KR20110085980A - Clarification process at higher cell density - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 브로쓰와 음이온 교환 물질을 접촉시키고, 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하며, 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리함으로써, 세포 브로쓰에서 전체적인 양전하를 갖는 원하는 분비된 생물학적 물질 및 포유동물 세포를 함유하는 세포 브로쏘의 정화 방법으로서, 상기 세포가 높은 세포 밀도로 존재하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 상기 단계를 수행한 후, 상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출함으로써, 세포 브로쓰에서 전체적인 양전하를 갖는 원하는 분비된 생물학적 물질을 생성하는 높은 세포 밀도로 포유동물 세포를 함유하는 세포 브로쓰로부터의 원하는 분비된 생물학적 물질의 회수 방법에 관한 것이다.The present invention allows for sufficient incubation time to contact the cell broth with the anion exchange material, to form the cell pellet and the supernatant layer, and to separate the resulting cell pellet from the supernatant layer, thereby producing a desired secretion with overall positive charge in the cell broth. A method for the purification of cell broths containing biological material and mammalian cells, the present invention relates to a method in which said cells are present at high cell density. The present invention further contains mammalian cells at a high cell density which, after performing the above steps, extracts the desired secreted biological material from the supernatant layer, thereby producing the desired secreted biological material with the overall positive charge in the cell broth. To a method for recovering the desired secreted biological material from the cell broth.
Description
본 발명은 세포 브로쓰 (cell broth) 의 정화 방법, 및 원하는 분비된 생물학적 물질을 생성하는 세포를 함유하는 세포 브로쓰로부터의 원하는 분비된 생물학적 물질의 회수 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for purifying cell broth and a method for recovering a desired secreted biological material from a cell broth containing cells producing a desired secreted biological material.
제약, 특히 단일클론 항체와 같은 생물학적 물질의 발효 생성으로, 생물학적 물질이 다수의 단계로 단리되고 정제되어야 하는 복합 세포 브로쓰를 산출한다.Fermentation production of biological materials, such as pharmaceuticals, in particular monoclonal antibodies, yields complex cell broths in which the biological material must be isolated and purified in multiple steps.
제 1 단계로서, 세포 및 세포 잔해와 같은 고형 물질이 세포 브로쓰 유체로부터 분리되어야 하고 - 이 단계를 정화라고 칭한다. 다수의 경우, 생물학적 물질은 세포외에 존재하고, 따라서 세포 브로쓰 유체에 존재할 것이다.As a first step, solid materials such as cells and cell debris must be separated from the cell broth fluid-this step is called purification. In many cases, the biological material is extracellular and therefore will be present in the cellular broth fluid.
지금까지 사용된 정화 방법의 예에는 원심분리, 여과 (예컨대, 정밀여과, 심층 여과 및 절대 세공 크기 막을 통한 여과) 및 팽창층 크로마토그래피가 포함된다. 응집은 임의의 상기 정화 방법을, 특히 여과와 조합된 방법을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.Examples of purification methods used to date include centrifugation, filtration (eg, microfiltration, deep filtration, and filtration through absolute pore size membranes) and expanded bed chromatography. Agglomeration can be used to enhance any of the above purification methods, especially those combined with filtration.
이러한 목적을 위한 공지된 응집제는 단순 전해질에서부터 합성 폴리-전해질 (예컨대, DEAE 덱스트란, 아크릴-기재의 중합체, 폴리에틸렌 아민) 또는 무기 물질 (예컨대, 규조토 또는 펄라이트) 까지 다양할 수 있다. 최근 이러한 목적을 위해 키토산의 사용이 개발되었다.Known flocculants for this purpose can range from simple electrolytes to synthetic poly-electrolytes (eg DEAE dextran, acrylic-based polymers, polyethylene amines) or inorganic materials (eg diatomaceous earth or pearlite). Recently, the use of chitosan has been developed for this purpose.
다수의 응집제 사용의 단점은, 특히, 이들이 관심있는 원하는 생물학적 물질을 결합할 수 있다는 것, 이들이 관심있는 원하는 생물학적 물질을 비활성화시킬 수 있다는 것, 응집 과정이 너무 오래 걸린다는 것 및/또는 응집제가 의학 용도에 필요한 고품질로 제조하기 위해 어렵거나 고비용일 수 있다는 것이다. 또한, 응집제는 최종 정제된 분자로부터 제거되어야 하는데, 이 방법은 이의 제거를 확인하기 위해 고비용이고 시간이 걸리는 분석 검정이 필요하다.The disadvantages of using multiple flocculants are, in particular, that they can bind the desired biological material of interest, that they can deactivate the desired biological material of interest, that the flocculation process takes too long and / or that the flocculant is medical It can be difficult or expensive to manufacture with the high quality required for the application. In addition, flocculants must be removed from the final purified molecule, which requires expensive and time-consuming assays to confirm their removal.
본 발명에 따른 방법은 상기 단점 중 어느 것도 갖지 않는다.The method according to the invention has none of the above disadvantages.
더욱이, 이러한 존재하는 방법은 비교적 낮은 세포 밀도에서만 정화를 달성한다는 것을 나타냈다. 또한, 상기 방법 중 대부분은 성공적으로 포유동물 세포, 특히 원하는 분비된 생물학적 물질을 생성하는 포유동물 세포에 적용된다는 것을 나타내지 않았다.Moreover, this existing method has been shown to achieve clarification only at relatively low cell densities. In addition, most of these methods have not been shown to be successfully applied to mammalian cells, particularly mammalian cells that produce the desired secreted biological material.
