KR20110074507A - Growth Factor―Derived Peptides and Uses Thereof - Google Patents

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KR20110074507A
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Abstract

PURPOSE: A growth factor-derived peptide and a composition thereof are provided to ensure excellent stability and skin permeability and to improve skin condition. CONSTITUTION: A peptide with growth factor activity contains an amino acid sequence of sequence number 2. The peptide of sequence number 2 is derived from human growth factor hormone. The peptide has an ability of promoting cell growth. The cell is fibroblast. A composition for improving skin condition contains the peptide as an active ingredient. The skin condition includes wrinkle, elasticity, aging, moisturizing, acne, wound, and skin regeneration.

Description

성장인자―유래 펩타이드 및 이의 용도{Growth Factor―Derived Peptides and Uses Thereof}Growth Factor-Derived Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 라미닌, 인간 성장호르몬 및 에피레귤린(epiregulin)-유래 펩타이드 및 이의 조성물에 대한 것이다.
The present invention relates to laminin, human growth hormone and epiregulin-derived peptides and compositions thereof.

성장호르몬은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증 (dwarfism, 난장이병) 환자들의 치료에 사용되어 왔는데, 과거에는 주로 성장호르몬이 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용됨으로써 분리 과정에서 다른 질병의 원인균까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 그 사용이 매우 제한되었다. 그러나 최근 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용한 성장호르몬의 대량 생산 및 공급이 가능해지고 다른 질환의 감염 위험성이 적어짐에 따라, 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질제제가 왜소증 치료제 시장의 대부분을 차지하게 되었다. 재조합 성장호르몬은 주사기를 이용하여 자가 치료가 가능할 정도로 보편화되어 있는데, 주로 근육주사로 투여된다. 투여된 인간 성장호르몬은 혈액을 따라 순환하면서 인체의 각 기관에 영향을 미치는데, 성장기에서의 근육의 증가, 지방의 분해, 장기의 성장, 골격의 성장, 성적인 성숙 등에 관계된다. 이 이외에도 인간 성장호르몬을 생리적인 범위의 혈중 농도로 성인에게 투여 시, 근육의 강화, 복부비만의 감소, 활력 증진, 심장순환계 강화, 운동능력의 향상, 동맥경화의 개선, 노인성 우울증의 개선 등의 효과에 대해 언급이 되고 있다. 인간 성장호르몬의 인체에 대한 효능은 그 자체에 기인하기 보다는 인간 성장호르몬에 의하여 발현이 촉발되어 주로 간에서 생산되어 혈중으로 분비되는 인슐린-유사 성장인자-1(Insulin-like Growth Factor-1; IGF-1)의 작용에 의한 효능으로 알려져 있다. 인간 성장호르몬의 혈중 반감기는 15분 내외인 반면에 IGF-1 의 혈중 반감기는 20 시간가량으로 작용시간이 훨씬 오래 지속될 수 있는데, 뇌하수체에서 분비된 인간 성장호르몬은 혈중에 존재하는 인간 성장호르몬 결합단백질과 결합하여 혈액순환에 따라 운반되어 인체의 각 조직에 퍼져 있는 인간 성장호르몬 수용체를 만나 결합을 하게 되는데 그 결합에 의한 신호전달의 결과로 IGF-1 의 합성과 분비가 촉진되게 된다. Growth hormone is a protein secreted by the pituitary gland of animals and is a peptide hormone composed of 191 amino acids. Growth hormone has been isolated from animal bodies for a long time and has been mainly used for the treatment of dwarfism (dwarfism) patients.In the past, growth hormone is mainly extracted from the pituitary gland of the corpse and used, so that other disease-causing bacteria are introduced into the patient during the separation process. There is a risk that it can be used, so its use is very limited. However, with the recent development of genetic engineering, mass production and supply of growth hormone using microorganisms has become possible, and the risk of infection of other diseases has decreased, so that protein preparations containing recombinant growth hormone have occupied most of the dwarfism treatment market. Recombinant growth hormone is universal enough to allow self-treatment using a syringe, and is mainly administered by intramuscular injection. The administered human growth hormone circulates along the blood and affects each organ of the human body, and is related to muscle growth, fat decomposition, organ growth, skeletal growth, and sexual maturation during the growth phase. In addition, when human growth hormone is administered to an adult in a physiological range of blood levels, it strengthens muscles, reduces abdominal obesity, increases vitality, strengthens the cardiovascular system, improves exercise capacity, improves arteriosclerosis, and improves senile depression. The effect is being mentioned. The efficacy of human growth hormone on the human body is not attributable to itself, but rather, insulin-like growth factor-1 (IGF), which is produced mainly in the liver and secreted into the blood by triggering its expression by human growth hormone. It is known for its efficacy by the action of -1). Human growth hormone has a blood half-life of around 15 minutes, whereas IGF-1 has a blood half-life of about 20 hours, which can last a much longer action time. Human growth hormone secreted from the pituitary gland is a human growth hormone-binding protein present in the blood. It binds to and is transported along the blood circulation to meet and bind to human growth hormone receptors that are spread throughout the tissues of the human body. As a result of signaling by the binding, the synthesis and secretion of IGF-1 is promoted.

