KR20110111779A - 폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제 - Google Patents

폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제 Download PDF

Info

Publication number
KR20110111779A
KR20110111779A KR1020100031028A KR20100031028A KR20110111779A KR 20110111779 A KR20110111779 A KR 20110111779A KR 1020100031028 A KR1020100031028 A KR 1020100031028A KR 20100031028 A KR20100031028 A KR 20100031028A KR 20110111779 A KR20110111779 A KR 20110111779A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peg
spions
fol
folate
lung cancer
Prior art date
Application number
KR1020100031028A
Other languages
English (en)
Inventor
조명행
조종수
유미경
박인규
임황태
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020100031028A priority Critical patent/KR20110111779A/ko
Publication of KR20110111779A publication Critical patent/KR20110111779A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/06—Aluminium, calcium or magnesium; Compounds thereof, e.g. clay
    • A61K33/08—Oxides; Hydroxides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A61K49/0409—Physical forms of mixtures of two different X-ray contrast-enhancing agents, containing at least one X-ray contrast-enhancing agent which is not a halogenated organic compound
    • A61K49/0414—Particles, beads, capsules or spheres
    • A61K49/0423—Nanoparticles, nanobeads, nanospheres, nanocapsules, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 폴레이트-PEG를 제조하고, 이를 이용하여 초상자성 산화철 나노입자를 코팅한 후, 표면에 광학 화상진단을 위한 근적외선형광 염료를 표지시킨 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 낮은 세포독성을 나타내고, in vitro 및 in vivo 모두에서 암세포에 대한 표적화 운반 효율을 증진시키며, 종양 위치를 보다 명료하게 확인할 수 있는 효과가 있다.

Description

폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제{Folate-PEG-Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles labeled with Cy5.5 for Lung Cancer Imaging and Contrastmedium for Lung Cancer Imaging containing the same}
본 발명은 폐암 화상진단을 위한 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴레이트-PEG를 제조하고, 이를 이용하여 초상자성 산화철 나노입자를 코팅한 후, 표면에 광학 화상진단을 위한 근적외선형광 염료를 표지시킨 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제에 관한 것이다.
최근 들어 각종 질환을 조기에 발견하여 치료율을 높이 위해 다양한 진단 방법이 개발되고 있으며, 특히 자각 증상이 나타나기 전에 시각적으로 조기 발견이 가능한 최첨단 방법인 핵자기공명 단층촬영술 (magnetic reasonance image, MRI)의 사용이 증가되고 있다.
MRI는 양성자에서 나오는 신호를 측정하여 나타낸 것으로, 인체에 비침습적인 방법으로 진단하였으나, MRI를 위한 조영제(contrast agent)를 사용하면 진단의 민감도와 특이도를 증가시킬 수 있음이 밝혀진 이후, 최근에는 MRI 혈관 조영술, 관류영상에 이르기까지 MRI 조영제의 적용영역이 확대되고 있다.
조영제는 MRI의 자장이나 X-선의 통과에 영향을 미침으로써, 일반 MRI나 X-선 촬영으로는 확인 불가했던 조직이나 혈관, 위, 장 등의 내장기관에 투여하여 각 기관의 흡수차이를 이용하여 목적하는 부위를 관찰하거나 기능을 평가하기 위해 이용되는 물질로서 보다 선명한 영상을 형성시키는 역할을 하는 물질이다. 상기 조영제는 자장에 미치는 영향에 따라 상자성(paramagnetism), 초상자성(superparamagnetism) 제제로 구분되며, 각각 양성 조영제 및 음성 조영제라고도 불리운다.
상기 음성 조영제에 사용되는 초상자성 물질로는 마그네타이트(magnetite, Fe3O4) 또는 마그헤마이트(maghemite, Fe2O3)와 같은 산화철(superparamagnetic 산화철, SPIO)이 대표적으로 들 수 있다(도 1 참조). 이들은 수십 나노미터 이하의 크기를 갖는 균일한 입자로 제조하여 안정한 콜로이드 형태로 이루어져 있는 산화철 용액(ferrofluid)으로 제조되어 체내로 투여된다.
한편, 초상자성 나노입자가 효과적인 조영제로 이용하기 위해서는 높은 포화자화도를 가지면서 작고 균일한 안정한 마그네틱 산화철 용액(ferrofluid)이 제조되어야 한다. 상기 산화철 용액(ferrofluid)은 Fe3O4나 Fe2O3와 같은 자성 나노입자의 콜로이드 분산용액으로 매우 강한 자기장하에서도 액체 상태를 유지할 수 있어야한다.
그러나 순수한 초상자성 산화철 입자는 1) 소수성이면서 부피 대 표면적의 비가 크기 때문에 입자들 간에 소수성 인력(hydrophobic interaction)이 강하고 이로 인해 응집이 잘 일어나 클러스터(cluster)를 형성하고, 2) 충분히 안정하지 않으면 본래 구조가 변해서 자기적인 특성이 변할 수 있고, 3) 생체 환경에 접하게 되면 빠르게 생분해가 될 수 있으며, 4) 순수한 산화철 자체만으로는 독성이 있어 인체에 유해하므로 조영제로서의 이용에 제한이 따르는 문제가 있다.
따라서 이러한 문제를 개선하고 상기 초상자성 나노입자를 포함하는 산화철 용액의 안정성을 유지시키기 위해서는 입자의 표면 개질이 요구된다. 일반적으로 계면활성제나 고분자와 같은 안정제로 상기 나노입자를 코팅하는 방법이 개발되어 왔다. 종래 나노입자를 코팅하는 고분자로는 폴리아크릴산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 합성 고분자와 젤라틴, 덱스트란, 키토산, 플루란(pullulan)의 천연 고분자가 보고되어있다.
하지만, 실제로 상기에 언급된 고분자들을 이용한 코팅된 초상자성 산화철 나노입자는 조직이나 장기에 비특이적으로 축적되어 특정 조직이나 장기를 표적 하는 조영제로는 사용되기 힘들다. 이에 조직에 특이적이면서도, 조직에 장시간 잔류가능하고, 세포내로 침투 가능하여 국소 병변의 영상 효율을 향상시키고 부작용과 독성을 줄일 수 있는 고분자가 요구된다.
