KR20110096936A - 코리네형 세포의 정지기에 분비되는 자가유도체에 의해 조절받는 뉴클레오티드 및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체(autoinducer)에 의해 조절되는 서열번호 1로 기재되는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가유도체를 스크리닝하는 방법 및 자가유도체에 의한 전사조절자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코리네형 박테리아의 정지기에 과발현되는 유전자의 프로모터 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
박테리아는 다른 미생물과 영양분 이용을 경쟁하기 위해, 주변 환경을 감시하고 반응한다. 또한, 박테리아 배양액의 개체군이 충분한 밀도에 도달하게 되면, 2차 대사산물이 생산됨에 따라 생리적 조절작용이 발생한다. 상기 2차 대사산물은 박테리아 자체에 의해 생산되며 세포 밖으로 배출되어 다양한 범위에서 신호물질로 작용한다. 상기 신호물질은 자가유도체(autoinducer)로 불리우며, 상기 자가유도체에 의한 조절은 자가유도 또는 쿼럼 센싱(quorum sensing)이라고 한다. 상기 자가유도체의 농도가 최소 한계점 자극 수준에 도달하게 되면, 박테리아는 상기 축적을 감지하고 독성 인자를 포함하는 다수의 유전자의 발현량을 변화시켜서, 박테리아 개체군의 행동 패턴을 조절하게 된다.
일반적으로 그람 음성 박테리아들은 서로 간의 소통을 위해 아실호모세린 락톤(acylhomoserine lactones; AHLs)이라는 지질계 분자를 이용한다. 상기 AHLs는 자가유도체 합성효소에 의해 생성되며, 박테리아 외부로 확산된다. 자가유도체의 한계점 농도에 도달하게 되면, 상기 AHLs는 세포질 전사 조절자에 결합하여 전사 조절자를 활성시키고, 세포의 생존에 중요한 유전자의 발현량을 조절하며, 추가 AHLs의 생산을 증가시킨다. AHLs에 의한 자가유도는 호흡기 병원감염(nosocomial respiratory tract infections)의 중요 박테리아성 병원체인 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 대상으로 광범위하게 연구되어 왔다. 슈도모나스 애루지노사의 두 개의 자가유도계인 las-계 및 rhl-계는 3-옥소-C12-HSL(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone) 및 C4-HSL (N-butanoyl-L-homoserine lactone)을 통해 독성 인자의 생성을 각각 조절하였다. 반면에, 그람 양성 박테리아들은 올리고펩티드 자가유도체로 불리는 펩티드계 분자를 이용하여 소통한다. 상기 올리고펩티드 자가유도체는 박테리아 막을 통과하여 확산되지 않으며, 특이한 올리고펩티드 배출자(exporter)에 의해 방출되고, 올리고펩티드의 구조에 예민한 막-결합 센서 히스티딘 키나아제에 의해 검출된다. 그람 양성 박테리아가 사용하는 자가유도체의 구조는 박테리아마다 다양하다.
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 1957년에 처음 발견된 이래로 글루타메이트, 라이신 및 쓰레오닌과 같은 아미노산의 산업적 생산과정에서 생물공학적으로 중요하게 사용되어 왔다. 이로 인해 최근 수십 년 동안 상기 균주의 아미노산 생합성 대사경로에 대한 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 유전자 발현 수준에서 조절 작용에 대한 정보는 매우 제한되어 있으며, 자가유도체에 관련된 연구는 아직 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에 자가유도체가 존재할 것으로 예측하고, 상기 무세포 배양액에 의해 발현량이 증가하는 유전자를 발견하고자 예의 노력한 결과, 무세포 배양액에서 발현량이 유의하게 증가하는 아실트랜스퍼라아제 유전자를 스크리닝하였다. 상기 유전자의 프로모터는 열처리, 단백질분해효소 K 및 저온처리에도 영향을 받지 않는 자가유도체에 의해 조절됨으로써, 상기 프로모터가 자가유도체의 스크리닝 및 자가유도체에 의한 전사 조절자의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 정지기까지 배양된 코리네형 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체(autoinducer)에 의해 조절 받는 뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 후보물질로부터 자가유도체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가유도체에 의한 전사 조절자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 폴리뉴클레오티드 또는 이와 동일한 활성을 나타내는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 이의 변이체를 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 배양액으로부터 수득한 무세포 배양액을 새 배지와 1:1로 혼합한 배양액에서 NCgl0350 유전자(아실트랜스퍼라아제)의 발현량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 1 참조). 상기 유전자는 무세포 배양액으로 처리하지 않은 경우에는 과발현되지 않았다. 이것은 상기 유전자가 코리네박테리움 글루타미쿰의 무세포 배양액 내에 존재하는 자가유도체에 의해 유도된 아실트랜스퍼라아제 프로모터에 의해 유도되었음을 지시하였다.