한편, 혈액으로 분비된 IGF-1은 다시 IGF-1 결합단백질과 결합하여 혈류를 타고 돌다가 다시 인체의 각 조직에 퍼져있는 IGF-1 수용체와 결합함으로써 인간 성장호르몬의 분비로 야기된 여러 생리적인 효능을 발휘하게 된다. 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고 주사를 이용하는 불편함으로 인하여 최근에는 다양한 투여 경로별의 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다. 주사제 이외의 제형에 따른 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는 동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 보다 높은 체내 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 성장인자와 유사한 기능의 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다. On the other hand, IGF-1 secreted into the blood binds to the IGF-1 binding protein again, rotates in the bloodstream, and then binds to the IGF-1 receptor spread in each tissue of the human body, resulting in various physiological effects caused by the secretion of human growth hormone. It becomes effective. Although recombinant growth hormone can be mass-produced, attempts to develop formulations for various routes of administration have been actively conducted in recent years due to the high cost required for a certain treatment period and inconvenient use of injections. The basic requirement of a growth hormone formulation according to formulations other than injections is that it must have a high absorption rate in the body and have a biological activity capable of selectively stimulating the secretion of growth hormone. In order to have a higher absorption rate in the body, the smaller the molecular weight is, the more advantageous it is, and in order to smoothly perform the physiological activity in the body, it must have special physicochemical properties that have a function similar to that of the growth factor structurally.

한편, 많은 논문들에서 인간 성장호르몬의 피부에 관한 효과가 많이 알려져 있는데, 상기 한대로 이미 알려져 있는 대부분의 기능, 특히 피부와 관련된 거의 모든 기능은 IGF-1의 작용에 의한 효과일 것이고, 혈액과 직접 접촉이 가능한 진피세포의 표면에 존재하는 IGF-1 수용체의 작용에 의한 피부 개선효과로 볼 수 있을 것이다. 또 다른 논문에는 표피의 세포층과 모공을 이루는 부대기관 및 조직 전반에 걸쳐 인간 성장호르몬의 수용체가 존재한다는 보고가 있다는 사실도 알려져 있다. On the other hand, in many papers, the effects of human growth hormone on the skin are known. As mentioned above, most of the functions already known, especially almost all functions related to the skin, will be due to the action of IGF-1, and directly with the blood. It can be seen as a skin improvement effect by the action of the IGF-1 receptor present on the surface of dermal cells that can be contacted. In another paper, it is also known that there are reports of the presence of receptors for human growth hormone throughout the epidermis cell layer and the subsidiary organs and tissues that make up the pores.

아울러 에피레귤린(Epiregulin)은 표피성장인자(Epidermal Growth Factor)의 패밀리로서 EGF와 같은 시그널 경로를 타면서 피부세포의 분화와 성장에 많은 영향을 끼치게 된다. In addition, Epiregulin, a family of epidermal growth factors, has a great influence on the differentiation and growth of skin cells while taking the same signaling pathway as EGF.