종래 산화철을 이용한 조영제와 관련된 기술을 살펴보면, 초상자성 산화철계 나노입자를 이용한 간 조영제 및 그 제조방법(대한민국 특허등록 제 10-0541282호), 초음파를 이용하여 제조된 MRI 조영제에 사용되는 산화철 나노분말 및 그 제조방법과 이를 이용한 MRI 조영제의 제조방법과 그 MRI 조영제(대한민국 특허등록 제 10-0637275호), 의료 및 진단절차에 사용하기 위한 조영제 및 그 이용방법(대한민국 특허 공개번호 10-2006-0052675호) 등이 있다.
또한 본 발명자들은 만난을 이용한 초상자성 산화철 나노입자의 코팅을 통해 조영제의 간세포 특이적 전달과 생리적 환경에서의 안정성을 크게 향상시키고, 간의 대식세포상의 만노스 수용체에 의하여 인식되어 간세포 속으로의 특이적 유입이 가능한 조영제를 개발한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2008-0015374호).
한편, 폐암 화상진단에 있어 종양 표적화에 나노입자를 이용하고 있으나, 무질서한 종양 맥관구조로 인해 나노입자의 종양 내 분포가 불충분하고, 나노입자의 내피세포 통과 효율이 낮은 문제점이 있어왔다.
폐암에서 나노입자의 표적화 능력을 증가시키는데 있어서, 암 세포에서는 상향 조절되지만 정상 조직에서는 거의 나타나지 않는 세포 표면 표적물질을 이용하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 암 세포에 효과적으로 흡수되는 리간드로 나노입자 표면을 개질하는 방법이 고려되고 있다.
이와 같은 암세포 표적 리간드로는 폴레이트 수용체(Folate receptor; FR)와 특이적으로 결합하는 폴레이트(Folate)가 있는데, FR은 높은 친화성 막 폴레이트-결합 단백질이며, 많은 인체 암에서 과발현되고 있으나, 대부분의 정상 조직에서는 존재하지 않는 특징이 있다. 따라서 표적 리간드를 사용하는 이점은 FR에 친화성이 높고, 면역원성이 없으며, 기능적으로 안정적이고, 화학적 컨쥬게이션이 한정되며, 비파괴성 세포 내재화 경로를 따른 다는 것이다(도 2 참조).
따라 본 발명자들은 종래 폐암 화상진단 방법에 있어서의 문제점을 극복하기 위하여, 종양 표적화 및 폐암의 조기 진단을 위한 화상진단 기능을 갖는 기능화된 산화철 나노프로브를 설계, 제작하고, 이들의 자성 유체 현탁액의 안정성을 포함한 in vivo 기능을 증진시키기 위해 예의 연구를 거듭한 결과 폐암 화상진단용으로 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자를 개발하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 폐암 화상진단용 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자를 유효성분으로 함유하는 폐암 화상진단용 조영제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 폴레이트-PEG를 제조하고, 이를 이용하여 초상자성 산화철 나노입자를 코팅한 후, 광학 화상진단용 염료인 Cy5.5를 표면에 표지시켜 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자를 제조하고, 세포내 흡수율과 세포독성을 평가하는 한편, 폐암 모델 마우스에 정맥주사 후 in vivo 화상진단 평가를 수행한 결과 세포독성이 낮고 암세포에 대한 표적화 운반 효율을 증진시키는 동시에 종양 위치를 보다 명료하게 확인할 수 있음을 통해 달성되었다.
본 발명은 폐암 화상진단용 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자인 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5를 제공한다.
본 발명에 따른 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자에 있어서, 폴레이트는 암 세포의 폴레이트 수용체에 결합되는 리간드로서의 폴레이트를 나타내며, SPIONs는 초상자성 산화철 나노입자(Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles)를 나타내고, Cy5.5는 광학 화상진단을 위한 근적외선(near-infrared; NIR) 형광 염료이다(도 3a 및 3b 참조).
본 발명에 있어서, Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자는 약어로 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5로 나타내며, 폴레이트는 약어로 Fol로 나타내고, 초상자성 산화철 나노입자는 약어로 SPIONs로 나타내며, 이와 같은 각각의 두 가지 표현은 동일한 의미를 나타낸다.
또한 본 발명은 상기 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5를 유효성분으로 함유하는 폐암 화상진단용 조영제를 제공한다.
본 발명에서는 폐암 화상진단을 위한 기능화된 산화철 나노프로브를 개발하기 위해, Fol-PEG를 SPIONs의 표면에 고정하고, 근적외선 형광 염료 Cy5.5로 표지하였다(도 3a 및 3b 참조).
이렇게 제조된 Fol-PEG-SPIONs에 대하여 DLS, TEM 및 XRD를 이용하여 특징을 분석하였다. In vitro에서 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 세포내 흡수율을 FACS로 분석하였다. 이들의 독성도 in vitro 및 in vivo에서 평가하였다. 또한 본 발명에서는 폐암 모델 마우스에 정맥주사 후 in vivo 화상진단을 체크하였다. 그 결과 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 보다 낮은 세포독성을 나타내었고, in vitro 및 in vivo 모두에서 암세포에 대한 표적화 운반 효율을 증진시켰다. NIR 형광 화상진단을 통해, 폴레이트가 결합되지 않은 PEG-SPIONs-Cy5.5와 비교하여 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5을 조직 주사한 경우 종양 위치가 보다 명료하게 확인되었다. 이러한 결과는 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5가 폐암 진단을 위한 in vivo 광학 화상진단제로 개발될 수 있음을 제안하는 것이다.
본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 낮은 세포독성을 나타내고, in vitro 및 in vivo 모두에서 암세포에 대한 표적화 운반 효율을 증진시키며, 종양 위치를 보다 명료하게 확인할 수 있는 효과가 있어, 본 발명은 폐암 진단을 위한 in vivo 광학 화상진단제 개발을 위한 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 초상자성 산화철 나노입자(Superparamagnetic 산화철 nanoparticles; SPION)의 구성을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 표적 리간드로서 폴레이트의 작용을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3a 및 3b는 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5를 이용한 폐암 화상진단 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 폴레이트-PEG 합성 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 폴레이트-PEG의 NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6은 SPION의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 7은 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 8은 폴레이트-PEG-SPION의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 9는 SPION(a)과 폴레이트-PEG-SPION(b)의 형태 및 입도분포에 대한 TEM 사진을 나타낸 도이다.
도 10은 SPION(a)과 폴레이트-PEG-SPION(b)의 형태 및 입도분포에 대한 ELS 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 폴레이트-PEG-SPION의 X-선 회절 패턴을 나타낸 도이다.