이에, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 서열번호 1로 기재되는 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터를 클로람페니콜 저항성 유전자와 연결한 벡터를 제조하여 상기 프로모터의 특성을 확인하였다. 즉, 상기 프로모터가 포함된 벡터로 형질전환된 균주는 클로람페니콜이 포함된 배지에서 전혀 자라지 못하다가 무세포 배양액이 포함됨으로써 성장하였고, 이로부터 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 무세포 배양액에 의해 유도되는 것을 확인하였다(도 2 참조). 이는 상기 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체가 상기 프로모터에 특이적으로 작용하여 클로람페니콜 저항성 유전자를 발현시킴으로써 클로람페니콜 포함 배지에서 생존이 가능한 것으로 볼 수 있다. 따라서, 이로부터 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 무세포 배양액에 의해 유도되는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 무세포 배양액은 정지기 배양액으로부터 수득 시기가 길어질수록 클로람페니콜 포함 배지에서 형질전환체 균주의 성장을 유도하는 활성이 높아졌다(도 3A 참조). 이는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 세포 성장의 정지기에 시간 의존적으로 생성되는 것을 지시하였다. 또한, 상기 무세포 배양액은 열처리 및 단백질분해효소의 처리와 상관없이 클로람페니콜 포함 배지에서 형질전환체 균주의 성장을 확인하였으며, 이로부터 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 비단백질성인 것을 알 수 있었다(도 3B 및 3C 참조). 아울러, 저온 처리와 상관없이 클로람페니콜 포함 배지에서 상기 형질전환체 균주가 성장하는 것을 확인하였으며, 이는 상기 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 저온에 저항성인 것을 지시하였다(도 3D 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 코리네박테리움 암모니아게네 ATCC6872(C. ammoniagene) 및 슈도모나스 애루기노사 PAK(Pseudomonas aeruginosa PAK) 유래의 무세포 배양액에 의해 클로람페니콜 포함 배지에서 아실트랜스퍼라아제 프로모터를 포함하는 형질전환체 균주의 성장이 유도되는 것을 확인함으로써, 그람 양성 박테리아인 상기 코리네박테리움 글루나미쿰 및 코리네박테리움 암모니아게네 뿐만 아니라 그람 음성 박테리아인 슈도모나스 애루기노사 유래의 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 상기 세 가지 미생물 균주의 배양액에 일반적으로 존재하는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).
이들 결과로부터, 본 발명의 서열번호 1로 기재되는 프로모터가 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치한다.
본 발명의 프로모터는 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체(autoinducer)에 의해 조절될 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래하였으며, 아실트랜스퍼라아제(acyltransferase; NCgl0350)를 암호화하는 유전자의 상단부에 위치한 것을 분리한 것이다.
본 발명의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 최근의 여러 가지 연구기법, 예를 들어 방향성 진화법(directed evolution) 또는 부위특이 돌연변이 기술(site-directed mutagenesis) 등의 방법을 통해 일정 정도 변형이 가능하다. 즉, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 폴리뉴클레오티드는 상기 아실트랜스퍼라아제 유전자의 발현을 위한 프로모터 활성을 유지하는 한, 이의 작용성 등가물을 포함한다. 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 폴리뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 폴리뉴클레오티드의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다. 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 목적 유전자의 발현을 위한 본 발명의 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 프로모터와 균등물로서 본 발명의 권리 범위에 속함을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태로서, 본 발명의 프로모터 핵산 분자는 서열번호 1로 기재되는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상의 상동성(homology)을 나타내고, 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "상동성"은 야생형(wild type) 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 서열번호 1로 기재되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일할 수 있는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 원핵세포, 바람직하게는 코리네형 박테리아에서의 유전자 발현을 위한 프로모터로 유용하다.
본 발명에서 용어 "코리네형 박테리아"는 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 포함하는 개념이다. 이러한 코리네형 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 외에도, 코리네박테리움 속의 적당한 균주로서 공지된 야생형 균주, 코리네박테리움 암모니아게네 ATCC 6872(C. ammoniagene), 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869을 들 수 있으며, 또한 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, ATCC 21831, ATCC 21493 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주들인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM-10741, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001, 코리네박테리움 암모니아게네스 CJHB100(KCCM-10330) 및 ATCC 6871 등이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
프로모터를 분리하기 위한 방법에는 (1) 게놈성 DNA 단편을, 클로닝된 단편이 프로모터 활성을 포함하는 경우에만 발현되는 리포터 유전자의 전방에 무작위로 클로닝시키는 프로모터 프로브 벡터(promoter probe vector)를 이용하는 방법, (2) 유전자 특이적 프로브에 기초한 하이브리드화를 이용하여 유전자 라이브러리로부터 유전자 및 이의 프로모터를 분리하는 방법, 및 (3) 유도성 cDNA 프로브 및 비유도성 cDNA 프로브를 사용한 유전자 뱅크의 차별 하이브리드화법 등이 있다.
본 발명의 프로모터의 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 코리네박테리움 속 미생물로부터, 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있으며, 또한 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.