통상적으로 피부를 통하여 효율적으로 전달될 수 있는 분자량은 약 900 dalton 이하라는 일반론이 기본적으로 알려져 있으며 화학적인 침투보조제(Chemical Penetration Enhancers, CPE)의 도움을 받을 경우에도 최대분자량은 약 2 kD 을 넘지 못하는 것이 일반적이다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 인간 성장호르몬 또는 표피 성장인자와 같은 고분자를 정상피부에 도포하여 인간 성장호르몬의 작용에 의한 미용적, 의학적 효능을 높이기 위하여 단백질과 같은 고분자를 정상적인 피부에 도포하여 진피층에 전달하는 방법으로 리포좀 또는 나노좀을 이용하는 방법을 모색해 오고 있다. 많은 문헌들에서 리포좀 또는 나노좀으로 단백질을 싸서 전달하는 경우, 표피층 및 모낭을 통하여 전달된다는 논문이 다수 언급되고 있다. 특히 모낭을 통한 전달에는 리포좀이나 나노좀 형태의 운반체나 지방산과 같은 지질을 포함하는 복합물이 효율적인 것으로 알려져 있으며, 에탄올과 같은 유기용매를 포함하는 수용액이나 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머 고분자를 포함하는 수용액도 모낭을 통한 전달에 이용된다고 알려져 있다. 모낭을 통한 단백질의 피부 전달의 경우가 많아지고 있으며, 리포좀의 전달 과정에 대한 과학적인 반증도 많이 이루어 지고 있는데, 리포좀 자체가 들어가기 보다는 리포좀 내외의 pH 및 전하상태를 포함한 인지질의 종류와 인지질에 부착되어 있거나 인지질이 둘러싸고 있는 단백질의 종류와 모공을 이루는 여러 구성조직의 구성성분, 이들 세 요소의 복합적 상호작용에 의해서 전달효율이 결정된다고 보여진다. Normally, the general theory is that the molecular weight that can be efficiently transmitted through the skin is about 900 daltons or less, and the maximum molecular weight does not exceed about 2 kD even with the help of Chemical Penetration Enhancers (CPE). It is common. For this reason, many researchers apply a polymer such as human growth hormone or epidermal growth factor to the normal skin, and in order to increase the cosmetic and medical efficacy by the action of human growth hormone, a polymer such as protein is applied to the normal skin and delivered to the dermal layer. As a method, a method of using liposomes or nanosomes has been sought. In many literatures, when a protein is wrapped and delivered with liposomes or nanosomes, a number of papers have been mentioned that it is delivered through the epidermal layer and hair follicles. In particular, for delivery through hair follicles, liposome or nanosome-type carriers or complexes containing lipids such as fatty acids are known to be efficient, and aqueous solutions containing organic solvents such as ethanol or polymer polymers such as polyethylene glycol It is also known that an aqueous solution containing a hair follicle is used for delivery. There are many cases of transdermal delivery of proteins through hair follicles, and there are many scientific disprovings about the delivery process of liposomes. Rather than liposomes themselves, the types of phospholipids including the pH and charge state inside and outside the liposome and attached to the phospholipids It is believed that the delivery efficiency is determined by the type of protein that has been formed or surrounded by phospholipids, the components of the various constituent tissues that make up the pores, and the complex interaction of these three elements.

피부조직은 표피와 진피 그리고 피하(hypodermis)로 이루어져 있다. 피부의 성질을 결정짓는 부분은 표피로서 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으므로 표피의 수선과 재생은 매우 중요하다. 사람의 표피는 2 주일에 한번씩 교체되므로 표피를 조성하는 피부 줄기세포의 증식능력은 엄청나다고 할 수 있다. 또한, 피부의 만능줄기세포가 모낭의 지질샘 바로 밑 벌지(bulge) 부위에 위치한다는 보고도 많이 언급이 되고 있는데, 이 벌지 줄기세포는 표피 줄기세포, 모근줄기세포(hair matrix stem cells), 지질샘 줄기세포(sebaceous glands stem cells)를 만드는 근간이 되는 줄기세포이다. 대부분의 표피 줄기세포는 3-6 번을 증식하고 나면 분화의 길을 밟는다. 반면에 벌지 줄기세포는 증식은 다른 세 줄기세포보다 느리지만 사람이 사는 동안 무한정 증식하면서 표피줄기세포, 모근줄기세포, 지질샘 줄기세포를 만드는 동시에 그 자신의 줄기세포 성격을 유지할 수 있는 것으로 보인다.
The skin tissue consists of the epidermis, the dermis and the subcutaneous (hypodermis). The part that determines the nature of the skin is the epidermis, and since the epidermis is directly and frequently damaged from the outside, repair and regeneration of the epidermis is very important. Human epidermis is replaced every two weeks, so it can be said that the proliferation capacity of the skin stem cells that make up the epidermis is enormous. In addition, there are many reports that the pluripotent stem cells of the skin are located in the bulge area just under the lipid gland of the hair follicle.These bulge stem cells are epidermal stem cells, hair matrix stem cells, and lipids. These stem cells are the basis for making sebaceous glands stem cells. Most epidermal stem cells proliferate 3-6 times and then go on the path of differentiation. Bulge stem cells, on the other hand, proliferate more slowly than the other three stem cells, but they seem to be able to proliferate indefinitely during human life to produce epidermal stem cells, hair root stem cells, and lipid gland stem cells while maintaining their own stem cell characteristics.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 천연의 성장인자와 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 성장인자류(성장호르몬, 에피레귤린, 라미닌)보다 안정성이 우수한 펩타이드를 제조하여, 다양한 종류의 성장인자 관련-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 콜라겐, 파이브로넥틴 또는 히알루론산 생성 촉진)이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have prepared peptides that have the same or similar function or action as natural growth factors, but are more stable than natural growth factors (growth hormone, epiregulin, laminin), and various kinds of growth factor-related-derived peptides Were prepared and screened. As a result, the present invention was completed by selecting a peptide having excellent physiological activity (eg, collagen, fibronectin, or hyaluronic acid production promotion) among many candidate peptide substances, as well as excellent stability and skin permeability.

