KR20110117684A - 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20110117684A
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스티븐 밀러
러셀 엘. 브롬리
마이클 에이. 플레이스
다니엘 게츠
아론 마틴
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노쓰웨스턴 유니버시티
마이엘린 리페어 파운데이션, 인크.
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Abstract

본 발명은 항원 특이적 내성을 유도하는 방식으로 면역계에 항원 펩티드 및 단백질을 제시하는 캐리어 입자를 활용한다. 이러한 캐리어 입자는 면역 내성 효과를 유발하기 위해 고안된다. 본 발명은 자가면역 질환, 이식 거부 및 알러지성 반응과 같은 면역 관련 장애의 치료에 유용하다.

Description

항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR INDUCTION OF ANTIGEN-SPECIFIC TOLERANCE}
상호-참조
본 출원은 2009년 1월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 61/145,941을 우선권으로 청구하고, 이러한 출원은 본원에 참고로 포함된다.
배경 기술
면역 응답의 개시에 이르는 첫번째 단계는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 회합되어 제시되는 항원 단편의 인식이다. 항원의 인식은 항원이 외래 세포 또는 조직의 표면 상에서 MHC와 회합되는 경우 직접적으로 발생할 수 있거나, 또는 항원이 프로세싱된 후 전문적인 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에서 MHC와 회합되는 경우 간접적일 수 있다. 이같은 항원-MHC 복합체를 인식하는 휴식 중의 T 림프구가 이러한 복합체와 T 세포 수용체의 회합을 통해 활성화된다 (문헌 [Jenkins et al., J. Exp. Med. 165, 302-319, 1987]; [Mueller et al., J. Immunol. 144, 3701-3709, 1990]). 살아 있는 생물은 일반적으로 자가-조립 항체에 대해 면역 응답을 나타내지 않는다. 이는 천연 또는 선천적 면역 내성으로 칭해진다. 반면에, 살아 있는 생물에 항원이 대해 이종성인 경우에도, 언제 투약되는지, 어떻게 투약되는지, 그리고 어떤 형태로 투약되는지에 따라, 항원의 투약 시에 나타나는 면역 응답에 대해 반응하지 않을 수 있다. 이는 후천적 내성으로 칭해진다. T 세포가 추가적인 공동자극성 신호를 받지 않으면서 T 세포 수용체를 통해서만 자극된다면, 이는 비-응답성이 되거나, 무반응성이 되거나, 또는 사망하여, 면역 응답의 하향 조절 및 항원에 대한 내성이 초래된다. (문헌 [Van Gool et al., Eur. J. Immunol. 29(8):2367-75, 1999]; [Koenen et al., Blood 95(10):3153-61, 2000]). 그러나, T 세포가 공동자극으로 칭해지는 제2 신호를 받으면, T 세포가 증식하도록 유도되고, 기능성이게 된다 (문헌 [Lenschow et al., Annu. Rev. Immunol. 14:233, 1996]). 자가/비-자가 인식은 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포 또는 대식세포)와 T 림프구의 상호작용 수준에서 발생하는 것으로 생각된다.
원치 않는 면역 응답과 관련된 장애 (예를 들어, 자가면역 질환, 이식편 거부)에서의 일반적인 장기 면역억제를 위한 통상적인 임상 전략은 광범위하게 작용하는 면역억제 약물, 예를 들어, 신호 1 차단제 예컨대 시클로스포린 A (CsA), FK506 (타크롤리무스) 및 코르티코스테로이드의 장기 투여를 기초로 한다. 고용량의 이러한 약물의 장기 사용은 독성 부작용이 또한 있을 수 있다. 더욱이, 이러한 약물들을 허용할 수 있는 환자에서도, 일생 동안의 면역억제 약물 요법을 필요로 하는 것은 종양, 심각한 감염, 신독성 및 대사 장애가 포함되는 중증 부작용의 상당한 위험을 지닌다 (문헌 [Penn 2000]; [Fishman et al. 1998]).
항원 또는 펩티드의 세포 커플링(coupling)이 포함되는, 항원-특이적 내성을 유도하는 방법들이 개발되었다. 예를 들어, 한 방법에서, 펩티드 유도 세포 커플링 내성은 무균성 GMP 조건 하에 말초혈 세포를 수집하고, 분리하여, 질환 특이적 자가항원 및 에틸렌 카르보디이미드 (ECDI) 커플링 시약으로 처리하는 것 및 이어지는 도너(donor)/환자 내로의 재주입을 수반하였다. 이러한 프로세스는 비용이 많이 들고, 면밀히 모니터링되는 조건 하에 숙련된 의사에 의해 수행되어야 하며, 이러한 시술을 수행할 수 있는 시설의 수가 한정된다. 캐리어(carrier) 세포 유형으로서 적혈구를 사용하는 것은 동종이형 도너를 포함하도록 잠재적인 원천을 확장시키고, 따라서 원천 세포의 공급을 극적으로 증가시키고, 잠재적으로 이러한 요법의 전달을 수혈에 대해 인가된 임의의 환경으로 확장시킨다. 통상적인 방법은 에틸렌 카르보디이미드가 고정된 자가 지라세포의 사용을 또한 포함한다. 이러한 세포는 항원-특이적 내성이 추구되는 펩티드를 발현한다. 그러나, 충분한 개수의 세포를 수집하고 제조하는 것이 인간 자가면역 질환, 이식 거부 및 알러지성 또는 과다면역 응답을 치료하기 위해 이러한 기술을 광범위하게 이용하는 것에 대해 상당한 장애를 나타낸다. 이러한 접근법들은 원천 세포의 공급 및 캐리어에 대한 면역 응답을 최소화하기 위한 조직 유형 매칭(matching)에 대한 필요성 면에서 상당한 잠재적인 한계가 있다. 또한, ECDI를 통해 자가항원을 커플링시키기 위해 세포를 국소 처리하는 것은 상당한 품질 제어 쟁점을 제시한다.
발명의 개요
특정 상황, 예를 들어, 자가면역 질환, 이식 거부 및 알러지성 또는 과다면역 응답에서 면역 내성의 달성이 요망된다. 따라서, 높은 초기 용량의 면역억제 약물을 요구하지 않으면서 또는 캐리어로서 생물학적 물질을 사용하지 않으면서 장기 면역 내성을 효율적으로 유도할 수 있는 개선된 접근법이 요구된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어 입자를 포함하는, 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어 입자를 포함하는, 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 캐리어 입자는 폴리스티렌 입자이다. 한 측면에서, 조성물은 대상체에서 항원-특이적 내성을 유도한다. 원하는 경우, 항원성 펩티드는 자가면역 항원, 이식 항원 또는 알레르겐(allergen)일 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩티드는 미엘린 염기성 단백질, 아세틸콜린 수용체, 내인성 항원, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타-세포 항원, 인슐린, 글루탐산 디카르복실라제(decarboxylase) (GAD), 콜라겐 유형 11, 인간 연골 gp39, fp130-RAPS, 단백지질 단백질, 피브릴라린, 소형 핵인 단백질, 갑상선 자극 인자 수용체, 히스톤, 당단백질 gp70, 피루베이트 탈수소효소 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase) (PCD-E2), 모낭 항원 또는 인간 트로포미오신 이소형(isoform) 5이다. 또 다른 측면에서, 항원성 펩티드는 접합 분자에 의해 캐리어에 커플링된다. 또 다른 측면에서, 아폽토시스성 신호전달 분자는 스캐빈저(scavenger) 수용체 리간드 예컨대 아넥신-1, 아넥신-5, 포스파티딜 세린, 콜레스테롤, 유지방 구체-EGF-인자 8 (MFG-E8), 또는 Fas-리간드이다. 원하는 경우, 항원성 펩티드가 아폽토시스성 신호전달 분자에 융합될 수 있다. 또 다른 측면에서, 캐리어는 양자 점을 포함한다. 일부 예에서, 캐리어는 덴드리머(dendrimer), 리포솜 또는 미셀(micelle)이다. 캐리어는 또한 직경이 1000 마이크로미터 미만인 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있다. 나노입자 또는 마이크로입자는 생체분해성일 수 있다.
본 발명은 대상체에서 항원-특이적 면역 응답을 감소시키는 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법은 상기 대상체에게 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물을 투여하는 단계를 수반한다. 한 실시양태에서, 조성물은 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어 입자를 포함하고, 이때 상기 조성물은 대상체에서 항원-특이적 면역 응답을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어 입자를 포함하고, 이때 상기 조성물은 대상체에서 항원-특이적 면역 응답을 감소시킨다. 바람직한 실시양태에서, 캐리어 입자는 폴리스티렌 입자이다. 원하는 경우, 이러한 방법에서 사용되는 항원성 펩티드는 자가면역 항원, 이식 항원, 또는 알레르겐이다. 일부 예에서, 자가면역 항원은 대상체가 면역 응답을 개시하는 항원일 수 있다.
본 발명은 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 나노입자 또는 마이크로입자는 (a) 선천적인 또는 첨가된 아폽토시스성 신호전달 분자; 및 (b) 병원성 항원을 포함한다.
본 발명은 임의의 본원에 개시된 조성물을 이용하는 것을 필요로 하는 대상체에서 탈수초성장애를 완화시키는 방법을 또한 제공한다.
(a) 캐리어 입자; 및 (b) 캐리어 입자에 결합된 항원성 펩티드를 포함하는 항원 특이적 내성을 유도하기 위한 키트가 본원에서 추가로 제공된다.
참조 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 신규 특색들이 첨부된 청구항에서 상세하게 기재된다. 본 발명의 원리가 활용된 예시적인 실시양태들이 기재된 하기의 상세한 설명, 및 하기와 같은 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 특색 및 장점의 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 인공 캐리어에 접합된 펩티드를 사용한 치료 후의 EAE의 임상 징후에 대한 평균 임상 점수를 도해한다. 그래프는 PLP 펩티드와 커플링된 폴리스티렌 마이크로스피어(microsphere)가 SJL 마우스에서 PLP139 -151/CFA 유도 EAE로부터의 보호를 제공하였고 활성 EAE의 재발을 폐지시켰음을 나타낸다.
도 2는 마우스에서 PLP139 -151 유도 EAE의 유도 전 또는 유도 후 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어를 투여하는 것의 효과를 도해한다. (A) PLP139 -151 + 완전 프로인트 아주반트(Complete Freund's Adjuvant) (CFA)로의 프라이밍(priming) 전에 펩티드-커플링 마이크로스피어로 예비처리 ; (B) PLP178 -191 + 완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍 전에 펩티드-커플링 마이크로스피어로 예비처리; (C) PLP139 -151 + 완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍 후 펩티드-커플링 마이크로스피어로 후처리.
도 3은 마우스 모델에서의 지연형 과민증 귀 부종에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 도해한다.
도 4는 CNS 내로의 백혈구의 CNS 침윤에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 도해한다. 백혈구 마커들을 척수 슬라이스(slice)로부터 분석하였고, (A) 세포충실성; (B) CD4+CD3+ 세포, 및 (C) Foxp3+ 세포에 대해 염색하였다.
도 5는 지라절제 마우스에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 도해한다.
발명의 상세한 설명
항원-특이적 내성의 유도를 위한 방법이 자가면역 질환, 이식 거부 및 알러지성 또는 과다면역 응답의 치료가 포함되는 여러 경우에 면역 반응을 방지하거나 감소시키는데 바람직하다. 본 발명은 항원-특이적 내성을 유도하는 것과 같은 방식으로 면역계에 항원성 펩티드 및 단백질을 제시하는 캐리어를 사용한다. 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포 및 대식세포는 본래 면역계 케스케이드를 유발하지만, 항원이 공동자극 분자 및/또는 염증성 사이토카인 분비의 부재 하에 제시되는 경우에는 동일한 세포가 내성을 유도할 수 있다 (문헌 [Duperrier, K. et al. "Immunosuppressive agents mediate reduced allostimulatory properties of myeloid-derived dendritic cells despite induction of divergent molecular phenotypes". Mol Immunol 42 (2005), 1531-40]; [Piemonti, L. et al. "Glucocorticoids affect human dendritic cell differentiation and maturation". J Immunol 162 (1999), 6473-81]). 입자가 숙주 망상내피계의 항원 제시 세포 (APC)에 의해 또는 직접적으로 T-세포에 의해 자가 항원으로서 인지되도록 허용하고, 회합된 항원의 내성-유도 방식으로의 제시를 허용할 물질 (예를 들어 에틸렌 카르보디이미드 또는 ECDI)에 접합된 항원에 본 발명의 캐리어가 결합될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, 이러한 내성은 면역 세포 자극에서 수반되는 분자들 (예를 들어, MHC 클래스 I/II 또는 공동자극 분자)의 관련된 상향조절 없이 항원을 제시하는 것에 의해 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 불활성 캐리어, 예컨대 하기에 기술된 것들이 항원-특이적 내성을 유도하고/하거나, 면역 관련 질환 (예컨대 마우스 모델에서의 EAE)의 개시를 예방하고/하거나, 기존의 면역 관련 질환의 중증도를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 T 세포가 T-세포 활성화와 관련된 초기 이벤트를 시작하게 할 수 있지만, T-세포가 이펙터 기능을 획득하도록 허용하지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 투여는 준-활성화 표현형의 T-세포, 예컨대 CD69 및/또는 CD44 상향조절을 초래할 수 있지만, IFN-γ 또는 IL-17 합성의 결여에 의해 지시되는 바와 같이 이펙터 기능을 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 투여는 나이브(naive) 항원-특이적 T-세포가 조절성 표현형, 예컨대 CD25+/Foxp3+ 표현형의 세포로 전환되지 않으면서 준-활성화 표현형의 T-세포를 초래한다.
일부 예에서, 캐리어가 내성발생성 신호를 모방하는 분자에 추가로 접합된다. 아폽토시스성 신호전달 분자의 부가가 회합된 항원이 자가 항원임을 숙주에게 지시하여 내성화 응답을 초래하는 위험하지 않은 아폽토시스성 흡수 신호를 APC에게 특이적으로 신호전달하는 것으로 생각된다. 다른 예에서, 캐리어 입자는 별도의 아폽토시스성 신호전달 분자를 포함하지 않는다. 이론에 제한되지 않으면서, 항원 특이적 펩티드 또는 단백질을 보유하는 캐리어 입자는 미성숙 B 및 T 세포 (예를 들어, 지라, 골수 또는 림프절 내)를 표적으로 하여 내성에 영향을 미친다.
본 발명은 면역 관련 장애 예컨대 자가면역 질환, 이식 거부 및 알러지성 반응의 치료에 유용하다. 항원-특이적 내성 응답을 유도하기 위해 세포성 기질을 보유할 수 있는 생체적합성 합성 캐리어 시스템의 치환은 제작 용이성, 광범위한 치료제 이용가능성에 이를 수 있고, 샘플들 간의 균일성을 증가시킬 수 있으며, 잠재적인 치료 부위의 수를 증가시킬 수 있고, 캐리어 세포에 대한 알러지성 응답의 가능성을 극적으로 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "면역 응답"은 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 응답을 포함한다. 예시적인 면역 응답에는 T 세포 응답, 예를 들어, 사이토카인 생산 및 세포형 세포독성이 포함된다. 또한, 용어 면역 응답에는 사이토카인 응답성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화 및 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 초래되는 면역 응답, 예를 들어, 항체 생산 (체액성 응답)이 포함된다. 면역 응답에 수반되는 면역 세포에는 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포 (CD4+, CD8+, Th1 및 Th2 세포); 항원 제시 세포 (예를 들어, 전문적 항원 제시 세포 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 랑게르한스(Langerhans) 세포, 및 비-전문적 항원 제시 세포 예컨대 각질세포, 내피 세포, 별아교세포, 섬유모세포, 희소돌기아교세포); 천연 킬러(killer) 세포; 골수 세포, 예컨대 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구가 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "무반응(anergy)", "내성", 또는 "항원-특이적 내성"은 T 세포 수용체-매개 자극에 대한 T 세포의 불감성을 지칭한다. 이같은 불감성은 일반적으로 항원-특이적이고, 항원성 펩티드에 대한 노출이 중지된 후에 지속된다. 예를 들어, T 세포에서의 무반응은 사이토카인 생산, 예를 들어, IL-2의 결여를 특징으로 한다. T-세포 무반응은 제2 신호 (공동자극 신호)의 부재 하에 T 세포가 항원에 노출되고 제1 신호 (T 세포 수용체 또는 CD-3 매개 신호)를 수신할 때 발생한다. 이러한 조건 하에, 동일한 항원에 세포가 재노출되면 (공동자극 분자의 존재 하에 재노출이 발생하는 경우에도), 사이토카인을 생산하는데 실패하고, 이어서 증식하는데 실패한다. 따라서, 사이토카인 생산 실패가 증식을 방지한다. 그러나, 무반응성 T 세포는 사이토카인 (예를 들어, IL-2)과 함께 배양되면 증식할 수 있다. 예를 들어, ELISA에 의해 또는 지시물 세포주를 사용하는 증식 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 결여에 의해 T 세포 무반응이 또한 관찰될 수 있다. 별법적으로, 리포터(reporter) 유전자 구축물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무반응성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서(enhancer)의 제어 하에 이종성 프로모터에 의해 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 다량체에 의해 유도되는 IL-2 유전자 전사를 시작하지 못한다 (문헌 [Kang et al. 1992 Science. 257:1134]).
본원에서 사용된 용어 "면역학적 내성"은 a) 특이적 면역학적 응답의 수준 감소 (적어도 부분적으로 항원-특이적 이펙터 T 림프구, B 림프구, 항체 또는 이들의 등가물에 의해 매개되는 것으로 생각됨); b) 특이적 면역학적 응답의 발병 또는 진행에서의 지연; 또는 c) 특이적 면역학적 응답의 발병 또는 진행의 위험 감소가 있는, 치료되지 않은 대상과 비교하여 일정한 비율의 치료된 대상체에 대해 수행되는 방법을 지칭한다. "특이적" 면역학적 내성은 면역학적 내성이 다른 것과 비교하여 특정 항원에 대해 우선적으로 야기되는 경우에 발생한다.
본 발명의 다양한 측면이 하기의 하위 섹션들에서 더욱 상세하게 기술된다.
캐리어
본 발명의 항원-특이적 내성 유도 조성물은 입자, 비드(bead), 분지형 중합체, 덴드리머, 또는 리포솜을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 캐리어들 중 임의의 것으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 캐리어는 입상물질이고, 일반적으로 형상이 구형, 타원형, 막대-형상, 구체, 또는 다면체이다. 그러나, 별법적으로, 캐리어는 형상이 불규칙하거나 분지형일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 캐리어는 생체분해성인 물질로 구성된다. 음성 순전하를 일반적으로 나타내는 세포 표면에 대한 비-특이적 결합을 감소시키기 위해, 캐리어의 순 전하가 중성 또는 음성인 것이 추가로 바람직하다. 캐리어는, 직접적으로 또는 간접적으로, 이에 대한 내성이 요망되는 항원 (본원에서 항원-특이적 펩티드, 항원성 펩티드, 자가항원, 유도 항원 또는 내성화 항원으로 또한 지칭됨)에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 다중 카피의 항원-특이적 펩티드가 노출되기 위하여, 그리고 내성 응답의 가능성을 증가시키기 위하여, 캐리어에 다중 결합 부위가 있을 것이다. 캐리어에서, 캐리어 표면 상에 하나의 항원성 펩티드가 있을 수 있거나, 또는 표면 상에 상이한 다중 항원성 펩티드들이 있을 수 있다. 그러나, 별법적으로, 캐리어에 화학적 결합의 형성 없이 접합 모이어티(moiety)가 흡착될 수 있는 표면이 있을 수 있다.
일부 예에서, 항원-특이적 펩티드가 림프구가 성장되는 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포 (DC) 또는 대식세포로 전달된다 (예를 들어 지라, 골수, 흉선 및 림프절). 예를 들어, 지라, 골수, 흉선 및 림프절 내에, 상주성 APC 및 DC가 있다. 별법적으로, 항원-특이적 펩티드가 말초 APC 또는 DC로 전달될 수 있고, 여기에서 이는 먼저 캐리어를 내재화한 후, 림프구 성숙 부위 (예를 들어 지라, 골수, 흉선 또는 림프절)로 이동하여, 내성 응답을 활성화시킨다. 이는 일반적으로 1-3일 이내에 발생한다. 림프구 성숙 부위의 상주성 APC가 표적으로서 이용될 수 있다.
캐리어의 전체적인 크기 및 중량이 중요한 고려사항이다. 바람직하게는, 용해도를 강화하고, 생체 내에서 응집에 의해 야기되는 가능한 합병증을 방지하며, 음세포작용을 용이하게 하기 위해, 캐리어는 크기가 마이크로스코픽(microscopic) 또는 나노스코픽(nanoscopic)이다. 입자 크기는 사이질 공간에서 림프구 성숙 구역 내로의 흡수를 위한 인자일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 최대 단면 직경은 약 1,000 ㎛, 500 ㎛, 100 ㎛, 50 ㎛, 25 ㎛, 20 ㎛, 15 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 1 ㎛, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm 또는 100 nm 미만이다. 본 발명의 조성물은 림프구, 예를 들어, 미성숙 림프구 예컨대 지라, 흉선, 골수 또는 림프절에서 발견되는 것들에 전달되는 것을 최대화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐리어의 최대 직경은 약 5-80 nm이다. 별법적으로, 캐리어의 최대 직경은 약 10-70 nm, 또는 20-60 nm, 또는 30-50 nm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐리어의 전체 중량은 약 10,000 kDa 미만, 약 5,000 kDa 미만, 또는 약 1,000, 500, 400, 300, 200 또는 100 kDa 미만이다.