본 발명의 프로모터는 코리네박테리움 속 균주이면 어디에서나 기능할 수 있으나, 당업자라면, 상기 본 발명에 따른 프로모터가 반드시 코리네박테리움 속 균주가 아니라도, 적절한 미생물 균주 내에서 그 프로모터 활성을 유지할 수 있을 것임을 충분히 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에서 용어 "자가유도체(autoinducer)"란 박테리아가 환경의 변화에 반응하여 세포 간 시그널링을 위해 특정한 분자를 합성하여 세포 밖으로(extracellular) 배출하거나 유입(uptake)하는 방법을 사용하여 서로 커뮤니케이션하는데 이러한 세포 간 시그널링인 쿼럼 센싱(quorum sensing)을 매개하는 분자를 말한다. 상기 쿼럼 센싱이란 세균이 숙주에 대한 공격을 극대화할 수 있도록 세포의 수가 일정 수준에 도달했는지 여부를 감지하는 것으로 "정족수 감지"라고도 한다. 이러한 쿼럼 센싱은 세균이 증식하면서 세포 안에 축적되는 자가유도체에 대한 반응으로 작동하게 된다. 또한, 상기 자가유도체는 전사 인자(transcription factor)의 활성을 조절하고, 이러한 전사인자에 의해 조절되는 유전자 발현을 조절하는 역할을 한다. 본 발명에서 상기 자가유도체는 아실호모세린 락톤(acylhomoserine lactone)계, 펩타이드계 및 퓨라논(furanone)계로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.
상기 목적 유전자는 리포터 유전자일 수 있다.
본 발명에서 용어 "리포터 유전자"는 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로서, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 선별 마커(selection marker)들이 사용될 수 있다. 또한, 형광이미지로 바로 검출할 수 있도록 형광을 낼 수 있는 단백질도 사용될 수 있다. 상기 선별 마커는 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커로, 클로람페니콜 저항성 유전자(chloramphenicol acyltransferase: cat), 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자, 네오마이신(Neomycin: Neo) 저항성 유전자, 하이그로마이신(hygromycin: Hyg) 저항성 유전자, 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinoldehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 클로람페니콜 저항성 유전자이지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 형광단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트는 목적 유전자로서 아실트랜스퍼라제(acyltransferase; NCg10350)를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 아실트랜스퍼라아제 및 리포터 유전자 둘 다를 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어 "벡터"란 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제 및 기능할 수 있거나, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 벡터에 제한효소 부위를 통해 클로닝되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 벡터는 pSK1CAT, pET21a, pET28a, pET/Rb, pGEX, pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 코리네형 박테리아 또는 상기 박테리아에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 그람 양성 세균에서 클로람페니콜 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아실트랜스퍼라아제를 암호화하는 cat 유전자가 포함된 프로모터가 없는 벡터인 pSK1CAT 벡터를 사용하였다. 즉, 증폭된 프로모터 영역을 T&A 벡터에 삽입한 후, PstI으로 절단하여 동일 효소로 절단된 pSK1CAT 벡터에 다시 클로닝 하여, NCgl0350의 프로모터가 포함된 pHS09004 벡터를 제조하였다(도 2A 참조).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
상기 숙주 미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 코리네형 박테리아(Coryneform bacteria), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있으며, 바람직하게는 코리네형 박테리아가 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 숙주 미생물로의 형질전환은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
상기 엔테로박테리아세 과에 속하는 미생물에는 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella) 및 쉬겔라(Shigella)가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 에스케리키아(Escherichia) 속의 미생물이며, 더욱 바람직하게는 대장균 (E.coli)이다.
본 발명에서 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 pHS09004 벡터를 야생형 코리네박테이움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질도입하여, C6(P0350:CAT) 형질전환체 균주를 제작하였다.
상기 코리네형 박테리아는 앞서 기술한 바와 같으며, 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 같은 병원체도 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 후보물질로부터 자가유도체를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 자가유도체를 스크리닝하는 방법은, 1) 상기 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계; 2) 자가유도체 후보물질을 포함하는 배양액인 실험군 및 일반 배양액인 대조군에서 상기 단계 1)의 형질전환체를 각각 배양하는 단계; 3) 단계 2)의 실험군 및 대조군에서 상기 형질전환체의 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및, 4) 단계 3)에서 상기 형질전환체의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높은 자가유도체 후보물질을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체에 의해 조절 받는 서열로, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드와 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여, 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체의 특성을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자가유도체의 스크리닝에도 유용하게 이용될 수 있다.
상기 단계 2)의 자가유도체 후보물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 리간드, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 2)의 자가유도체 후보물질을 포함하는 배양액은 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액일 수 있다.
상기 박테리아는 바람직하게는 코리네형 박테리아 일 수 있다. 또한, 상기 박테리아는 코리네박테리움 글루나미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 자가유도체 후보물질은 열처리, 단백질 분해효소 K, 저온처리, 필터링, 크로마토그래피 및 투과(dialysis) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 전처리 될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가유도체에 의한 전사 조절자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 자가유도체에 의한 전사 조절자를 스크리닝하는 방법은, 1) 상기 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 1을 제조하는 단계; 2) 후보 전사 조절자 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 2를 제조하는 단계; 3) 자가유도체를 포함하는 배양액인 실험군 및 일반 배양액인 대조군에서 상기 단계 1) 및 단계 2)의 형질전환체 1 및 형질전환체 2를 각각 배양하는 단계; 4) 단계 3)의 실험군 및 대조군에서 상기 형질전환체 1 및 형질전환체 2의 리포터 유전자 활성을 각각 측정하는 단계; 및 5) 단계 4)에서 상기 형질전환체 1의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높고, 상기 형질전환체 2의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높은 후보 전사 조절자를 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 프로모터 활성을 갖는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 정지기까지 배양된 코리네형 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체에 의해 조절되는 서열로서, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드와 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 제조하여, 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체의 특성을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지의 자가유도체에 의해 발현량이 조절되는 전사 조절자를 스크리닝하기 위한 대조군 유전자, 즉 내재유전자로 이용될 수 있다.