따라서 본 발명의 목적은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a peptide that exhibits growth factor activity.

본 발명의 다른 목적은 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a composition for improving skin conditions.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제3서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, the present invention provides a peptide exhibiting growth factor activity comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 3 in Sequence Listing.

본 발명자들은 천연의 성장인자와 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 성장인자류(성장호르몬, 에피레귤린, 라미닌)보다 안정성이 우수한 펩타이드를 제조하여, 다양한 종류의 성장인자 관련-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 콜라겐, 파이브로넥틴 또는 히알루론산 생성 촉진)이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별하였다.The present inventors have prepared peptides that have the same or similar function or action as natural growth factors, but are more stable than natural growth factors (growth hormone, epiregulin, laminin), and various kinds of growth factor-related-derived peptides Were prepared and screened. As a result, among many candidate peptides, peptides having excellent physiological activity (eg, promoting collagen, fibronectin or hyaluronic acid production) as well as excellent stability and skin permeability were selected.

본 발명에서, 본 발명의 펩타이드는 다음 일반식 1-3으로 표시된다:In the present invention, the peptide of the present invention is represented by the following general formula 1-3:

일반식 1 General Formula 1

Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-ArgArg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg

일반식 2 Formula 2

Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Ala-Thr-Phe-Lys-Arg-IlePhe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Ala-Thr-Phe-Lys-Arg-Ile

일반식 3 Formula 3

Gly-Gln-Cyc-Ile-Tyr-Leu-Ser-Gly-Asp-Arg-Cys
Gly-Gln-Cyc-Ile-Tyr-Leu-Ser-Gly-Asp-Arg-Cys

본 발명자들은 천연의 성장인자의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 성장인자-유래 펩타이드를 합성하였다. 좀더 자세히 살펴보면, 성장인자의 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 예측하고, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화 하여 본 발명의 펩타이드가 제조된다. 수용체 결합가능 예상부위를 검사하여 후보 펩타이드들을 제조하고, 이들 후부 펩타이드들 중에서 가장 생리 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 펩타이드가 제공된다.The present inventors synthesized a number of growth factor-derived peptides exhibiting the above-described characteristics based on the site related to the function of natural growth factors. Looking in more detail, the peptide of the present invention is prepared by predicting the binding site of the growth factor to the receptor protein, and optimizing the amino acid sequence of the predicted site. The peptides of the present invention are provided by examining the predicted receptor binding site to prepare candidate peptides, and screening for the most physiologically active peptides among these posterior peptides.

본 발명자들은 컴퓨터를 이용한 유사 검색(Homology Search)와 도킹 방법 등을 통해 이미 알려져 있는 가상의 수용체 단백질과의 결합 가능 부위를 선정하여 후보 펩타이드들을 합성하였다. 선정된 다수의 펩타이드들은 2-클로로-트리틸-레진에 Fmoc-아미노산을 이용한 고체상 합성을 수행한 뒤, 트리플로로아세트산을 이용하여 레진에서 떼어낸 뒤 무수에테르에서 원하는 펩타이드를 수득하였다. 합성한 펩타이드는 정제 및 분석과정을 거쳐 함량과 순도를 점검한 뒤 여러 생물학적 테스트를 거쳐 인간-유래 성장인자류와 유사한 효능을 가지는 펩타이드를 선정하였다.The present inventors synthesized candidate peptides by selecting a site capable of binding to an already known virtual receptor protein through a computer-based homology search and a docking method. After performing solid phase synthesis of the selected peptides using Fmoc-amino acid on 2-chloro-trityl-resin, the desired peptides were obtained from anhydrous ether after being separated from the resin using trifluoroacetic acid. The synthesized peptide was purified and analyzed to check its content and purity, and then, through several biological tests, a peptide having similar efficacy to that of human-derived growth factors was selected.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드는 세포간극물질인 라미닌에서 유래되고 상기 서열목록 제2서열 펩타이드는 인간 성장호르몬에서 유래되며, 상기 서열목록 제3서열 펩타이드는 에피레귤린(epiregulin)으로부터 유래된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention is derived from laminin, which is a cell interstitial material, and the peptide of SEQ ID NO: 2 is derived from human growth hormone, and the peptide of SEQ ID NO: 3 is It is derived from epiregulin.