바람직하게는, 입자 표면이 비-특이적이거나 원치않는 생물학적 상호작용을 최소화하는 물질로 구성된다. 입자 표면과 사이질 간의 상호작용은 림프관 흡수에서 중요한 역할을 하는 인자일 수 있다. 비-특이적 상호작용을 방지하거나 감소시키기 위해 입자 표면이 물질로 코팅될 수 있다. 입자를 친수성 층 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 및 이의 공중합체 예컨대 플루로닉스(PLURONICS) (폴리(에틸렌 글리콜)-bl-폴리(프로필렌 글리콜)-bl-폴리(에틸렌 글리콜)의 공중합체 포함)로 코팅하는 것에 의한 입체적 안정화는 피하 주사 후의 개선된 림프관 흡수에 의해 실연되는 바와 같이 사이질의 단백질과의 비-특이적 상호작용을 감소시킬 수 있다. 이러한 사실들 모두는 림프관 흡수 면에서 입자의 물리적 성질의 중요성을 지적한다. 생체분해성 중합체가 중합체 및/또는 입자 및/또는 층 전체 또는 일부를 제조하는데 사용될 수 있다. 생체분해성 중합체는, 예를 들어, 관능기가 용액 내의 물과 반응하는 것의 결과로, 분해될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "분해"는 분자량의 감소에 의해 또는 소수성 기가 친수성 기로 전환되는 것에 의해 가용성이 되는 것을 지칭한다. 에스테르 기가 있는 중합체, 예를 들어, 폴리락티드 및 폴리글리콜리드는 일반적으로 자발적으로 가수분해된다. 예를 들어, 콜라게나제(collagenase) 또는 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)에 의해 분해되는 바와 같이, 특이적인 효소 공격을 받는 다수의 펩티드 서열이 공지되어 있다: 생물학적 유리 라디칼 메커니즘에 의해서만 분해되는 서열은 특이적으로 분해되지 않는다. 산화-민감성인 관능기가 있는 중합체는 순한 산화제에 의해 화학적으로 변경될 것이고, 이때 이에 대한 테스트는 시험관 내에서 20시간 동안 10％ 과산화수소에 노출되는 것에 의한 가용화 강화이다.
본 발명의 캐리어는 추가적인 성분을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 캐리어에 혼입 또는 접합된 조영제가 캐리어에 있을 수 있다. 현재 시판되는 조영제가 있는 캐리어 나노스피어(nanosphere)의 예는 코닥 X-사이트(Kodak X-sight) 나노스피어이다. 양자 점 (QD)으로 알려진, 무기 양자-구속 발광 나노결정이 FRET 용도에서 이상적인 도너로 판명되었다: 이의 높은 양자 수율 및 조정가능한 크기-의존적 스토크스 이동(Stokes Shift)은 단일 자외선 파장에서 여기되었을 때 청색에서 적외선까지 상이한 크기가 방출되도록 한다. (문헌 [Bruchez, et al., Science, 1998, 281, 2013]; [Niemeyer, C. M Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 5796]; [Waggoner, A. Methods Enzymol. 1995, 246, 362]; [Brus, L. E. J. Chem. Phys. 1993, 79, 5566]). 덴드리머로 공지된 중합체 부류를 기초로 하는 하이브리드(hybrid) 유기/무기 양자 점과 같은 양자 점이 생물학적 표지, 영상화, 및 광학적 바이오센싱(biosensing) 시스템에서 사용될 수 있다. (문헌 [Lemon, et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 12886]). 전통적인 무기 양자 점 합성과 달리, 이러한 하이브리드 양자 점 나노입자의 합성은 고온 또는 고도로 독성인 불안정한 시약을 요구하지 않는다. (문헌 [Etienne, et al., Appl. Phys. Lett. 87, 181913, 2005]).
마이크로비드 또는 나노비드 캐리어
일부 실시양태에서, 본 발명의 항원-특이적 내성 유도 조성물은 마이크로입자 또는 나노입자인 캐리어를 포함한다. 일부 예에서, 마이크로입자 또는 나노입자는 실질적으로 구형인 비드 또는 다공성 비드이다.
광범위한 물질로부터 캐리어 입자가 형성될 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 용도에 적절한 물질로 입자가 구성된다. 예를 들어, 입자가 유리, 실리카, 히드록시 카르복실산의 폴리에스테르, 디카르복실산의 다가무수물(polyanhydride), 또는 히드록시 카르복실산과 디카르복실산의 공중합체로 구성될 수 있다. 더욱 일반적으로, 캐리어 입자가 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화, 선형 또는 가교형 알카닐, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 아릴, 아랄킬, 알케닐, 아랄케닐, 헤테로아릴 또는 알콕시 히드록시 산의 폴리에스테르, 또는 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화, 선형 또는 가교형 알카닐, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 아릴, 아랄킬, 알케닐, 아랄케닐, 헤테로아릴 또는 알콕시 디카르복실 산의 다가무수물로 구성될 수 있다. 추가적으로, 캐리어 입자가 양자 점일 수 있거나, 또는 양자 점, 예컨대 양자 점 폴리스티렌 입자로 구성될 수 있다 (문헌 [Joumaa et al. (2006) Langmuir 22:1810-6]). 에스테르 및 무수물 결합의 혼합물 (예를 들어, 글리콜산 및 세박산의 공중합체)을 포함하는 캐리어 입자가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 캐리어 입자가 폴리글리콜산 중합체 (PGA), 폴리락트산 중합체 (PLA), 폴리세박산 중합체 (PSA), 폴리(락트산-코-글리콜산) 공중합체 (PLGA), 폴리(락트산-코-세박산) 공중합체 (PLSA), 폴리(글리콜산-코-세박산) 공중합체 (PGSA) 등이 포함되는 물질을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 기타 생체적합성, 생체분해성 중합체에는 카프로락탐, 카르보네이트, 아미드, 아미노산, 오르토에스테르, 아세탈, 시아노아크릴레이트 및 분해성 우레탄의 중합체 또는 공중합체, 뿐만 아니라 이들과 직쇄 또는 분지형, 치환 또는 비치환 알카닐, 할로알킬, 티오알킬, 아미노알킬, 알케닐 또는 방향족 히드록시- 또는 디-카르복실산의 공중합체가 포함된다. 또한, 반응성 측쇄 기가 있는 생물학적으로 중요한 아미노산, 예컨대 라이신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신 및 시스테인, 또는 이들의 거울상체가 상기 언급된 물질들 중 임의의 것과 함께 공중합체 내에 포함되어, 항원 펩티드 또는 단백질 또는 접합 모이어티에 접합하기 위한 반응성 기를 제공할 수 있다. 본 발명에 적절한 생체분해성 물질에는 PLA, PGA, 및 PLGA 중합체가 포함된다. 생체적합성이지만 생체분해성이지 않은 물질이 본 발명의 캐리어 입자에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 아크릴레이트, 에틸렌-비닐 아세테이트, 아실 치환 셀룰로스 아세테이트, 비-분해성 우레탄, 스티렌, 염화비닐, 플루오르화비닐, 비닐 이미다졸, 클로로술폰화 올레핀, 에틸렌 옥시드, 비닐 알콜, 테플론(TEFLON)® (듀퐁(DuPont), 델라웨어주 윌밍턴), 및 나일론의 비-생체분해성 중합체가 사용될 수 있다.
현재 시판되는 적절한 비드에는 폴리스티렌 비드 예컨대 플루오스피어(FluoSpheres) (모레큘러 프로브즈(Molecular Probes), 오리건 주 유진)가 포함된다.
한 실시양태에서, 마이크로입자 또는 나노입자가 APC에 의해 흡수된다. 바람직하게는, 마이크로입자 또는 나노입자의 크기는 APC에서 포식작용 또는 음세포작용을 촉발하는 범위이다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자 또는 나노입자는 약 100 nm 내지 50 ㎛, 1 ㎛ 내지 40 ㎛, 5 ㎛ 내지 30 ㎛ 또는 10 ㎛ 내지 20 ㎛의 범위이다. 일부 실시양태에서, 마이크로입자 또는 나노입자는 100 ㎛, 50 ㎛, 25 ㎛, 20 ㎛, 15 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 1 ㎛, 500 nm 또는 100 nm 미만이다. 다른 실시양태에서, 마이크로입자 또는 나노입자는 10 nm, 50 nm, 100 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm 또는 1 ㎛ 초과이다.
한 실시양태에서, 마이크로입자 및 나노입자가 미성숙 림프구가 있는 구역 (예를 들어 지라, 골수, 흉선 또는 림프절)에서 흡수된다. 본원에 문서화된 바와 같이, 크기가 미성숙 림프구가 있는 구역에서의 캐리어 흡수 및 유지에 관련된다. 캐리어 성질, 예컨대 크기 및 표면 특징에 상충되는 효과가 있을 수 있기 때문에, 효율적인 흡수 및 유지 양쪽 모두를 수득하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 더 작은 입자가 더 큰 입자보다 더 잘 흡수되지만, 유지가 더 낮다. 직경 약 5 nm 내지 약 10 ㎛ 크기의 캐리어가 바람직하다; 당업자는 명료하게 언급된 범위 내의 모든 범위 및 값, 예를 들어, 25 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 ㎛, 2 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 6 ㎛, 7 ㎛, 8 ㎛, 9 ㎛ 또는 10 ㎛가 고려된다는 것을 바로 이해할 것이다. 나노입자는 평균 직경이 약 5 내지 약 100 nm인 입자들의 선집으로 제조될 수 있다; 당업자는 명료하게 언급된 범위 내의 모든 범위 및 값, 예를 들어, 약 10 내지 약 70 nm가 고려된다는 것을 바로 이해할 것이다. 이같은 입자 선집의 크기 분포는 입자 선집의 평균 직경의 변동 계수 (표준 편차 ÷ 평균 입자 크기)가 약 50, 약 35, 약 20, 약 10, 또는 약 5 nm 미만일 수 있도록 제어될 수 있다. 당업자는 명료하게 언급된 범위 내의 모든 범위 및 값이 고려된다는 것을 바로 이해할 것이다.
물리적 성질은 미성숙 림프구가 있는 구역에서의 흡수 및 유지 후의 나노입자의 유용성에 또한 관련된다. 여기에는 기계적 성질 예컨대 강직성 또는 탄력성(rubberiness)이 포함된다. 일부 실시양태는 최근에 개발되고 전신 전달 (그러나 표적화된 전달 또는 면역 전달은 아님)을 특징으로 하는 PPS-PEG 시스템에서와 같이, PEG 내의 오버레이어(overlayer), 예를 들어, 친수성 오버레이어가 있는 탄력성 코어(core), 예를 들어, 폴리(프로필렌 술피드) (PPS) 코어를 기초로 한다. 탄력성 코어는 폴리스티렌 또는 금속 나노입자 시스템에서와 같은 실질적으로 강직성인 코어와 대조적이다. 용어 탄력성은 천연 또는 합성 고무 이외의 특정한 탄성 물질을 지칭하고, 이때 탄력성은 중합체 분야의 당업자에게 친숙한 용어이다. 예를 들어, 가교 PPS가 소수성 탄력성 코어를 형성하는데 사용될 수 있다. PPS는 산화 조건 하에 폴리술폭시드로, 그리고 최종적으로 폴리술폰으로 분해되어, 소수성 고무에서 친수성의 수용성 중합체로 전이되는 중합체이다. 기타 술피드 중합체가 사용하기 위해 개조될 수 있고, 이때 용어 술피드 중합체는 중합체의 골격 내에 황이 있는 중합체를 지칭한다. 사용될 수 있는 기타 탄력성 중합체 중합체는 수화된 조건 하에 유리 전이 온도가 약 37℃ 미만인 폴리스티렌이다. 소수성 코어는 친수성 오버레이어와 함께 유리하게 사용될 수 있는데, 이는 오버레이어가 코어로부터 입체적으로 확장되는 경향이 있도록 코어 및 오버레이어가 섞이지 않는 경향이 있을 것이기 때문이다. 코어는 이의 위에 층이 있는 입자를 지칭한다. 층은 코어의 적어도 일부분을 덮는 물질을 지칭한다. 층은 흡착될 수 있거나, 또는 공유결합으로 결합될 수 있다. 입자 또는 코어는 고체 또는 중공 물질일 수 있다. 탄력성 소수성 코어가 있는 입자에 의해 소수성 약물의 더 높은 로딩(loading)이 수행될 수 있다는 점에서, 탄력성 소수성 코어가 강직성 코어, 예컨대 결정질 또는 유리질 (폴리스테린의 경우) 코어보다 유리하다.
또 다른 물리적 성질은 표면의 친수성이다. 친수성 물질은 가교되지 않았을 때 물에서의 용해도가 1 g/ℓ 이상일 수 있다. 입자를 친수성 중합체로 입체적으로 안정화시키는 것은 비-특이적 상호작용을 감소시킴으로써 사이질로부터의 흡수를 개선시킬 수 있다; 그러나, 입자의 증가된 스텔스(stealth) 성질이 미성숙 림프구가 있는 구역에서의 포식 세포에 의한 내재화를 또한 감소시킬 수 있다. 그러나, 이러한 경쟁적인 특색들을 균형잡는 것의 난점에 마주치고, 본 출원은 림프절 내의 DC 및 기타 APC로의 효과적인 림프 전달을 위한 나노입자의 생성을 문서화한다. 일부 실시양태는 친수성 성분, 예를 들어, 친수성 물질의 층을 포함한다. 적절한 친수성 물질의 예는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리에틸렌 옥시드, 다당류, 폴리아크릴산 및 폴리에테르 중 하나 이상이다. 생체 내에서 유용한 정도의 입체 장애를 제공하도록, 예를 들어, 약 1,000 내지 약 100,000 또는 이를 초과하도록, 층 내의 중합체의 분자량이 조정될 수 있다; 당업자는 명료하게 언급된 범위 내의 모든 범위 및 값, 예를 들어, 10,000 내지 50,000이 고려된다는 것을 바로 이해할 것이다.
추가적인 반응을 위한 관능기가 나노입자에 혼입될 수 있다. 추가적인 반응을 위한 관능기에는 친전자체 또는 친핵체가 포함된다; 이들은 다른 분자와 반응하기에 편리하다. 친핵체의 예는 1차 아민, 티올, 및 히드록실이다. 친전자체의 예는 숙신이미딜 에스테르, 알데히드, 이소시아네이트, 및 말레이미드이다.
바람직한 실시양태에서, 평균 직경이 약 5-1000 nm, 10-400 nm, 20-200 nm, 30-100 nm 또는 약 40-50 nm인 캐리어 비드가 사용된다.
하나 이상의 항원성 펩티드에 결합된, 기술된 바와 같은 마이크로입자 또는 나노입자의 사용을 통해 항원-특이적 내성이 유도될 수 있다.
일련의 실시양태에서, 본 발명은 나노입자 캐리어 입자에 부착된 항원성 펩티드를 사용하는 내성 유도를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 예에서, 캐리어는 아폽토시스성 신호전달 분자를 또한 함유한다. 캐리어 입자는 고체, 중공 물질, 또는 다공성일 수 있다.
폴리스티렌 비드
폴리스티렌 비드가 아폽토시스성 신호전달 분자를 필요로 하지 않으면서 표면 상에 결합된 항원성 펩티드에 대해 항원-특이적 내성 효과를 도출하는 것으로 발견되었다. 한 실시양태에서, 본 발명은 우수한 성질, 예컨대 비드 크기 분포, 구멍 크기, 밀도, 팽윤 성질 및/또는 올리고머 합성에서 전형적으로 사용되는 용매 및 시약에 대한 내성에서의 탁월한 균일성을 지니는 가교된 관능화 폴리스티렌 비드를 제공한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 이러한 비드는 로딩 특성이 우수하다. 일부 바람직한 실시양태에서, 이러한 비드는 로딩 용량이 비드 1 g 당 약 50 μM 이상, 비드 1 g 당 약 100 μM 이상, 비드 1 g 당 약 150 μM 이상, 비드 1 g 당 약 200 μM 이상, 비드 1 g 당 약 250 μM 이상, 비드 1 g 당 약 300 μM 이상, 비드 1 g 당 약 350 μM 이상, 비드 1 g 당 약 400 μM 이상, 또는 비드 1 g 당 약 450 μM 이상이다. 일부 실시양태에서, 비드의 로딩 용량은 비드 1 g 당 약 100 μM 내지 비드 1 g 당 약 350 μM이다.
40-50 nm 범위의 폴리스티렌 입자는 수지상 세포 (DC)에 인식되는 위험한 신호를 촉발하는 것으로 공지되어 있다. 폴리스티렌 비드는 더 작은 크기 (20 nm) 및 더 큰 크기 (>100 nm)보다 중간 크기 (40 nm)에서 림프절에 더 많이 축적되는 것으로 공지되어 있다. 일부 예에서, 10-100 nm, 20-80 nm, 30-70 nm, 또는 40-50 nm 사이의 폴리스티렌 입자가 바람직할 수 있다.
폴리스티렌 비드 크기가 DC에 대한 신호를 촉발하는데 중요할 수 있는데, 이는 DC가 바이러스성 크기 범위를 인식하도록 진화되었기 때문이다. 따라서, 비드 크기가 성공적인 DC 표적화를 제어할 것이고, 이때 정확하게 크기가 맞춰진 비드가 말초에 있는 DC에 의해 인식된다. 추가적으로, 지라의 구조는 자신을 대식세포에 의한 입자의 흡수에 적합하게 한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 최대 단면 직경은 약 1,000 ㎛, 500 ㎛, 100 ㎛, 50 ㎛, 25 ㎛, 20 ㎛, 15 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 1 ㎛, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm 또는 100 nm 미만이다. 본 발명의 조성물은 림프구, 예를 들어, 미성숙 림프구 예컨대 지라, 흉선, 골수 또는 림프절에서 발견되는 것들에 대한 전달을 최대화하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐리어의 최대 직경은 약 10-500 nm이다. 별법적으로, 캐리어의 최대 직경은 약 100-500 nm, 또는 250-500 nm, 또는 300-500 nm이다. 일부 실시양태에서, 캐리어의 전체 중량은 약 10,000 kDa 미만, 약 5,000 kDa 미만, 또는 약 1,000, 500, 400, 300, 200 또는 100 kDa 미만이다.
일련의 실시양태에서, 본 발명은 폴리스티렌 비드에 부착된 항원성 펩티드를 사용하는 내성 유도를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 예에서, 항원성 펩티드는 폴리스티렌 비드에 항원성 펩티드의 N-말단을 통해 폴리스티렌 비드 상의 카르복실 부위에 연결된다. 일부 예에서, 캐리어는 아폽토시스성 신호전달 분자를 또한 함유한다.
분지형 중합체 캐리어 / 덴드리머
일부 실시양태에서, 본 발명의 내성 유도 조성물은 분지형 중합체, 예컨대 덴드리머인 캐리어를 포함한다. 분지형 중합체에는 관능화될 수 있는 수많은 사슬-끝부분 또는 말단이 있고, 따라서 다수의 내성 유도 복합체에 직접적으로 또는 접합 모이어티를 통해 간접적으로 접합될 수 있다.
일부 중합체 시스템은 자체가 나노입상물질이고, 용어 나노입자에 포함된다. 예를 들어, 덴드리머는 nm 범위의 나노입상물질일 수 있는 중합체 부류이다. 이러한 중합체는 이의 표면에 다수의 관능기를 포함하고, 예를 들어, 이들은 생체분자 및 기타 기에 접합하는데 사용되어 왔다. 유사하게, 항원이 덴드리머 표면에 접합될 수 있다. 또한, 덴드리머 표면 상의 관능기가, 예를 들어 히드록실화에 의해, 보체 활성화에 최적화될 수 있다. 일부 덴드리머-DNA 복합체가 보체를 활성화시키는 것으로 실연되었다. 덴드리머는 본원에 기술된 기술을 사용하여 림프 표적화를 위해, 항원 접합을 위해, 그리고 보체 활성화를 위해, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0086479, 2006/0204443, 및 미국 특허 번호 6,455,071 및 6,998,115 (명확하게 개시된 것과 모순되지 않는 정도로 본원에 참고로 포함됨)에서와 같이, 개조될 수 있는 흥미로운 나노입상물질 화학을 나타낸다.
다른 한편으로, 덴드리머는 소정의 환경에서의 성분 중합체의 용해도에 형상이 고도로 의존적이고, 덴드리머 주변의 용질 또는 용매, 예를 들어, 온도, pH, 이온 함량에서의 변화에 따라, 또는 DC에 의한 흡수 후에 극적으로 변할 수 있다. 대조적으로, 물리적 치수가 덴드리머 또는 단지 분지형인 다른 중합체 시스템보다 비교적 더욱 안정적인 나노입자가 보관 목적을 위해 또는 생물학적 활성과 관련하여 유용할 수 있고, 예를 들어, 친수성 코로나가 있는 고체 코어가 코로나를 이의 환경에 일관되게 제시할 것이다. 따라서, 나노입자의 일부 실시양태는 덴드리머가 아닌, 또는 고체인 코어가 있고/있거나 가교된 하이드로젤인 코어가 있는 입자에 의존한다. PPS-기반 나노입자는 덴드리머가 아니고, 고체 코어가 있다.
아르보롤(arborol), 케스케이드(cascade) 분자, 수지상 중합체, 또는 프랙탈(fractal) 중합체로 또한 공지된 덴드리머는 중심의 코어로부터 분지들이 나오는 고도로 분지된 거대분자이다. 덴드리머는 폴리아미도아민, 폴리아미도알콜, 폴리알킬렌이민 예컨대 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민, 폴리알킬렌 예컨대 폴리스티렌 또는 폴리에틸렌, 폴리에테르, 폴리티오에테르, 폴리포스포늄, 폴리실록산, 폴리아미드, 폴리아릴 중합체, 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 아미노산 (예를 들어, 폴리라이신)으로부터 덴드리머가 또한 제조될 수 있다. 바람직하게는, 접합을 용이하게 하기 위해 카르복실 또는 기타 음성 전하를 띠는 반응성 기로 종결되는 덴드리머가 사용된다.
