184B2 (en) 2012-09-19 2017-04-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
US9907838B2 (en) 2013-04-19 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition and methods for treating ischemic damage
US9937240B2 (en) 2014-04-11 2018-04-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
US10034922B2 (en) 2013-11-22 2018-07-31 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same
US10383926B2 (en) 2013-06-07 2019-08-20 Gemvax & Kael Co., Ltd. Biological markers useful in cancer immunotherapy
US10463708B2 (en) 2014-12-23 2019-11-05 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US10561703B2 (en) 2013-06-21 2020-02-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Method of modulating sex hormone levels using a sex hormone secretion modulator
US10662223B2 (en) 2014-04-30 2020-05-26 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for organ, tissue, or cell transplantation, kit, and transplantation method
US10676507B2 (en) 2015-05-26 2020-06-09 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide and composition containing the same for anti-inflammation, anti-fibrosis, wound healing, and anticancer treatment
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
US10898540B2 (en) 2016-04-07 2021-01-26 Gem Vax & KAEL Co., Ltd. Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same
US11015179B2 (en) 2015-07-02 2021-05-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
US11058744B2 (en) 2013-12-17 2021-07-13 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating prostate cancer

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101841241B1 (en) * 2015-09-10 2018-03-22 한양대학교 산학협력단 fusion peptides associated with inflammatory skin disease and phamaceutical composition comprising the same
KR20210147977A (en) * 2020-05-28 2021-12-07 주식회사 미토퀘스트 A novel anti-inflammatory peptides and use thereof
KR20210147362A (en) * 2020-05-28 2021-12-07 주식회사 미토퀘스트 A novel anti-inflammatory peptides derived nlrx1 and use thereof

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10960056B2 (en) 2012-05-11 2021-03-30 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US9907837B2 (en) 2012-05-11 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating cachexia
US11857607B2 (en) 2012-05-11 2024-01-02 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US11369665B2 (en) 2012-05-11 2022-06-28 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US9540419B2 (en) 2012-05-11 2017-01-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US10039811B2 (en) 2012-05-11 2018-08-07 Gemvax & Kael Co., Ltd. Anti-inflammatory peptides and composition comprising the same
US9730984B2 (en) 2012-05-11 2017-08-15 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating rheumatoid arthritis
US9844584B2 (en) 2012-05-11 2017-12-19 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for preventing or treating sepsis
US10967000B2 (en) 2012-07-11 2021-04-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell-penetrating peptide, conjugate comprising same and composition comprising same
WO2014010971A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 주식회사 카엘젬백스 Cell-penetrating peptide, conjugate comprising same and composition comprising same
US11844845B2 (en) 2012-09-19 2023-12-19 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US9572900B2 (en) 2012-09-19 2017-02-21 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US9631184B2 (en) 2012-09-19 2017-04-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US10245327B2 (en) 2012-09-19 2019-04-02 Gemvax & Kael Co., Ltd. Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate
US9907838B2 (en) 2013-04-19 2018-03-06 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition and methods for treating ischemic damage
US10383926B2 (en) 2013-06-07 2019-08-20 Gemvax & Kael Co., Ltd. Biological markers useful in cancer immunotherapy
US10561703B2 (en) 2013-06-21 2020-02-18 Gemvax & Kael Co., Ltd. Method of modulating sex hormone levels using a sex hormone secretion modulator
US9572858B2 (en) 2013-10-23 2017-02-21 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating and preventing benign prostatic hyperplasia
US10034922B2 (en) 2013-11-22 2018-07-31 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having angiogenesis inhibitory activity and composition containing same
US11058744B2 (en) 2013-12-17 2021-07-13 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for treating prostate cancer
US9937240B2 (en) 2014-04-11 2018-04-10 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having fibrosis inhibitory activity and composition containing same
US10662223B2 (en) 2014-04-30 2020-05-26 Gemvax & Kael Co., Ltd. Composition for organ, tissue, or cell transplantation, kit, and transplantation method
WO2016006744A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 주식회사 프로셀테라퓨틱스 Peptide-sirna complex for transdermal delivery using intracellular molecular transport peptide, and use thereof
US10463708B2 (en) 2014-12-23 2019-11-05 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US11077163B2 (en) 2014-12-23 2021-08-03 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide for treating ocular diseases and composition for treating ocular diseases comprising same
US10835582B2 (en) 2015-02-27 2020-11-17 Gemvax & Kael Co. Ltd. Peptide for preventing hearing loss, and composition comprising same
US10676507B2 (en) 2015-05-26 2020-06-09 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide and composition containing the same for anti-inflammation, anti-fibrosis, wound healing, and anticancer treatment
US11015179B2 (en) 2015-07-02 2021-05-25 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having anti-viral effect and composition containing same
US10898540B2 (en) 2016-04-07 2021-01-26 Gem Vax & KAEL Co., Ltd. Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same

Also Published As

Publication number Publication date
KR101263212B1 (en) 2013-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101263212B1 (en) A new cell-permeable peptide and its use
EP3341396B1 (en) Improved cell-permeable (icp)-socs3 recombinant protein and uses thereof
JP5548616B2 (en) VEGFR-1 / NRP-1 targeting peptide
JP4697982B2 (en) Modular transfection system
JP5858285B2 (en) Carrier peptide fragment and use thereof
Wang et al. Arginine-rich intracellular delivery peptides noncovalently transport protein into living cells
CN106255699B (en) Cell penetrating peptides and methods of using the same to deliver biologically active substances
KR101160381B1 (en) Method of producing recombinant TAT-HOXB4H protein for use as a stimulant of hematopoiesis in vivo
JP2011504458A5 (en)
CN116041551A (en) Interleukin-4 receptor binding fusion proteins and uses thereof
CN101511872A (en) Pharmaceutical composition for suppression of apoptosis and method for delivering the same
KR20230074076A (en) Modified mitochondria and use thereof
RU2685869C1 (en) Versions of disintegrin and their pharmaceutical application
WO2016179861A1 (en) Slit2d2-hsa fusion protein and use thereof against tumours
JP2003528596A (en) Amino acid sequence that promotes entry of a target substance into the cytoplasm and / or cell nucleus
JP2023019098A (en) Nucleolus transitional carrier peptide fragment, and application of the same
JP2007527206A (en) Peptabody for cancer treatment
CN107827970B (en) Anti-tumor protein peptide for inhibiting FOXM1
KR100935030B1 (en) New cell penetrating peptides and method for delivery of biologically active agents using thereof
WO2014191608A1 (en) Peptides derived from connexin 43, and pharmaceutical composition for the treatment of cancer
JP6932506B2 (en) Cell permeation composition and method using it
KR102348838B1 (en) Active TRAIL trimer and tumor targeting peptide multi-displayed on ferritin nanocage and use in anti-cancer agent thereof
US20220177547A1 (en) Ferritin nanocage for multi-displaying trail trimer and cancer-targeting peptide and use thereof as anticancer agent
KR102195740B1 (en) Cell-penetrating peptide dimers, method for preparing the same, and cargo delivery system using the same
KR102398339B1 (en) Fusion peptide for nitric oxide delivery and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160310

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170324

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180528

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190410

Year of fee payment: 7