선정된 최종 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 기재되어 있다.The amino acid sequence of the selected final peptide is shown in Table 1.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 각 성장인자류의 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 성장인자 보다 열안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of the present invention can induce a modification at the N-terminus or C-terminus in order to select a part of the amino acid sequence of each growth factor and increase its activity. Through this modification, the peptide of the present invention can have a high half-life by increasing the half-life when administered in vivo. In addition, although the peptide of the present invention itself has better thermal stability than a natural growth factor, stability may be further improved by modification of amino acids.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형되어 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the C-terminus of the peptide is modified with a hydroxy group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide (-NHNH 2 ), and the like.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the N-terminus of the peptide is from the group consisting of acetyl group, fluorenyl methoxycarbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group, and polyethylene glycol (PEG). The protecting groups of choice are combined.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.The above-described amino acid modification acts to greatly improve the stability of the peptide of the present invention. In the present specification, the term “stability” means not only in vivo stability, but also storage stability (eg, room temperature storage stability). The above-described protecting group functions to protect the peptide of the present invention from attack by protein cleavage enzymes in vivo.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).In the present specification, the term “peptide” refers to a linear molecule formed by bonding of amino acid residues to each other by peptide bonds. The peptides of the present invention can be prepared according to chemical synthesis methods known in the art, in particular solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54 (1963)). ; Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)).

본 발명의 펩타이드에 대한 상기 일반식 1-3은 본 발명의 펩타이드의 구조를 편의적으로 표현하기 위하여 기재된 것이며, 이의 변형도 본 발명에 속한다는 것은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 상기 일반식 1-3에서 성장인자류-유래 서열의 변형체들도 본 발명의 범위에 속한다는 것은 당업자에 자명하다.The general formula 1-3 for the peptide of the present invention is described to conveniently express the structure of the peptide of the present invention, and it is obvious to those skilled in the art that modifications thereof also belong to the present invention. For example, it is apparent to those skilled in the art that variants of the growth factor-derived sequence in Formula 1-3 are also within the scope of the present invention.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 세포의 성장 촉진능을 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 섬유아세포의 성장을 촉진한다. 본 발명에 따르면, 세포에 본 발명의 펩타이드류를 다양한 농도로(예컨대, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml) 처리하여 72시간 동안 배양시킨 후 세포의 성장을 살펴보면, 제1서열 내지 제3서열 펩타이드는 섬유아세포에서 농도-의존적으로 약 1.5-3.5배의 성장 촉진을 유발하였다(참조: 도 2 및 도 3).According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of the present invention has the ability to promote cell growth. More preferably, the peptide of the present invention promotes the growth of fibroblasts. According to the present invention, cells are cultured for 72 hours by treating the peptides of the present invention at various concentrations (eg, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 μg/ml and 10 μg/ml) Looking at the growth of the cells after the treatment, the peptides of the first to third sequences induce a concentration-dependent growth promotion of about 1.5-3.5 times in fibroblasts (see FIGS. 2 and 3).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 콜라겐 및 파이브로넥틴의 생성을 농도-의존적으로 증가시킨다. 보다 상세하게는, 본 발명의 펩타이드류는 섬유아세포에서 콜라겐 또는 파이브로넥틴의 생성량을 각각 2.5-12배 또는 2-5배 정도 증가시켰다. 또한, 웨스턴 블롯팅 분석을 통해, 본 발명의 제3서열 펩타이드는 각질세포에서 EGFR의 인산화를 증가시켰다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부상태 또는 주름 개선에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 경우, 연고 등의 제제를 이용하여 상처 치료에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of the present invention increases the production of collagen and fibronectin in a concentration-dependent manner. More specifically, the peptides of the present invention increased the amount of collagen or fibronectin produced in fibroblasts by 2.5-12 times or 2-5 times, respectively. In addition, through Western blotting analysis, the peptide of the third sequence of the present invention increased the phosphorylation of EGFR in keratinocytes. These results mean that the peptides of the present invention have very excellent efficacy in improving skin conditions or wrinkles. In addition, in the case of a composition comprising the peptide of the present invention, it can be very effectively used for wound treatment by using an ointment or the like.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 성장인자류의 활성을 나타내는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for improving skin conditions comprising the peptide of the present invention, which exhibits the activity of growth factors, as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 인간 성장호르몬-유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention contains the human growth hormone-derived peptide of the present invention described above as an active ingredient, the overlapping content between the two will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification due to redundant description.