덴드리머는 당업계에 공지되어 있고, 분지형 구조를 수득하기 위한 다관능성 단량체의 단계식 또는 반복식 반응에 의해 일반적으로 제조되는, 화학적으로 정의된 구형 분자이다 (예를 들어, 문헌 [Tomalia et al. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75] 참조). 다양한 덴드리머, 예를 들어, 아민-말단 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민 및 폴리프로필렌이민 덴드리머가 공지되어 있다. 본 발명에서 유용한 예시적인 덴드리머에는 "덴스 스타(dense star)" 중합체 또는 "스타버스트(starburst)" 중합체 예컨대 폴리(아미도아민) 덴드리머 ("PAMAM")가 포함되는 미국 특허 번호 4,587,329; 5,338,532; 및 6,177,414에 기술된 것들이 포함된다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 또 다른 다량체성 스페이서(spacer) 분자에는 화학적으로 정의된, 비-중합체성 원자가 플랫폼(platform) 분자 예컨대 미국 특허 번호 5,552,391; 및 PCT 출원 공개 WO 00/75105, WO 96/40197, WO 97/46251, WO 95/07073, 및 WO 00/34231에 기술된 것들이 포함된다. 다수의 기타 적절한 다가 스페이서들이 사용될 수 있고, 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 덴드리머 및 이의 용도가 미국 특허 출원 번호 20070238678에 기술되어 있고, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
이같은 덴드리머에는 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리(프로필렌이민) (PPI) 덴드리머, 폴리(트리아진) 덴드리머, 폴리(에테르-히드록시아민) (PEHAM) 덴드리머가 포함되지만, 이에 한정되지 않고, 이들에는 킬레이팅제를 배타적으로 수지상 중합체 내부로 밀어넣도록 또는 캡슐화와 조합되어 수지상 중합체의 표면과의 회합을 허용하도록 변형 또는 선택된 Z 기가 있을 수 있다. 일부 이같은 Z 표면의 예는 리간드와 상호작용하지 않는 것들이다; 이같은 Z 기는 히드록실, 에스테르, 산, 에테르, 카르복실산 염, 알킬, 글리콜, 예를 들어 히드록실 기, 특히 아미도에탄올로부터의 것, 아미도에틸에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아민, 카르보메톡시피롤리돈, 아미도, 티오우레아, 우레아, 카르복실레이트, 숙시남산 및 폴리에틸렌 글리콜 또는 히드록실 알킬 변형이 있는 또는 없는 1차 또는 1차, 2차 또는 3차 아민 기이다. 기타 적절한 표면 기에는 수지상 중합체 표면의 연합 부착을 허용할 (이와 회합될) 임의의 관능기가 포함될 수 있고, 수용체 매개 표적화 기 (예를 들어, 엽산, 항체, 항체 단편, 단일쇄 항체, 단백질, 펩티드, 올리고머, 올리고펩티드, 또는 유전자 물질) 또는 생체적합성, 생체분포, 용해도를 용이하게 하거나 독성을 조정할 기타 관능기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 덴드리머는 표면 상에 아미노 및/또는 카르복시 결합 부위를 함유한다.
현재 시판되는 적절한 덴드리머에는 폴리아미도아민 덴드리머 예컨대 스타버스트(Starburst)™ 덴드리머 (덴드리머테크(Dendritech), 미시간주 미들랜드)가 포함된다. 스타버스트™ 덴드리머는 아민 기 또는 카르복시메틸 기에서 종결되고, 이러한 기들은, 추가적인 변형과 함께 또는 변형 없이, 그리고 개재된 접합 모이어티와 함께 또는 모이어티 없이, 항원 펩티드 및 단백질을 이러한 캐리어의 표면에 접합시키는데 사용될 수 있다.
한 덴드리머 생산 방법에서, 단량체 층의 순차적인 부가에 의해 코어 분자로부터 바깥쪽을 향해 덴드리머가 합성된다. 제1 라운드의 덴드리머 합성은 단량체의 단일 층 또는 "세대"를 코어에 부가하고, 이때 각각의 단량체에는 하나 이상의 반응성 유리 말단이 있다. 각각의 후속 중합 라운드는 한 층씩 덴드리머의 확장을 초래하고, 반응성 유리 말단의 개수를 증가시킨다. 원하는 직경 또는 중량의 덴드리머가 생산되도록 이러한 공정이 여러 번 반복될 수 있다. 분지의 밀도가 증가함에 따라, 가장 바깥쪽의 분지들이 더 낮은 밀도의 코어를 둘러싸는 스피어(sphere)의 형태로 자신들을 배열한다. 예를 들어, 본원에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,338,532 참조. 또한, 코어 분자의 형상을 바꿈으로써, 덴드리머가 막대-형상, 디스크-유사, 및 빗-유사 형태로 생산될 수 있다. 생성된 덴드리머는 임의의 다수의 반응성 유리 말단을 보유할 수 있고, 여기에 다수의 항원 펩티드 및 단백질이 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 덴드리머의 형상은 구형 또는 알 모양이다.
덴드리머는 중량, 크기, 형상 및 말단 반응성 기의 개수 면에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 덴드리머는 중량 면에서 100 내지 10000 kDa, 또는 200 내지 5000 kDa, 또는 250 내지 2500 kDa 범위일 수 있다. 또한 덴드리머는 크기 면에서 최장 직경이 20 내지 1000 nm, 30 내지 500 nm, 또는 50 내지 250 nm 범위일 수 있다.
덴드리머, 예를 들어, PANAM 또는 PPI 덴드리머의 사용은 특정 개수의 아미노 결합 부위가 표면에 있는 양이온성 구형 입자의 생성을 가능하게 한다. 이러한 입자의 크기는 로딩을 최적화하도록, 그리고 표면 연결 항원 펩티드들 간의 입체 장애를 최소화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 용도에서, 6-7 세대의 PANAM 덴드리머가 사용되어, 분자량 50-125 kDa, 직경 60-90 옹스트롬 (헤모글로빈, IgG 또는 히스톤과 크기가 대략적으로 유사함), 및 활성 표면 기 100-1500개의 입자가 초래되었다.
다양한 원자가의 다가 스페이서가 본 발명의 실행에서 유용하고, 다양한 실시양태에서, 다가 스페이서는 약 3개 내지 약 400개의 핵산 모이어티, 종종 3개 내지 100개, 때때로 3-50개, 빈번하게 3-10개, 그리고 때때로 400개를 초과하는 핵산 모이어티에 결합된다. 다양한 실시양태에서, 다가 스페이서는 10개 초과, 25개 초과, 50개 초과, 또는 500개 초과의 핵산 모이어티 (동일하거나 상이할 수 있음)에 접합된다. 다가 스페이서를 포함하는 특정 실시양태에서, 본 발명이 약간 상이한 분자 구조들의 집단을 제공한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 덴드리머는 생산된 분자들의 다소 이질성인 혼합물로 구성될 수 있고, 즉 각각의 덴드리머 분자에 연결된 상이한 개수 (확정할 수 있는 범위 내이거나 대부분 이러한 범위 내임)의 핵산 모이어티를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 덴드리머들은 크기 및 형상이 유사하고, 즉, 서로 20％, 15％, 10％, 5％, 2％ 또는 1％ 이내로 변하는 개수의 핵산 모이어티로 구성된다.
덴드리머가 아닌 분지형 중합체가 본 발명에서 또한 사용될 수 있고, 덴드리머와 동일한 일반적인 물질 부류로부터 생산될 수 있다. 이같은 분지형 중합체의 합성이 또한 당업계에 주지되어 있다.
분지형 중합체는 5개 이상의 말단, 10개 이상의 말단, 또는 100개 이상의 말단을 포함할 수 있다. 분지형 중합체는 5개 내지 500개의 말단, 바람직하게는 10개 내지 400개의 말단, 더욱 바람직하게는 50개 내지 250개의 말단을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 내성 유도 조성물은 내성 유도 복합체가 분지형 또는 선형 중합체에 접합된 접합체의 생산을 제공한다.
리포솜 캐리어
일부 실시양태에서, 다량체성 항원 펩티드 또는 단백질 접합체는 리포솜 또는 미셀인 캐리어를 포함한다. 지질 소포로 또한 칭해지는 리포솜은 지질 막으로 둘러싸인 수성 구획이고, 적절한 지질을 수성 매질에 현탁시키고, 혼합물을 진탕시키거나, 압출하거나 초음파처리하여 소포의 분산액을 산출함으로써 전형적으로 형성된다. 단층 소포 및 다층 소포를 포함하여 다양한 형태의 리포솜이 본 발명에서 사용될 수 있다.
폴리(에틸렌 글리콜) 및 PPS의 AB 및 ABA 블록 공중합체로부터 형성된 미셀을 포함하여, 미셀 시스템은 상기 기술된 것과 동일한 유용한 특징들을 또한 나타낼 수 있다. 이같은 공중합체들이 폴리(에틸렌 글리콜)의 몰 분획이 비교적 높게, 예를 들어, 약 40％ 과량으로 형성되는 경우, 특정 조건 하에 구형 미셀이 형성될 것으로 예상될 수 있다. 이러한 미셀은 소형일 수 있고, 예를 들어, 림프 진입을 위해 상기 언급된 크기를 충족시킬 수 있으며, 임의적으로 PEG의 오버레이어가 그래프트될 수 있거나 또는 다른 방식으로 PEG 또는 기타 중합체가 혼입되어 유사한 성질을 달성할 수 있다. 또한, 미셀 표면에서 본원에 교시된 바와 같은 항원, 위험 신호 또는 양쪽 모두와 접합될 수 있다. 블록 공중합체는 보체 활성화를 위해 히드록실 기로 종결될 수 있고, 친수성 블록이 히드록실 기로 종결되어 이러한 히드록실 기가 보체 결합을 위해 미셀형 나노입자 표면 상에서 더욱 쉽게 이용가능한 것이 특히 이롭다. 이같은 히드록실화 표면은 효과적으로 보체를 활성화하도록 맞춰질 수 있다. 특히 유용한 친수성 블록은 히드록실 기로 종결되는 PEG이다. 미셀-형성 중합체 구성에 더하여, 블록 크기 및 블록 크기 비율이 소포 구조를 형성하도록 선택될 수 있다. 사용될 수 있는 미셀형 제형의 다수의 기타 가능한 화학 조성이 또한 존재한다.
또 다른 일련의 실시양태에서, 본 발명은 다수의 항원 펩티드 및 단백질이 리포솜의 외부 표면에 접합된 다량체성 항원 펩티드 및 단백질 접합체의 생산을 제공한다.
리포솜은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티드산, 디세틸 포스페이트, 모노시알로강글리오시드, 폴리에틸렌 글리콜, 스테아릴 아민, 오보레시틴 및 콜레스테롤의 지질, 뿐만 아니라 다양한 화학양론의 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 지질 물질로부터 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 리포솜은 비-지질 양쪽성 분자, 예컨대 폴리(옥시에틸렌-b-이소프렌-b-옥시에틸렌)의 블록 공중합체 등으로부터 또한 형성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜은 포스파티딜 세린, 디아세틸 포스페이트 및 디미리스토일 포스파티드산으로부터 생산된 것과 같이 음성 전하를 띠는 리포솜을 형성할 지질로부터 제조된다.
면역원성을 감소시키도록 또는 접합을 위한 편리한 반응성 기를 제공하도록 리포솜의 표면이 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, 시알산 또는 기타 탄수화물, 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 알킬 또는 알케닐 중합체가 면역원성을 감소시키도록 리포솜의 표면에 부착될 수 있다. 별법적으로, 작은 몰 백분율의 예를 들어 비오틴-X-디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (모레큘러 프로브즈, 오리건주 유진)을 리포솜 내에 포함하는 것에 의해 접합 모이어티 예컨대 비오틴을 보유하는 리포솜이 생산될 수 있다.
항원 펩티드 및 단백질을 캐리어에 접합시키는 수단
당업계에 주지되어 있는 다양한 수단을 사용하여 항원성 펩티드 및 단백질을 캐리어에 접합시킬 수 있다. 이러한 방법에는 항원 펩티드 및 단백질의 생물학적 활성을 파괴하거나 심하게 제한하지 않고, 충분한 개수의 항원 펩티드 및 단백질이 항원 펩티드 또는 단백질과 동족 T 세포 수용체의 상호작용을 허용하는 배향으로 캐리어에 접합되도록 하는 임의의 표준 화학이 포함된다. 일반적으로, 항원 펩티드 또는 단백질의 C-말단 영역, 또는 항원 펩티드 또는 단백질 융합 단백질의 C-말단 영역을 캐리어에 접합시키는 방법이 바람직하다. 물론, 정확한 화학은 캐리어 물질의 성질, 항원 펩티드 또는 단백질에 대한 C-말단 융합의 존재 또는 부재, 및/또는 접합 모이어티의 존재 또는 부재에 좌우될 것이다.
이용가능성을 위해 필요하다면 관능기가 입자 상에 위치할 수 있다. 한 위치는 코어 중합체 또는 코어 위의 층인 중합체 또는 다른 방식으로 입자에 매달린 중합체 상의 측면 기 또는 말단으로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 특이적 세포 표적화 또는 단백질 및 펩티드 약물 전달을 위해 쉽게 관능화될 수 있는 나노입자를 안정화시키는 PEG를 기술하는 예가 본원에 포함된다.
접합체 예컨대 에틸렌 카르보디이미드 (ECDI), 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 2개의 에폭시 잔기를 함유하는 프로필렌글리콜 디-글리시딜에테르, 및 에피클로로히드린이 펩티드 또는 단백질을 캐리어 표면에 고정시키는데 사용될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, ECDI는 내성 유도를 위한 2개의 주요 기능을 달성하는 것으로 생각된다: (a) 단백질/펩티드를 유리 아미노기와 유리 카르복실기 간의 펩티드 결합 형성의 촉매를 통해 세포 표면에 화학적으로 커플링시키고, (b) 지라 내의 숙주 항원 제시 세포에 의해 채집되고 내성을 유도하도록, 캐리어를 아폽토시스성 세포 사망을 모방하게 유도한다. 비-면역원성 방식으로의 숙주 T-세포에 대한 이러한 제시는 자가반응성 세포에서의 무반응의 직접적인 유도에 이른다. 또한, ECDI는 특이적 조절 T 세포의 유도를 위한 강력한 자극물 역할을 한다.
일련의 실시양태에서, 항원 펩티드 및 단백질이 화학적 공유 결합을 통해 캐리어에 결합된다. 예를 들어, 항원의 C-말단에 가까운 반응성 기 또는 모이어티 (예를 들어, C-말단 카르복실 기, 또는 아미노산 측쇄로부터의 히드록실, 티올 또는 아민 기)가 직접적인 화학 반응에 의해 캐리어의 표면 상의 반응성 기 또는 모이어티 (예를 들어, PLA 또는 PGA 중합체의 히드록실 또는 카르복실 기, 덴드리머의 말단 아민 또는 카르복실 기, 또는 인지질의 히드록실, 카르복실 또는 포스페이트 기)에 직접적으로 접합될 수 있다. 별법적으로, 항원 펩티드 및 단백질과 캐리어 양쪽 모두에 공유결합으로 접합됨으로써 이들을 함께 연결하는 접합 모이어티가 있을 수 있다.
캐리어 표면 상의 반응성 카르복실 기가 항원 펩티드 또는 단백질 상의 유리 아민 (예를 들어, Lys 잔기로부터의 아민)에 이를, 예를 들어, 1-에틸-3-[3,9-디메틸 아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS)와 반응시킴으로써 연결될 수 있다. 유사하게, 동일한 화학이 캐리어 표면 상의 유리 아민을 항원 펩티드 또는 단백질 상의 유리 카르복실 (예를 들어, C-말단, 또는 Asp 또는 Glu 잔기로부터의 카르복실)과 접합시키는데 사용될 수 있다. 별법적으로, 본질적으로 문헌 [Arano et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2:71-6]에 기술된 바와 같이, 술포-SIAB 화학을 사용하여, 캐리어 표면 상의 유리 아민 기가 항원 펩티드 및 단백질, 또는 항원 펩티드 또는 단백질 융합 단백질에 공유결합으로 결합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항원 펩티드 또는 단백질에 결합된 리간드와 캐리어에 부착된 항-리간드 사이의 비-공유결합성 결합이 항원을 캐리어에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 비오틴 리가제(ligase) 인식 서열 태그(tag)가 항원 펩티드 또는 단백질의 C-말단에 연결될 수 있고, 이러한 태그가 비오틴 리가제에 의해 비오틴화될 수 있다. 그러면 비오틴이 항원 펩티드 또는 단백질을 항-리간드로서 캐리어의 표면 상에 흡착된 또는 다른 방식으로 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 비-공유결합으로 접합시키는 리간드로서의 역할을 할 수 있다. 별법적으로, 항원 펩티드 및 단백질이 상기 기술된 바와 같이 Fc 영역을 보유하는 면역글로불린 도메인에 융합되면, Fc 도메인이 리간드로서 작용할 수 있고, 캐리어 표면 상에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 결합된 단백질 A가 항원 펩티드 또는 단백질을 캐리어에 비-공유결합으로 접합시키는 항-리간드로서의 역할을 할 수 있다. 금속 이온 킬레이트화 기술 (예를 들어, 항원 펩티드 또는 단백질 또는 항원 펩티드 또는 단백질 융합 단백질의 C-말단의 폴리-His 태그, 및 Ni+-코팅 캐리어를 사용함)이 포함되는, 항원 펩티드 및 단백질을 캐리어에 비-공유결합으로 접합시키는데 사용될 수 있는 기타 수단이 당업계에 주지되어 있고, 이러한 방법들이 본원에 기술된 것들을 대체할 수 있다.
하나 이상의 가교제 및 핵산 모이어티 상의 관능기 및 플랫폼(platform) 분자가 전형적으로 수반되는, 플랫폼 분자에 대한 핵산 모이어티의 접합이 많은 방식으로 실행될 수 있다. 표준 합성 화학 기술을 사용하여 연결 기가 플랫폼에 부가된다. 표준 합성 기술을 사용하여 핵산 모이어티에 연결 기가 부가될 수 있다.
아폽토시스성 신호전달 분자
일부 실시양태에서, 본 발명의 내성 유도 조성물은 아폽토시스성 신호전달 분자를 함유한다. 아폽토시스성 신호전달 분자는 캐리어가 숙주의 항원 제시 세포, 예컨대 숙주 망상내피계의 세포에 의해 아폽토시스체로 인지되도록 하는 역할을 한다. 이는 회합된 펩티드 에피토프가 내성-유도 방식으로 제시되도록 한다. 이론에 제한되지 않으면서, 이는 면역 세포 자극에서 수반되는 분자, 예컨대 MHC 클래스 I/II, 및 공동자극 분자의 상향조절을 방지하는 것으로 가정된다. 이러한 아폽토시스성 신호전달 분자는 또한 포식작용 마커로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적절한 아폽토시스성 신호전달 분자가 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 번호 20050113297에 기술되어 있다. 본 발명에 적절한 분자에는 대식세포, 수지상 세포, 단핵구 및 중성구가 포함되는 포식 세포를 표적으로 하는 분자가 포함된다.
아폽토시스성 신호전달 분자로서 적절한 분자는 회합된 펩티드의 내성을 강화하는 작용을 한다. 추가적으로, 아폽토시스성 신호전달 분자에 결합된 캐리어가 아폽토시스성 세포 인식에서 C1q에 의해 결합될 수 있다 (문헌 [Paidassi et al., (2008) J. Immunol. 180:2329-2338]). 예를 들어, 아폽토시스성 신호전달 분자로서 유용할 수 있는 분자에는 포스파티딜 세린, 아넥신-1, 아넥신-5, 유지방 구체-EGF-인자 8 (MFG-E8), 또는 트롬보스폰딘 패밀리가 포함된다.
트롬보스폰딘은 세포-대-세포 및 세포-대-매트릭스 소통에 참여하는 세포외 단백질들의 패밀리이다. 이들은 조직 생성 및 복구 동안 세포 표현형을 조절한다. 또한, 트롬보스폰딘-1 (TSP-1)은 아폽토시스성 세포 상에서 발현되고, 대식세포에 의한 이의 인식에서 수반된다. 따라서, 트롬보스폰딘-1은 본 발명에 따라 포식작용을 강화하도록 사용될 수 있는 또 다른 포식작용 마커이다. CD36 분자를 통해 대식세포가 아폽토시스성 세포 상의 TSP-1을 인식하고, 이러한 분자는 대식세포의 표면 상에 존재하고 아폽토시스성 세포 상에 또한 존재할 수 있다. 어떠한 이론에 의해서도 제한되기를 원치 않으면서, 아폽토시스성 세포의 표면 상의 CD36/TSP1 복합체가 세포를 대식세포 상의 알파(v)베타 3/CD36/TSP1로 구성된 복합체에 연결하는 리간드를 형성할 수 있는 것이 가능하다. TSP-1이 CD36에 결합하는 것이 TSP-1의 TSR-1 도메인과 CD36 내의 CLESH-1로 칭해지는 보존된 도메인의 상호작용에 의해 매개되는 것이 가능하다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 세포 또는 분자의 표면 상의 TSP-1, CD36, 또는 TSP-1/CD36 복합체의 수준 또는 밀도를 증가시킴으로써, 예를 들어, TSP-1, CD36, 또는 TSP-1/CD36 복합체를 세포에 전달함으로써 포식작용이 강화된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, TSP-1/CLESH 도메인 복합체가 세포에 전달된다.
별법적으로 또는 추가적으로, 포식작용 마커가 대식세포와 이의 표적 간의 연결제로서의 역할을 하는 분자 (예를 들어, MFG-E8, b2-당단백질 등), 또는 이같은 분자의 일부분을 포함할 수 있다. 이같은 마커는, 예를 들어, 대식세포에 의한 포스파티딜 세린의 인식을 용이하게 할 수 있거나, 또는 간접적으로 인식될 수 있다. 포식작용을 강화하는 것으로 공지된 기타 마커에는 단백질 S, 성장 정지 특이적 유전자 생성물 GAS-6, 및 다양한 보체 성분 (인자 B, C1q, 및 C3을 포함하지만 이에 한정되지 않음)이 포함된다. 상기 언급된 바와 같이, MFG-E8은 자극된 대식세포에 의해 생산되고 아미노인지질 예컨대 포스파티딜세린 (PS)을 인식함으로써 아폽토시스성 세포에 특이적으로 결합하는 분비형 당단백질이다. MFG-E8은, 인지질에 의해 고용된 경우, 자신의 RGD (아르기닌-글리신-아스파테이트) 모티프를 통해 세포에 결합하고, 알파(v)베타(3) 인테그린을 발현하는 세포, 예컨대 대식세포에 특히 강하게 결합한다. MFG-E8의 2개 이상의 스플라이스(splice) 변이체가 공지되어 있고, 이중 L 변이체가 포식작용을 자극하는데 활성인 것으로 여겨진다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 포식작용 마커는 MFG-E8의 L 스플라이스 변이체 (MFG-E8-L)를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 포식작용 마커는 MFG-E8의 N-말단 도메인을 포함한다.