본 발명의 목적은 생물반응기로부터 수확되고 포유동물 세포 및 원하는 분비된 생물학적 물질을 함유하는 세포 브로쓰의 비용-효율적인 정화 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a cost-effective purification method of cell broth harvested from a bioreactor and containing mammalian cells and the desired secreted biological material.
본 발명의 추가 목적은 높은 세포 밀도에서 포유동물 세포를 함유하는 세포 브로쓰의 정화 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for purifying cell broths containing mammalian cells at high cell densities.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계로, 포유동물 세포 및 배양 배지뿐만 아니라 세포 브로쓰에서 전체적인 양전하를 갖는 원하는 분비된 생물학적 물질을 함유하는 세포 브로쓰의 정화 방법으로서, 상기 세포가 15 × 106 세포/㎖ 이상의 초기 세포 밀도로 존재하는 방법에 관한 것이다:In certain embodiments, the present invention provides a method of purifying a cell broth containing the desired secreted biological material having a globally positive charge in the cell broth as well as mammalian cells and culture medium, wherein the cells are 15 × 10. A method of presenting at an initial cell density of at least 6 cells / ml:
a. 세포 브로쓰와 입자성 음이온 교환 물질을 접촉시키는 단계,a. Contacting the cell broth with the particulate anion exchange material,
b. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계, 및b. Allowing sufficient incubation time to form cell pellet and supernatant layers, and
c. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계.c. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer.
미국 특허 출원 2003/170810 에는, 회분식으로 음이온 교환 수지와 용해물을 혼합한 후 여과, 원심분리 또는 비중 분리를 통해 가용성 물질로부터 불용성 물질 (수지 및 이에 결합된 것들, 세포 및 세포 잔해 포함) 을 분리함으로써 미정제 세포 용해물을 정화하는 방법이 기재되어 있다. 상기 미국 특허 출원의 개시내용과 달리, 본 발명에 따르면, 세포가 용해되지 않은 후, 이들을 음이온 교환 수지와 혼합하고, 정화가 특히 높은 세포 밀도에서 일어나며, 세포 브로쓰 중 원하는 생물학적 물질이 전체적인 양전하를 가진다. 놀랍게도 본 발명에 따르면 정화가 높은 세포 밀도의 세포 브로쓰로 달성될 수 있다고 여겨진다.U.S. Patent Application 2003/170810 discloses the separation of insoluble materials (including resins and their bounds, cells and cell debris) from soluble materials by batch mixing anion exchange resins and lysates followed by filtration, centrifugation or specific gravity separation. A method of purifying crude cell lysate is described. Contrary to the disclosure of the above U.S. patent application, according to the present invention, after cells are not lysed, they are mixed with an anion exchange resin, clarification occurs at a particularly high cell density, and the desired biological material in the cell broth is responsible for the overall positive charge. Have It is surprisingly believed that according to the present invention purification can be achieved with high cell density cell broth.
본 발명의 본문에서, "세포 브로쓰" 는 온전한 포유동물 세포로 접종된 세포 배양액을 의미하고, 이는 추가로 이하에 정의되는 배양 배지뿐만 아니라 분비된 생물학적 물질을 함유할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 특히 세포 밀도가 매우 높은 경우, 생물반응기로부터의 출발 물질을 바람직한 세포 밀도로 희석시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 이와 같이 희석된 물질은 여전히 용어 세포 브로쓰에 포함된다.In the context of the present invention, "cell broth" means a cell culture inoculated with intact mammalian cells, which may further contain secreted biological material as well as culture medium as defined below. In the process of the invention, it may be desirable to dilute the starting material from the bioreactor to the desired cell density, especially when the cell density is very high. For the purposes of the present invention, such diluted substances are still included in the term cell broth.
"분비된 생물학적 물질" 은 본원에서 포유동물 세포에 의한 생성시 배양 배지로 주로 배출되는 (능동적으로 또는 수동적으로) 생물학적 물질을 의미한다.By "secreted biological material" is meant herein a biological material that is mainly released (actively or passively) into the culture medium upon production by mammalian cells.
"원하는" 은 본원에서 생물학적 물질이 포유동물 세포를 사용하여 의도적으로 생성되는 것을 의미한다."Want" means herein that the biological material is intentionally produced using mammalian cells.
원하는 분비된 생물학적 물질의 "전체적인 양전하" 는 본원에서 세포 브로쓰 중 용매 조건 하의 생물학적 물질 상의 양전하 및 음전하 이온발생기의 정전기적 기여가 순 양전하를 생성하는 것을 의미한다. 생물학적 물질의 전체적인 전하는 산성 및 염기성 잔기의 pKa 및 용액의 pH - 이 경우 세포 브로쓰의 pH 에 기초한다. 생물학적 물질이 세포 브로쓰에서 순 양전하를 갖기 위해서는, 물질의 pI (순 전하가 0 인 pH) 는 세포 브로쓰의 pH 보다 높아야 한다.By "total positive charge" of the desired secreted biological material is meant herein the electrostatic contribution of the positive and negatively charged ionizers on the biological material under solvent conditions in the cell broth to produce a net positive charge. The overall charge of the biological material is based on the pKa of acidic and basic residues and the pH of the solution-in this case the pH of the cell broth. In order for a biological material to have a net positive charge in the cell broth, the pI (the pH at which the net charge is zero) of the material must be higher than the pH of the cell broth.