본 발명의 펩타이드는 천연 인간 성장호르몬류 보다 분자량이 훨씬 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 수 있다.Since the peptide of the present invention has a much smaller molecular weight than natural human growth hormones, the skin penetration rate is very good. Therefore, when the composition of the present invention is topically applied to the skin, the skin condition can be effectively improved.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의한 피부상태 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처제거 및 피부재생 효과이며, 보다 바람직하게는 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 상처제거 및 피부재생 효과이다. 예를 들어, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 이들 세포로부터 콜라겐, 히알루론산 또는 파이브로넥틴의 합성 증가를 유도하며, 피부의 각질세포층, 상피층 및 진피층을 재생 또는 성장시켜, 결국 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거, 피부재생 등의 효능을 발휘한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the improvement of skin condition by the composition of the present invention is an effect of improving wrinkles, improving skin elasticity, preventing skin aging, improving skin moisturization, removing age spots, treating acne, removing wounds, and regenerating skin, and more preferably It is effective in improving wrinkles, improving skin elasticity, preventing skin aging, removing wounds, and regenerating skin. For example, the peptide used as an active ingredient in the present invention promotes the proliferation of fibroblasts, induces increased synthesis of collagen, hyaluronic acid or fibronectin from these cells, and regenerates the stratum corneum, epithelial and dermal layers of the skin. Or, by growing it, it exhibits the effect of improving wrinkles, improving skin elasticity, preventing skin aging, improving skin moisturizing, removing wounds, and regenerating skin.

본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드들은 세포성장효과 이외에도 천연 성장인자에 비해 매우 뛰어난 열안정성을 가진다(참조: 도 7). 기존의 성장인자류는 다음과 같은 문제점을 가지고 있다: (a) 적은 합성량, (b) 제조의 어려움, (c) 높은 가격 및 (d) 온도 및 장기 보관 시에 낮은 안정성. 하지만 본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에, 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 의약품 및 화장품의 용도에 적합한 형태로 이용할 수 있다.According to the present invention, the peptides of the present invention have very excellent thermal stability compared to natural growth factors in addition to cell growth effects (see Fig. 7). Existing growth factors have the following problems: (a) low synthesis, (b) difficulty in manufacturing, (c) high price and (d) low stability at temperature and long-term storage. However, since the peptides of the present invention can be synthesized in large quantities at very low cost and are physicochemically stable at high temperatures, it is possible to prevent a decrease in physiological activity as much as possible, and has a more improved therapeutic effect by increasing the remaining period in the body. Therefore, the peptide of the present invention can be used in a form suitable for use in pharmaceuticals and cosmetics.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물과 화장품 조성물로 제조될 수 있다.The composition of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition and a cosmetic composition.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-described peptide.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. I can.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in various ways depending on factors such as the formulation method, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. Can be. Meanwhile, the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 μg per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be prepared by placing it in a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "cosmetically effective amount" means an amount sufficient to achieve the skin improvement effect of the composition of the present invention described above.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, and may be formulated as a spray, but is not limited thereto. In more detail, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutritional lotion, nutritional cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, or zinc oxide may be used as a carrier component. I can.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component. In particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain propellants such as butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and crystallites Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like can be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant containing cleansing, as a carrier component, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions, in addition to peptides and carrier ingredients as active ingredients, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and perfumes. May contain adjuvants.

한편, 본 발명의 조성물은 인간 성장인자-유효성의 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 천연 인간 성장인자류와 동일한 또는 유사한 활성을 가진다. 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 성장인자의 활성을 보유하여, 생체에 적용 시 천연 성장인자가 발휘하는 작용 또는 기능을 발휘한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 천연 성장인자류 중 라미닌, 인간 성장호르몬 및 에피레귤린의 작용을 미미킹 하도록 제작된 것이기 때문에, 천연 성장인자들의 다양한 생체 내 활성과 관련된 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
Meanwhile, the composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of human growth factor-effective diseases or conditions. The peptides of the present invention have the same or similar activity as natural human growth factors. The peptide used as an active ingredient in the present invention retains the activity of a growth factor and exerts an action or function exerted by a natural growth factor when applied to a living body. Therefore, since the peptide of the present invention is designed to mimic the action of laminin, human growth hormone, and epiregulin among natural growth factors, prevention of diseases or conditions related to various in vivo activities of natural growth factors Or it can be used for treatment.