아넥신 I은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 또 다른 포식작용 마커이다. 간략하게, 37 kDa 단백질 아넥신 I (Anx-1; 리포코틴 1)은 포식작용의 조절, 세포 신호전달 및 증식에 연루된 글루코코르티코이드-조절 단백질이고, 염증에서 및 뇌하수체 전엽 호르몬 방출의 제어에서 글루코코르티코이드 작용의 매개물인 것으로 가정된다. 아넥신 I 발현이 아폽토시스성 세포에서 상승되고, 아폽토시스성 세포 상의 포스파티딜세린을 포식 세포에 연결시키는 것에서, 그리고 포식 세포 예컨대 대식세포에 의한 아폽토시스성 세포의 인식을 강화하는 것에서 역할을 하는 것으로 보인다. 어떠한 이론에 의해서도 제한되기를 원치 않으면서, 대식세포 상의 포스파티딜세린 수용체가 아넥신 I 또는 아넥신 I 및 PS를 함유하는 복합체를 인식하는 것 또는 PS를 클러스터로 응집시킴으로써 아넥신 I이 인식을 용이하게 하는 것이 가능하다. 추가적으로, 기타 DC 표적화 연구에서, 접합된 표적화 리간드 예컨대 항-Dec-205 및 항-CD11c가 DC 특이성을 증가시키기 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 아폽토시스성 신호전달 분자가 항원-특이적 펩티드에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원-특이적 펩티드가 융합 단백질의 생성에 의해 접합된다. 본원에서 사용된 "융합 단백질"은 아폽토시스성 신호전달 분자 (또는 이의 단편 또는 변이체)의 하나 이상의 분자에 대한 하나 이상의 항원-특이적 펩티드 (또는 이의 단편 또는 변이체)의 융합에 의해 형성된 단백질을 지칭한다. 융합 단백질의 생성에 대해, 용어 "융합 단백질", "융합 펩티드", "융합 폴리펩티드", 및 "키메라 펩티드"는 상호교환가능하게 사용된다. 항원-특이적 펩티드의 적절한 단편에는 본 발명의 원하는 항원-특이적 내성 기능을 생성시키는 기능을 유지하는, 전장 펩티드의 임의의 단편이 포함된다. 아폽토시스성 신호전달 분자의 적절한 단편에는 아폽토시스성 신호를 생성시키는 기능을 유지하는, 전장 펩티드의 임의의 단편이 포함된다. 본 출원은 본원에 기재된 기준 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 항원-특이적 펩티드 또는 아폽토시스성 신호전달 분자 또는 이의 융합 단백질) 또는 이의 단편에 대해 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 폴리펩티드를 함유하는 단백질에 또한 지시된다. 변이체는 기준 핵산 또는 폴리펩티드과 상이하지만 이의 본질적인 성질을 유지하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 지칭한다. 일반적으로, 변이체는 기준 핵산 또는 폴리펩티드와 전반적으로 밀접하게 유사하고, 많은 영역에서, 이와 동일하다. 본원에서 사용된 "변이체"는 각각 본 발명의 항원-특이적 펩티드, 아폽토시스성 신호전달 분자 또는 이들의 융합 단백질과 서열 면에서 상이하지만 이들의 하나 이상의 기능적 및/또는 치료적 성질 (예를 들어, 면역계에서 내성을 유발하거나 또는 아폽토시스성 신호를 일으킴)을 유지하는 항원-특이적 펩티드, 아폽토시스성 신호전달 분자 또는 이들의 융합 단백질을 지칭한다. 본 발명은 예를 들어 본 발명의 항원-특이적 펩티드, 아폽토시스성 신호전달 분자 또는 이들의 융합 단백질의 아미노산 서열에 대해 적어도 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 별법적으로는 이러한 서열로 구성되는 단백질에 또한 지시된다.
다양한 수단에 의해 융합 단백질이 생성될 수 있다. 한가지 수단은 유전자 융합에 의한 것이다 (즉, 융합 단백질이 항원-특이적 펩티드 전체 또는 이의 일부분 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 아폽토시스성 신호전달 분자 전체 또는 이의 일부분 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 인-프레임(in-frame)으로 연결되어 있는 핵산 서열의 번역에 의해 생성된다). 2개의 단백질은 직접적으로 또는 아미노산 링커를 통해 융합될 수 있다. 융합 단백질을 형성하는 폴리펩티드들은 전형적으로는 C-말단 대 N-말단으로 연결되지만, C-말단 대 C-말단, N-말단 대 N-말단, 또는 N-말단 대 C-말단으로 또한 연결될 수 있다. 융합 단백질의 폴리펩티드들은 임의의 순서일 수 있다. 이러한 용어는 보존적으로 변형된 변이체, 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체, 하위서열, 및 융합 단백질을 구성하는 항원의 종간(interspecies) 상동체를 또한 지칭한다. 융합 단백질은 화학적 접합에 의해 또한 생성될 수 있다. 융합 폴리펩티드의 생성을 위한 프로토콜들이 당업계에 주지되어 있고, 여기에는 다양한 재조합 수단 및 DNA 합성기가 포함된다. 별법적으로, 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원-특이적 펩티드 융합 단백질이 PCR 증폭 및 앵커(anchor) 프라이머(primer)를 사용하여 쉽게 또한 생성될 수 있고, 이때 상기 프라이머는 2개의 연속적인 유전자 단편들 사이에 유전자 상보적인 오버행(overhang)을 발생시키고, 이어서 이들이 어닐링(annealing)되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열이 생성된다. 예를 들어, 아폽토시스성 신호전달 분자가 인-프레임으로 항원-특이적 펩티드와 융합될 수 있다. 본 발명에서, 아폽토시스성 신호전달 분자 또는 항원-특이적 펩티드가 융합 단백질의 N-말단 부분일 수 있다.
화학적 접합이 포함되는 표준 기술을 사용하여 융합 단백질이 일반적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질이 재조합 단백질로서 발현되어, 융합되지 않은 단백질과 비교하여 발현 시스템에서 증가된 수준의 생산을 허용한다. 간략하게, 폴리펩티드 성분을 코딩하는 DNA 서열들이 따로따로 어셈블리되어, 적합한 발현 벡터 내로 결찰될 수 있다. 하나의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 DNA 서열의 3' 끝부분이, 펩티드 링커로 또는 펩티드 링커 없이, 서열들의 리딩 프레임이 동조되도록 제2 폴리펩티드 성분을 코딩하는 DNA 서열의 5' 끝부분에 결찰된다. 이는 양쪽 성분 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지하는 단일 융합 단백질로의 번역을 허용한다.
제1 폴리펩티드 성분과 제2 폴리펩티드 성분을 각각의 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되는 것을 보장하기에 충분한 거리만큼 분리하기 위해 펩티드 링커 서열이 사용될 수 있다. 이같은 펩티드 링커 서열이 당업계에 주지된 표준 기술을 사용하여 융합 단백질 내로 혼입된다. 적절한 펩티드 링커 서열이 하기의 인자들을 기초로 선택될 수 있다: (1) 유연한 연장된 구조를 채택할 수 있음; (2) 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 기능성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택할 수 없음; 및 (3) 폴리펩티드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 띠는 잔기가 없음. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 중성에 가까운 기타 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala가 링커 서열에서 또한 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌 [Maratea et. al., Gene 40:39-46 (1985)]; [Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986)]; 미국 특허 번호 4,935,233 및 미국 특허 번호 4,751,180에 개시된 것들이 포함된다. 링커 서열은 일반적으로 길이가 아미노산 1개 내지 약 50개일 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드에 기능성 도메인들을 분리하고 입체적인 방해를 방지하는데 사용될 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역이 있는 경우에는 링커 서열이 요구되지 않는다.
결찰된 DNA 서열들이 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. DNA의 발현을 담당하는 조절 요소는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에만 위치한다. 유사하게, 번역을 끝내는데 요구되는 정지 코돈 및 전사 종결 신호는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 대해 3'에만 존재한다.
항원성 펩티드 및 단백질
본 발명의 조합물에서 사용되는 항원에 대한 다수의 선택권이 진료의에게 있다. 조합물 내에 존재하는 유도 항원은 유도되는 내성발생성 응답의 특이성에 기여한다. 이는 원치 않는 면역학적 응답에 대한 표적이거나 이에 대해 내성이 요망되는, 치료될 대상 내에 존재하거나 대상 내에 놓일 항원인 표적 항원과 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
본 발명의 유도 항원은 생물학적 공급원으로부터 단리된 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 당지질 또는 기타 물질일 수 있거나, 또는 화학적으로 합성된 소형 분자, 중합체, 또는 생물학적 물질의 유도체일 수 있고, 단 이는 점막 결합 성분과 조합되는 경우 본 명세서에 따른 내성을 유도하는 능력이 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 유도 항원은 단리된 또는 재조합에 의해 생산된 단일 분자이다. 표적 항원이 숙주 내의 다양한 위치에 흩어져 있는 용태를 치료하기 위해, 유도 항원이 표적 항원과 동일하거나 또는 면역학적으로 관련되는 것이 일반적으로 필요하다. 이같은 항원의 예는 대부분의 폴리뉴클레오티드 항원, 및 일부 탄수화물 항원 (예컨대 혈액형 항원)이다.
표적 항원이 특정 기관, 세포 또는 조직 유형에서 우선적으로 발현되는 경우, 진료의는 표적 항원과 동일하거나 또는 면역학적으로 관련되는 유도 항원을 사용하는 선택권을 또다시 갖는다. 그러나, 표적에 대한 방관자인 항원을 사용하는 추가적인 선택권이 또한 존재한다. 이는 표적 항원과 면역학적으로 관련되지 않을 수 있지만 표적 항원이 발현되는 조직에서 우선적으로 발현되는 항원이다. 방관자 억제의 유효성에 관한 작업 이론은 억제가 표적 세포에서의 면역 응답의 이펙터 팔을 하향-조절하는 활성 세포-매개 프로세스라는 것이다. 억제인자 세포가 점막 표면에서 유도제 항원에 의해 특이적으로 자극되고, 방관자 항원이 우선적으로 발현되는 조직 부위로 귀향한다. 상호작용성 또는 사이토카인-매개 메커니즘을 통해, 국소화된 억제인자 세포가 이웃에 있는 이펙터 세포 (또는 이펙터 세포의 유도제)를, 이들이 반응성인 대상과 관계 없이, 하향-조절시킨다. 이펙터 세포가 유도 항원과 상이한 표적에 대해 특이적이면, 결과가 방관자 효과이다. 방관자 반응의 추가적인 상술 및 이러한 효과가 있는 내성발생성 펩티드의 목록에 관하여, 독자는 국제 특허 공개 WO 93/16724를 참조한다. 방관자 이론은 본 발명을 실행하기 위해 당업자가 항원에 대한 내성을 원하는 특정 표적 항원을 확인 또는 단리할 필요가 없다는 것을 함축한다. 진료의는 유도 항원으로서 사용하기 위해 표적 부위에서 우선적으로 발현되는 하나 이상의 분자를 수득할 수 있을 것만을 필요로 한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 유도 항원은 치료될 개체에서 발현되는 것과 동일한 형태이지 않고, 이의 단편 또는 유도체이다. 본 발명의 유도 항원에는 적합한 특이성의 분자를 기초로 하지만 단편화, 잔기 치환, 표지, 접합, 및/또는 다른 기능성 성질이 있는 펩티드와의 융합에 의해 개조된 분자를 기초로 하는 펩티드가 포함된다. 임의의 원치 않는 성질, 예컨대 독성 또는 면역원성을 제거하는 것, 또는 임의의 원하는 효과, 예컨대 점막 결합, 점막 투과 또는 면역 응답의 내성발생성 팔의 자극을 강화하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 원하는 목적을 위해 개조가 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 인슐린 펩티드, 콜라겐 펩티드, 및 미엘린 염기성 단백질 펩티드와 같은 용어는 무손상 서브유닛뿐만 아니라, 자신이 이에 대해 유사체인 각각의 분자의 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 연속적인 아미노산에 대해 상동성 (아미노산 수준에서 바람직하게는 70％ 동일하고, 더욱 바람직하게는 80％ 동일하며, 더욱 더 바람직학는 90％ 동일함)인 영역을 함유하는 합성 변이체, 단편, 융합 펩티드, 접합체 및 기타 유도체를 지칭하고, 이때 유도체의 상동성 영역은 표적 항원에 대한 내성을 유도하는 능력을 각각의 어버이 분자와 공유한다.
유도 항원의 내성발생성 영역이 항원 응답의 자극을 위한 면역우세 에피토프와 종종 상이한 것으로 인지된다. 일반적으로 내성발생성 영역은 T 세포를 수반하는 특정 세포 상호작용에서 존재할 수 있는 영역이다. 내성발생성 영역은 무손상 항원의 제시 시 존재할 수 있고 내성을 유도할 수 있다. 천연 항원의 프로세싱 및 제시가 일반적으로는 내성을 촉발하지 않는다는 점에서, 일부 항원은 잠재성(cryptic) 내성발생성 영역을 함유한다. 잠재성 항원 및 이의 확인의 상술이 국제 특허 공개 WO 94/27634에서 확인된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 2개, 3개 또는 그 이상의 다수의 유도 항원이 사용된다. 다수의 표적 항원이 있는 경우에 이러한 실시양태들을 실행하는 것이, 또는 표적에 대한 다수의 방관자를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인슐린 및 글루카곤 양쪽 모두가 당뇨병의 치료에서 점막 결합 성분과 혼합될 수 있다. 여러 가능한 별법적인 표적들을 다루기 위해 항원들의 칵테일을 제공하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조직적합성 항원 단편들의 칵테일이 미지의 표현형의 동종이식편의 추후 이식이 예상되는 대상체를 내성화시키는데 사용될 수 있다. 인간 백혈구 항원의 동종변이체(allovariant) 영역이 당업계에 공지되어 있다: 예를 들어, 문헌 [Immunogenetics 29:231, 1989]. 또 다른 예에서, 알레르겐들의 혼합물이 아토피의 치료를 위한 유도 항원으로서의 역할을 할 수 있다.
분자의 성질에 따라, 당업계에 공지된 다수의 기술에 의해 유도 항원이 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 및 탄수화물 항원이 이들이 보강된 치료될 종의 세포로부터 단리될 수 있다. 짧은 펩티드는 아미노산 합성에 의해 편리하게 제조된다. 공지된 서열의 더 긴 단백질은 코딩 서열을 합성하거나 또는 천연 공급원 또는 벡터로부터 코딩 서열을 PCR-증폭시킨 후, 코딩 서열을 적절한 박테리아 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조합물은 세포 또는 조직으로부터 수득된 항원들의 복합 혼합물을 포함하고, 이들 중 하나 이상이 유도 항원으로서의 역할을 한다. 항원은 손상되지 않은 또는 포름알데히드, 글루타르알데히드 또는 알콜과 같은 고정제로 처리된 전체 세포의 형태일 수 있다. 항원은 세포 또는 조직의 세제 용해 또는 기계적 파열에 이은 정화에 의해 생성된 세포 용해물의 형태일 수 있다. 세포하 분획화, 특히 세제 용해 및 투석이 임의적으로 이어지는 분별 원심분리와 같은 기술에 의한 형질막의 강화에 의해 항원이 또한 수득될 수 있다. 기타 분리 기술들, 예컨대 용해된 막 단백질의 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피가 또한 적절하다.
한 실시양태에서, 항원성 펩티드 또는 단백질은 자가항원, 동종항원 또는 이식 항원이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 자가항원은 미엘린 염기성 단백질, 콜라겐 또는 이의 단편, DNA, 핵 및 핵소체 단백질, 미토콘드리아 단백질 및 췌장 β-세포 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 이에 대한 내성을 원하는 항원을 투여하는 것에 의한 자가면역 질환의 치료를 위한 자가항원에 대한 내성의 유도를 제공한다. 예를 들어, 미엘린 염기성 단백질 (MBP)에 대해 지시된 자가항체가 다발성 경화증 환자에서 관찰되고, 따라서, MBP 항원성 펩티드 또는 단백질이 다발성 경화증을 치료 및 예방하기 위해 본 발명의 조성물을 사용하여 전달되도록 본 발명에서 사용될 수 있다.
또 다른 비-제한적인 예로서, 이란성 쌍둥이로부터의 이식에 대한 후보인 대상체가 이식된 세포, 조직 또는 기관의 거부를 경험할 수 있는데, 이는 이식된 항원이 수용자에 대해 이종이기 때문이다. 의도되는 이식편에 대한 수용 개체의 사전 내성은 추후의 거부를 폐기 또는 감소시킨다. 만성 항-거부 요법의 감소 또는 제거가 본 발명의 실행에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 예에서, 다수의 자가면역 질환이 내인성 또는 자가 항원에 대한 세포성 면역 응답을 특징으로 한다. 내인성 항원에 대한 면역계의 내성이 이러한 질환을 제어하는데 바람직하다.
추가적인 예에서, 예컨대 근무 중에 마주칠 수 있는 공업 오염물 또는 화학물질에 대한 개체의 민감화가 면역 응답의 위험을 제시한다. 화학물질, 특히 개체의 내인성 단백질과 반응한 화학물질 형태의 화학물질에 대한 개체의 면역계의 사전 내성이 면역 응답의 추후의 직업적인 발달을 방지하는데 바람직할 수 있다.
알레르겐은 이에 대한 면역 응답의 내성이 또한 바람직한 또 다른 항원이다.
특히, 병원성 자가항원이 알려져 있지 않은 질환에서도, 해부학적으로 근접하여 존재하는 항원을 사용하여 방관자 억제가 유도될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐에 대한 자가항체가 류머티스성 관절염에서 관찰되고, 따라서, 콜라겐-코딩 유전자가 류머티스성 관절염을 치료하기 위해 항원-발현 유전자 모듈로서 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Choy (2000) Curr Opin Investig Drugs 1:58-62] 참조). 또한, 베타 세포 자가항원에 대한 내성이 제1형 당뇨병의 발달을 예방하는데 이용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Bach and Chatenoud (2001) Ann Rev Immunol 19:131-161] 참조).
또 다른 예로서, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 대해 지시된 자가항체가 자가면역 뇌척수염에서, 그리고 다수의 기타 CNS 질환, 뿐만 아니라 다발성 경화증에서 관찰된다 (예를 들어 문헌 [Iglesias et al. (2001) Glia 36:22-34] 참조). 따라서, 본 발명에서 MOG 항원 발현 구축물을 사용하는 것은 다발성 경화증, 뿐만 아니라 중추 신경계의 관련된 자가면역 장애의 치료를 허용한다.
자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 후보 자가항원의 또 다른 예로는 하기의 것들이 포함된다: 인슐린-의존적 당뇨병을 치료하기 위한 췌장 베타-세포 항원, 인슐린 및 GAD; 류머티스성 관절염을 치료하는데 사용하기 위한 콜라겐 유형 11, 인간 연골 gp 39 (HCgp39) 및 gp130-RAPS; 다발성 경화증을 치료하기 위한 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 단백지질 단백질 (PLP) 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG, 상기 참조); 피부경화증을 치료하기 위한 피브릴라린 및 소형 핵인 단백질 (snoRNP); 그레이브스병을 치료하는데 사용하기 위한 갑상선 자극 인자 수용체 (TSH-R); 전신 홍반 루푸스를 치료하는데 사용하기 위한 핵 항원, 히스톤, 당단백질 gp70 및 리보솜 단백질; 원발성 담즙성 간경화를 치료하는데 사용하기 위한 피루베이트 탈수소효소 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제 (PCD-E2); 원형 탈모증을 치료하는데 사용하기 위한 모낭 항원; 및 궤양성 결장염을 치료하는데 사용하기 위한 인간 트로포미오신 이소형 5 (hTM5).
내성 평가
단리된 세포로 또는 동물 모델에서 실험을 수행함으로써 조합물을 내성을 촉진하는 이의 능력에 대해 테스트할 수 있다.
내성발생성 활성에 대한 위임장은 표적 부위에서 적합한 사이토카인의 생산을 자극하는 무손상 항원 또는 단편의 능력이다. 표적 부위에서 T 억제인자 세포에 의해 방출되는 면역자극성 사이토카인은 TGF-β인 것으로 생각된다 (문헌 [Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:421, 1992]). 내성 동안 생산될 수 있는 기타 인자는 사이토카인 IL4 및 IL-10, 및 매개물 PGE이다. 대조적으로, 활성 면역 파괴가 진행되는 조직에서의 림프구는 IL-1, IL-2, IL-6, 및 γ-IFN과 같은 사이토카인을 분비한다. 따라서, 후보 유도 항원의 효능을 적합한 유형의 사이토카인을 자극하는 이의 능력을 측정함으로써 평가할 수 있다.
이를 염두에 두고, 유도 항원의 내성발생성 에피토프, 효과적인 점막 결합 성분, 효과적인 조합물, 또는 효과적인 점막 투여 양식 및 일정에 대한 신속한 스크리닝 테스트가 시험관내 세포 분석법을 위한 도너로서 동계 동물을 사용하여 수행될 수 있다. 동물을 점막 표면에서 테스트 조성물로 처리하고, 일부 경우에는 완전 프로인트 아주반트 내의 표적 항원을 비경구 투여로 챌린지한다. 지라 세포를 단리하고, 약 50 ㎍/㎖ 농도의 표적 항원의 존재 하에 시험관 내에서 배양한다. 내성발생성 에피토프의 위치의 지도를 작성하기 위해 표적 항원을 후보 단백질 또는 하위-단편으로 치환한다. 배지 내로의 사이토카인 분비를 표준 면역분석법에 의해 정량할 수 있다.