단계 3)의 자가유도체는 아실호모세린 락톤(acylhomoserine lactone)계, 펩타이드계, 및 퓨라논(furanone)계로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체는 자가유도체의 스크리닝 및 자가유도체에 의한 전사조절자의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 무세포 배양액에 의해 발현량이 증가한 유전자를 확인한 도이다:
레인 1 내지 12는 표 3에서 선별한 후보 유전자 1 내지 12에 대응함.
도 2는 무세포 배양액에 의해 아실트랜스퍼라아제의 프로모터의 발현이 유도되는 것을 확인한 도이다:
A: 음성대조군인 NCgl0697 유전자의 프로모터 또는 실험군인 NCgl0350 유전자(아실트랜스퍼라아제)의 프로모터가 클로람페니콜 저항성 유전자(cat)의 상단부에 작동가능하게 연결되도록 발현벡터를 제작하는 과정을 나타냄; 및,
B: 상기 발현벡터가 형질도입된 형질전환체가 클로람페니콜 저항성을 나타냄으로써, 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 무세포 배양액에 의해 작동되는 것을 확인함.
도 3은 무세포 배양액의 특성을 확인한 도이다:
A: 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 곡선 및 무세포 배양액의 자가유도 활성 시기;
B: 무세포 배양액의 열저항 특성;
C: 무세포 배양액의 비단백질 특성; 및,
D: 무세포 배양액의 저온저항성 특성.
도 4는 코리네박테리움 암모니아게네 또는 슈도모나스 애루기노사 유래의 무세포 배양액에 의한 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 활성화되는 것을 확인한 도이다:
A: 코리네박테리움 암모니아게네; 및,
B: 슈도모나스 애루기노사.
도 5는 NCg10350 유전자의 프로모터 서열을 나타낸 도이다.
레인 1 내지 12는 표 3에서 선별한 후보 유전자 1 내지 12에 대응함.
도 2는 무세포 배양액에 의해 아실트랜스퍼라아제의 프로모터의 발현이 유도되는 것을 확인한 도이다:
A: 음성대조군인 NCgl0697 유전자의 프로모터 또는 실험군인 NCgl0350 유전자(아실트랜스퍼라아제)의 프로모터가 클로람페니콜 저항성 유전자(cat)의 상단부에 작동가능하게 연결되도록 발현벡터를 제작하는 과정을 나타냄; 및,
B: 상기 발현벡터가 형질도입된 형질전환체가 클로람페니콜 저항성을 나타냄으로써, 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 무세포 배양액에 의해 작동되는 것을 확인함.
도 3은 무세포 배양액의 특성을 확인한 도이다:
A: 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 곡선 및 무세포 배양액의 자가유도 활성 시기;
B: 무세포 배양액의 열저항 특성;
C: 무세포 배양액의 비단백질 특성; 및,
D: 무세포 배양액의 저온저항성 특성.
도 4는 코리네박테리움 암모니아게네 또는 슈도모나스 애루기노사 유래의 무세포 배양액에 의한 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터가 활성화되는 것을 확인한 도이다:
A: 코리네박테리움 암모니아게네; 및,
B: 슈도모나스 애루기노사.
도 5는 NCg10350 유전자의 프로모터 서열을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
코리네박테리움
글루타미쿰의
무세포
배양액에 의해 발현량이 증가하는 유전자의 선별
<1-1> 세포 배양 및
무세포
배양액 처리
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032은 MB 배지(Follettie, J. Bacteriol . 175:4096~4103, 1993)에서 30℃, 36시간 동안 교반하면서 배양하였다. 상기 배양액을 10,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.2 μm)에 통과시켜서 무세포 배양액인 Gc 용액을 제조하였다. 상기와 동일한 방법으로 OD600이 1.8이 될 때까지 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 배양액으로부터 세포를 회수한 후, 상기 방법으로 제작한 무세포 배양액과 새 배지를 1:1로 혼합한 MB 배지에 현탁하였다. 추가로 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, TRIzol 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 전체 RNA를 제조사의 권고방법대로 분리하였다.
<1-2>
RT
-
PCT
수행
분리된 전체 RNA로부터 Verso cDNA 키트(Thermo, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 표 1에 기재된 바와 같이 총 12개의 후보 유전자를 선별한 후, 상기 유전자를 대상으로 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 프라이머쌍은 표 2에 기재된 것을 이용하였고, 95℃ 2분; 95℃ 30초, 52℃ 30초 및 72℃ 1분을 30회 반복의 조건으로 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 NCgl0350 유전자(서열번호 3)의 발현량이 매우 높게 증가하는 것을 확인하였다. 상기 NCgl0350은 아실트랜스퍼라아제를 암호화하는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자는 무세포 배양액으로 처리되지 않은 경우에는 과발현되지 않았다(데이터는 기재하지 않았음). 이것은 상기 유전자가 코리네글루타미쿰의 무세포 배양액 내 자가유도체에 의해 유도되었음을 지시한다.