"배양 배지" 는 본원에서 세포의 세포외 환경을 의미하고, 이는 영양분, 및 세포의 성장 및 생성을 지지하는 기타 성분을 함유하나, 또한 노폐물 또는 숙주 세포 단백질 (HCP) 또는 용해된 세포로부터의 물질을 함유할 수 있다. 배양 배지의 조성은 세포의 배양 과정 동안 변할 수 있고, 정화 단계에서 하나 이상의 원래의 구성성분이 매우 감소할 수 있다."Culturing medium" refers herein to the extracellular environment of a cell, which contains nutrients and other ingredients that support the growth and production of cells, but also from waste products or host cell proteins (HCP) or lysed cells It may contain. The composition of the culture medium may vary during the culturing process of the cells, and at least one original component may be greatly reduced in the clarification step.
"접촉" 은 본원에서 음이온 교환 물질을 세포 브로쓰에 도입하고 세포를 침강시키는 것 (예, 중력 하 또는 원심분리로) 을 의미한다."Contact" herein means introducing an anion exchange material into a cell broth and settling the cell (eg, under gravity or by centrifugation).
"음이온 교환 물질" 은 본원에서 입자성 약한 또는 강한 음이온 교환 크로마토그래피 매질을 의미한다. 음이온 교환 물질은 일반적으로 담체를 포함하고, 상기 담체는 유기 물질 또는 무기 물질 또는 유기 및 무기 물질의 혼합물일 수 있다. 적합한 유기 물질은 아가로오스 기재의 매질 및 메타크릴레이트이다. 적합한 무기 물질은 실리카, 세라믹 및 금속이다. 입자는 바람직하게는 크기가 15 내지 150 ㎛ 일 수 있다. 더욱 바람직하게는 이의 크기는 15 내지 70 ㎛ 이다. 입자는 세포 브로쓰로부터 세포를 비교적 신속하게 침강시키는데 적합한 밀도를 가질 수 있으나, 너무 밀집한 입자가 침강되지 않는다는 것을 관찰하기 때문에 밀도가 너무 높으면 안된다."Anion exchange material" means herein a particulate weak or strong anion exchange chromatography medium. Anion exchange materials generally comprise a carrier, which may be an organic or inorganic material or a mixture of organic and inorganic materials. Suitable organic materials are agarose based media and methacrylates. Suitable inorganic materials are silica, ceramics and metals. The particles may preferably be 15 to 150 μm in size. More preferably its size is from 15 to 70 μm. The particles may have a density suitable to settle cells relatively quickly from the cell broth, but the density should not be too high because it observes that too dense particles do not settle.
"적당한 인큐베이션 시간" 은 본원에서 세포의 침전이 분명한 세포 펠렛 부피 및 상청액 층을 생성하는 시간을 의미한다.“Moderate incubation time” means herein the time for cell precipitation to produce a clear cell pellet volume and supernatant layer.
"분리" 는 본원에서, 예컨대 상청액을 디켄팅 또는 드로잉 아웃시켜, 또는 예를 들어 바닥의 포트를 통해 관으로부터 펠렛을 빼내어, 세포 펠렛으로부터 상청액을 제거하기 위한 임의의 방법을 의미한다."Separation" means herein any method for removing the supernatant from cell pellets, such as by decanting or drawing out the supernatant, or withdrawing pellet from a tube, for example, through a port in the bottom.
"상청액 층" 은 침강의 결과로서 위에 놓인 부피의 액체이다. 상청액 층은 여전히 초기 세포 밀도보다 상당히 낮은 세포 밀도로 세포를 함유할 수 있다 (일반적으로 함유할 것임).A "supernatant layer" is a volume of liquid superimposed as a result of sedimentation. The supernatant layer may still contain (usually will) cells at a cell density significantly lower than the initial cell density.
본 발명의 방법에 대한 초기 세포 밀도는 15 × 106 세포/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는 80 × 106 세포/㎖ 이상이다. 실제 상한으로서, 본 발명에 따른 방법은 175 × 106 세포/㎖ 이하, 더욱 바람직하게는 130 × 106 세포/㎖ 이하의 세포 밀도로 수행될 수 있다.The initial cell density for the method of the present invention is at least 15 × 10 6 cells / ml, more preferably at least 80 × 10 6 cells / ml. As a practical upper limit, the method according to the invention can be carried out at a cell density of 175 × 10 6 cells / ml or less, more preferably 130 × 10 6 cells / ml or less.
세포 밀도는 Vi-CELL™ (트리판 블루 배제 방법 이용) 과 같은 세포 계수기를 사용하여 측정될 수 있으나, 다른 적합한 방법에는 세포계수, 압축 세포 용적 측정 또는 콜터 계수기 (Electrical Sensing Zone Method 이용) 가 포함된다.Cell density can be measured using a cell counter such as Vi-CELL ™ (using trypan blue exclusion method), but other suitable methods include cell count, compressed cell volume measurement or Coulter counter (using Electrical Sensing Zone Method). do.
초기 세포 밀도가 130 × 106 세포/㎖ 초과인 경우, 우선 세포 브로쓰를 희석시키는 것이 바람직하다. 실제로, 초기 세포 밀도가 100 × 106 세포/㎖ 초과인 세포 브로쓰가 우선 희석되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 80 × 106 세포/㎖ 이하의 세포 밀도로 희석될 수 있다. 세포 브로쓰는 포유동물 세포의 용해를 야기하지 않도록 세포의 환경을 크게 변화시키지 않는 용액, 즉 PBS 와 같은 등장성 용액으로 희석될 수 있다.If the initial cell density is greater than 130 × 10 6 cells / ml, it is preferred to first dilute the cell broth. Indeed, it is preferred that cell broth with an initial cell density greater than 100 x 10 6 cells / ml be first diluted. Preferably it can be diluted to a cell density of 80 x 10 6 cells / ml or less. The cell broth may be diluted with a solution that does not significantly change the environment of the cell, ie, an isotonic solution such as PBS, so as not to cause lysis of mammalian cells.