다른 세포의 활성을 억제하는 세포의 능력을 표적 항원으로 면역화된 동물로부터 단리된 세포를 사용하여, 또는 표적 항원에 대해 응답성인 세포주를 생성시킴으로써 결정할 수 있다 (문헌 [Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol. 11:195, 1981]). 이러한 실험의 한 변형에서, 증식을 방지하기 위해 억제인자 세포 집단에 가볍게 방사선을 조사하고 (약 1000 내지 1250 라드), 억제인자를 응답자 세포와 공동-배양한 후, 삼중수소 티미딘 혼입 (또는 MTT)을 사용하여 응답자의 증식 활성을 정량한다. 또 다른 변형에서, 억제인자 세포 집단 및 응답자 세포 집단을 더 높은 수준 및 더 낮은 수준의 이중 챔버 트랜스웰(transwell) 배양 시스템 (코스타(Costar), 매사추세츠주 캠브리지)에서 배양하고, 이는 집단들이 폴리카르보네이트 막에 의해 분리되어 서로 1 ㎜ 이내에서 공동배양되도록 허용한다 (WO 93/16724). 이러한 접근법에서, 응답자의 증식 활성을 별도로 측정할 수 있기 때문에 억제인자 세포 집단의 자극이 불필요하다.
표적 항원이 개체 내에 이미 존재하는 본 발명의 실시양태에서, 항원을 단리하거나 이를 점막 결합 성분과 미리 조합할 필요가 없다. 예를 들어, 식품 알레르겐의 소화를 통해 또는 병리학적 용태 (예컨대 염증성 장 질환 또는 소아 지방변증)의 결과로서 특정 양식으로 개체 내에서 항원이 발현될 수 있다. 1회 이상의 용량 또는 제형으로 점막 결합 성분을 제공하고, 원위치에서 항원에 대한 내성화를 촉진하는 이의 능력을 결정함으로써 테스트가 수행된다.
특정 질환의 치료를 위한 조성물 및 투여 방식의 유효성이 상응하는 동물 질환 모델에서 또한 상술될 수 있다. 질환의 종합적 증상을 감소 또는 지연시키는 치료 능력이 질환의 생화학적 및 면역학적 순환 특징물의 수준, 침범된 조직의 면역조직학, 및 사용되는 모델에 대해 적합하게 총체적인 임상 특색에서 모니터링된다. 테스트에 사용될 수 있는 동물 모델의 비-제한적인 예가 하기 섹션에서 포함된다.
TH1 응답, TH2 응답, TH17 응답, 또는 이러한 응답들의 조합을 조정하는 것에 의한 내성의 조정이 본 발명에서 구현된다. TH1 응답을 조정하는 것은, 예를 들어, 인터페론-감마의 발현을 변화시키는 것을 포함한다. TH2 응답을 조정하는 것은, 예를 들어, IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 임의의 조합의 발현을 변화시키는 것을 포함한다. 전형적으로, TH2 응답에서의 증가 (감소)는 IL-4, IL-5, IL-10, 또는 IL-13 중 하나 이상의 발현에서의 증가 (감소)를 포함할 것이다; 더욱 전형적으로는 TH2 응답에서의 증가 (감소)는 IL-4, IL-5, IL-10, 또는 IL-13 중 2개 이상의 발현에서의 증가를 포함할 것이고, 가장 전형적으로는 TH2 응답에서의 증가 (감소)는 IL-4, IL-5, IL-10, 또는 IL-13 중 3개 이상에서의 증가를 포함할 것인 한편, 이상적으로는 TH2 응답에서의 증가 (감소)는 IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13 모두의 발현에서의 증가 (감소)를 포함할 것이다. TH17을 조정하는 것은, 예를 들어, TGF-베타, IL-6, IL-21 및 IL23의 발현을 변화시키는 것을 포함하고, IL-17, IL-21 및 IL-22의 수준을 달성한다.
본 발명의 연구에서, 가속화된 질환 개시에도 불구하고, 전반적인 질환 발병률 및 중증도가 CD200KO 마우스에서 경시적으로 감소하였고, 이때 질환 증상에서의 감소가 상승된 개수의 조절 T 세포의 개수 및 높은 IL-10 분비 지라 골수 세포의 존재와 질환 프로세스에서 추후에 상호관련되었다. CD200KO가 망막 항원에 대한 내성을 강화하였다. CD200KO의 이러한 결과는 야생형과 비교하여 호흡관 내의 APC의 변경된 표현형 및 내성화된 CD200KO 마우스에서의 강화된 Th2 스위치와 관련될 수 있다. CD200KO 마우스에서의 내성 유도가 효율적이었고, 이때 면역화 28일 후에 50％의 눈이 질환으로부터 여전히 보호되었다 (예를 들어, 문헌 [Murphy and Reiner (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:933-944]; [Suri-Payer, et al. (1998) J. Immunol. 160:1212-1218]; [Thornton and Shevach (2000) J. Immunol. 164:183-190]; [Roncarolo, et al. (2001) Immunol. Rev. 182:68-79]; [Peiser and Gordon (2001) Microbes Infect. 3:149-159]; [Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:23-35] 참조).
본 발명의 연구에서, 제28일에 허위로 내성화된 CD200KO 마우스 및 내성화된 CD200KO 마우스 양쪽 모두의 지라에서 CD11b-IL10하이 ( high ) 세포가 명확하게 증가되었다. 이러한 세포들은 제21일부터 모든 실험군 내에 존재하는 더 큰 CD11b+IL10로우( low ) 집단과 별개였다. 어떠한 추가적인 활성화 자극, 또는 브레펠딘 A 또는 기타 골지 억제제에 의한 인공적인 사이토카인 격리도 없이 생체 외에서 직접적으로 세포를 분석했을 때, 검출된 높은 수준의 IL-10은 내인성이었다. 이러한 세포들의 추가적인 분석은 이들이 CD11c-/로우, CD45RB중간체 및 B220-이고 형질세포모양 DC 형태임을 가리켰다. 유사한 표현형이지만 CD45RB하이인 내성발생성 형질세포모양 DC가 IL-10과의 시험관내 배양에 의해 생성될 수 있고, 정상 C57B1/6 마우스의 지라로부터 단리될 수 있으며, IL10 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서 상승된다. 이러한 세포는 시험관 내에서 분화하는데 3주가 걸리고, 본 발명의 연구에서 질환 발병 3-4주 후 CD200KO 지라에서 나타났으며, 이는 장기간의 자극 및/또는 여러 라운드의 세포 분열이 수반된다는 것을 시사한다. 생체 내에서, 골수 유래 형질세포모양 세포가 또한 내성발생성이었고 생체 내에서 항원 특이적 IL-10 분비 Treg를 생성시킬 수 있었다. 유의한 개수의 CD3+CD4+IL-10+ 세포가 이러한 연구에서 발견되지 않았지만, CD200KO 마우스에서 증가된 개수의 CD3+CD4+CD25+를 향한 경향이 발견되었고, 이는 내성화된 군에서 모든 시점에 유의하였다. 예를 들어, IL-2 또는 IL-10의 발현을 억제하는 것에 의해, Treg에 면역억제 효과가 있을 수 있다. 본 발명의 연구의 제28일의 모든 군에서의 IL-10의 유도 및 IL-2의 억제가 질환 프로세스 동안의 조절성 T 세포의 유도, 및 항원의 비강 투여와 Tr1의 유도를 연결시키는 발견과 일관되었다 (예를 들어, 문헌 [Shevach (2002) Nat. Rev. Immunol 2:389400]; [McGuirk and Mills (2002) Trends Immunol. 23:450455]; [Herrath and Harrison (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:223-232]; [Bluestone and Abbas (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:253-257]; [Thornton and Shevach (1998) J. Exp. Med. 188:287-296]; [Jonuleit, et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1213-1222]; [Wakkach, et al. (2003) Immunity 18:605-617] 참조).
자가항원 및 자가면역 질환에 대한 내성이 흉선 내의 자가-반응성 T-세포의 음성 선별 및 흉선 제거에서 벗어나고 말초에서 발견되는 자가반응성 T 세포에 대한 말초 내성의 메커니즘을 포함하는 다양한 메커니즘에 의해 달성된다. 말초 T 세포 내성을 제공하는 메커니즘의 예로는 자가 항원의 "무시", 자가 항원에 대한 무반응 또는 무응답, 사이토카인 면역 치우침, 및 자가-반응성 T 세포의 활성화-유도 세포 사망이 포함된다. 또한, 조절성 T 세포가 말초 내성을 매개하는 것에서 수반되는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌 [Walker et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:11-19]; [Shevach et al. (2001) Immunol. Rev. 182:58-67] 참조. 일부 상황에서, 자가항원에 대한 말초 내성이 상실 (또는 파괴)되고, 자가면역 응답이 뒤이어 일어난다. 예를 들어, EAE에 대한 동물 모델에서, TLR 선천 면역 수용체를 통한 항원 제시 세포 (APC)의 활성화가 자가-내성을 파괴하고 EAE의 유도를 초래하는 것으로 나타났다 (문헌 [Waldner et al. (2004) J. Clin. Invest. 113:990-997]).
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 TLR7/8, TLR9, 및/또는 TLR 7/8/9 의존적 세포 자극을 억제하거나 감소시키는 한편 항원 제시를 증가시키는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 특정 NISC의 투여는 면역자극성 폴리뉴클레오티드와 관련된 TLR 7/8, TLR9, 및/또는 TLR7/8/9 의존적 세포 응답을 억제하는 한편 DC 또는 APC에 의한 항원 제시를 초래한다. 이같은 억제는 하나 이상의 TLR-관련 사이토카인의 감소된 수준을 포함할 수 있다. TLR9 의존적 세포 자극을 억제하는데 사용하기에 적합한 IRP는 TLR9와 관련된 세포 응답을 저해 또는 억제하는 IRP이다.
사용 방법
본 발명은 개체에게 본원에 기술된 바와 같은 항원-캐리어 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 개체, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간에서 면역 응답을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 면역조절 방법에는 면역자극 폴리펩티드, 예컨대 미엘린 염기성 단백질에 의해 자극되는 면역 응답을 포함하지만 이에 한정되지 않는 선천 면역 응답을 억제 및/또는 저해하는 방법이 포함된다.
항원-캐리어 복합체는 면역 응답을 조절하는데 충분한 양으로 투여된다. 본원에 기술된 바와 같이, 면역 응답의 조절은 체액성 및/또는 세포성일 수 있고, 당업계의 표준 기술을 사용하여, 그리고 본원에 기술된 바와 같이 측정된다.
특정 실시양태에서, 개체는 알러지성 질환 또는 용태, 알러지 및 천식과 같은 원치 않는 면역 활성화와 관련된 장애를 앓는다. 알러지성 질환 또는 천식에 걸린 개체는 기존의 알러지성 질환 또는 천식의 인식가능한 증상이 있는 개체이다.
특정 실시양태에서, 개체는 자가면역 질환 및 염증성 질환과 같은 원치 않는 면역 활성화와 관련된 장애를 앓는다. 자가면역 질환 및 염증성 질환에 걸린 개체는 기존의 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 인식가능한 증상이 있는 개체이다.
자가면역 질환은 크게 2가지 카테고리로 분류될 수 있다: 기관-특이적 및 전신성. 자가면역 질환에는 류머티스성 관절염 (RA), 전신 홍반 루푸스 (SLE), 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 다발성 경화증 (MS), 면역-매개 불임증 예컨대 조기 난소 부전, 피부경화증, 쇼그렌 질환, 백반증, 탈모 (대머리), 다선성 부전, 그레이브스 병, 갑상선기능저하증, 다발근육염, 보통 천포창, 낙엽 천포창, 크론병 및 궤양성 결장염이 포함되는 염증성 장 질환, B형 간염 바이러스 (HBV) 및 C형 간염 바이러스 (HCV)와 관련된 것이 포함되는 자가면역 간염, 뇌하수체저하증, 이식편-대-숙주 질환 (GvHD), 심근염, 애디슨병, 자가면역 피부 질환, 포도막염, 악성 빈혈, 및 부갑상선기능저하증이 비제한적으로 포함된다.
자가면역 질환에는 하시모토 갑상선염, 제I형 및 제II형 자가면역 다분비선 증후군, 신생물딸림 천포창, 물집성 유사천포창, 헤르페스모양 피부염, 선형 IgA 질환, 후천성 수포성 표피박리증, 결절 홍반, 천포찬양 임신, 흉터성 유사천포창, 혼합형 본태성 한랭글로불린혈증, 소아의 만성 수포성 질환, 용혈성 빈혈, 혈소판감소성 자색반, 굿파스처(Goodpasture) 증후군, 자가면역 중성구감소증, 중증 근육무력증, 이튼-램버트(Eaton-Lambert) 근무력 증후군, 강직 증후군, 급성 파종성 뇌척수염, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경근병증, 전도 차단이 있는 다병소성 운동 신경병증, 모노클로날 감마글로불린병증이 있는 만성 신경병증, 안구간대경련-근간대경련 증후군, 소뇌 변성, 뇌척수염, 망막병증, 원발성 담즙성 경변, 경화성 담관염, 글루텐-민감성 장병, 강직성 척추염, 반응성 관절염, 다발근육염/피부근육염, 혼합형 결합 조직 질환, 베쳇(Bechet) 증후군, 건선, 결절성 다발동맥염, 알러지성 혈관염 및 육아종증 (처그-스트라우스(Churg-Strauss) 병), 다발혈관염 중첩 증후군, 과민성 혈관염, 베게너 육아종증, 측두 동맥염, 타카야스(Takayasu) 동맥염, 가와사키병, 중추 신경계의 단리 혈관염, 폐쇄성 혈전혈관염, 사르코이드증, 사구체신염, 및 한랭병증이 비제한적으로 또한 포함될 수 있다. 이러한 용태들은 의학 업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th ed., Fauci A S et al., eds., New York: McGraw-Hill, 1998]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 질환의 발병 전의 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 진행 중인 질환을 억제하기 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 완화하는 것에 관한 것이다. 대상체에서의 질환 완화는 대상체에서의 질환을 치료, 예방 또는 억제하는 것을 포함하도록 의도된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 질환의 재발을 방지하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 원치 않는 면역 응답이 펩티드의 한 영역 (예컨대 항원 결정인자)에서 발생할 수 있다. 원치 않는 면역 응답과 관련된 질환의 재발이 이러한 펩티드의 상이한 영역에서 면역 응답 공격이 있는 것에 의해 발생할 수 있다. MS 및 기타 Th1/17-매개 자가면역 질환이 포함되는 일부 면역 응답 장애에서의 T-세포 응답이 재발-완화성 및/또는 만성-진행성 질환의 과정 동안 동적일 수 있고 발달될 수 있다. T-세포 레퍼토리의 동적 성질은 특정 질환의 치료를 위한 함축성이 있는데, 이는 표적 부위가 질환이 진행됨에 따라 변할 수 있기 대문이다. 이전에는, 응답 패턴의 사전 지식이 질환의 진행을 예측하는데 필요하였다. 본 발명은 동적 변화 질환의 효과인 "에피토프 확산"의 기능을 방지할 수 있는 조성물을 제공한다. 재발에 대한 공지된 모델은 다발성 경화증 (MS)에 대한 모델로서의 단백지질 단백질 (PLP)에 대한 면역 반응이다. 초기 면역 응답은 PLP139 -151에 대한 응답에 의해 발생할 수 있다. 이어지는 질환 개시가 PLP178 -191에 대한 재발 면역 응답에 의해 발생할 수 있다. 본 발명의 조성물은 PLP 모델을 사용하여 질환을 재발을 예방하는 것으로 나타났다.
본 발명의 특정 실시양태는 치료적 개입에 의해 미리 내성화되지 않은 개체에서 면역 내성을 프라이밍(priming)하는 것에 관한 것이다. 일반적으로 이러한 실시양태들은 항원 및 점막 결합 성분의 조합물을 여러번 투여하는 것을 수반한다. 대상체가 치료 과정에서 초기에 내성의 소견을 나타낼 수 있더라도, 전형적으로, 3회 이상의 투여, 빈번하게는 4회 이상의 투여, 때때로 6회 이상의 투여가 오래 지속되는 결과를 달성하기 위해 프라이밍 동안 수행된다. 가장 종종, 각각의 용량이 볼루스 투여로서 제공되지만, 점막 방출이 가능한 지속 제형이 또한 적절하다. 다중 투여가 수행되는 경우, 투여 사이의 시간은 일반적으로 1일 내지 3주, 전형적으로 약 3일 내지 2주이다. 일반적으로, 동일한 항원 및 점막 결합 성분이 동일한 농도로 존재하고, 투여가 동일한 점막 표면에 제공되지만, 치료 과정 동안의 이러한 변수들 중 임의의 것에서의 변동이 달성될 수 있다.
본 발명의 기타 실시양태는 앞서 확립된 면역 내성을 부스팅(boosting)하거나 이의 지속성을 연장시키는 것에 관한 것이다. 일반적으로 이러한 실시양태는 확립된 내성이 쇠퇴하거나 또는 쇠퇴 위험에 있는 시점에서의 1회 투여 또는 단기간의 치료를 수반한다. 부스팅은 프라이밍 또는 이전의 부스트 후 일반적으로 1개월 내지 1년 동안, 전형적으로 2개월 내지 6개월 동안 수행된다. 본 발명은 주2회, 매주, 격주 발생하는 투여 일정 또는 임의의 규칙적인 기타 일정의 내성의 규칙적인 유지를 수반하는 실시양태를 또한 포함한다.
본 발명의 기타 실시양태는 원치 않는 과민증에 관련된 병리학적 용태의 치료에 관한 것이다. 과민증은 제I형, 제II형, 제III형, 및 제IV형 중 임의의 것일 수 있다. 급성 (제I형) 과민증은 하나 이상의 유발 알레르겐 또는 이의 내성발생성 단편을 유도 항원으로 사용함으로써 전형적으로 치료된다. 투여 빈도는 알레르겐 노출 시점과 전형적으로 일치할 것이다. 적절한 동물 모델이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gundel et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146:369, 1992]; [Wada et al., J. Med. Chem. 39, 2055, 1996]; 및 WO 96/35418).
본 발명의 기타 실시양태는 이식에 관한 것이다. 이는 도너 개체로부터의 조직 샘플 또는 이식편을 수용자 개체에게 전달하는 것을 지칭하고, 이러한 조직에의해 제공되는 생리학적 기능을 복구하기 위해 조직을 필요로 하는 인간 수용자에 대해 빈번하게 수행된다. 이식되는 조직에는 전체 기관 예컨대 신장, 간, 심장, 폐; 기관 성분 예컨대 피부 이식편 및 눈의 각막; 및 세포 현탁액 예컨대 골수 세포 및 골수 또는 순환 혈액으로부터 선택 및 확장된 세포의 배양물, 및 전혈 수혈액이 포함된다 (그러나 이에 한정되지 않는다).
임의의 이식의 심각한 잠재적인 합병증은 숙주 수용자와 이식된 조직 사이의 항원 차이로부터 확실해진다. 차이의 성질 및 정도에 따라, 숙주에 의한 이식편의 면역학적 습격 또는 이식편에 의한 숙주의 면역학적 습격의 위험이 있을 수 있거나, 또는 양쪽 모두 발생할 수 있다. 위험 정도는 유사한 표현형의 유사하게 치료된 대상들의 집단에서의 응답 패턴을 추적하고, 잘 확립된 임상 절차에 따라 다양한 가능한 기여 요인들을 상호관련시킴으로서 결정된다. 면역학적 습격은 기존의 면역학적 응답 (예컨대 실행된 항체)의 결과, 또는 이식 시점에 개시되는 것 (예컨대 TH 세포의 생성)일 수 있다. 항체, TH 세포, 또는 TC 세포가 서로 및 다양한 이펙터 분자 및 세포와의 임의의 조합으로 수반될 수 있다.
표준 외과수술 절차에 따라, 그러나 이식물의 수용자에 대한 불리한 면역학적 반응의 위험이 감소되면서 이식이 수행되도록 허용하는 물질 및 절차를 제공하는 것이 본 발명의 목표이다. 이러한 절차는 수용자를 도너의 조직에 대해 내성화시키는 것 또는 이의 반대, 또는 양쪽 모두를 수반한다. 내성화는 본 발명의 조성물 내의 이식된 조직에서 발현되는 표적 항원 또는 방관자 항원을 투여함으로써 수행된다. 표적 항원은, 예를 들어, 동종이형 세포 추출물일 수 있다. 이식편은 다양한 상이한 세포 유형들의 복합적인 구조물일 수 있고, 개체 내로 이식된 세포 유형들 중 임의의 하나 이상이 본 발명의 절차가 이에 대해 적합한 위험성을 지닐 수 있다. 예를 들어, 내피 세포 항원이 신장 이식물을 악화시키고, 패신저(passenger) 림프구가 간 이식물을 악화시킨다.
본 발명의 특정 실시양태는 수용자의 조직 이식편 거부에 이르는 숙주 대 이식편 질환의 위험을 감소시키는 것에 관한 것이다. 치료는 초급성, 급성 또는 만성 거부 응답의 효과를 예방하거나 감소시키기 위해 수행될 수 있다. 이식에 충분히 앞서서 치료가 우선적으로 시작되어, 이식편이 설치되었을 때 내성이 정착되어 있을 것이다; 그러나, 이것이 가능하지 않은 경우, 이식과 동시에 또는 이식 후에 치료가 개시될 수 있다. 개시 시점과 관계 없이, 일반적으로, 이식 후 적어도 처음 1개월 동안 규칙적인 간격으로 치료가 계속될 것이다. 이식편의 충분한 적응이 발생하면 후속 용량이 필요하지 않을 수 있지만, 거부 또는 염증의 임의의 증거가 있으면 후속 용량이 재개될 수 있다. 물론, 본 발명의 내성화 절차가 더욱 더 낮은 위험 수준을 달성하도록 다른 형태의 면역억제와 조합될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태는 이식편 대 숙주 질환의 위험을 감소시키는 것에 관한 것이다. 이러한 일련의 실시양태에서, 살아 있는 도너를 이식이 일어나기 전에 미래의 이식편 수용자의 표적 항원에 대해 내성화시키는 것이 필요하다. 일단 내성이 달성되면, 도너의 세포 또는 조직을 수확하고, 이식을 수행한다.