도 12는 수성 매질에서 폴레이트-PEG-SPION의 안정성을 나타낸 도이다.
도 13은 KB 세포에 대한 폴레이트-PEG-SPION(a)과 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(b)의 세포독성을 나타내는 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 13은 KB 세포에 대한 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(b)의 세포독성을 나타내는 LDH 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 뇌, 간, 심장 및 비장에서 조직병리학 결과를 나타낸 도이다. 대조구(A), PEG-SPION-Cy5.5(B), 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(C).
도 16은 간의 조직병리학 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조구. (B) PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 투여 후 괴사가 관찰됨(점선 원). (C) 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 투여 후 괴사가 관찰됨(점선 원).
도 17은 신장의 조직병리학 결과를 나타낸 도이다. (A) 대조구. (B-1) PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 투여 후 피질에서 관상 괴사가 관찰됨(화살표). (B-2) 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 투여 후 피질에서 관성 괴사가 관찰됨(화살표).
도 18은 매질 중에 폴레이트의 존재 및 부재 하에 KB 세포로 PEG-SPION-Cy5.5(a) 및 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(b)의 세포 내 흡수능에 대한 형광-활성화 세포 분류 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 폴레이트의 존재 및 부재 하에서 1 시간 동안 PEG-SPION 또는 및 폴레이트-PEG-SPION을 이용하여 배양한 KB 세포에서 공초점 레이저 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 20은 우레탄 유발 폐암 모델 마우스를 나타낸 도이다.
도 21a 및 21b는 마우스의 광학 이미지를 나타낸 도로서, (a) 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5 및 PEG-SPION-Cy5.5 주입 6시간 후, (b) 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5 및 PEG-SPION-Cy5.5 주입 24시간 후의 이미지이다.
도 22는 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5의 표적 특이성을 나타낸 도이다. 폐암 모델 마우스에 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 또는 PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg) 주입한 후, IVIS-100으로 촬영하였다. 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5(A) 및 PEG-SPION-Cy5.5(B). 리빙 이미징(Living Imaging) V2.5를 이용하여 ROI(Region of Interest)로부터의 히스토그램의 휘도를 측정하였다(C).
도 23은 PEG-SPION(A) 및 폴레이트-PEG-SPION(B-1, B-2)을 I.V. 주입 후 림프절의 펄스 프루시안 (Perl's Prussian) 블루 염색 결과를 나타낸 도이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 폴레이트-PEG (Fol-PEG)의 합성
본 실시예에서는 도 4에 도시한 바와 같이 Fol-PEG를 합성하였다. 우선,엽산(folic acid) 0.44g (1.0 mmol)을 DMSO 용매에 녹인 후 NHS(N-hydroxysuccinimde) 0.23g (2.0 mmol)과 DCC(N,N‘-Dicyclohexylcarbodiimide) 0.41g (2.0 mmol)을 첨가하여 질소 가스 분위기와 실온에서 12시간 교반시켜 폴산의 카르복실기가 활성화된 폴산을 준비하였다. 이 반응 결과물을 필터(syringe filter)(0.45 μm)를 이용하여 여과한 후, 여액에 이관능성-PEG(bifunctional-PEG)(NH2-PEG-COOH, MW=5kDa) 1g (0.2 mmol)과 피리딘 20 μL를 첨가하여 질소 가스 분위기와 실온에서 4시간 교반시켜 이관능성 PEG의 한쪽 아미노기와의 아미드 결합을 통해 폴레이트-PEG-COOH를 합성하였다. 이 반응 결과물을 DMSO에서 2일간 투석 (MW cut-off 1000)하여 미반응의 폴산을 제거시킨 후 동결건조하여 사용하였다.
DCC/NHS 커플링제를 사용하여 폴산을 이관능성 PEG의 한쪽 아미노기에 결합시켜 Fol-PEG를 합성하였다. Fol-PEG의 NMR 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 6.6 ppm에서 폴산의 특정 피크가 나타나는 것으로부터 폴레이트가 PEG에 결합된 것을 확인할 수 있었고 PEG와 폴산 피크의 면적비로 계산한 결과 폴레이트가 48.4 mol% 도입된 것을 알 수 있었다.
실시예 2 : SPIONs의 제조
본 실시예에서는 도 6에 나타낸 바와 같이 SPIONs를 제조하였다. 우선, 산화철 나노입자는 염화 제2철과 염화 제3철의 알칼리 공침전법에 의하여 제조하였다. 염화철(Ⅲ)(FeCl36H2O) 3.255g과 염화철(Ⅱ)(FeCl24H2O) 1.197g을 증류수 70mL에 첨가하여 혼합 수용액을 제조하였다. 상기 혼합 수용액을 격렬히 교반시키면서 암모니아 수용액 7mL을 첨가하였다. 이때 검은 침전물이 형성되는데, 상기 침전물을 영구자석을 이용하여 고정시키면서 pH가 10에서 7로 떨어질 때까지 증류수로 여러 번 세척하였다. 상기 pH 7이 된 침전물만을 수거하였다. 상기 침전물에 2M의 질산용액 20mL과 0.35M의 질산 제2철(Fe(NO3)3) 수용액 30mL을 가하여 1시간동안 환류(reflux)하면서 산화시켰다. 산화로 인하여 형성된 갈색 현탁액을 0.01M의 질산으로 2일동안 투석하여 산화철 나노입자 저장 용액을 제조하였으며, 4℃에서 보관하였다.
실시예 3 : 폴레이트-PEG와 Cy5.5를 이용한 SPIONs의 표면 개질
본 실시예에서는 도 7에 도시한 바와 같이 상기 실시예 1에서 합성한 폴레이트-PEG와 근적외선 형광 염료 Cy5.5를 이용하여, 실시예 2에서 제조한 SPIONs의 표면을 개질하여 폴레이트-PEG-SPION-Cy5.5를 제조하였다.
우선, APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 이용하여 산화철 나노 입자의 표면에 아미노기를 도입하였다. 실시예 2에서 준비한 SPIONs 저장용액 50mL에 에탄올 50mL를 더해 혼합용액을 만든 후, 여기에 APTES 5.7mL를 첨가하고 질소분위기하에서 24시간 교반시켰다. 이 반응 혼합물에 글리세롤(glycerol) 50 mL를 첨가하여 30분 동안 교반시킨 후, 영구 자석을 이용하여 침전물을 수거하고 상기 침전물을 영구자석을 이용하여 고정시키면서 에탄올로 5회 세척하여 표면에 APTES가 결합된 산화철 나노입자 (APTES-SPIONs)를 얻었다.