그 외, NCgl0308, NCgl1742 및 NCgl2582도 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
| Lane* | NCgl | Gene ID | Genetic locus | Description |
| 1 | 0251 | cg0310 | Catalase | Response to ppGpp synthase |
| 2 | 0308 | cg0378 | Putative phage-associated protein | Response to SigB |
| 3 | 0350 | cg0432 | Predicted acyltransferase | Highly expressed at stationary phase |
| 4 | 0697 | cg0834 | ABC-type transpoter | Response to ppGpp synthase |
| 5 | 0841 | cg0998 | Trypsin-like serine protease | Response to nitrogen starvation |
| 6 | 1206 | cg1413 | ABC-type transpoter | LuxP like ABC type transporter |
| 7 | 1466 | cg1718 | Phospholipid-binding protein | Response to SigB |
| 8 | 1742 | cg2037 | Hypothetical protein | Highly expressed at stationary phase |
| 9 | 2582 | cg2958 | L-2,3-butanediol dehydrogenase | Response to nitrogen starvation |
| 10 | 2632 | cg3022 | Acetyl-CoA acetyltransferase | Response to SigB |
| 11 | 2704 | cg3102 | Hypothetical nucleosidase | S. pneumoniae MTAN like protein |
| 12 | 2899 | cg3329 | Hypothetical protein | Response to SigB |
* 도 1에 기재된 레인에 대응하는 숫자임.
| RT-PCR 용 | 서열번호 | |
| 0251F-RTPCR | 5' -ACC TCA TTG AAA AGC TCG CAC A-3' | 4 |
| 0251R-RTPCR | 5' -AGC GTT AAT CCA CTG GAA GGT-3' | 5 |
| 0308F-RTPCR | 5' -GAA GAT CAG AAG TGC ACG TGA AAT-3' | 6 |
| 0308R-RTPCR | 5' -AAG AAA TCT TTC AGC GCA GCA TCT-3' | 7 |
| 0350F-RTPCR | 5' -TAC ATC GAC GGC AAC TGC TAA A-3' | 8 |
| 0350R-RTPCR | 5' -ACG ATG CCG ACT GAA ATA CAA CAA-3' | 9 |
| 0697F-RTPCR | 5' -TTT CAG TGA ACA CCA TCG GCT T-3' | 10 |
| 0697R-RTPCR | 5' -GTT TTC CAG GGA TTC CTT CAG T-3' | 11 |
| 0841F-RTPCR | 5' -AAG GAA ATG AGC AAC AAG CTC CA-3' | 12 |
| 0841R-RTPCR | 5' -AGA ACC AAC AGC CAT CAC ACT T-3' | 13 |
| 1206F-RTPCR | 5' -TTC TGT CGT TTT GGC TTT CAG CT-3' | 14 |
| 1206R-RTPCR | 5' -TCT TCA AAT CCC TGT CCA CGA T-3' | 15 |
| 1466F-RTPCR | 5' -ATG AGC ACC TAC CAA GAC GAT-3' | 16 |
| 1466R-RTPCR | 5' -TAG TTC TCG TAC CAT CCC CAC-3' | 17 |
| 1742F-RTPCR | 5' -TCG TTG GAA TCT TGC GTT GAT AG-3' | 18 |
| 1742R-RTPCR | 5' -TCA AGA AGC AAA GCG CAA CCA AT-3' | 19 |
| 2582F-RTPCR | 5' -CTG CAG GTC AAA AGG CTG TAT-3' | 20 |
| 2582R-RTPCR | 5' -TCC GGT GAT GTA GTT GGA GTT-3' | 21 |
| 2632F-RTPCR | 5' -TCA AAA TAC CCG TCA CTC CAC-3' | 22 |
| 2632R-RTPCR | 5' -TAT CCG TAG AGC AAG TGA GCT-3' | 23 |
| 2704F-RTPCR | 5' -TAT CCG CCA CAA CTG AGG AAG-3' | 24 |
| 2704R-RTPCR | 5' -TAA ACT CCT TCA CAG CCT CCG-3' | 25 |
| 2899F-RTPCR | 5' -TTG CGG AAT GAT AGG AGT GTG TA-3' | 26 |
| 2899R-RTPCR | 5' -TAG TTA TGG TGG CAG TTG ATG C-3' | 27 |
| 16SrRNA_F | 5' -GCT GGC AAC ATA AGA CAA GG-3' | 28 |
| 16SrRNA_R | 5'GCA TAA CTT GAG TGC TGT AGG-3' | 29 |
| 클로닝 PCR 용 | ||
| 0350F | 5' -TTG TGC AGA TGT CCT GGA ATA C-3' | 30 |
| 0350R | 5' -CCG GAT TGG TGT ATG AAA AAT AA-3' | 31 |
| 0697F | 5' -CGA AGG TGT TCC TCA TGG AT-3' | 32 |
| 0697R | 5' -GAG TTC GTT GAG CGT TAC CTG-3' | 33 |
무세포
배양액에 의한
아실트랜스퍼라아제
프로모터의 유도
<2-1> 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제조
상기 실시예 1에서 무세포 배양액에 의해 발현량이 증가한 것으로 확인된 NCgl0350의 프로모터의 발현 벡터를 제조하였다. 이때, 발현량이 증가하지 않았던 NCgl0697의 프로모터를 음성대조군으로 사용하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 표 2의 클로닝용 PCR 프라이머쌍(0350F/0350R 및 0697F/0697R)을 이용하여, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 NCgl0350 및 NCgl0697 프로모터 영역을 각각 증폭하였다.