자가면역 질환의 연구를 위한 동물 모델들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 자가면역 질환과 가장 유사한 것으로 보이는 동물 모델에는 높은 발병률의 특정 질환이 자발적으로 발달되는 동물 계통이 포함된다. 이같은 모델의 예로는 제1형 당뇨병과 유사한 질환이 발달되는 비-비만형 당뇨병 (NOD) 마우스, 및 루푸스-유사 질환 경향이 있는 동물, 예컨대 뉴질랜드 하이브리드, MRL-Faslpr 및 BXSB 마우스가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 자가면역 질환이 유도된 동물 모델에는 다발성 경화증에 대한 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE), 류머티스성 관절염에 대한 모델인 콜라겐-유도 관절염 (CIA), 및 포도막염에 대한 모델인 실험적 자가면역 포도막염 (EAU)이 포함된다. 자가면역 질환에 대한 동물 모델들이 유전자 조작에 의해 또한 생성되었고, 여기에는, 예를 들어, 염증성 장 질환에 대한 IL-2/IL-10 녹아웃(knockout) 마우스, SLE에 대한 Fas 또는 Fas 리간드 녹아웃, 및 류머티스성 관절염에 대한 IL-1 수용체 길항제 녹아웃이 포함된다.
투여 및 면역 응답의 평가
캐리어는 본원에 기술된 바와 같이 다른 약제와 조합하여 투여될 수 있고, 이의 생리학상 허용되는 캐리어와 조합될 수 있다 (그리고, 따라서 본 발명은 이러한 조성물들을 포함한다). 캐리어는 본원에 기술된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 이를 필요로 하는 개체, 특히 원치 않는 면역 응답이 있는 인간 대상체에게 투여하기 위해 제조될 수 있다. 조성물의 제조 및 이의 사용은 제약 조성물의 제조를 위한 일반적으로 허용되는 절차에 따라 수행된다.
제약 조성물을 제조하기 위한 절차가 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin ed., Mack Publishing Co., Pa.]에 기술되어 있다. 점막 결합 성분 및 항원 (따로따로 또는 함께 제공됨)이 임의적으로 다른 활성 성분, 캐리어 및 부형제, 및 안정화제와 조합된다. 관심 대상인 추가적인 활성 성분은 점막 표면에서 조성물의 내성발생성 효과를 강화하는 작용제이다. 추가적인 활성 성분의 예는 IL-4가 예시되는 사이토카인이다. 요구되지는 않지만, 제약 조성물은 정확한 양의 투여에 적절한 단위 투약 형태로 공급될 수 있다.
면역응답의 조정을 위한 본 발명의 투여의 유효량 및 방법은 개체, 치료될 용태, 및 당업자에게 명백한 기타 인자들을 기초로 변할 수 있다. 고려되는 인자에는 투여 경로 및 투여될 용량의 횟수가 포함된다. 이같은 인자들은 당업계에 공지되어 있고, 과도한 실험 없이 이같은 결정을 내리는 것은 당업자의 기술 내에 속한다. 적절한 투여량 범위는 면역 응답의 원하는 조절 (예를 들어, IFN-α 또는 기타 사이토카인 생산의 억제)을 제공하는 것이다. 전달되는 캐리어의 양으로 제공되는, 캐리어의 유용한 투여량 범위는, 예를 들어, 하기의 것들 중 임의의 것일 수 있다: 0.5 내지 10 mg/kg, 1 내지 9 mg/kg, 2 내지 8 mg/kg, 3 내지 7 mg/kg, 4 내지 6 mg/kg, 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 5 내지 10 mg/kg. 별법적으로, 투여량이 입자의 개수를 기초로 투여될 수 있다. 예를 들어, 전달되는 캐리어의 양으로 제공되는, 캐리어의 유용한 투여량은, 예를 들어, 하기의 것들 중 임의의 것일 수 있다: 용량 당 106, 107, 108, 109, 또는 1010개 초과의 입자, 또는 용량 당 1×107 내지 1×109개의 입자, 또는 용량 당 1×108 내지 1×109개의 입자, 또는 용량 당 2×109 내지 5×109개의 입자. 각각의 환자에게 제공되는 절대량은 약리학적 성질 예컨대 생체이용률, 소거 속도 및 투여 경로에 좌우된다. 제약상 허용되는 캐리어, 희석제 및 부형제 및 제약 조성물 및 제형의 제조 방법의 상세사항이 문헌 [Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18th Edition, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA.]에서 제공되고, 이는 전문이 참고로 본원에 포함된다.
특정 캐리어 제형의 유효량 및 투여 방법은 개별적인 환자, 원하는 결과 및/또는 장애의 유형, 질환 단계 및 당업자에게 명백한 기타 인자들을 기초로 변할 수 있다. 특정 용도에서 유용한 투여 경로(들)이 당업자에게 명백하다. 투여 경로에는 국소, 피부, 경피, 경점막, 표피, 비경구, 위장, 및 코인두 및 폐 (경기관지 및 경폐포 포함)가 포함된다. 적절한 투여량 범위는 혈액 수준에 의해 측정 시 약 1-50 μM 의 조직 농도를 수득하도록 충분한 IRP-함유 조성물을 제공하는 것이다. 각각의 환자에게 제공되는 절대량은 약리학적 성질 예컨대 생체이용률, 소거 속도 및 투여 경로에 좌우된다.
본 발명은 생리학상 허용되는 이식물, 연고, 크림, 린스 및 젤을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 국소 적용에 적절한 캐리어 제형을 제공한다. 예시적인 피부 투여 경로는 최소로 침습성인 것 예컨대 경피 전달, 표피 투여 및 피하 주사이다.
캐리어가 피부를 투과하여 혈류에 진입하도록 할 수 있는 크림, 린스, 젤 등의 적용에 의해 경피 투여가 달성된다. 경피 투여에 적절한 조성물에는 제약상 허용되는 피부에 직접적으로 적용되거나 보호 캐리어 예컨대 경피 장치 (소위 "패치") 내로 혼입된 현탁액, 오일, 크림 및 연고가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적절한 크림, 연고 등의 예를, 예를 들어, 문헌 [Physician's Desk Reference]에서 확인할 수 있다. 이온토포레시스(iontophoresis)에 의해, 예를 들어 수일 이상의 기간 동안 손상되지 않는 피부를 통해 제품을 지속적으로 전달하는 시판되는 패치를 사용하여 경피 전달이 또한 달성될 수 있다. 이러한 방법의 사용은 비교적 높은 농도의 제약 조성물의 제어 전달을 허용하고, 조합 약물의 주입을 허가하며, 흡수 프로모터의 동시 사용을 허용한다.
비경구 투여 경로에는 전기적 (이온토포레시스) 또는 직접적 주사 예컨대 중심정맥로 내로의 직접적인 주사, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내, 또는 피하 주사가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 비경구 투여에 적절한 캐리어의 제형은 일반적으로 USP 물 또는 주사용수 내에 제형되고, pH 완충제, 염 벌크화제, 방부제, 및 기타 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 비경구 주사를 위한 면역조절 폴리뉴클레오티드는 제약상 허용되는 무균성 등장액 예컨대 주사용 염수 및 포스페이트 완충 염수 내에 제형될 수 있다.
위장 투여 경로에는 섭취 및 직장 경로가 포함되지만 이에 한정되지 않고, 예를 들어, 제약상 허용되는 섭취용 분말, 알약 또는 액체, 및 직장 투여용 좌약의 사용을 포함할 수 있다.
비강-인두 및 폐 투여는 흡입에 의해 달성되는 것을 포함하고, 비강내, 경기관지 및 경폐포 경로와 같은 전달 경로를 포함한다. 본 발명은 에어로졸을 형성하기 위한 액체 현탁액뿐만 아니라 건조 분말 흡입 전달 시스템을 위한 분말 형태를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 흡입에 의한 투여에 적절한 캐리어의 제형을 포함한다. 캐리어 제형의 흡입에 의한 투여에 적절한 장치에는 분무기, 기화기, 연무기 및 건조 분말 흡입 전달 장치가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
당업계에 주지된 바와 같이, 본원에 기술된 투여 경로에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 무균성 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH가 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알 내에 넣어질 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 주사 용도에 적절한 제약 조성물은 무균성 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적절한 캐리어에는 생리식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor) EL™ (BASF, 뉴저지주 파시패니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 무균성이어야 하고, 용이하게 주사될 수 있는 정도로 유체일 수 있다. 이는 제작 및 보관 조건 하에 안정적일 수 있고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 캐리어는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용의 방지가 달성될 수 있다. 일부 실시양태는 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 내에 포함한다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사 조성물의 장기 흡수가 초래될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 무균성 주사 용액은 요구되는 양의 활성 화합물(들)을, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께, 적합한 용매 내에 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 동결 건조이다.
본 발명의 특정 실시양태는 환자 또는 의료 종사자에 의한 제약 조성물의 조립을 위한, 임의적으로 문서화된 설명서와 함께, 하나 이상의 성분이 분리된 용기 내에서 제공되는 키트 및 시약에 관한 것이다.
실시예
본 발명의 바람직한 실시양태들이 본원에서 제시 및 기술되었지만, 이같은 실시양태들은 예로서만 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변경, 변화 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태들에 대한 다양한 별법이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기의 청구항들이 본 발명의 범주를 정의하고, 이러한 청구항의 범주 내의 방법 및 구조물 및 이들의 등가물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
실시예 1. 폴리스티렌 스피어에 접합된 PLP 펩티드를 사용한 EAE 재발에 대한 내성의 유도.
폴리스티렌 마이크로스피어를 뇌염발생 에피토프 또는 대조군 펩티드와 커플링시켜, 인공 캐리어를 사용하여 활성 EAE가 유도될 수 있는지 여부를 결정하였다.
유도된 EAE의 억제의 결정 방법은 기존에 기술된 바와 같은 절차를 따랐다 (문헌 [Smith and Miller (2006) J. Autoimmun. 27:218-31]; [Turley and Miller (2007) J Immunol. 178:2212-20]). 간략하게, 6-7주령의 SJL 마우스를 하란 래버러토리즈(Harlan Laboratories) (메릴랜드주, 베데스다)로부터 구입하였다. 모든 마우스를 <Northwestern University Center for Comparative Medicine>에서 특정 병원체가 없는 조건 (SPF) 하에 거주시켰다. 마비된 동물에게는 음식 및 물에 대한 더 쉬운 접근을 제공하였다.
플루오르브라이트(Fluoresbrite) YG 카르복실레이트 마이크로스피어를 폴리사이언시즈 인크(Polysciences, Inc.) (펜실베이아주 워링턴)에서 구입하였다. 합성 펩티드 PLP139 -151 (HSLGKWLGHPDKF) 및 OVA323 -339 (ISQAVHAAHAEINEAGR)를 진메드(Genemed) (캘리포니아주 샌프란시스코)에서 구입하였다. 펩티드들을 입자 상의 특정 개수의 활성 아미노 또는 카르복실 부위에 대해 ECDI를 사용하여 마이크로스피어에 커플링시켰다.
폴리스티렌 마이크로스피어 현탁액을 에틸렌 카르보디이미드 (ECDI)를 사용하여 펩티드와 커플링시켰다. 마이크로스피어를 PBS에서 2× 세정하고, 1 mg/㎖의 각각의 펩티드 및 30.75 mg/㎖ ECDI (칼바이오켐(CalBiochem), 캘리포니아주 라 호야)와 함께 PBS 내에 3.2×106개/㎖로 재현탁시키고, 주기적으로 진탕하면서 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 펩티드-커플링 마이크로스피어를 PBS에서 3× 세정하고, 70 ㎛ 세포 거르개를 통해 여과하고, PBS 내에 250×106개 마이크로스피어/㎖로 재현탁시켰다. 제0일에 PLP139 -151/완전 프로인트 아주반트 (CFA)로 프라이밍하는 것에 대응하는 제-7일에 PLP139 -151 또는 OVA323 -339와 커플링된 지시된 플루오르브라이트 카르복실레이트 YG 0.50 ㎛ 마이크로스피어 109개를 8-10주령 암컷 마우스에게 정맥내 주사하였다. 개별적인 동물들을 1-3일 마다 관찰하였고, 임상 점수를 하기와 같이 0-4의 등급으로 평가하였다: 0 = 이상 없음; 1 = 늘어진 꼬리 또는 뒷다리 약화; 2 = 늘어진 꼬리 및 뒷다리 약화; 3 = 부분적인 뒷다리 마비; 4 = 완전한 뒷다리 마비. 평균 일일 임상 점수로서 데이터가 보고되었다. 추가로 40일 동안 EAE의 임상 징후에 대해 마우스를 관찰하였다.
면역화 후 지시된 날에 마우스를 마취시키고 30 ㎖ PBS를 관류시켰다. 절개에 의해 척수를 제거하였고, 2- 내지 3-㎜ 척수 블럭을 액체 질소 내의 OCT (마일즈 래버러토리즈(Miles Laboratories); 인디애나주 엘하르트)에서 즉각적으로 동결시켰다. 블럭을 플라스틱 백 내에서 -80℃에서 보관하여, 탈수를 방지하였다. 허리 영역 (대략적으로 L2-L3)으로부터의 6 ㎛ 두께의 단면을 레이처트-정 크라이오컷(Reichert-Jung Cryocut) CM1850 냉동조직절편기 (라이카(Leica), 일리노이주 데어필드) 상에서 절단하고, 정전기 전하를 띠는 수퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 슬라이드 (피셔(Fisher), 펜실베니아주 피츠버그) 상에 마운팅하고, 공기 건조시키고, -80℃에서 보관하였다. 슬라이드를 티라미드 시그널 앰플리피케이션 (Tyramide Signal Amplification) (TSA) 디렉트(Direct) 키트 (NEN, 매사추세츠주 보스턴)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 염색하였다. 각각의 군으로부터의 허리 절편을 해동시키고, 공기-건조시키고, 실온에서 2％ 파라포름알데히드에서 고정시키고, 1×PBS에서 재수화시켰다. TSA 키트에서 제공되는 차단 시약에 더하여, 항-CD16/CD32, (FcIII/IIR, 2.4G2; BD 파민젠(PharMingen)), 및 아비딘/비오틴 차단 키트 (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories))를 사용하여 비-특이적 염색을 차단하였다. 조직을 비오틴-접합 Ab인 항-마우스 CD4 (H129.19) (BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 캘리포니아주 산호세) 및 항-마우스 F4/80 (BM8) (칼태그(Caltag), 캘리포니아주 벌링게임)으로 염색하였다. DAPI (벡터 래버러토리즈, 캘리포니아주 벌링게임)를 포함하는 벡타실드(Vectashield) 마운팅 매질과 함께 절편을 커버슬립으로 덮었다. SPOT RT 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠(Diagnostic Instruments), 미시간주 스터링 헤이츠) 및 메타모프(Metamorph) 영상화 소프트웨어 (유니버설 이미징(Universal Imaging), 펜실베니아주 다우닝타운)를 사용하여 에피형광을 통해 슬라이드를 시험하고 영상을 취득하였다. 군 당 각각의 샘플로부터의 8개의 비연속적 허리 절편을 100× 및 200× 배율로 분석하였다.
결과가 도 1에서 제시된다. 아미노 결합을 통해 PLP139-151과 커플링된 플루오르브라이트 카르복실레이트 YG 0.50 ㎛ 폴리스티렌 마이크로스피어 (폴리사이언시즈, 펜실베이아주 워링턴)가 PLP139-151/CFA-유도 EAE의 유도로부터 유의한 보호를 제공하는데 있어서 효과적이었을 뿐만 아니라, 더욱 중요하게는 SJL 마우스에서 활성 EAE의 재발의 개시를 완전히 폐기하였지만, OVA323-339와는 그렇지 않았다. 이는 불활성 캐리어 상에 아폽토시스성 신호를 포함하는 것이 캐리어 비드의 조성에 따라 필요하지 않을 수 있음을 지시할 수 있다.
실시예 2. PLG 마이크로스피어의 제형
본 실시예는 항원-특이적 펩티드를 캡슐화 및 전달하는데 적절한 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로스피어의 제형을 기술한다. 이중 에멀션 기술을 사용하여 마이크로스피어를 제조하였다 (문헌 [J. H. Eldridge et al. Mol Immunol, 28:287-294, 1991]; [S. Cohen et al. Pharm Res, 8:713-720, 1991]). RG502H가 중합체로서 사용되었고, 폴리비닐 알콜이 안정화제로서 사용되었다. 유기 상 (디클로로메탄) 내의 PLG 농도 (30-200 mg/㎖)가 증가되면 캡슐화 효율이 증가하는 것으로 발견되었고, 이는 중앙값 마이크로스피어 직경 (약 1 내지 약 10 ㎛)의 증가와 또한 상호관련되었다.
실시예 3. 미엘린 염기성 단백질을 함유하는 리포솜형 조성물의 제조
최적의 미엘린 염기성 단백질 (MBP)/리포솜 비율이 기존에 기술된 방법 (17)에 의해 실험적으로 결정되었다. MBP/지질 조합물을 제조하기 위해, 먼저 성분들을 실온이 되게 하였다. 120 mg/㎖ 농도의 지질 [1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DLPC); 아반티 폴라-리피즈 인크(Avanti Polar-Lipids, Inc.), 앨라배마주 엘라베스터]를 3차-부탄올 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 텍사스주 휴스턴)에 용해시킨 후, 초음파처리하여 투명한 용액을 수득하였다. 40 mg/㎖의 MBP를 또한 3차-부탄올에 용해시키고, 모든 고체가 용해될 때까지 와동시켰다. 그 후, 2개의 용액을 동일한 양 (v:v)으로 조합하여 MBP/리포솜의 원하는 비율을 달성하고, 와동에 의해 혼합하고, -80℃에서 1-2시간 동안 동결시키고, 하룻밤 동안 건조 분말로 동결건조시킨 후, 필요할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 각각의 처리 바이알은 75 mg MBP를 함유하였다.
실시예 4. 폴리(Glu-Lys) 중합체의 합성
연결 캐리어로서 사용하기에 적절한 폴리펩티드 중합체는 폴리(글루탐산-라이신) (폴리(글루타밀-라이신) 또는 폴리(EK))이다. N-α-Fmoc 글루탐산 y-벤질 에스테르 (Fmoc-Glu(OBzl)-OH)를 N-E-CBZ 라이신 t-부틸 에스테르 (H-Lys(Z)-tBu) (양쪽 시약 모두 칼바이오켐-노바바이오켐(Calbiochem-Novabiochem) (캘리포니아주 샌디에고)로부터 시판됨)에 디이소프로필카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸을 사용하여 커플링시켰다. 생성된 디펩티드인 Fmoc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-tBu를 H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OH가 산출되도록 피페리딘에 이어서 95％ 트리플루오로아세트산을 사용하여 탈보호시킬 수 있었다. 그 후, 카르보디이미드 또는 기타 축합에 의해 다양한 사슬 길이의 혼합물이 형성되도록 디펩티드 유닛을 자유롭게 중합시킬 수 있었다. 별법적으로, 규정된 길이를 원한다면, H-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OtBu를 제공하기 위한 피페리딘으로의 아미노 말단의 탈보호 및 Fmoc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OH를 제공하기 위한 95％ 트리플루오로아세트산으로의 카르복실 말단의 탈보호가 2개의 디펩티드와 카르보디이미드의 축합을 가능하게 하여 Fmoc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys-(Z)-OtBu를 제공하였다. 이러한 사이클의 반복이 규정된 길이의 폴리(Glu(OBzl)-Lys(Z))를 제공할 수 있었다. 무작위 중합체 또는 규정된 길이의 중합체를 위해, 글루탐산 상의 벤질 보호기 및 라이신 상의 CBZ 보호기가 H2/Pd 또는 강산 예컨대 액체 HF 또는 트리플루오로메탄술폰산을 사용하여 동시에 제거될 수 있었다. 이는 유리 아미노 기 및 유리 카르복실 기 양쪽 모두를 항원-특이적 펩티드 및/또는 아폽토시스성 신호전달 분자를 부착시키는 것에서 사용하는 것에 대해 이용가능하게 만들었다. 펩티드 화학 분야의 표준 기술을 사용함으로써, 카르복실레이트 기의 유도체화 동안 반응을 방지하기 위해 유리 아미노 기가 Boc, Bpoc 또는 Fmoc 기로 재보호될 수 있었다.
실시예 5. 항원-특이적 펩티드-접합 중합 리포솜
항원-특이적 펩티드에 대한 내성의 유도에서 사용하기 위한 항원-특이적 펩티드-접합 중합 리포솜을 형성하도록, 중합된 리포솜에 항원-특이적 펩티드를 접합시켰다.
60％ 펜타코사디인산 충전제 지질, 29.5％ 킬레이터 지질, 10％ 아민 말단 지질 및 0.5％ 비오틴화 지질의 지질 성분들이 지시된 양으로 조합되었고, 용매를 증발시켰다. 아실 사슬이 30 mM인 용액이 산출되도록 물을 첨가하였다. 지질/물 혼합물을 1시간 이상 동안 초음파처리하였다. 초음파처리 동안, 용액의 pH가 NaOH로 7 내지 8로 유지되었고, 온도는 초음파처리에 의해 생성되는 열에 의해 젤-액체 결정 상 전이점보다 높게 유지되었다. 리포솜을 얼음물 베드 상에 있는 페트리접시로 옮기고, 1시간 이상 동안 254 nm의 빛을 조사하여 중합시켰다. 중합된 리포솜을 0.2 ㎛ 필터를 통과시킨 후 수집하였다. 항원-특이적 펩티드-접합 중합 리포솜을 형성시키기 위해, 2.3 ㎍ 아비딘을 약 1:3 몰비의 포스페이트 완충 염수 내의 14.9 ㎍ 비오틴화 항체와 조합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 용액을 150 ㎕의 상기 형성된 중합된 리포솜과 조합하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여, 항원-특이적 펩티드-접합 중합 리포솜을 형성시켰다.