Fol-PEG-SPIONs은 Fol-PEG의 카르복실 말단을 활성화시켜 산화철의 아미노기와의 아미드 결합 형성을 통해 산화철 나노 입자의 표면을 Fol-PEG로 개질하였다. 우선, Fol-PEG를 DMSO 용매에 녹인 후 NHS(N-hydroxysuccinimde) 와 DCC(N,N‘-Dicyclohexylcarbodiimide)를 첨가하여 (Fol-PEG : NHS : DCC의 몰비=1 : 2 : 2) 질소 가스 분위기와 실온에서 12시간 교반시켜 폴레이트-PEG의 카르복실기가 활성화된 Fol-PEG를 준비하였다. 상기에서 준비한 APTES-SPIONs를 증류수에 넣고 초음파 처리 (50W, 30분)하여 고루 분산시킨 후 증류수에 녹인 활성화된 Fol-PEG 용액을 첨가하여 (APTES-SPIONs : 활성화된 Fol-PEG의 무게비=1 : 7) 실온에서 12시간 교반시켰다. 이 반응 결과물을 증류수에서 3일간 투석 (MW cut-off 6500)하여 미반응의 Fol-PEG를 제거시킨 후 동결건조하여 사용하였다. 대조군으로서 PEG-SPIONs도 동일한 방법으로 제조하였다.
Fol-PEG-SPION-Cy5.5는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 4.5 mg의 Cy5.5를 TEA(triethylamine) 8μL를 포함하고 있는 무수 DMSO 1 ml에 녹인 후 각각 무수 DMSO 2.5 mL에 분산시킨 PEG-SPIONs(50 mg)와 Fol-PEG-SPIONs(50mg)에 500 μL 씩 첨가하여 빛이 차단된 조건에서 12 h 반응시켜 Cy5.5가 결합된 PEG-SPIONs(PEG-SPIONs-Cy5.5)와 Fol-PEG-SPIONs(Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5)를 제조하였다. 부산물과 미반응 Cy5.5는 투석(molecular weight cutoff 6500)을 통해 제거한 후 동결 건조시켰다. PEG-SPIONs와 Fol-PEG-SPIONs에 결합된 Cy5.5 분자수는 675 nm에서 흡광계수(extinction coefficient)(molar coefficient : 2.5×105 M-1cm-1)를 측정하여 정량하였다.
실험예 1 : Fol-PEG-SPION-Cy5.5의 특성 분석
실험예 1-1 : FT-IR 분광 분석
본 실험예에서는 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 이용하여 산화철 나노 입자의 표면에 아미노기를 도입한 후 Fol-PEG의 카르복실 말단과 산화철의 아미노기와의 아미드 결합 형성을 통해 산화철 나노 입자의 표면을 Fol-PEG로 개질하였다. Fol-PEG-SPIONs의 합성을 확인하기 위해 FT-IR을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. PEG의 CH2 벤딩이 1466.8 cm-1에서 관찰되었고, 산화철 나노입자 표면의 아미노기와 Fol-PEG의 카르복실 말단의 화학결합에 의해 생성된 아미드 결합은 3425.6cm-1 (N-H stretching)와 1650.8cm-1(C=O stretching, N-H bending)에서 흡수 피크를 나타내었다. 또한 산화철 나노입자의 FeO에 기인하는 강한 흡수 피크가 APTES에 의한 표면 코팅에 의해 더 높은 파수인 636.5 cm-1와 582.4 cm-1로 각각 이동하였다는 것을 알 수 있었다.
실험예 1-2 : X-선 회절 분석
본 실험예에서는 동결건조시켜 얻은 파우더형태의 시료를 X-선 회절 분석기(X-ray diffractometer, XRD)(GADDS; Bruker-AXS D5005, Karlsruhe, Germany)를 이용하여 결정구조를 분석하였다. Fol-PEG-SPIONs의 X-선 회절 패턴을 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 산화철 나노입자의 X-선 회절 분석에 의한 패턴은 표준 maghemite () 회절 분석 데이터베이스인 (111), (220), (311), (400), (422), (511), (440)면으로부터 나오는 피크와 일치하는 것을 확인할 수 있었고, Fol-PEG를 사용한 표면개질 후에도 피크의 변화가 관찰되지 않았다. 또한 합성한 나노 입자들이 결정성이 좋음을 알 수 있었다[Jolivet, J.P. et al. J. Colloid Interf. Sci, 125, 688 (1988); Hyeon, T.H. et al. J. Am. Chem. Soc. 123, 12798 (2001)]
실험예 1-3 : 전기영동 광산란 광도계(ELS) 분석
본 실험예에서는 Fol-PEG-SPIONs의 크기와 그 분포를 측정하기 위해, 산란각 90°로 조절된 토탈 광산란 측정기(electrophoretic light scattering spectrophotometer, ELS 8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 25 ℃에서 측정하였다. 상기 토탈 광산란 측정기 분석을 위한 시료는 각각을 증류수에 넣어 초음파 처리를 하여 준비하였다.
SPIONs(a) 및 Fol-PEG-SPIONs(b)의 ELS 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 토탈광산란기로 측정한 SPIONs와 Fol-PEG-SPIONs의 수평균크기와 그 분포를 보여주는 히스토그램이다. 산화철 나노입자의 평균 크기는 8.8±1.7 nm이었고 Fol-PEG 산화철 나노입자는 18.5±3.4 nm의 입자 크기를 갖는 것으로 나타나 고분자인 Fol-PEG를 이용한 산화철나노입자의 표면 개질에 의해 입자 크기가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 분포도를 분석한 결과 단분산에 가까운 분포 경향을 보여 나노입자의 크기 분포가 매우 고른 것으로 나타났다.
실험예 1-4 : 투과 전자 현미경(TEM) 분석
본 실험예에서는 투과전자현미경 (transmission electron microscopy, TEM) (JEM 1010, JEOL, Japan)을 이용하여 SPIONs와 Fol-PEG-SPIONs의 형태 및 크기를 측정하였다. 투과전자현미경 측정을 위한 시료는 증류수에 넣고 초음파 분산액을 구리 그리드(copper grid) 위에 소량 떨어뜨린 후 15 분간 공기 중에서 건조시켜 측정하였다.