본 발명의 특징 및 이점(advantages)을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명의 성장 인자-유래 펩타이드는 천연의 성장인자류와 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있다. (a) The growth factor-derived peptide of the present invention may have the same function or function as natural growth factors.

(b) 본 발명의 펩타이드는 천연 성장인자와 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 매우 우수하다.(b) The peptide of the present invention is very excellent in stability and skin permeability compared to natural growth factors.

(c) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 인간 성장인자의 활성이 요구되는 피부상태를 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.(c) The composition containing the peptide of the present invention exhibits very excellent efficacy in improving skin conditions requiring the activity of human growth factors.

(d) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.
(d) The excellent activity and stability of the peptide of the present invention described above makes it possible to be applied very advantageously to medicines, quasi-drugs, and cosmetics.

도 1a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제2서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제3서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드를 각 농도별로 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드를 각 농도별로 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4는 세포 배양에서 본 발명의 펩타이드에 의한 콜라겐 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 5는 세포 배양에서 본 발명의 펩타이드에 의한 파이브로넥틴 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 6은 세포 배양에서 서열목록 제2서열의 펩타이드에 의한 히알루론산 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 7은 세포 배양에서 서열목록 제3서열의 펩타이드를 처리한 세포 배양에서 배양액 내 EGF의 분비량의 증가를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 제3서열 펩타이드 처리에 의한 EGFR 단백질의 인산화 증가를 나타내는 ELISA 결과이다.
도 9는 본 발명의 펩타이드 처리에 의한 조직에서 상처 치료 효과를 관찰한 현미경 사진이다.1A is a graph showing the results of high-performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared according to the synthesis example of the present invention.
1B is a graph showing the results of high-performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 2 prepared according to the synthesis example of the present invention.
1C is a graph showing the results of high-performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 3 prepared according to the synthesis example of the present invention.
2 is a graph showing the cell growth effect of fibroblasts after treatment of the peptides of the present invention for each concentration.
3 is a photomicrograph showing the cell growth effect of fibroblasts after treatment of the peptides of the present invention for each concentration.
4 is a graph showing an increase in the amount of collagen produced by the peptide of the present invention in cell culture.
5 is a graph showing an increase in the amount of fibronectin produced by the peptide of the present invention in cell culture.
6 is a graph showing an increase in the amount of hyaluronic acid produced by the peptide of the second sequence in the sequence listing in cell culture.
7 is a result of measuring the increase in the secretion amount of EGF in the culture medium using ELISA in cell culture treated with the peptide of SEQ ID NO: 3 in cell culture.
8 is an ELISA result showing an increase in phosphorylation of EGFR protein by treatment with the peptide of the third sequence of the present invention.
9 is a photomicrograph of observing the wound healing effect in the tissue by the peptide treatment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

합성예Synthesis example 1: One: FRKDMDKVATFLRIFRKDMDKVATFLRI (서열목록 제2서열)의 합성Synthesis of (SEQ ID NO: 2)