실시예 6. 나노입자의 생산 방법
나노입자를 역-유화 중합에 의해 합성하였다. PEG 블록 공중합체 유화제, 플루로닉(PLURONIC) F-127 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 스위스 부흐스) 및 단량체 프로필렌 술피드를 일정한 교반 하에 초순수 밀리큐(milliQ) 물에 첨가함으로써 에멀션이 생성되었다. 보호된 개시제 펜타에리트리톨 테트라티오에스테르를 이를 10분 동안 교반 하에 0.20 ㎖의 0.5 M 메틸산나트륨 용액과 혼합함으로써 탈보호시켰다. 탈보호 후, 개시제를 단량체 에멀션에 첨가하고, 5분 후에 60 ㎕의 염기 디아자[5.4.0]비시클로운데크-7-엔 (DBU)을 반응에 첨가하고, 불활성 대기 하에 24시간 동안 계속 교반되도록 하였다. 그 후, 디술피드 가교를 일으키기 위해 나노입자를 공기에 노출시켰다.
초순수 밀리큐 물에 대한 12-14 kDa MWCO 막 (스펙트럼 래버러토리즈(Spectrum Laboratories), 캘리포니아주 랜초 도밍게즈)으로의 2일의 반복된 투석에 의해 나노입자를 잔존하는 단량체, 염기 또는 유리 플루로닉으로부터 정제하였다. 동적 빛 산란 기구 (말번(Malvern), 영국 우스터셔)를 사용함으로써 나노입자 크기 분포를 결정하였다.
실시예 7. 나노입자에 대한 미엘린 염기성 단백질 접합
플루로닉(Pluronic) (PEG 및 PPG의 블록 공중합체) 표면을 단백질 또는 펩티드로 관능화시킴으로써 나노입자에 대한 항원 접합을 달성할 수 있다. 접합 계획이 화학적 접합을 위해 유리 시스테인 잔기를 사용하여 단백질 항원 미엘린 염기성 단백질 (MBP)에 대해 본 실시예에서 제시된다. 기타 관능기, 예컨대 N-말단에 또는 라이신 잔기 상에 있는 아민이 관련된 계획에서 사용될 수 있었다. 또한 항원이 나노입자 표면에 흡착될 수 있었다.
MBP를 나노입자에 접합시키기 위해, 플루로닉 디비닐술폰을 합성하고, 여기에 마이클 부가 반응으로 MBP 상의 유리 티올 기를 통해 MBP를 커플링시켰다. 양쪽 단계에 대한 합성 상세사항이 하기에서 제공된다.
플루로닉 F127 (시그마(Sigma)), 디비닐술폰 (플루카(Fluka)), 수소화나트륨 (알드리치), 톨루엔 (VWR), 아세트산 (Fluka), 디에틸에테르 (피셔), 디클로로메탄 (피셔) 및 셀라이트(Celite) (마쉐리 나겔(Macherey Nagel))가 제공된 대로 사용되었다. 아르곤 (메세르(Messer)) 하에 반응이 수행되었다. 1H NMR을 중수소화 클로로포름 (아르마르(Armar))에서 측정하였고, 화학적 이동은 0.0 ppm에서의 내부 표준 테트라메틸실란 (아르마르) 신호에 대해 ppm으로 제공되었다.
톨루엔 내의 플루로닉 F-127의 용액을 딘-스타크(Dean-Stark) 트랩을 사용하여 공비 증류에 건조시켰다. 얼음 조에서 용액을 냉각하고, 수소화나트륨을 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반하고, 디비닐 술폰 (시그마-알드리치)을 신속하게 첨가하였다. 실온에서 5일 동안 암실에서 교반한 후, 아세트산을 첨가함으로써 반응을 켄칭(quenching)시켰다. 셀라이트 상에서 여과하고 여과액을 소형 부피로 감압 하에 농축한 후, 생성물을 1 ℓ의 빙냉 디에틸에테르 내에 침전시켰다. 고체를 여과하고, 최소량의 디클로로메탄에 용해시키고, 빙냉 디에틸에테르에 침전시켰다 (총 4회). 중합체를 진공 하에 건조시키고, 아르곤 하에 -20℃에서 보관하였다.
실시예 8. 유동 세포측정법 & 분석 및 시험관내 나노입자 내재화: DCS가 포함되는 APC에 의한 흡수
나노입자를 내재화하는 림프절 내의 APC 및 DC의 분율을 정량하기 위해 유동 세포측정법 분석을 수행하였다. 염색 후, 림프절 세포 현탁액을 유동 세포측정법 (사이안(CyAn) ADP, 다코(Dako), 덴마크 글로스트럽)에 의해 분석하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리스타(TreeStar), 오리건주 애쉬랜드)를 사용하여 추가적인 분석을 수행하였다. 형광 나노입자가 내재화된 APC 및 DC는 각각 MHCII+FITC+ 및 CD11c+FITC+인 것으로 결정되었고, 이때 FITC는 나노입자의 표지를 나타낸다. CD86 및 CD80을 발현한 세포의 분율을 계산함으로써 나노입자 내재화 후의 DC 성숙을 계산하였다.
실시예 9. 양자 점 나노입자의 변형
덴드리머-캡슐화 양자 점을 포함하는 양자 점 나노입자의 아민 표면을 연결제 예컨대 Sulfo-SMCC (술포숙신이미딜 4-N-말레이미도메틸 시클로헥산-1-카르복실레이트)로 변형시켜 말레이미드-활성화 양자 점을 형성시켰다. 임의의 과량의 시약을 반응 혼합물의 성분들을 분리하기 위해 통상적으로 사용되는 기술인 크기-배제크로마토그래피로 제거하였다. 양자 점을 덴드리머로 캡슐화하는 방법이, 예를 들어, 문헌 [Lemon et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122:12886]에 기술되어 있고, 이의 내용은 참고로 본원에 포함된다.
양자 점 나노입자-AChE 접합체의 형성
말레이미드-활성화 QD를 다중 QD가 다중 단백질에 부착하는 것을 방지하기 위해 제한된 시간 동안 술프히드릴-변형 AChE와 반응시켰다. 다중 가교는 대형 분자의 입체 장애 및 엔트로피로 인해 선호되지 않는다. 크기-배제크로마토그래피를 사용하여 분리에 의해 반응을 정지시켰다.
실시예 10. 덴드리머의 생산 방법
PAMAM 덴드리머는 4개의 방사상 가지돌기 팔이 있는 에틸렌디아민 (EDA) 개시제 코어로 구성되고, 각각의 연속적인 생성을 일으키기 위한 메틸 아크릴레이트 (MA)의 철저한 마이클 부가 및 생성된 에스테르와 많은 과량의 EDA의 축합 (아미드화)으로 구성되는 반복적 반응 순서를 사용하여 합성되었다. 따라서, 이론적으로 각각의 연속적인 반응은 관능화를 위해 활성화될 수 있는 표면 아미노 기의 개수를 배가시켰다. 합성된 덴드리머를 분석하였고, 분자량이 GPC에 의해 26,380 g/몰인 것으로 확인되었으며, 1차 아미노 기의 평균 개수는 전위차 적정에 의해 110인 것으로 결정되었다.
실시예 11. 덴드리머 관능기의 특성화
덴드리머의 아세틸화
아세틸화는 덴드리머의 합성에서 최초의 필수 단계이다. 생물학적 시스템 내에서의 추가적인 반응 또는 분자간 반응으로부터 일부 덴드리머 표면을 중화시켜서, 비-특이적 상호작용이 합성 동안 발생하는 것을 방지하기 위해, 부분적인 아세틸화가 사용되었다. 일부 표면 아민을 아세틸화되지 않게 하는 것은 관능기의 부착을 허용하였다. 나머지 아미노 기의 아세틸화는 수용성 증가를 초래하여 (FITC 접합 후), 다수의 통상적인 매질과 비교하여, 표적화 특이성 증가와 함께 수성 매질 내에서 덴드리머가 더욱 자유롭게 분산되도록 하였다 (문헌 [Quintana et al., Pharm. Res. 19, 1310 (2002)]).
실시예 12. 아세틸화 덴드리머에 대한 관능기의 접합
아세틸화 덴드리머에 대한 플루오레세인 이소티오시아네이트의 접합. 부분적으로 아세틸화된 PAMAM 덴드리머가 덴드리머의 용해도를 증가시키기 위한 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)의 접합에 사용되었다. 부분적으로 아세틸화된 덴드리머를 플루오레세인 이소티오시아네이트와 반응시켰고, 집중 투석, 동결건조 및 반복된 막 여과 후, 덴드리머-FITC 생성물이 산출되었다.
아세틸화 덴드리머에 대한 엽산의 접합.
부분적으로 아세틸화된 단일-관능성 수지상 장치에 대한 엽산의 접합을 엽산의 γ-카르복실 기와 덴드리머의 1차 아미노 기 사이의 축합을 통해 수행하였다. 이러한 반응 혼합물을 덴드리머-FITC를 함유하는 탈이온수의 용액에 적가하고, 2일 동안 격렬하게 교반하여 (질소 대기 하에), 엽산이 덴드리머-FITC에 완전히 접합되도록 하였다.
실시예 13. T 세포 표현형 분석에 의한 내성 평가
본 발명의 나노입자-MBP(83-99) 복합체를 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 용해시키고, 500 ㎍의 나노입자-MBP 복합체를 함유하는 0.1-0.2 ㎖로 암컷 루이스(Lewis) 래트 내로 복강내 주사하였다. 대조군 래트에게는 0.1-0.2 ㎖의 PBS를 제공하였다. 주사하고 나서 9일 내지 10일 후, 지라 및 림프절 (서혜 및 허리)을 래트로부터 수확하고, 40 ㎛ 나일론 세포 거르개를 통해 조직을 침연시킴으로써 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 샘플을 관련된 모노클로날 항체의 적합한 희석물이 있는 PBS (1％ FCS)에서 염색하였다. 요오드화 프로피듐 염색 세포를 분석에서 배제하였다. 샘플을 LSR2 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시즈, 미국) 상에 놓고, FACS 디바(Diva) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 활성화 마커 CD25, CD44, CD62L, CTLA-4, CD45Rb, 및 CD69의 발현을 나노입자-MBP 복합체가 주사된 래트로부터의 지라세포 및 림프절 세포 상에서 분석하였다. 복합체가 주사된 래트로부터의 CD4+ T 세포가 CD25하이/CD45RBint 표현형을 나타냈고, 이는 무반응화 CD4+ T 세포의 특징이었다. CD25하이 및 FoxP3+인 CD4+ 세포의 백분율이 또한 더 높았고, 이는 조절 T 세포의 유도를 시사하였다.
아폽토시스를 평가하기 위해, CD8+ T 세포를 CD8α 단리 키트 (밀텐이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 지라세포로부터 단리하고, 아넥신 V 및 PI (양쪽 모두 BD 바이오사이언시즈)로 제조사의 프로토콜에 따라 염색한 후, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 그랜자임(Granzyme) B 및 Bcl-2의 세포내 염색을 위해, BD 사이토픽스/사이토펌(cytofix/cytoperm) 키트 (BD 바이오사이언시즈)로 T 세포를 투과성이게 만들고, 래트-항-마우스 그랜자임 B PE mAb (이바이오바이언스(eBioscience)) 또는 햄스터-항-마우스 Bcl-2 FITC mAb (BD 바이오사이언시즈)로 염색하였다. 적합한 이소타입 mAb를 사용하여 특이성 대조군을 수행하였다. 당업계에 주지된 유동 세포측정법에 의해 샘플을 분석하였다.
실시예 14. T 세포 증식에 의한 내성 평가
본 발명의 나노입자-MBP(83-99) 복합체를 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 용해시키고, 500 ㎍의 나노입자-MBP 복합체를 함유하는 0.1-0.2 ㎖로 Balb/c 마우스 내로 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 0.1-0.2 ㎖의 PBS를 제공하였다. 주사하고 나서 9일 내지 10일 후, 지라 및 림프절 (서혜 및 허리)을 마우스로부터 수확하고, 40 ㎛ 나일론 세포 거르개를 통해 조직을 침연시킴으로써 단일 세포 현탁액을 수득하였다. CD4+ T 세포를 CD4+ T 세포 단리 키트 (밀텐이 바이오텍, 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 지라세포로부터 단리하였다. 정제된 CD4+ T 세포를 1) T 세포-고갈, 방사선조사 (2000 R) CBA/J 자극물 (5×105개)과 함께 72시간 동안, 2) 동계 지라세포 (5×105개) + 가용성 항-CD3 (145-2C11)와 함께 48시간 동안, 또는 3) 100 ng/㎖ 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (시그마) 및 200 nM 칼슘 이온운반체 (ionomycin, Sigma)와 함께 총 36시간 동안 삼중으로 플레이팅하였고 (5×104개/웰), 이때 마지막 8-12시간 동안의 펄스는 1 μCi/웰 [3H]TdR이었다. DNA 복제 및 세포 증식의 지표로서의 [3H]TdR 혼입을 β-카운터 (벡트만 쿨터, 인크(Beckman Coulter, Inc.), 캘리포니아주 풀러턴) 상에서 섬광액의 존재 하에 측정하였다. 항-CD3-자극 T 세포로부터의 상등액을 48시에 수집하고, 항-IL-4 항체 (11B11)의 존재 하에 IL-2-의존적 세포주 CTLL-2의 증식을 측정함으로써 IL-2의 생산을 결정하였으며, 이때 1 유닛은 반-최대 [3H]TdR 혼입을 지지하는데 요구되는 IL-2의 양이었다.
형광 세포질 염료인 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 세포 분열을 직접적으로 가시화함으로써 T 세포 증식을 또한 측정할 수 있었다. 세포의 CSFE 표지를 위해, 나노입자-MBP 복합체가 주사된 마우스로부터의 지라세포를 1 ㎖의 PBS 내에서 3분 동안 37℃에서 3 μM CFSE (모레큘러 프로브즈, 영국)와 함께 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트의 각각의 웰에서, 2×105개의 CFSE-표지 지라세포를 MBP(83-99) 펩티드 (10 μM) 또는 관련이 없는 대조군 펩티드인 pSV9 (10 μM)로 코팅된 1×105개의 방사선조사 (80 Gy), 온도-유도 RMA-S로 자극하였다. 적합한 배양물에 10 U/㎖ IL-2, 10 ng/㎖ IL-7, 50 ng/㎖ IL-15 또는 50 ng/㎖ IL-21을 보충하였다. 적합한 시점에 세포를 수확하고, CD4로 염색하고, 유동 세포측정법에 의한 CFSE 프로파일링에 적용하였다.
실시예 15. T 세포 사이토카인 프로파일 및 세포독성에 의한 내성 평가
IFN -γ 분석법
본 발명의 나노입자-MBP(83-99) 복합체를 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 용해시키고, 500 ㎍의 나노입자-MBP 복합체를 함유하는 0.1-0.2 ㎖로 Balb/c 마우스 내로 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 0.1-0.2 ㎖의 PBS를 제공하였다. 주사하고 나서 9일 내지 10일 후, 지라 및 림프절 (서혜 및 허리)을 마우스로부터 수확하고, 40 ㎛ 나일론 세포 거르개를 통해 조직을 침연시킴으로써 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 항원 특이적 IFN-γ 생산을 측정하기 위해, CD4+ T 세포를 CD4+ T 세포 단리 키트 (밀텐이 바이오텍, 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 지라세포로부터 단리하였다. 정제된 CD4+ T 세포를 자극하고, 배양 상등액을 수확하고, IFN-γ를 IFN-γ ELISA에서 측정하였다. 96웰 둥근 바닥 플레이트 상에 각각의 상이한 실험 조건에 대해 삼중 배양물을 플레이팅하였다. 각각의 웰에서, 나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터의 1×104개의 지라세포를 MBP(83-99) 펩티드 (10 μM) 또는 관련이 없는 대조군 펩티드인 pSV9로 코팅된 1×104개의 방사선조사 (80 Gy), 온도-유도 RMA-S로 자극하였다. 적합한 배양물에 10 U/㎖ IL-2, 10 ng/㎖ IL-7, 50 ng/㎖ IL-15 또는 50 ng/㎖ IL-21을 보충하였다. 72시간 후, 50 ㎕ 배양 상등액을 각각의 웰로부터 수확하고, 항-IFN-γ 항체 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 뮤린(murine) IFN-γ를 측정하였다. 실험 샘플에서의 활성을 평균 흡광 값 (OD) 대 상등액 내의 재조합 IFN-γ의 희석도의 표준 곡선을 사용하여 확인하였다.
IL -2 바이오어세이
항원 특이적 IL-2 생산을 측정하기 위해, 나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 자극하고, 배양 상등액을 수확하고, IL-2를 IL-2 의존적 CTLL 세포를 사용하여 측정하였다. IL-2 분석법의 자극 단계는 IFN-γ 분석법대로 수행되었다. 72시간 후, 50 ㎕ 세포 상등액을 수확하고, CTLL 세포 (5×103개)를 함유하는 웰로 옮기고, 16-18시간 동안 인큐베이션하였다. 1 μCi 3[H]-티미딘을 각각의 웰에 첨가하고 추가로 12시간 동안 인큐베이션함으로써 세포를 3[H]-티미딘으로 펄싱(pulsing)하였다. 실험 샘플에서의 활성을 cpm 대 상등액 내의 재조합 IL-2의 희석도의 표준 곡선을 사용하여 확인하였다. 별법적으로, 상등액으로부터의 뮤린 IL-2를 항-IL-2 항체 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 측정할 수 있었다.
CTL 분석법
나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터의 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 MBP(83-99) 펩티드 또는 MHC 클래스 I-결합 대조군 펩티드로 코팅된 RMA-S 세포 및 MBL-2 종양 세포에 대한 4시간 51크롬-방출 분석법에서 결정하였다. 51크롬-방출 분석법은 당업계에 주지되어 있다.
사이토카인 ELISA
나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터의 정제된 CD4+ T 세포를 상기 기술된 바와 같이 자극하고 배양 상등액을 수확하였다. IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGF-β 및 TNF-α가 포함되는 사이토카인의 수준을 표준 프로토콜 (BD 바이오사이언시즈)을 사용하여 사이토카인 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13의 생산 증가는 전형적으로 Th2 응답과 관련되었다. IL-10 및 TGF-β는 전형적으로 조절 T 세포 응답과 관련되었다.
실시예 16. T 세포 억제 활성에 의한 내성 평가
본 발명의 나노입자-MBP(83-99) 복합체를 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 용해시키고, 500 ㎍의 나노입자-MBP 복합체를 함유하는 0.1-0.2 ㎖로 Balb/c 마우스 내로 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에게는 0.1-0.2 ㎖의 PBS를 제공하였다. 주사하고 나서 9일 내지 10일 후, 지라 및 림프절 (서혜 및 허리)을 마우스로부터 수확하고, 40 ㎛ 나일론 세포 거르개를 통해 조직을 침연시킴으로써 단일 세포 현탁액을 수득하였다. T 세포 억제 활성을 측정하기 위해, CD4+ T 세포를 CD4+ T 세포 단리 키트 (밀텐이 바이오텍, 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 지라세포로부터 단리하였다. CD4+CD25+ 조절 T 세포를 CD25 마이크로비드를 사용하여 단리할 수 있었다.
U-바닥 96웰 플레이트 내의 CD4+CD25- 응답자 T 세포 (Tresp) (3×104개)의 배양물을 2-4일 동안 가용성 0.5-0.75 ㎍/㎖ α-CD3 및 2.5-4 ㎍/㎖ α-CD28의 존재 하에 나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터의 Treg (CD4+CD25+)와 함께 배양하였다. 3×104개의 방사선조사 (3000 Rad) T 세포-결핍 지라세포가 공동 배양물에서 α-CD28 대신 APC로서 첨가될 수 있었다. Tresp 세포를 CFSE로 표지하여, 이를 공동 배양물 내의 Treg 세포로부터 구별하였다. 배양의 마지막 6-16시간 동안의 3H-티미딘의 혼입에 의해 또는 CFSE 희석에 의해 CD4+CD25- 응답자 T 세포의 증식을 측정하였다. 0시 및 1일, 2일 및 3일 후에 세포 사망을 측정하였다. CFSE+ 응답자의 세포 사망 분석은 전방 산란 또는 아넥신 V 및 요오드화 프로피듐 염색을 기초로 수행되어야 하였다. 나노입자-MBP(83-99) 복합체가 주사된 마우스로부터 단리된 Treg는 응답 CD4+CD25- T 세포의 증식을 억제할 수 있었다.
실시예 17. 생체 내에서의 gp39 펩티드로의 내성 유도
펩티드 항원으로의 내성 유도를 모니터링하는데 적절한 인간 연골 (HC) gp-39 (263-275)-특이적 지연형 과민성 (DTH) 분석법이 개발되었다. 불완전 프로인트 아주반트 (IFA) 내의 HC gp-39 (263-275)로의 Balb/c 마우스의 면역화가 HC gp-39 (263-275) 펩티드로의 챌린지 후의 DTH 응답의 유도에 효과적이었다. 이러한 펩티드-기반 DTH 시스템을 사용하여 HC gp-39 (263-275) 펩티드와 접합된 나노입자의 비경구 적용에 의한 DTH 응답의 조정을 검출하였다. HC gp-39 (263-275) 펩티드와 접합된 나노입자의 적용은, 용량-의존적 방식으로, HC gp-39 (263-275)가 유도한 DTH 응답을 하향조정하였고, 이는 HC gp-39 (263-275) 펩티드와 접합된 나노입자가 HC gp-39 (263-275)로 유도된 펩티드-특이적 응답을 효율적으로 내성화시킬 수 있음을 가리켰다.
실시예 18. HLA:DR2 트랜스제닉 마우스에서의 내성 유도
본 발명의 항원-캐리어 복합체는, MHC 분자에 의해 제시되었을 때, 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 140-154에 상응하는 MBP의 T-세포 에피토프 내로부터 선택된 펩티드를 사용하여 다발성 경화증의 인간화된 마우스 모델에서 면역학적 내성을 유도할 수 있다. 이러한 마우스 모델은 인간 MHC 분자 HLA:DR2 (DRB1*1501)에 대해 트랜스제닉이다 (문헌 [Madsen et al. (1999) Nature Genetics 23:343-347]).
항원-캐리어 복합체의 투여 후 마우스에서 무반응 또는 CD4+ T-세포 집단에서의 변화가 유도되는 것을 생체 내에서 항원으로 챌린지되었을 때의 T-세포 증식 감소에 의해 모니터링할 수 있다.