SPIONs(a) 및 Fol-PEG-SPIONs(b)의 TEM 분석 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, SPIONs와 Fol-PEG-SPIONs 모두에서 입자의 크기가 약 10~20nm 이하이고 잘 분리된 구형임을 확인할 수 있었다.
실험예 1-5 : 안정성 분석
본 실험예에서는 제조된 Fol-PEG-SPIONs와 PEG-SPIONs의 시간에 따른 안정성은 ELS를 이용한 1, 2, 4, 7일의 시간 경과 후 입자 크기와 분포도를 측정하여 조사하였다.
수성 매질에서 Fol-PEG-SPIONs의 안정성 분석 결과를 도 12에 나타내었다.
산화철 나노입자를 바이오메디컬 분야 에 응용하기 위해서는 작고 균일한 입자 크기를 가지면서 안정한 자성유체(ferrofluid)가 만들어져야 한다. 따라서 본 발명에서는 산화철 나노입자의 표면을 PEG 또는 Fol-PEG로 개질한 후 8 주까지의 시간의 경과에 따른 나노입자의 크기 및 분포도 변화를 조사하여 Fol-PEG-SPIONs와 PEG-SPIONs의 수용액 상에서의 안정성을 조사하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, PEG-SPIONs와 Fol-PEG-SPIONs를 각각 증류수에 분산시켜 콜로이드 용액을 만든 후 4℃에서 8주까지 보관하면서 입자의 크기를 ELS로 측정한 결과이다. PEG-PEG-SPIONs는 입자 크기가 14.3±2.6nm에서 22.7±7.4nm로 소폭 증가하여 안정한 상태를 유지했으며, Fol-PEG-SPIONs는 2주까지는 14.3±1.6nm에서 20.8±5.3nm로 큰 변화가 없었고 8주가 경과했을 때는 30.8±7.2nm로 증가하였지만 대체로 안정한 상태를 유지하였다. Fol-PEG-SPIONs에 비해 PEG-SPIONs의 입자 안정성이 더 우수했는데 이는 소수성인 폴레이트의 영향인 것으로 사료된다.
실험예 2 : 세포독성 및 세포 내 흡수능 평가
실험예 2-1 : MTT 분석 및 LDH 분석
본 실험예에서는 본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIO-Cy5.5의 세포독성을 in vitro에서 MTT 분석 및 LDH 분석을 통해 평가하였다.
1. 세포 배양
폴레이트 수용체를 과발현시킨 KB (human epidermal carcinoma) 세포주를 10% 의 우태아혈청(fetal bovine serum:FBS), 100μg/mL의 스트렙토마이신 및 100 units/mL의 페니실린이 첨가된 RPMI 1640배지((Gibco BRL, Paris, France)에서 배양하였다. 배양은 5% 의 이산화탄소 함유 대기, 37℃ 하에서 수행하였다.
2. MTT 분석
MTT 분석을 통하여 미토콘드리아에의 독성을 평가하고 농도를 설정의 자료로 이용하였다. KB세포를 웰당 1×105 세포수의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간동안 배양하였다. 배양 후 다양한 농도의 SPIONs, PEG-SPIONs (또는PEG-SPIONs-Cy5.5), Fol-PEG-SPIONs (또는 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5)를 함유한 새로운 배지로 교체하였다. 24시간 후 0.5mg/mL의 MTT 첨가후 4시간 더 배양하였다. 상기 배지를 버리고, 형성된 포르마잔염(formazan salt)을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide;DMSO)로 녹인 후 ELISA 판독기를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 비율(%)로 결과를 나타내었다.
3. LDH 분석
LDH(Lactose dehydrogenase) 분석을 통하여 나노 입자의 세포막에 대한 독성을 평가하였다. LDH는 세포질에 존재하는 효소로 통상은 세포막을 통과하지 않으나 세포막이 손상되면 세포 외부로 방출된다. 이를 통하여 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 안전성을 검사하였다.
KB세포를 웰당 1×105 세포수의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고 24시간동안 배양하였다. 배양 후 다양한 농도의 SPIONs, PEG-SPIONs-Cy5.5, Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5를 함유한 새로운 배지로 교체하였다. 24시간 배양 후 각 웰로부터 30μl의 배양액을 취해 96-웰 플레이트에 옮기고 각 시료에 Substrate Mix (CytoTox 96Assay kit) 30μl씩 가해 빛을 차단한 상태에서 30분간 방치한다, 각 웰에 Stop solution (CytoTox 96Assay kit) 30μl씩 첨가 후, ELISA 판독기를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 웰당 1×105 세포수의 농도로 24-웰 플레이트에 분주한 후, 시료를 처리하지 않고 48시간 배양한 KB세포를 -70℃와 건조오븐 3차례 거치면서 인위적으로 세포를 죽인 다음 이로부터 분비된 최대 LDH 값을 대조군으로 잡고 이에 대한 비율(%)로 결과를 나타내었다. 그 결과를 도 13 및 14에 나타내었다.
도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 산화철 나노입자의 표면을 PEG 또는 폴레이트-PEG로 개질한 후 각 고분자의 코팅이 산화철 나노입자의 독성에 어떤 영향을 미치는지(a), 또 여기에 Cy5.5를 형광 표지하면 독성에 어떤 영향을 미치는지(b)를 KB 세포를 대상으로 한 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 조사하여 평가한 결과이다. 표면 개질을 하지 않은 산화철 나노입자에 비해 PEG 또는 Fol-PEG로 표면 개질한 산화철 나노입자의 세포생존율이 현격히 증가한 것으로 미루어 표면 코팅이 산화철 나노입자의 독성을 감소시키는 걸 확인할 수 있었고 PEG-SPIONs과 Fol-PEG-SPIONs 모두에서 농도와 무관하게 95% 이상의 높은 세포 생존율을 보여 무독성 물질임이 알 수 있었다 [도 13(a)]. 그러나 Cy5.5로 표지한 PEG-SPIONs-Cy5.5와 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 세포생존율은 농도-의존적 경향을 보여 처리해 준 시료의 농도가 증가할수록 독성이 증가하는 경향을 보였다 [도 13(b)]. LDH 분석에 의한 독성 평가도 MTT 분석과 비슷한 결과를 나타내었다 [도 14].