추가 구현예에 따르면, 본 발명은 하기 단계로, 세포 브로쓰 중 전체적인 양전하를 갖는 원하는 분비된 생물학적 물질을 생성하는 세포를 함유하는 세포 브로쓰로부터의 원하는 분비된 생물학적 물질의 회수 방법으로서, 상기 세포 브로쓰 중 세포가 15 × 106 세포/㎖ 이상의 초기 세포 밀도의 포유동물 세포인 회수 방법에 관한 것이다:According to a further embodiment, the present invention provides a method of recovering a desired secreted biological material from a cell broth containing cells that produce a desired secreted biological material having a total positive charge in the cell broth, the cell comprising: A method of recovery wherein the cells in the broth are mammalian cells with an initial cell density of at least 15 × 10 6 cells / ml:
a. 세포 브로쓰와 입자성 음이온 교환 물질을 접촉시키는 단계,a. Contacting the cell broth with the particulate anion exchange material,
b. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계,b. Allowing sufficient incubation time to form the cell pellet and supernatant layer,
c. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계, 및c. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer, and
d. 상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출하는 단계.d. Extracting the desired secreted biological material from the supernatant layer.
"회수" 는 본원에서 본질적으로 부산물 및 노폐물이 없는 원하는 생성물을 수득하는 것을 의미한다."Recovery" means herein to obtain the desired product which is essentially free of by-products and wastes.
본 발명은 추가로 상기 기재된 바와 같은 원하는 분비된 생물학적 물질을 생성하는 세포를 함유하는 세포 브로쓰로부터의 원하는 분비된 생물학적 물질의 회수 방법으로서, 상기 세포 브로쓰 중 세포가 15 × 106 세포/㎖ 이상의 초기 세포 밀도의 포유동물 세포이고, 생성된 세포 펠렛이 추가로 하기 단계로 처리되는 방법에 관한 것이다:The present invention further provides a method of recovering a desired secreted biological material from a cell broth containing cells producing a desired secreted biological material as described above, wherein the cells in said cell broth are 15 × 10 6 cells / ml. Mammalian cells of the above initial cell density, and the resulting cell pellet is further processed to the following steps:
e. 생성된 세포 펠렛을 재현탁하는 단계,e. Resuspending the resulting cell pellet,
f. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계,f. Allowing sufficient incubation time to form the cell pellet and supernatant layer,
g. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계 및g. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer and
h. 상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출하는 단계.h. Extracting the desired secreted biological material from the supernatant layer.
본 발명에 따른 추가의 방법에서, 상기 방법의 단계 e 내지 h 는 1 회 이상 반복된다.In a further method according to the invention, steps e to h of the method are repeated one or more times.
본 발명에 따른 추가의 바람직한 방법에서, 생성된 세포 펠렛은 포유동물 세포의 용해를 야기하지 않도록 세포의 환경을 크게 변화시키지 않는 용액, 예컨대 염 수용액 (바람직하게는 등장성), 더욱 바람직하게는 PBS 에 재현탁된다.In a further preferred method according to the invention, the resulting cell pellets are added to a solution which does not significantly change the environment of the cells such as to cause lysis of mammalian cells, such as an aqueous solution of salt (preferably isotonic), more preferably PBS. Resuspend.
바람직하게는 상청액 층은 수집되고, 원하는 분비된 생물학적 물질은 풀링된 (pooled) 상청액으로부터 추출된다.Preferably the supernatant layer is collected and the desired secreted biological material is extracted from the pooled supernatant.
포유동물 세포의 예에는 CHO (중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK (새끼 햄스터 신장) 세포, 골수종 세포, 인간 세포, 예를 들어 HEK-293 세포, 인간 림프모 세포, E1 불멸화된 HER 세포, 마우스 세포, 예를 들어 NS0 세포가 포함된다. 더욱 바람직하게는, E1 불멸화된 HER 세포, 가장 바람직하게는 PER.C6 세포가 사용된다.Examples of mammalian cells include CHO (Chinese hamster ovary) cells, hybridomas, BHK (cub hamster kidney) cells, myeloma cells, human cells, eg HEK-293 cells, human lymphoblasts, E1 immortalized HER cells , Mouse cells, such as NS0 cells. More preferably, El immortalized HER cells, most preferably PER.C6 cells, are used.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법의 세포는 E1-불멸화된 HER 세포, 더욱 바람직하게는 PER.C6 세포 (미국 특허 5,994,128 참조, 이의 내용은 본원에 참고로서 포함됨) 이다. PER.C6 세포는 ECACC 번호 96022940 로 기탁된 세포로 예시된다 (예를 들어, 미국 특허 5,994,128, EP 0833934 B1 참조, 이들 내용은 본원에 참고로서 포함됨).In a preferred embodiment, the cells of the methods of the invention are E1-immortalized HER cells, more preferably PER.C6 cells (see US Pat. No. 5,994,128, the contents of which are incorporated herein by reference). PER.C6 cells are exemplified as cells deposited under ECACC No. 96022940 (see, eg, US Pat. No. 5,994,128, EP 0833934 B1, the contents of which are incorporated herein by reference).