상기 증폭된 프로모터 영역을 T&A 벡터(Real Biotech Corporation)에 삽입한 후, PstI으로 절단하여 동일 효소로 절단된 pSK1CAT 벡터에 다시 클로닝 하였다. 상기 pSK1CAT 벡터는 그람 양성 균에서 클로람페니콜 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아실트랜스퍼라아제를 암호화하는 cat 유전자가 포함된 프로모터가 없는 벡터이다.
그 결과, NCgl0350의 프로모터가 포함된 pHS09004 벡터 및 NCgl0697의 프로모터가 포함된 pHS09002 벡터를 각각 제조하였다(도 2A).
<2-2>
무세포
배양액에 의한 프로모터의 유도 확인
상기 pSK1CAT 벡터, pHS09002 벡터 및 pHS09004 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환함으로써, 각각 C3, C5(P0697:CAT) 및 C6(P0350:CAT) 형질전환체 균주를 제작하였다. 상기 형질전환체 균주들을 30 ㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 MB 배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 무세포 배양액과 MB 배지를 클로람페니콜이 포함하거나 포함하지 않는 상태로 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 제조한 분석배지 2 ㎖에, 상기 균주 배양액을 1:2,000의 비율로 희석하였다. 대조군으로는 MB 배지만 단독으로 2 ㎖가 사용되었다. 상기 형질전환체 균주들은 24시간 동안 분석배지에서 30℃에서 밤새 배양하였다. OD600의 값을 SmartSpec 3000 Spectrophotometer(Bio-Rad Laboratories, USA)를 이용하여 측정함으로써, 세포의 성장을 관찰하였다.
그 결과, 도 2B에서 나타난 바와 같이 클로람페니콜 무포함 배지에서 유사하게 자라던 상기 형질전환체 균주들은 무세포 배양액에서 배양함으로써 성장이 절반수준으로 감소하였다. 또한, 클로람페니콜 포함 배지에서 다른 C3, C5(P0697:CAT) 균주는 전혀 자라지 못하고, 무세포 배양액에서 C6(P0350:CAT) 균주만 유일하게 성장하였다. 이로부터, 아실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체에 의해 특이적으로 조절되고, 이러한 프로모터의 활성에 의해 클로람페니콜 저항성 유전자의 발현이 조절됨을 확인하였다.
무세포
배양액 및
자가유도체의
특성 분석
<3-1>
무세포
배양액의 시간대별 특징
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주를 MB 배지에서 배양하면서, 12, 24, 36 및 48 시간에 세포의 OD600 값을 측정한 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 24시간 이후에 정지기에 도달하는 것을 확인하였다. 12, 24, 36 및 48 시간 배양액에서 수득한 무세포 배양액에 의한 야생형 균주(대조군)와 P0350:CAT 형질전환체 균주(실험군)의 성장을 클로람페니콜이 포함되거나 포함되지 않은 배지에서 확인하였다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 클로람페니콜 무포함 배지에서 무세포 배양액에 의해 대조군과 실험군의 성장이 저하되며, 무세포 배양액의 수득 시기가 길어질수록 저하 정도가 더 커지는 것을 확인하였다. 또한, 클로람페니콜 포함 배지에서 실험군이 성장하였으며, 무세포 배양액의 수득 시기가 길어질수록 성장 정도가 커지는 것을 확인하였다. 이는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 세포 성장의 정지기에 시간 의존적으로 생성되는 것을 지시하였다.
<3-2>
자가유도체의
비단백질성
특징
무세포 배양액 내의 자가유도체가 펩타이드 또는 단백질인지를 확인하기 위해, 36시간 무세포 배양액을 15분 동안 가압멸균처리(autoclave)하여 변성하거나 300 ㎍의 단백질분해효소 K를 37℃에서 30분 동안 처리한 후, 65℃에서 20분 동안 추가로 처리하여 단백질 분해효소 K를 불활성화하였다. 상기 방법으로 처리된 무세포 배양액에 의한 야생형 균주(대조군)와 P0350:CAT 형질전환체 균주(실험군)의 성장을 클로람페니콜이 포함되거나 포함되지 않은 배지에서 확인하였다.
그 결과, 도 3B 및 3C에 나타난 바와 같이 클로람페니콜 무포함 배지에서 무세포 배양액에 의해 대조군과 실험군의 성장이 저하되었다. 또한, 열처리 및 단백질분해효소의 처리와 상관없이 클로람페니콜 포함 배지에서 실험군이 성장하는 것을 확인하였다. 이는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 비단백질성인 것을 지시하였다.
<3-3>
자가유도체의
저온 저항성 특징
무세포 배양액 내의 자가유도체가 저온에서 활성을 유지하는 지 여부를 확인하기 위해, 36시간 무세포 배양액을 10일 동안 4℃에서 유지하였다. 상기 방법으로 저온 처리된 무세포 배양액에 의한 야생형 균주(대조군)와 P0350:CAT 형질전환체 균주(실험군)의 성장을 클로람페니콜이 포함되거나 포함되지 않은 배지에서 확인하였다.