실험예 2-2 : 혈액학적 및 조직병리학적 분석
본 실험예에서는 본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 혈액학적 및 조직병리학적 영향을 in vivo에서 평가하였다.
1. ICR 마우스에의 미정맥 주사 후 혈액, 혈청 검사
(1) 시험물질 및 사육조건
5주령 수컷 ICR 마우스를 중앙실험동물에서 구입하여 이주일간의 순화기간을 거쳐 실험에 사용하였다. 사료와 배딩은 각 각 퓨리나와 중앙실험동물에서 구입하였으며 급수와 사료는 충분히 공급하였다. 사육조건은 온도 24±3℃, 상대습도 50±20%, 조명시간 12시간 (오전 8시-오후 8시)으로 하였다. 모든 실험동물의 사육 및 실험은 서울대학교의 실험동물 관리지침에 따라 실시하였다 (SNU-081009-02).
(2) 시험군의 구성
이주일 간의 순화기간을 거친 후 건강하다고 판정된 동물에 한하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하였으며 처리군당 실험동물의 수는 5마리로 하였다. 시험군은 Fol-PEG-SPION-Cy5.5, PEG-SPION-Cy5.5를 5mg/kg을 기준 농도로 하여 10mg/kg의 고농도 군과 2.5mg/kg의 저농도 군으로 각 각 분류하였다.
(3) 시험물질 노출방법 및 관찰
Fol-PEG-SPION-Cy5.5 또는 PEG-SPION-Cy5.5는 정맥주사를 통하여 투여하였다. 투여 후 부검 전까지 한주동안 매일 2번씩 동일한 시간에 상태 변화 및 독성 발현 정도, 사망 유무 등을 점검하였다. 또한 체중은 주사 후 3일 간격으로 측정하였다. 실험 종료 후 부검을 실시하여 육안적 이상 증상을 관찰 하였다. 또한 부검 전 실험동물의 혈액을 채취하여 혈액학적 검사를 진행함으로써 Fol-PEG-SPION-Cy5.5가 적혈구 및 백혈구 성장에 미치는 영향을 평가 하였다.
(4) 혈액학적 검사
제조한 Fol-PEG-SPION-Cy5.5 나노입자를 ICR 마우스에 미정맥으로 투여한 후 7일의 시간이 흐른 후 부검하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 EDTA가 함유된 채혈용 튜브에 취한 후 혈구자동측정기 (Hemavet, USA)로 검사를 실시하였다. 일부 혈액은 혈액검사에 사용 하고 남은 혈액은 원심분리 후 상층의 혈청을 분리하여 LDH, 알부민, 콜레스테롤, 답즙산(Bile acid) 등의 기본 혈청검사를 수행하였다.
2. ICR 마우스에의 단회 미정맥 주사 후 조직병리 검사
제조한 PEG-SPION-Cy5.5와 Fol-PEG-SPION-Cy5.5 나노입자를 ICR 마우스에 미정맥으로 투여한 후 7day의 시간이 흐른 후 ICR 마우스의 뇌, 심장, 폐, 간, 신장, 비장을 적출하여 각각 H&E 염색을 실시하였다. 각 장기는 부검 후 10% 포르말린에 고정하였으며 프로세싱 과정을 거친 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 조직 슬라이드는 3㎛의 두께로 절단하였다.
독성 시험 7일 째 ICR 마우스의 생존률과 체중을 하기 표에 나타내었다.
Figure pat00001
정맥주사를 통하여 고분자 나노물질을 실험동물에 투여한 후 일주일 동안 사망률을 측정한 결과 Fol-PEG-SPION-Cy5.5군과 PEG-SPION-Cy5.5군 모두에게서 사망은 관찰되지 않았다. 체중의 변화에서도 대조군과 비교 시 유의성 있는 데이터는 관찰되지 않았다.
Fol-PEG-SPIO-Cy5.5의 조직병리학적 영향을 in vivo에서 평가한 결과를 도 15 내지 17에 나타내었다.
도 15 내지 17에 나타낸 바와 같이, Fol-PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg)군과 PEG-SPION-Cy5.5(5mg/kg)군에 대한 H&E 염색을 실시한 결과 간에서 조직 괴사가 관찰되었으며(도 16) 신장의 피질에서 조직 괴사와 수질에서의 출혈이 관찰되었다 (도 17). 그 외 뇌, 심장, 폐, 비장에서의 특이적인 병변은 관찰되지 않았다 (도 15).
실험예 2-3 : 유세포 분석
본 실험예에서는 나노입자에 형광 염료를 결합시키면 형광 유세포 분석(Fluorescent flow cytometry)으로 나노입자가 세포내로 유입되었는지 여부를 정량적으로 분석할 수 있다. 이를 이용하여 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자와 대조군인 PEG-SPIONs-Cy5,5 나노입자의 암세포 내 유입 효율을 비교하였다. KB 세포를 웰당 1× 106 세포수로 6-웰 플레이트에 분주한 후 24시간동안 배양하였다. 0.1M의 PBS로 세척하고 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자 (100 mg/mL)를 함유하고 있는 RPMI배지 1mL를 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세 번 세척한 후 트립신 처리 후 플레이트에서 빼내고 500μL의 DMSO에 용해 시켰다. 한편, 폴레이트를 함유하고 있는 RPMI배지(0.5 mM)를 각 웰에 1 mL씩 20분간 전처리하여 KB 세포의 폴레이트-수용체를 블록킹시킨 후 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자의 세포내 유입 효율을 조사하였다. 대조군인 PEG-SPIONs-Cy5,5 나노입자에 대해서도 동일한 방법으로 실험한 후 그 결과를 비교하였다. 세포-관련 형광 탐색은 FACSCalibur(Beckton Dickinson, Mansfield, MA, USA)를 이용하여 형광-활성화 세포 분류(Fluorescence-activated cell sorting)에 의하여 수행하였다. 상기 데이터는 CELLQuest 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 유세포 분석 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 폴레이트-수용체를 과발현 시킨 인체 암세포(human epidermal carcinoma KB)가 리간드를 가진 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5가 함유된 배지에서 배양될 경우[도 18(b)] 폴레이트가 없는 PEG-SPIONs-Cy5.5와 비교하여 볼 때[도 18(a)], 형광 정도가 크게 나타나 나노입자의 세포내 유입이 높음을 알 수 있었다. 이는 폴레이트-수용체를 통하여 이루어지는 산화철 나노입자의 KB 세포로의 엔도시토시스(내포작용; endocytosis)가 효율적이라는 것을 보여준다. 또한 Fol-PEG-산화철 나노입자의 KB 세포내 유입이 폴레이트-수용체 매개 엔도시토시스 메카니즘에 의한 것인지 확인하기 위해 엽산을 전처리하여 KB 세포의 폴레이트-수용체를 블록킹시킨 다음, 각각 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5와 PEG-SPIONs-Cy5.5가 함유된 배지에서 배양하여 나노입자의 세포내 유입을 비교한 결과, 폴레이트가 없는 PEG-SPIONs-Cy5.5의 경우 세포내 유입정도에 차이가 없는 반면[도 18(a)] Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 전처리한 폴산과의 경쟁반응을 통해 세포내 유입이 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다[도 18(b)].