정화를 위한 세포 브로쓰는 15 × 106 세포/㎖ 이상의 포유동물 세포의 세포 밀도에 이르는데 적합한 임의의 세포 배양 방법에 의해 수득될 수 있다. 이에 대해 적합한 방법은 예를 들어 WO2005095578, WO2004099396 및 WO2008006494 에 기재되어 있다. 이들 내용은 참고로서 본원에 포함된다.Cell broth for clarification can be obtained by any cell culture method suitable for reaching cell densities of mammalian cells of at least 15 × 10 6 cells / ml. Suitable methods for this are described for example in WO2005095578, WO2004099396 and WO2008006494. These contents are incorporated herein by reference.
본 발명에 따라 세포에 의해 (예를 들어, 그러므로 (재조합) 유전자 코딩을 발현하여) 생성될 수 있는 생물학적 물질은 예를 들어 바이러스 또는 (재조합) 단백질, 특히 수용체, 효소, 융합 단백질, 혈액 응집 캐스케이드로부터의 단백질과 같은 혈액 단백질, 예를 들어 에리트로포이에틴과 같은 다기능성 단백질, 예를 들어 백신용 바이러스 또는 세균 단백질; 예를 들어 IgG 또는 IgM 과 같은 면역글로불린 등이다. 바람직하게는 단백질, 더욱 바람직하게는 면역글로불린 또는 이의 부분은 세포에 의해 생성된다. 바람직하게는, 세포에 의해 생성되는 단백질 또는 백신과 같은 생물학적 물질은 약학적 제제에서 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 본문에서, 용어 '생성물' 및 '생물학적 물질' 은 교체가능하다.Biological substances that can be produced by the cell (eg, thus expressing (recombinant) gene coding) according to the invention are for example viral or (recombinant) proteins, in particular receptors, enzymes, fusion proteins, blood aggregation cascades. Blood proteins such as proteins from, for example, multifunctional proteins such as erythropoietin, eg viral or bacterial proteins for vaccines; For example immunoglobulins such as IgG or IgM. Preferably the protein, more preferably the immunoglobulin or part thereof, is produced by the cell. Preferably, biological substances such as proteins or vaccines produced by the cells can be used as active ingredients in pharmaceutical preparations. In the context of the present invention, the terms 'product' and 'biological material' are interchangeable.
상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출하는데 적합한 방법은 예를 들어 여과 (예컨대, 심층 여과, 정밀여과, 한외여과, 정용여과), 크로마토그래피 (예컨대, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피), 수성 2-상 추출, 침전 또는 원심분리이다. 유리하게는, 원하는 생물학적 물질은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 매우 효과적으로 추출될 수 있다. 원하는 생물학적 물질로서의 면역글로불린의 경우, 친화성 크로마토그래피, 특히 단백질 A 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피가 특히 적합한 분리 방법이다.Suitable methods for extracting the desired secreted biological material from the supernatant layer include, for example, filtration (eg, deep filtration, microfiltration, ultrafiltration, diafiltration), chromatography (eg, size exclusion chromatography, affinity chromatography, cation). Exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, immobilized metal affinity chromatography), aqueous two-phase extraction, precipitation or centrifugation. Advantageously, the desired biological material can be extracted very effectively by cation exchange chromatography. For immunoglobulins as desired biological materials, affinity chromatography, in particular Protein A chromatography and cation exchange chromatography, are particularly suitable separation methods.
도 1. Si-PEI 를 이용한 초기 침강 및 후속의 PBS 를 이용한 세척 단계 후의 생성물의 회수
(a) 다양한 음이온 교환 물질에 대한 시간에 따른 상청액 세포 밀도.
(b) 다양한 음이온 교환 물질에 대한 시간에 따른 상청액 부피.Figure 1. Recovery of product after initial settling with Si-PEI and subsequent washing with PBS
(a) Supernatant cell density over time for various anion exchange materials.
(b) Supernatant volume over time for various anion exchange materials.
실시예Example
기호:sign:
Xt = 총 세포 밀도, 세포/㎖X t = total cell density, cell / ml
Si-PEI = Bakerbond Wide-Pore PEI (폴리에틸렌이민) Prep LC 패킹 그래프팅된 실리카 비드 (JT Baker)Si-PEI = Bakerbond Wide-Pore PEI Prep LC Packing Grafted Silica Beads (JT Baker)
DEAE Hyper D = 디에틸아미노에틸 그래프팅된 세라믹 비드 (Pall)DEAE Hyper D = diethylaminoethyl grafted ceramic beads (Pall)
Streamline DEAE = 디에틸아미노에틸 그래프팅된 아가로오스 비드 (GE Healthcare)Streamline DEAE = diethylaminoethyl grafted agarose beads (GE Healthcare)
PrA HPLC = 분석적 단백질 A 고압 액체 크로마토그래피.PrA HPLC = Analytical Protein A High Pressure Liquid Chromatography.
PBS = 포스페이트 완충 염수PBS = phosphate buffered saline
하기 정화 실험을 다양한 세포 밀도의 PER.C6® 세포로 하였고, WO2008006494 에 나타낸 절차에 따라 제조하였다. PER.C6® 세포는 항체를 생성하였다. 상청액 층 중 항체의 농도를 PrA HPLC 로 측정하였다. 필요시, 즉 세포 밀도가 너무 높은 경우 농도를 바이오매스에 대해 보정하였고, 세포는 작업 부피에 상당히 기여했다.The following clarification experiments were performed with PER.C6® cells of various cell densities and prepared according to the procedure shown in WO2008006494. PER.C6® cells produced antibodies. The concentration of antibody in the supernatant layer was measured by PrA HPLC. If necessary, ie if the cell density was too high, the concentration was corrected for biomass and the cells contributed significantly to the working volume.
실시예Example 1. 낮은 세포 밀도를 이용한 정화. 1. Purification with low cell density.