그 결과, 도 3D에 나타난 바와 같이 클로람페니콜 무포함 배지에서 무세포 배양액에 의해 대조군과 실험군의 성장이 저하되었다. 또한, 저온 처리와 상관없이 클로람페니콜 포함 배지에서 실험군이 성장하는 것을 확인하였다. 이는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 저온에 저항성인 것을 지시하였다.
무세포
배양액의 종간 교차 활성
코리네박테리움 암모니아게네 ATCC6872(C. ammoniagene)는 30℃의 MB 배지에서 36시간 동안 배양한 후, 실시예 1-1의 방법으로 무세포 배양액인 Ga 용액을 제조하였고, 슈도모나스 애루기노사 PAK(Pseudomonas aeruginosa PAK)는 37℃의 LB 배지(10 g Tryptone, 5 g yeast extract 및 10 g NaCl)에서 36시간 동안 배양한 후, 실시예 1-1의 방법으로 무세포 배양액인 Pa 용액을 제조하였다.
상기 방법으로 제조된 각각의 무세포 배양액에 의한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주(대조군)와 P0350:CAT 형질전환체 균주(실험군)의 성장을 클로람페니콜이 포함되거나 포함되지 않은 배지에서 확인하였다.
그 결과, 도 4A 및 도 4B에 나타난 바와 같이 클로람페니콜 무포함 배지에서 무세포 배양액에 의해 대조군과 실험군의 성장이 저하되었다. 또한, 무세포 배양액의 유래와 상관없이 클로람페니콜 포함 배지에서 실험군이 성장하는 것을 확인하였다. 이는 무세포 배양액에 포함된 자가유도체가 세 가지 미생물 균주의 배양액에 일반적으로 존재하는 것을 지시하였다.
<110> CJ Cheiljedang Corporation
<120> Nucleotide which is controlled by autoinducer of Coryneform
bacteria and the screening method using it
<130> PA100072/KR
<160> 33
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 400
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
ttgtgcagat gtcctggaat acttgcgagg tgtacacact gccatgttct tcagtggaac 60
acagcatcct ttacgatgtc tagttggtct ttagccatca tcaacgcatc ctgaaccaac 120
gacgtcggat taggtcttag ttgccatgat cggtaggtta cctttttgtc ccaaattgtt 180
gggacattag gtgtctacca agcaggagcc agatccatgt atattcttcc tgcacaatta 240
cagccaatag cttacgatct ttaatgcata tacgaaggtg caataagcgt atgatcttcg 300
aagttttaaa tcaatttgtc tacgctaaaa ttgccagcaa cattcaactg attagattat 360
tgcaattcag aattaaagaa tcatacggaa ggtttttatg 400
<210> 2
<211> 503
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gggttgctgc agcaggtcgc accgcccagg gagctttacg acgccccggt caacgaattc 60
gttgcgggct tcatcggctc gccgtccatg aacctcttcc ctgccaacgg gcacaagatg 120
ggtgtgcgcc cggagaagat gctggtcaat gagacccctg agggtttcac aagcattgat 180
gctgtggtgg atatcgtcga ggagcttggc tccgaatcgt atgtttatgc cacttgggag 240
ggccaccgcc tggtggcccg ttgggtggaa ggccccgtgc cagcccctgg cacgcctgtg 300
actttttcct atgatgcggc gcaggcgcat catttcgatc tggagtcggg cgagcgtatc 360
gcttagtttc ggacgtgggg aggcgtcgaa aagcatcttt atttttgacc ctccgggggt 420
gatttaacct aaaattccac acaaacgtgt tcgaggtcat tagattgata agcatctgtt 480
gttaagaaag gtgacttcct atg 503
<210> 3
<211> 1067
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
ttgtgcagat gtcctggaat acttgcgagg tgtacacact gccatgttct tcagtggaac 60
acagcatcct ttacgatgtc tagttggtct ttagccatca tcaacgcatc ctgaaccaac 120
gacgtcggat taggtcttag ttgccatgat cggtaggtta cctttttgtc ccaaattgtt 180
gggacattag gtgtctacca agcaggagcc agatccatgt atattcttcc tgcacaatta 240
cagccaatag cttacgatct ttaatgcata tacgaaggtg caataagcgt atgatcttcg 300
aagttttaaa tcaatttgtc tacgctaaaa ttgccagcaa cattcaactg attagattat 360
tgcaattcag aattaaagaa tcatacggaa ggtttttatg actacatcga cggcaactgc 420
taaacaacaa gcttcgaaaa gtcatttccg tcccgacatt caaggactgc gagccgtcgc 480
ggtactttta gtattgatat ttcatgctgg cgatggctcc gtgctttccg gaggttttac 540
gggtgttgat attttctttg taatttctgg ctacttgatt actggacact tgatcaggtc 600
ttgtctagaa aagggaaaaa ttagtttaat taacttttat gcgggccgga ttaggagaat 660
tctgccagca gccacagccg ttttggtatt cacggcccta attacgattt tagtgttgcc 720
tgatacccgg tggatgctta tcggtgctga gatcattgca agttcagtgt atttggtaaa 780
ctggcttttt gcctcaaata cgaattattt gaatgcagaa gctgctgcca gtccagttca 840
gcattattgg accttatctg tggaggagca gttctatatc ctctggccag cgctacttat 900
tgggttgttg tatttcagtc ggcatcgttt tacactggac tcagaggaaa ctagtggcac 960
gaaactaaac aaagttcgtt ggctgcagcg ttatatcgct ttagcagctg tacttataac 1020
gttagtttct ctttgctttt ccatttattt ttcatacacc aatccgg 1067
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0251F-RTPCR
<400> 4
acctcattga aaagctcgca ca 22
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0251R-RTPCR
<400> 5
agcgttaatc cactggaagg t 21
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
gaagatcaga agtgcacgtg aaat 24
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0308R-RTPCR
<400> 7
aagaaatctt tcagcgcagc atct 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 8
tacatcgacg gcaactgcta aa 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0350R-RTPCR
<400> 9
acgatgccga ctgaaataca acaa 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0697F-RTPCR
<400> 10
tttcagtgaa caccatcggc tt 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gttttccagg gattccttca gt 22
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0841F-RTPCR