실험예 2-4 : 이미지 복원 현미경을 이용한 세포 내 흡수율 분석
본 실험예에서는 KB세포내로 유입된 Fol-PEG-SPIONs 나노입자를 시각적으로 확인하기 위하여 공초점 레이저 주사현미경 분석을 행하였다, 12-웰 플레이트에 콜라겐으로 코팅한 원형 커버 글라스를 깔고 KB 세포를 웰당 2× 105 세포수로 분주한 후 24시간동안 배양하였다. 폴레이트를 함유하고 있는 RPMI배지(0.25 mM)를 각 well에 1 mL씩 20분간 전처리한 후 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자 (50 mg/mL)를 함유하고 있는 RPMI배지 1mL를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세 번 세척하여 세포 외부에 남아 있는 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자를 제거한 후, 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy, Micro Systems CLSM 410, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 세포에 존재하는 산화철 나노입자의 형광과 위상차 이미지를 관찰하고 동일한 방법으로 시행한 PEG-SPIONs-Cy5.5 나노입자의 결과와 비교하였다. 공초점 레이저 현미경 분석 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 폴레이트 수용체-매개 엔도사이토시스(폴레이트 receptor-mediated endocytosis)를 통한 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 암세포 표적성은 공초점 레이저 주사현미경 분석에 의해도 시각적으로 확인할 수 있었다
실험예 3 : in vivo 폐암 화상진단
본 실험예에서는 실험동물로 6주령의 우레탄-유발 폐암 모델 마우스(도 20 참조)를 이용하여 본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 in vivo 폐암 표적화를 분석하였다. 폐암 모델 쥐를 제작하기 위하여 5주령의 수컷 A/J mice를 중앙실험동물에서 구입하여 사용하였다. 두주간의 순화기간을 거쳐 실험에 사용하였으며 실험동물의 사육 및 관리는 단회투여 독성실험과 같다. 폐암 모델 쥐 제작에 사용된 우레탄(Urethan)은 Sigma(#U2500)에서 구입하였으며 0.9% 생리식염수에 0.5㎎/1㎕의 농도로 희석하여 실험동물의 체중에 따라 우레탄의 농도가 1mg/g이 되도록 I.P 주사하였다. 복막내 주사 후 6주 동안 폐암이 유발되도록 한 뒤 실험에 사용하였다(SNU-081119-2)
도 20에 나타낸 바와 같이, 원형의 흰색 점선으로 표시된 부위에 암조직이 발견되어 폐암이 유발된 모델 쥐를 얻을 수 있었다.
형광 현미경으로 측정한 Fol-PEG-SPIONs에 결합된 Cy5.5 분자의 수를 하기 표에 나타내었다.
SPIONs에 결합된 Cy5.5의 양(mg/g) SPIONs에 결합된 Cy5.5의 수(mmol/g)
PEG-SPIONs-Cy5.5 25.15 0.022
Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5 25.76 0.023
실험예 3-1 : 광학 화상진단
본 실험예에서는 Fol-PEG-SPION-Cy5.5의 폐암특이성을 조사하기 위하여 폐암이 유발된 A/J 마우스에 5㎎/㎏의 고분자 나노입자를 정맥 주사한 후 발광도(Luminescence) 및 형광도(Fluorescence) 측정 장비인 IVIS-100을 사용하여 형광이미지를 측정하였으며 대조군으로 PEG-SPION-Cy5.5를 사용하였다. 사료에서 나타나는 자가형광(Autofluorescence)을 차단하기 위하여 고분자 나노입자 투여 하루 전부터 실험동물에 대한 절식을 실시하였다. IVIS-100의 노출 시간은 0.5 Sec를 사용하였으며 ROI(Region of Interest) intensity를 측정한 후 Living Imaging V2.5를 사용하여 분석을 실시하였다.
마우스의 광학 화상진단 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 폴레이트 리간드가 있는 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5를 사용한 경우 리간드가 없는 PEG-SPIONS-Cy5.5를 단독으로 사용했을 때보다 폐조직에서의 광학 이미징(optical imaging) 효율이 높은 것으로 관찰되었다. 미정맥 투여 후 6 시간이 경과한 후 폐암조직에서 형광을 관찰한 결과 PEG-SPIONS-Cy5.5에 비해 월등한 형광 정도를 관찰할 수 있었고, 폐 이외에 간과 신장에서도 높은 형광 효율을 나타내었다. 이는 암조직에 과발현되어 있는 폴레이트-수용체(폴레이트-receptor)와 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 폴레이트 리간드와의 상호작용에 의해 나노 입자의 세포내 유입이 잘 일어나고 있기 때문인 것으로 사료된다.
또한 폐암 모델 마우스에 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5(5mg/kg) 또는 PEG-SPIONs-Cy5.5(5mg/kg)을 주사한 후, IVIS-100을 이용하여 촬영하였다. 본 발명에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5의 표적 특이성을 도 22에 나타내었다[Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5(A) 및 PEG-SPIONs-Cy5.5(B)]. ROI(Region of Interest) 히스토그램의 복사휘도를 리빙 이미징(Living Imaging) V2.5로 측정하였다(도 22 (C) 참조).
도 22에 나타낸 바와 같이, 폴레이트 리간드가 있는 Fol-PEG-SPIONS-Cy5.5는 종양이 있는 폐와 간, 신장 등에서 높은 형광 효율을 나타낸 반면 (A), 폴레이트 리간드가 없는 PEG-SPIONS-Cy5.5는 종양이 있는 폐보다 간과 신장에서 훨씬 높은 형광 효율을 나타내었다 (B). 각 장기 별로 ROI(Region of Interest) 강도를 측정한 후 Living Imaging V2.5를 사용하여 분석을 실시한 결과를 [도 22(C)]에 나타내었다. 모든 장기에서 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 PEG-SPIONs-Cy5.5에 비해 높은 형광 효율을 보였고 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5는 폐, 간, 신장 등에서 비슷한 정도로 높은 형광을 보인 반면 PEG-SPIONs-Cy5.5는 신장에서 특히 높은 형광을 나타내었다.