10 ㎖ 의 세포 배양액을 함유하는 개별 바이알에 상이한 양의 Si-PEI 를 첨가하였다. Xt = 4.3 × 106 세포/㎖. 세포를 15 분 동안 침강시켰다. 단지 5 % (vol) 의 Si-PEI 가 97 % 의 세포를 침강시키는데 필요했다. 10 % (vol) 의 Si-PEI 를 첨가하여 99 % 의 세포를 침강시켰다. 생성물 회수는 100 % 였다.Different amounts of Si-PEI were added to individual vials containing 10 ml of cell culture. X t = 4.3 × 10 6 cells / ml. The cells were allowed to settle for 15 minutes. Only 5% (vol) of Si-PEI was needed to settle 97% of cells. 10% (vol) of Si-PEI was added to settle 99% of cells. Product recovery was 100%.
Si-PEI 의 첨가로 세포를 침강시키는데 필요한 시간을 매우 감소시켰다. 또한, Si-PEI 의 첨가는 대조군 (Si-PEI 첨가하지 않음) 에 비해 더욱 조밀한 펠렛을 생성하였다.The addition of Si-PEI greatly reduced the time required to settle the cells. In addition, addition of Si-PEI produced more dense pellets compared to the control (no addition of Si-PEI).
실시예Example 2. 중간 세포 밀도를 이용한 정화. 2. Purification using medium cell density.
5 ㎖ 의 세포 배양액을 함유하는 개별 바이알에 상이한 양의 Si-PEI 를 첨가하였다. Xt = 63.5 × 106 세포/㎖. 세포를 30 분 동안 침강시켰다. 5 % (vol) 의 Si-PEI 가 87 % 의 세포를 침강시켰다. 10 % (vol) 의 Si-PEI 를 첨가하여 89 % 의 세포를 침강시켰다. 20 % (vol) 의 Si-PEI 를 첨가하여 85 % 의 세포를 침강시켰다. 각각의 경우, 생성된 세포 밀도는 10 × 106 세포/㎖ 미만이었고, 이는 심층 여과에 적합한 공급물이다. 생성물 회수는 97 % 였다.Different amounts of Si-PEI were added to individual vials containing 5 ml of cell culture. X t = 63.5 × 10 6 cells / ml. The cells were allowed to settle for 30 minutes. 5% (vol) of Si-PEI precipitated 87% of cells. 89% of the cells were allowed to settle by adding 10% (vol) of Si-PEI. 85% of the cells were allowed to settle by adding 20% (vol) of Si-PEI. In each case, the resulting cell density was less than 10 × 10 6 cells / ml, which is a suitable feed for deep filtration. Product recovery was 97%.
Si-PEI 의 첨가로 세포를 침강시키는데 필요한 시간을 매우 감소시켰다. 또한, Si-PEI 의 첨가는 대조군 (Si-PEI 첨가하지 않음) 에 비해 더욱 조밀한 펠렛을 생성하였다.The addition of Si-PEI greatly reduced the time required to settle the cells. In addition, addition of Si-PEI produced more dense pellets compared to the control (no addition of Si-PEI).
실시예Example 3. 높은 세포 밀도를 이용한 정화 3. Purification using high cell density
10 % (vol) 의 Si-PEI 를 345 ㎖ 의 세포 배양 브로쓰에 첨가하였다. Xt = 123 × 106 세포/㎖. 높은 세포 밀도로 인해 2 시간 동안 침강시켰다. 상기 2 시간 후, 생성된 상청액 중 세포 밀도는 13.6 × 106 세포/㎖ 였다. 펠렛 부피는 총 부피의 53 % 였다 (Si-PEI 를 첨가하지 않은 대조군에 대해서는 93 %). 상청액을 디켄팅하고, 펠렛을 등장성 PBS 로 2 회 세척하고, 각 세척 후에 1 시간 동안 침강시켰다. 생성물 회수는 2 회 세척 후 93 % 였다. 총 처리 시간은 4 시간이었다. 상청액을 풀링한 후, 최종 처리 부피는 600 ㎖ 이고, 세포 밀도는 9.9 × 106 세포/㎖ 였다.10% (vol) of Si-PEI was added to 345 ml of cell culture broth. X t = 123 x 10 6 cells / ml. It settled for 2 hours due to the high cell density. After 2 hours, the cell density in the resulting supernatant was 13.6 × 10 6 cells / ml. The pellet volume was 53% of the total volume (93% for the control without addition of Si-PEI). The supernatant was decanted and the pellet washed twice with isotonic PBS and allowed to settle for 1 hour after each wash. Product recovery was 93% after two washes. Total treatment time was 4 hours. After pooling the supernatant, the final treatment volume was 600 ml and the cell density was 9.9 × 10 6 cells / ml.
실시예Example 4. 반복된 세척에 의한 생성물 회수의 최대화 4. Maximize product recovery by repeated washing
10 % (vol) 의 Si-PEI 를 345 ㎖ 의 세포 배양 브로쓰에 첨가하였다. Xt = 78 × 106 또는 120 × 106 세포/㎖. 약 200 ㎖ 의 상청액 층을 초기 침강 후 디켄팅하였다. 이 부피를 동일한 부피의 PBS 로 대체하고, 세포를 60 분 동안 침강시켰다. 약 200 ㎖ 의 상청액 층을 다시 디켄팅하고, 동일한 부피의 PBS 로 대체한 후 60 분 동안 침강시켰다. 그리고, 200 ㎖ 의 상청액 층을 다시 디켄팅하였다.10% (vol) of Si-PEI was added to 345 ml of cell culture broth. X t = 78 × 10 6 or 120 × 10 6 cells / ml. About 200 mL of the supernatant layer was decanted after initial settling. This volume was replaced with an equal volume of PBS and the cells were allowed to settle for 60 minutes. About 200 mL of the supernatant layer was decanted again and replaced with an equal volume of PBS and allowed to settle for 60 minutes. Then, 200 ml of the supernatant layer was decanted again.