<400> 12
aaggaaatga gcaacaagct cca 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0841R-RTPCR
<400> 13
agaaccaaca gccatcacac tt 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1206F-RTPCR
<400> 14
ttctgtcgtt ttggctttca gct 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1206R-RTPCR
<400> 15
tcttcaaatc cctgtccacg at 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1466F-RTPCR
<400> 16
atgagcacct accaagacga t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1466R-RTPCR
<400> 17
tagttctcgt accatcccca c 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1742F-RTPCR
<400> 18
tcgttggaat cttgcgttga tag 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 1742R-RTPCR
<400> 19
tcaagaagca aagcgcaacc aat 23
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2582F-RTPCR
<400> 20
ctgcaggtca aaaggctgta t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2582R-RTPCR
<400> 21
tccggtgatg tagttggagt t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2632F-RTPCR
<400> 22
tcaaaatacc cgtcactcca c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2632R-RTPCR
<400> 23
tatccgtaga gcaagtgagc t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2704F-RTPCR
<400> 24
tatccgccac aactgaggaa g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2704R-RTPCR
<400> 25
taaactcctt cacagcctcc g 21
<210> 26
<211> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2899F-RTPCR
<400> 26
ttgcggaatg ataggagtgt gta 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 2899R-RTPCR
<400> 27
tagttatggt ggcagttgat gc 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 16SrRNA_F
<400> 28
gctggcaaca taagacaagg 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 16SrRNA_R
<400> 29
gcataacttg agtgctgtag g 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0350F
<400> 30
ttgtgcagat gtcctggaat ac 22
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0350R
<400> 31
ccggattggt gtatgaaaaa taa 23
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0697F
<400> 32
cgaaggtgtt cctcatggat 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for 0697R
<400> 33
gagttcgttg agcgttacct g 21
Claims (16)
- 프로모터 활성을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 는 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액에 존재하는 자가유도체(autoinducer)에 의해 조절되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움 글루나미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제2항에 있어서, 상기 자가유도체는 비단백질성이며 저온 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 아실트랜스퍼라제(acyltransferase; NCgl0350)를 암호화하는 유전자의 상단부에 위치하는 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 목적 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
- 제6항에 있어서, 상기 목적 유전자는 리포터 유전자인 유전자 컨스트럭트.
- 제6항에 있어서, 상기 목적 유전자는 아실트랜스퍼라제(acyltransferase; NCgl0350)를 암호화하는 유전자인 유전자 컨스트럭트.
- 제6항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
- 제9항의 재조합 벡터가 숙주 미생물로 형질전환된 형질전환체.
- 제10항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 코리네형 박테리아(Coryneform bacteria), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)과 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질전환체.
- 제11항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 코리네형 박테리아인 형질전환체.
- 1) 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;
2) 자가유도체 후보물질을 포함하는 배양액인 실험군 및 일반 배양액인 대조군에서 상기 단계 1)의 형질전환체를 각각 배양하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군 및 대조군에서 상기 형질전환체의 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및,
4) 단계 3)에서 상기 형질전환체의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높은 자가유도체 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 자가유도체를 스크리닝하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 단계 2)의 자가유도체 후보물질을 포함하는 배양액은 정지기까지 배양된 박테리아의 무세포 배양액인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움 글루나미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 1) 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 1을 제조하는 단계;
2) 후보 전사 조절자 및 이에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 2를 제조하는 단계;
3) 자가유도체를 포함하는 배양액인 실험군 및 일반 배양액인 대조군에서 상기 단계 1) 및 단계 2)의 형질전환체 1 및 형질전환체 2를 각각 배양하는 단계;
4) 단계 3)의 실험군 및 대조군에서 상기 형질전환체 1 및 형질전환체 2의 리포터 유전자 활성을 각각 측정하는 단계; 및,
5) 단계 4)에서 상기 형질전환체 1의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높고, 상기 형질전환체 2의 리포터 유전자 활성이 대조군보다 실험군에서 높은 후보 전사 조절자를 선별하는 단계를 포함하는, 자가유도체에 의한 전사 조절자를 스크리닝하는 방법.
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