방법
항원
MBP 펩티드 140-154를 아비메드(Abimed) AMS 422 다중 펩티드 합성기 (아비메드, 독일 랑겐펠트) 상에서 L-아미노산 및 표준 F-moc 화학을 사용하여 합성하였다. MBP 펩티드 140-154의 서열은 GFKGVDAQGTLSKIF였다. MBP 펩티드 140-154를 본원에 기술된 바와 같은 나노입자에 접합시켰다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 정제된 단백질 유도체 (PPD) (베터러너리 래버러토리즈(Veterinary Laboratories), 서리주 애들스톤)가 림프구 증식 분석법에서 50 ㎍/㎖의 농도로 사용되었다.
마우스 및 내성 유도
HLA:DR2 트랜스제닉을 분리기에서 사육하고, 특정 병원체가 없는 설비에 거주시켰다. 각각의 처리군 내에서, 마우스들이 연령 (8-12주) 및 성별 양쪽 모두가 매칭되었다. 제0일의 면역화 전에 제-8일, 제-6일 및 제-4일에 마우스들을 25 ㎕의 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내의 100 ㎍의 MBP 펩티드 140-154 또는 25 ㎕ PBS 단독으로 비강내 (i.n) 예비-처치하였다.
동일한 부피의 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 및 200 ㎍ MBP140-154 및 400 ㎍ 열-사멸 마이코박테리움 투베르쿨로시스 균주 H37RA (디프코(Difco), 미시간주 디트로이트)를 함유하는 PBS로 구성된 에멀션 100 ㎕로 꼬리 및 뒷다리의 기부에서 마우스를 피하 면역화시켰다. 미리 PBS가 비강내 처치된 대조군 마우스는 펩티드 없이 면역화시켰다.
비강내 예비-처치에 이은 면역화로 3가지 마우스 군이 발생되었다: A군은 PBS로 내성화되었고, MBP 140-154로 면역화되었다 (마우스 7마리); B군은 MBP 140-154-나노입자로 내성화된 후, 동일한 펩티드 MBP 140-154로 면역화되었다 (마우스 7마리); C군은 PBS로 내성화 및 면역화되었다.
림프절 증식 분석법
10일 후, 오금 및 서혜 배출 림프절을 무균적으로 제거하였다. 림프절을 분해하고, 세정하고, 5×10-5 M 2-메르캅토에탄올 및 4 mM L-글루타민이 보충된 엑스-비보(X-Vivo) 15 배지 (바이오휘태커(BioWhittaker), 영국 메이든헤드)에 재현탁시켰다. 세포를 5×105개의 세포/웰로 3중으로 플레이팅하고, 다양한 농도의 MBP 펩티드 140-154 (1-150 ug/㎖)의 존재 하에 또는 이러한 펩티드 없이 72시간 동안 배양하였다. 마우스의 성공적인 면역화를 점검하기 위해, 림프절 세포를 상기 기술된 바와 같이 PPD (50 ㎍/㎖)와 함께 플레이팅하였다. 최종 16시간 동안 배양물을 0.5 uCi [3H]-티미딘으로 펄싱하였다. 세포를 수확하고, T-세포 증식이 자극 지수 (SI)로서 표현되었다: 항원 함유 배양물의 수정된 분당 카운트 (ccpm)/항원이 없는 배양물의 ccpm.
결과
PBS로 비강 내 예비-처치된 후 MBP 펩티드 140-154로 면역화된 마우스 (A군)는 MBP140-154가 다시 챌린지되었을 때 용량 의존적 방식으로 항원성 자극에 응답하였다. 펩티드의 농도가 증가되면, 림프구 증식의 척도인 SI가 2.5의 중앙값에서 10으로 증가하였다. 이러한 군 내의 모든 마우스는 비강내 투여된 PBS가 MBP 140-154에 대한 내성을 유도할 수 없음을 나타냈다. 반면에, MBP 140-154-나노입자로의 비강내 예비-처치는 이러한 펩티드로 자극된 림프구의 증식성 응답에 대해 충분한 효과가 있었다. B군 마우스로부터의 림프구는, 심지어 150 ㎍/㎖의 높은 펩티드 농도에서도, 어떠한 유의한 정도로도 응답할 수 없었다 (SI 중앙값 3). A군와 비교하여 B군에서의 현저한 증식 감소가 명백하였다. 데이터는 본 발명의 MBP 140-154-나노입자가 HLA-DR2 마우스로부터의 림프구에서 내성을 유도한다는 것을 나타낸다.
PBS로 예비-처치 및 면역화된 마우스 (C군)로부터 추출된 림프구는 MBP 140-154에 대해 어떠한 응답도 나타내지 못했지만, PPD에 대한 우수한 응답을 도출하였고 따라서 PPD 항원에 대해 면역화되었다. C군에서의 MBP 펩티드에 대한 이러한 응답 결여는 A군에서 나타난 증식성 응답이 실제로 MBP 140-154로의 면역화에 대한 응답이라는 것과 대조군 A군 및 C군에서의 MBP 140-154 및 PPD 양쪽에 대한 응답이 항원 특이적이라는 것을 확증하였다. MBP 140-154에 대한 증식이 항원 특이적이기 때문에, 이러한 분자에 대한 내성 유도 또한 특이적이었다.
결론
프로세싱을 필요로 하지 않고 HLA:DR2 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 본 발명의 MBP 펩티드-나노입자, 예를 들어, MBP 140-154가 비강내 투여되었을 때 내성을 유도할 수 있었다.
실시예 19. 항원-캐리어 복합체로의 EAE의 치료
면역화 및 EAE 유도
MBP 펩티드 및 펩티드 유사체를 포스페이트-완충 염수 (PBS)에 용해시키고, 오일 내의 4 mg/㎖ 가열 살균 마이코박테리움 투베르클로시스 H37Ra (디프코 래버러토리즈, 인크(Difco Laboratories, Inc.), 미시간주 디트로이트)가 보충된 동일한 부피의 불완전 프로인트 아주반트로 유화시켰다. 암컷 루이스 래트를 에멀션 내에 500 ㎍의 펩티드를 함유하는 0.1-0.2 ㎖로 꼬리 기부에서 피하 면역화시키고, 임상 징후에 대해 매일 모니터링하였다. EAE를 하기와 같이 0-4의 척도로 채점하였다: 0, 임상적으로 정상임; 1, 늘어진 꼬리; 2, 뒷다리 약화; 3, 뒷다리 마비; 4, 앞다리 및 뒷다리 침범.
이러한 시스템에서, 실험적 알러지성 뇌척수염 (EAE)이 꼬리 기부에서의 완전 프로인트 아주반트 (CFA) 내의 MBP(83-99) 펩티드의 주사에 의해 12마리의 암컷 루이스 래트에서 유도되었다. 9일 후, 래트들을 동물 6마리의 군 2개로 나누고, 13.2 ㎎/㎏의 MBP 펩티드-덴드리머 또는 대조군 펩티드인 향유 고래 마이오글로빈 (SWM) (110-121)을 피하 주사하였다. 동물을 질환 증상에 대해 매일 모니터링하고, 맹검 방식으로 0-4의 비-선형 상승 척도로 채점하였으며, 이때 증가량은 증가되는 마비를 가리켰다. 각각의 개별적인 점수를 군 코호트로 평균하여, 평균 임상 점수를 수득하였다.
MBP 펩티드-덴드리머로 처치된 동물에서의 질환 중증도가 대조군에 비해 약 50％ 감소하였다. MBP 펩티드-덴드리머가 이러한 모델 시스템에서 질환의 중증도 및 기간을 감소시켰다.
이러한 결과들이 MBP 펩티드-덴드리머가 EAE의 발달을 억제한다는 것을 명확하게 실연하였지만, EAE의 뮤린 동물 모델 시스템이 또한 개발되었다. SJL/J (H-25) 마우스에서 백일해 백신의 존재 하에 MBP(83-99) 펩티드로의 면역화에 응답하여 만성 재발 형태의 EAE가 발달되었다. 이러한 질환을 억제하는 MBP 펩티드 (83-99)-덴드리머의 능력을 평가하였다.
동물 10마리의 군에게 20 ㎎/㎏의 대조군 펩티드 또는 펩티드 유사체를 4주 동안 매주 복강내 주사하였다. 그 후, 다음 2-3개월에 걸쳐 질환에 대해 동물을 모니터링하였다. 대조군에서는, SJL/J 마우스에서 EAE의 증상이 제20일 정도에 발달되기 시작하였고, 약 3주 동안 지속되었다. 제70일 정도에 시작하여, 재발이 발생하여 약 1점의 평균 임상 점수에 도달하였다. 그러나, 4주 동안 MBP 펩티드 (83-99)-덴드리머를 매주 주사하면, 제1 단계의 질환의 수준이 감소되었을 뿐만 아니라, 재발의 중증도가 또한 감소되었다.
실시예 20. 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 생산 및 사용
펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 생산
필요하다면, 카르복실 마이크로입자, 폴리링크 커플링 버퍼(PolyLink Coupling Buffer) 및 폴리링크 워시/스토리지 버퍼(PolyLink Wash/Storage Buffer) (폴리사이언시즈, 인크(Polysciences, Inc.), 펜실베니아주 워링턴)를 실온으로 가온하였다. 카르복실 (COOH) 마이크로입자는 수용성 카르보디이미드 (ECDI)로 카르복실 기를 활성화시킴으로써 단백질의 공유결합 커플링에 사용될 수 있었다. 카르보디이미드가 카르복실 기와 반응하여, 관심 단백질의 1차 아민에 대해 반응성인 활성 에스테르가 생성되었다. 12.5 ㎎의 마이크로입자를 1.5 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브 내로 피펫팅하였다. 약 10000×G에서의 5-10분의 원심분리를 통해 마이크로입자를 펠렛화시켰다. 마이크로입자 펠렛을 0.4 ㎖의 폴리링크 커플링 버퍼에 재현탁시켰다. 약 10000×G에서의 5-10분의 원심분리를 통해 다시 펠렛화시켰다. 마이크로입자 펠렛을 0.17 ㎖의 폴리링크 커플링 버퍼에 재현탁시켰다. 사용 직전에, 10 ㎎ 폴리링크 ECDI를 50 ㎕ 폴리링크 커플링 버퍼에 용해시킴으로써 200 ㎎/㎖ ECDI 용액을 제조하였다. 20 ㎕의 ECDI 용액을 마이크로입자 현탁액에 첨가하였다. 끝에서 끝으로 부드럽게 혼합하거나, 또는 간단히 와동시켰다. 단백질 등가물 (예를 들어 PLP139 -151, PLP178 -191 또는 OVA323 -339)을 200-500 ㎍으로 첨가하였다. 피펫팅에 의해 부드럽게 혼합하였다. 30-60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 10분 동안 약 10000×G에서 원심분리하였다. 이러한 상등액을 결합된 단백질의 양의 결정을 위해 보관하였다. 마이크로입자 펠렛을 1 ㎖ 무균성 PBS 내에 재현탁시켰다. 다시 10000×G에서 원심분리하였다.
펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 주사
1 ㎖의 무균성 PBS 내에 재현탁시켰다. 현탁액을 40 ㎛ 메시 거르개를 통과시켜, 가교된 입자 덩어리를 제거하였다. 무균성 PBS로 부피를 4 ㎖로 상승시켰다 (500 ㎍의 커플링된 마이크로스피어가 20마리의 동물에게 투약하는데 충분함). 현탁된 입자를 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스 내로 주사하였다.
실시예 21. 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어가 PLP-유도 EAE의 예방 및 치료 양쪽 모두를 위한 특이적 내성을 유도한다
본 실시예는 마우스에서 PLP139 -151 유도 EAE를 유도하기 전 또는 후에 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어를 투여하는 것의 효과를 기술한다.
펩티드-커플링 마이크로스피어의 생산을 실시예 1 또는 실시예 20에 기술된 바와 같이 수행하였다. PLP139 -151 또는 대조군 (OVA323 -339) 펩티드를 0.5 ㎛ 마이크로스피어에 커플링시켰다. 제0일의 PLP139 -151 또는 PLP178 -191 + 완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍에 대응하는 제-7일 ("질환 예방) 또는 제12일 ("질환 치료")에 PLP139-151 또는 대조군 (OVA323 -339) 펩티드가 결합된 마이크로스피어를 마우스에게 정맥내 주사하였다. 실시예 1에서와 같이 동물들을 관찰하고 채점하였다. 결과가 도 2에서 제시된다. 질환 개시 전에 PLP139 -151-코팅 마이크로스피어로 처치된 동물은 허위 비드 (ECDI로 처리되었지만 펩티드로는 처리되지 않은 마이크로스피어)로 처치된 동물과 비교하여 임상 점수 감소를 나타냈다. 결과는 세포 표면 상에 PLP139-151이 있도록 처리된 세포를 사용한 처치에 대해 임상 점수의 유사한 감소를 또한 나타냈다 (도 2A 및 2B 참조). 질환 개시 후 PLP139 -151-코팅 마이크로스피어로 처치된 동물이 처치되지 않았거나 대조군 펩티드가 있는 마이크로스피어로 처치된 동물과 비교하여 임상 점수 감소를 유사하게 나타냈다 (도 2C 참조). 따라서, 이러한 결과들은 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어를 사용한 처치가 질환 개시 전 및 후에 질환 중증도를 감소시키는데 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 22. 프라이밍 및 확산 에피토프에 대한 회상 응답이 내성화된 수용자에서 감소된다
본 실시예는 마우스 모델에서의 지연형 과민증에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 기술한다.
마우스를 준비시키고, PLP139 -151, 대조군 (OVA323 -339) 펩티드, 또는 허위 결합 마이크로스피어로 처치하였다. 기존에 기술된 바와 같이 (문헌 [Smith and Miller (2006) Journal of Autoimmunity 27:218-31]; [Luo et al. (2008) PNAS 105:14527-32]), 제0일의 PLP139 -151 또는 PLP178 -191/완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍에 대응하는 제40일의 지연형 과민성 (DTH)에 의해 CD4 T-세포의 회상 응답을 측정하였다. 24시간 귀 부종 분석법을 사용하여 귀 부종을 측정함으로써 DTH를 측정하였다. 챌린지 전의 귀 두께를 미츠토요(Mitutoyo) 모델 7326 엔지니어 마이크로미터 (슐레신저즈 툴스(Schlesinger's Tools), 뉴욕주 브루클린)를 사용하여 결정하였다. 바로 직후에, 펩티드를 귀의 등쪽 표면 내로 주사함으로써 DTH 응답을 유발하였다. 챌린지전 측정치에 비하여 귀 두께의 증가를 귀 챌린지 24시간 후에 결정하였다. 결과가 도 3에서 제시된다. PLP139 -151 마이크로스피어로 예비-처치된 마우스에서의 평균 순수 부종은 대조군에 필적한 반면, 대조군 (OVA323 -339) 펩티드, 또는 허위 결합 마이크로스피어는 부종 증가를 초래하였다. 이러한 결과들은 마이크로입자가 추후의 염증성 응답으로부터 동물을 보호하는데 사용될 수 있음을 가리킨다.
실시예 23. CNS 침윤에 대한 펩티드-커플링 마이크로스피어의 효과
본 실시예는 CNS 내로의 백혈구의 CNS 침윤에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 기술한다.
마우스를 준비시키고, PLP139 -151, 대조군 (OVA323 -339) 펩티드 결합 마이크로스피어로 처치하거나, 어떠한 마이크로스피어로도 처치하지 않았다. PLP139 -151/완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍에 대응하는 제-7일에 마우스에게 주사를 놓았다. 마우스의 CNS 내로의 백혈구의 침윤을, 기존에 기술된 바와 같이 (문헌 [Smith and Miller (2006) Journal of Autoimmunity 27:218-31]; [Turley and Miller (2007) J Immunol. 178:2212-20]), 면역조직화학에 의해 시험하였다. 간략하게, 면역화 후 지시된 날에 마우스를 마취시키고 30 ㎖ PBS를 관류시켰다. 절개에 의해 척수를 제거하였고, 액체 질소에서 즉각적으로 동결시켰다. 허리 영역으로부터의 6 ㎛ 두께의 단면을 절단하고, 정전기 전하를 띠는 수퍼프로스트 플러스 슬라이드 (피셔, 펜실베니아주 피츠버그) 상에 마운팅하고, 공기 건조시키고, -80℃에서 보관하였다. 결과가 도 4에서 제시된다. 슬라이드를 CNS 내의 세포충실성 (도 4A), CD4+CD3+ 세포 (도 4B) 또는 Foxp3+ 세포 (도4C)에 대해 염색하였다. 결과는 PLP139 -151-처리 마이크로스피어로의 처치가 대조군과 비교하여 CNS 내의 백혈구 감소를 초래하였음을 가리킨다.
실시예 24. 지라절제 동물에 대한 펩티드-커플링 마이크로스피어의 효과
본 실시예는 내성 유도에서의 지라 활성의 필요성을 시험하기 위해 지라가 절제된 마우스에 대한 펩티드-커플링 폴리스티렌 마이크로스피어의 투여 효과를 기술한다.
펩티드-커플링 마이크로스피어의 생산을 실시예 1 또는 실시예 20에 기술된 바와 같이 수행하였다. 지라절제 동물 또는 무손상 동물을 PLP139 -151, 대조군 (OVA323-339) 펩티드 결합 마이크로스피어로 처치하거나, 어떠한 마이크로스피어로도 처치하지 않았다. PLP139 -151/완전 프로인트 아주반트 (CFA)로의 프라이밍에 대응하는 제-7일에 동물을 마이크로스피어로 처치하였다. 결과가 도 5에서 제시된다. 대조군 (OVA323 -339) 펩티드가 결합된 마이크로스피어는 어떠한 마이크로스피어로도 처치되지 않은 동물과 유사한 평균 임상 점수를 나타낸 반면, PLP139 -151 마이크로스피어로 처치된 지라절제 마우스 또는 무손상 마우스 양쪽 모두는 평균 임상 점수 감소를 나타냈다.

Claims (33)

  1. 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어(carrier) 입자를 포함하는 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 대상체에서 항원-특이적 내성을 유도하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드가 자가면역 항원, 이식 항원 또는 알레르겐(allergen)인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 항원성 펩티드가 미엘린 염기성 단백질, 아세틸콜린 수용체, 내인성 항원, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타-세포 항원, 인슐린, 글루탐산 디카르복실라제(decarboxylase) (GAD), 콜라겐 유형 11, 인간 연골 gp39, fp130-RAPS, 단백지질 단백질, 피브릴라린, 소형 핵인 단백질, 갑상선 자극 인자 수용체, 히스톤, 당단백질 gp70, 피루베이트 탈수소효소 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase) (PCD-E2), 모낭 항원 또는 인간 트로포미오신 이소형(isoform) 5인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드가 접합체 분자에 의해 캐리어에 커플링된 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 접합체가 에틸렌 카르보디이미드 (ECDI)인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 아폽토시스성 신호전달 분자가 아넥신-1, 아넥신-5, 포스파티딜 세린, 또는 유지방 구체-EGF-인자 8 (MFG-E8)인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 아폽토시스성 신호전달 분자가 Fas-리간드 또는 TNF-알파인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 항원성 펩티드가 아폽토시스성 신호전달 분자에 융합된 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 캐리어 입자가 나노입자 또는 마이크로입자인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 나노입자 또는 마이크로입자의 직경이 1 내지 20 마이크로미터인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 나노입자 또는 마이크로입자가 생체분해성인 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 캐리어가 양자 점을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 캐리어가 덴드리머(dendrimer)인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 캐리어가 리포솜 또는 미셀(micelle)인 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 제2 항원성 펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
  17. 항원성 펩티드가 부착되어 있는 폴리스티렌 입자를 포함하는 조성물.
  18. 아폽토시스성 신호전달 분자 및 항원성 펩티드가 부착되어 있는 캐리어 입자를 포함하는 항원-특이적 내성의 유도를 위한 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 조성물이 대상체에서 항원-특이적 면역 응답을 감소시키는 것인, 대상체에서 항원-특이적 면역 응답을 감소시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항원성 펩티드가 자가면역 항원, 이식 항원 또는 알레르겐인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 자가면역 항원이 대상체가 면역 응답을 개시하는 항원인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 항원성 펩티드가 미엘린 염기성 단백질, 아세틸콜린 수용체, 내인성 항원, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타-세포 항원, 인슐린, 글루탐산 디카르복실라제 (GAD), 콜라겐 유형 11, 인간 연골 gp39, fp130-RAPS, 단백지질 단백질, 피브릴라린, 소형 핵인 단백질, 갑상선 자극 인자 수용체, 히스톤, 당단백질 gp70, 피루베이트 탈수소효소 디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라제 (PCD-E2), 모낭 항원 또는 인간 트로포미오신 이소형 5인 방법.
  22. 제18항에 있어서, 항원성 펩티드가 ECDI에 커플링된 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 아폽토시스성 신호전달 분자가 아넥신-1, 아넥신-5, 포스파티딜 세린, 또는 유지방 구체-EGF-인자 8 (MFG-E8)인 방법.
  24. 제18항에 있어서, 아폽토시스성 신호전달 분자가 Fas-리간드 또는 TNF-알파인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 캐리어가 나노입자 또는 마이크로입자인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 캐리어가 덴드리머인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 캐리어가 리포솜 또는 미셀인 방법.
  28. 제18항에 있어서, 항원-특이적 면역 응답이 자가면역 응답, 알러지, 천식, 이식편-대-숙주 반응 또는 이식편 거부 반응인 방법.
  29. 제18항에 있어서, 조성물이 경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비경구, 안구 또는 피하 전달되는 것인 방법.
  30. 병원성 항원을 포함하는 폴리스티렌 입자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 면역 응답을 감소시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항원이 ECDI를 사용하여 폴리스티렌 입자에 접합된 것인 방법.
  32. 대상체가 자가면역 장애에 대해 치료되도록
    (a) 아폽토시스성 신호전달 분자; 및
    (b) 병원성 항원
    을 포함하는 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 자가면역 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법.
  33. (a) 캐리어 입자; 및
    (b) 캐리어 입자에 결합된 항원성 펩티드
    를 포함하는 항원 특이적 내성을 유도하기 위한 키트를 필요로 하는 대상체에서 탈수초성장애를 완화시키는 방법.
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