수회의 세척 단계를 통한 생성물 회수를 도 1 에 요약한다. 결과는 단지 2 회 세척 단계 후 상청액으로부터 생성물을 수집함으로써 매우 상당한 생성물 회수의 향상을 나타냈다.Product recovery through several washing steps is summarized in FIG. 1. The results showed a very significant improvement in product recovery by collecting the product from the supernatant after only two wash steps.
실시예Example 5. 높은 세포 밀도 및 다양한 음이온 교환 물질을 이용한 정화 5. Purification using high cell density and various anion exchange materials
10 % (vol) 의 음이온 교환 물질 Si-PEI, DEAE Hyper D 또는 Streamline DEAE 를 20 ㎖ 의 세포 배양 브로쓰의 샘플에 첨가하였고, 초기 Xt 는 123 × 106 세포/㎖ 였다.10% (vol) of anion exchange material Si-PEI, DEAE Hyper D or Streamline DEAE was added to a sample of 20 ml of cell culture broth and the initial X t was 123 × 10 6 cells / ml.
세포를 2 시간 동안 침강시켰다.The cells were allowed to settle for 2 hours.
도 2a 는 음이온 교환 물질 각각에 대한 시간에 따른 상청액 중 세포 밀도 및 음이온 교환 물질이 첨가되지 않은 대조군의 세포 밀도를 나타낸다.FIG. 2A shows the cell density in the supernatant over time for each of the anion exchange material and the cell density of the control without an anion exchange material added.
도 2b 는 시간에 따른 상청액 부피를 나타낸다. 음이온 교환 물질을 첨가함으로써 더욱 조밀한 펠렛, 즉 증가한 상청액 부피를 생성하였다.2B shows the supernatant volume over time. The addition of anion exchange material produced more dense pellets, ie increased supernatant volume.
실시예Example 6. 매우 높은 세포 밀도를 이용한 정화 6. Purification with very high cell density
Xt = 150 × 106 세포/㎖ 의 수확으로 정화를 시도하였다. 희석되지 않은 수확을 갖는 이러한 세포 밀도에서 매우 적은 침강을 관찰하였다. PBS 로 세포 배양액을 1:1 로 희석시켜 침강을 용이하게 하였다. 이를 위해, 10 ㎖ 의 매질을 20 ㎖ 의 최종 부피로 희석시키고, 10 % (총 vol) Si-PEI 를 첨가하였다 (2 ㎖). 2 회 세척 후 생성물 회수는 92.6 % 였다. HCP 의 농도는 28 % 감소하였다. 총 처리 시간은 4 시간이었다. 상청액을 풀링한 후, 최종 처리 부피는 48 ㎖ (4.8 × 증가) 였고, 세포 밀도는 6.1 × 106 세포/㎖ 였다.Purification was attempted with a harvest of X t = 150 × 10 6 cells / ml. Very little settling was observed at this cell density with undiluted harvest. The cell culture was diluted 1: 1 with PBS to facilitate settling. To this end, 10 ml of medium was diluted to a final volume of 20 ml and 10% (total vol) Si-PEI was added (2 ml). Product recovery after 9 washes was 92.6%. The concentration of HCP was reduced by 28%. Total treatment time was 4 hours. After pooling the supernatant, the final treatment volume was 48 ml (4.8 × increase) and cell density was 6.1 × 10 6 cells / ml.
실시예Example 7. 원하는 생물학적 물질의 정제 7. Purification of the desired biological material
초기 세포 밀도가 175 × 106 세포/㎖ 인 세포 배양 수확물을 PBS (초기 부피 1.7 ℓ) 로 ~ 75 × 106 세포/㎖ 로 희석하였다. 희석 후 Si-PEI 크로마토그래피 매질을 수확물에 첨가하였다 (1 ℓ 의 희석된 수확물 당 0.1 ℓ 의 Si-PEI 수지). 세포를 ~60 분 동안 침강시켰다. 상청액을 함유하는 생성물을 디켄팅하고, 침강된 세포를 PBS 로 2 회 세척하였다. 2 회 세척과 함께 초기 상청액을 풀링하여 생성물 회수를 최대화하였다 (~ 95 %). 수합된 풀은 5 ×106 세포/㎖ 미만으로 함유하고, HCP 함량은 59 % 감소하였다.The initial cell density of 175 × 10 6 cells / ㎖ the cell culture harvest was diluted to ~ 75 × 10 6 cells / ㎖ in PBS (the initial volume of 1.7 ℓ). After dilution Si-PEI chromatography media was added to the harvest (0.1 L of Si-PEI resin per 1 L of diluted harvest). Cells were allowed to settle for ˜60 minutes. The product containing the supernatant was decanted and the precipitated cells were washed twice with PBS. Initial supernatant was pooled with two washes to maximize product recovery (˜95%). The pooled pools contained less than 5 × 10 6 cells / ml and the HCP content was reduced by 59%.