실험예 3-2 : 프루시안 블루 염색(Prussian blue staining)
본 실험예에서는 Fol-PEG-SPION-Cy5.5가 폐암에 특이적으로 축적되었는지를 확인하기 위하여 폐암 유발 A/J 마우스 폐에 대한 펄 프러시안 블루 염색(Perl's Prussian blue staining)을 실시하였다. Fol-PEG-SPION-Cy5.5와 PEG-SPION-Cy5.5를 각각 5mg/kg의 농도로 정맥 주사한 다음 24h 후에 부검하였다. 폐 조직은 10% 포르말린에 고정하였으며 조직 절편은 3㎛의 두께로 절단하여 조직 슬라이드로 사용하였다.
도 23에 PEG-SPIONs(A) 및 Fol-PEG-SPIONs(B-1, B-2)를 정맥 주사한 후 림프절의 펄스 프루시안 블루 염색 결과를 나타내었다. 배율은 40x이었고, 스케일 바는 500μm를 나타낸다.
도 23에 나타낸 바와 같이, Fol-PEG-SPION-Cy5.5군 (B-1, B-2)과 PEG-SPION-Cy5.5 군 (A)의 폐에서 펄 플러시안 블루 염색을 통하여 산화철의 분포를 확인한 결과 종양에서 산화철의 존재를 확인하였지만 두 군을 비교 시 큰 차이는 나타나지 않았다. Fol-PEG-SPION-Cy5.5를 투여한 군의 경우 림프절에서의 발현을 확인하였으나 PEG-SPION-Cy5.5군의 경우 림프절이 명확히 확인되는 부분을 찾지 못하였다.

Claims (2)

  1. 폐암 화상진단용 Cy5.5로 표지된 폴레이트-PEG-초상자성 산화철 나노입자인 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5.
  2. 제1항에 따른 Fol-PEG-SPIONs-Cy5.5를 유효성분으로 함유하는 폐암 화상진단용 조영제.
KR1020100031028A 2010-04-05 2010-04-05 폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제 KR20110111779A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100031028A KR20110111779A (ko) 2010-04-05 2010-04-05 폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100031028A KR20110111779A (ko) 2010-04-05 2010-04-05 폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110111779A true KR20110111779A (ko) 2011-10-12

Family

ID=45027736

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100031028A KR20110111779A (ko) 2010-04-05 2010-04-05 폐암 화상진단을 위한 Ｃｙ5.5로 표지된 폴레이트-ＰＥＧ-초상자성 산화철 나노입자 및 이를 이용한 폐암 화상진단용 조영제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20110111779A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arami et al. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles
Hu et al. Dysprosium-modified tobacco mosaic virus nanoparticles for ultra-high-field magnetic resonance and near-infrared fluorescence imaging of prostate cancer
Hou et al. Nanoparticles for multi-modality cancer diagnosis: simple protocol for self-assembly of gold nanoclusters mediated by gadolinium ions
Peng et al. Targeted tumor CT imaging using folic acid-modified PEGylated dendrimer-entrapped gold nanoparticles
Kim et al. A cancer-recognizable MRI contrast agents using pH-responsive polymeric micelle
Veiseh et al. Specific targeting of brain tumors with an optical/magnetic resonance imaging nanoprobe across the blood-brain barrier
Ke et al. A specific tumor-targeting magnetofluorescent nanoprobe for dual-modality molecular imaging
Xiong et al. A functional iron oxide nanoparticles modified with PLA-PEG-DG as tumor-targeted MRI contrast agent
Liu et al. Gd 3+-Ion-induced carbon-dots self-assembly aggregates loaded with a photosensitizer for enhanced fluorescence/MRI dual imaging and antitumor therapy
Hu et al. Facile synthesis of hyaluronic acid-modified Fe 3 O 4/Au composite nanoparticles for targeted dual mode MR/CT imaging of tumors
Xu et al. Melanin-manganese nanoparticles with ultrahigh efficient clearance in vivo for tumor-targeting T 1 magnetic resonance imaging contrast agent
CN108404142B (zh) 一种磁共振成像纳米载体、纳米载药系统及其制备方法
Shao et al. A smart multifunctional nanoparticle for enhanced near-infrared image-guided photothermal therapy against gastric cancer
Lin et al. Folic acid-modified diatrizoic acid-linked dendrimer-entrapped gold nanoparticles enable targeted CT imaging of human cervical cancer
Li et al. Non-invasively differentiating extent of liver fibrosis by visualizing hepatic integrin αvβ3 expression with an MRI modality in mice
Ho et al. Unibody core–shell smart polymer as a theranostic nanoparticle for drug delivery and MR imaging
Luo et al. Hyaluronic acid-mediated multifunctional iron oxide-based MRI nanoprobes for dynamic monitoring of pancreatic cancer
Huang et al. Multifunctional liposomal drug delivery with dual probes of magnetic resonance and fluorescence imaging
Wang et al. Efficient exosome extraction through the conjugation of superparamagnetic iron oxide nanoparticles for the targeted delivery in rat brain
Cai et al. A transferrin-target magnetic/fluorescent dual-mode probe significantly enhances the diagnosis of non-small cell lung cancer
Dai et al. Targeted therapy of atherosclerosis vulnerable plaque by ROS-scavenging nanoparticles and MR/fluorescence dual-modality imaging tracing
Yan et al. A tumor-targeting and ROS-responsive iron-based T 1 magnetic resonance imaging contrast agent for highly specific tumor imaging
Shi et al. Enhanced CT imaging of human laryngeal squamous carcinoma and indirect CT lymphography imaging using PEGylated PAMAM G5· NH2-entrapped gold nanoparticles as contrast agent
Gong et al. A dual ligand targeted nanoprobe with high MRI sensitivity for diagnosis of breast cancer
Mekawy et al. Hybrid magneto-fluorescent nano-probe for live apoptotic cells monitoring at brain cerebral ischemia

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E601 Decision to refuse application