Si-PEI 침강 후 회수된 생성물을 추가로 심층 여과로 정제하였다. 심층 여과는 세포량의 추가 감소에 사용되는 1 차 필터 (통상적으로는 10 또는 5 ㎛ 세공 크기), 이어서 더욱 작은 입자를 제거하고 통상 구배 0.8/0.2 ㎛ 필터를 통해 무균 여과를 위해 정화된 수확물을 생성하는 2 차 필터 (통상적으로는 3 또는 1 ㎛ 세공 크기) 로 이루어진다. 심층 여과 트레인은 D0HC (1 차), 이어서 X0HC (2 차) 와 같은 매질을 함유하는 Millipore Millistak+HC 필터 또는 10M02 (1 차), 이어서 60ZA05A (2 차) 와 같은 매질을 함유하는 CUNO ZetaPlus 필터일 수 있다. 이러한 경우, 정화된 수확물은 0.8/0.2 ㎛ 필터 (Supor, Pall) 를 통해 추가 여과된다.The product recovered after Si-PEI sedimentation was further purified by deep filtration. Deep filtration removes the primary filter (typically 10 or 5 μm pore size) used for further reduction of cell volume, followed by removal of smaller particles and clarified harvest for aseptic filtration, usually through a gradient 0.8 / 0.2 μm filter. Resulting secondary filter (usually 3 or 1 μm pore size). The deep filtration train may be a Millipore Millistak + HC filter containing a medium such as D0HC (primary) followed by X0HC (secondary) or a CUNO ZetaPlus filter containing a medium such as 10M02 (primary) followed by 60ZA05A (secondary). Can be. In this case, the clarified harvest is further filtered through a 0.8 / 0.2 μm filter (Supor, Pall).
또한 심층 여과 동안 2 차 필터를 통해 85 % HCP 감소를 관찰하였다. 2 차 필터를 통한 HCP 의 감소는 이러한 필터의 전하 특성에 기여될 수 있었고, 문헌 (Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. 2006. Exploitation of the Adsorptive Properties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification. Biotechnology Progress 22(1):288-296) 에 이미 보고되어 있다.A 85% HCP reduction was also observed through the secondary filter during deep filtration. The reduction of HCP through the secondary filter could contribute to the charge characteristics of this filter, see Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. 2006. Exploitation of the Adsorptive Properties of Depth Filters for Host Cell Protein Removal during Monoclonal Antibody Purification.Biotechnology Progress 22 (1): 288-296).
정화된 물질을 추가로 GigaCap S (Tosoh) 와 같은 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 단일클론 항체 (생성물) 를 95 g/ℓ 초과의 크로마토그래피 매질의 용량으로 수지에 고정화시켰다. 항체 고정화에 사용된 조건은 다소 산성 (pH ~ 5.3) 이었고, 전도도가 ~4.5 mS/㎝ 였다. 결합한 후 항체를 평형 완충액으로 세척하고, 최종적으로 100 mM 염화나트륨을 함유하는 완충 단계로 용리시켰다. HCP 함량의 추가 감소 (78 %) 를 이 단계로 수득하였다.The clarified material was further purified by cation exchange chromatography such as GigaCap S (Tosoh). Monoclonal antibodies (products) were immobilized to the resin at a volume of chromatographic media of greater than 95 g / l. The conditions used for antibody immobilization were somewhat acidic (pH-5.3) and the conductivity was ˜4.5 mS / cm. After binding the antibodies were washed with equilibration buffer and finally eluted with a buffer step containing 100 mM sodium chloride. A further reduction in HCP content (78%) was obtained with this step.
필요한 순도 사양을 충족시킬 때까지 크로마토그래피와 여과 기술의 조합에 의해 용리된 항체를 추가 정제시킬 수 있다.Eluted antibodies can be further purified by a combination of chromatography and filtration techniques until the required purity specifications are met.
CEX 단계를 통해 세포 배양 수확으로부터의 숙주 세포 단백질의 전체적인 감소를 이하에 요약한다:The overall reduction in host cell protein from cell culture harvest through the CEX step is summarized below:
Claims (11)
a. 세포 브로쓰와 입자성 음이온 교환 물질을 접촉시키는 단계,
b. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계, 및
c. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계.In the following steps, a method of purifying a cell broth containing desired secreted biological material and mammalian cells having an overall positive charge in the cell broth, wherein the cells are present at an initial cell density of at least 15 × 10 6 cells / ml :
a. Contacting the cell broth with the particulate anion exchange material,
b. Allowing sufficient incubation time to form cell pellet and supernatant layers, and
c. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer.
a. 세포 브로쓰와 입자성 음이온 교환 물질을 접촉시키는 단계,
b. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계,
c. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계, 및
d. 상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출하는 단계.In the following steps, a method of recovering a desired secreted biological material from a cell broth containing cells that produce a desired secreted biological material having a total positive charge in the cell broth, wherein the cells in the cell broth are 15 x 10 6 cells. Methods for Mammalian Cells with Initial Cell Density of at least / mL:
a. Contacting the cell broth with the particulate anion exchange material,
b. Allowing sufficient incubation time to form the cell pellet and supernatant layer,
c. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer, and
d. Extracting the desired secreted biological material from the supernatant layer.
e. 생성된 세포 펠렛을 재현탁하는 단계,
f. 세포 펠렛 및 상청액 층을 형성하도록 충분한 인큐베이션 시간을 허용하는 단계,
g. 상청액 층으로부터 생성된 세포 펠렛을 분리하는 단계 및
h. 상청액 층으로부터 원하는 분비된 생물학적 물질을 추출하는 단계.The method of claim 2, wherein the resulting cell pellet is further processed in the following steps:
e. Resuspending the resulting cell pellet,
f. Allowing sufficient incubation time to form the cell pellet and supernatant layer,
g. Separating the resulting cell pellet from the supernatant layer and
h. Extracting the desired secreted biological material from the supernatant layer.
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