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Ile-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Ile-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Arg(pbf)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Arg(pbf)-Ile-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Met, Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Arg(pbf) 및 Fmoc-Phe 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한 뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 서열목록 제2서열 펩타이드 NH2-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Ala-Thr-Phe-Lys-Arg-Ile-OH를 1.28 g 합성하였다(수율: 76.6%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1740.8(이론값 : 1740.1)를 얻을 수 있었다.
700 mg of chloro trityl chloride resin (CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) was placed in a reaction vessel, and 10 ml of methylene chloride (MC) was added, followed by stirring for 3 minutes. The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, 200 mmole of Fmoc-Ile-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropyl ethylamine (DIEA) were added, then stirred to dissolve well, and reacted with stirring for 1 hour. After the reaction was washed, methanol and DIEA (2:1) were dissolved in DCM (dichloromethane), reacted for 10 minutes, and washed with an excess of DCM/DMF (1:1). The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of a deprotection solution (20% piperidine/DMF) was added to the reaction vessel and stirred at room temperature for 10 minutes, and then the solution was removed. The same amount of the deprotection solution was added and the reaction was maintained for another 10 minutes, and then the solution was removed and washed twice with DMF for 3 minutes, once with MC, and once again with DMF for 3 minutes to prepare an Ile-CTL resin. 10 ml of DMF solution was added to a new reactor, 200 mmole of Fmoc-Arg(pbf)-OH (Bachem, Swiss), 200 mmole of HoBt, and 200 mmole of Bop were added, followed by stirring to dissolve well. After adding 400 mmole DIEA to the reactor twice as a fraction, the mixture was stirred for at least 5 minutes until all solids were dissolved. The dissolved amino acid mixture solution was placed in a reaction vessel with a deprotected resin and reacted with stirring at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed, and the mixture was stirred 3 times for 5 minutes with a DMF solution, and then removed. A small amount of reaction resin was taken and the degree of reaction was checked using a Kaiser test (Nihydrin Test). Arg(pbf)-Ile-CTL resin was prepared by performing a deprotection reaction twice in the same manner as above with a deprotection solution. After sufficiently washing with DMF and MC, performing the Kaiser test again, the following amino acid adhesion experiment was performed in the same manner as above. Based on the selected amino acid sequence, Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Val, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Met, Fmoc- Asp(tBu), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Arg(pbf), and Fmoc-Phe were sequentially subjected to chain reaction. The Fmoc-protecting group was reacted twice with a deprotection solution for 10 minutes each, and then washed well and removed. After drying with a slow flow of nitrogen air, vacuum under P 2 O 5 to completely dry it, and then decontaminate solution [Trifluroacetic acid 81.5%, distilled water 5%, thioanisole 5%, phenol ( Phenol) 5%, EDT 2.5% and TIS 1%] 30 ml were added, and the reaction was maintained for 2 hours by occasionally shaking at room temperature. The resin was filtered by filtering, and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor. After distillation using reduced pressure so that the total volume remains about half, 50 ml of cold ether was added to induce precipitation, centrifuged to collect the precipitate, and washed with cold ether twice. Remove the mother liquor and dry sufficiently under nitrogen to obtain the second sequence peptide NH 2 -Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Ala-Thr-Phe-Lys-Arg-Ile-OH before purification. 1.28 g was synthesized (yield: 76.6%). When measured using a molecular weight analyzer, a molecular weight of 1740.8 (theoretical value: 1740.1) could be obtained.

합성예Synthesis example 2: 다른 2: different 펩타이드들의Peptides 합성 synthesis

상기 합성예 1과 동일한 방법으로 합성하되, 아미노산은 서열에 부합되는 아미노산을 사용하여 서열목록 제1서열 및 제3서열의 펩타이드를 합성하였다. 제1서열 펩타이드의 서열은 NH2-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-OH이며, 제3서열 펩타이드의 서열은 NH2-Gly-Gln-Cys-Ile-Tyr-Leu-Ser-Gly-Asp-Arg-Cys-OH에 해당하는 것이다. 각 합성된 펩타이드의 HPLC 결과는 도 1a-1c에 예시되어 있다. 아울러 합성된 펩타이드들에 대한 분자량 측정기 측정값은 다음 표 1과 같다:Synthesized in the same manner as in Synthesis Example 1, but the peptides of the first and third sequences of the Sequence Listing were synthesized using amino acids matching the sequence. The sequence of the first sequence peptide is NH2-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-OH, and the sequence of the third sequence peptide is NH2-Gly-Gln-Cys It corresponds to -Ile-Tyr-Leu-Ser-Gly-Asp-Arg-Cys-OH. The HPLC results of each synthesized peptide are illustrated in FIGS. 1A-1C. In addition, the measured values of the molecular weight analyzer for the synthesized peptides are shown in Table 1 below:

서열 번호Sequence number 아미노산 서열Amino acid sequence 분석값(질량분석기)Analysis value (mass spectrometer) 분석치Analysis value 이론치Theoretical value 1One RLYCKNGGFFLRRLYCKNGGFFLR 1474.01474.0 1473.81473.8 22 FRKDMDKVATFLRIFRKDMDKVATFLRI 1740.81740.8 1740.11740.1 33 GQCIYLSGDRCGQCIYLSGDRC 1214.91214.9 1214.41214.4

시험예Test example 1: 합성 1: synthesis 펩타이드를Peptide 활용한 Utilized NIH3T3NIH3T3 섬유아세포 성장 Fibroblast growth 효과능Effectiveness 분석 analysis

합성예를 통해 제조된 펩타이드에 대한 성장호르몬의 유사 효능을 분석하기 위해, 리지노 등의 방법(Rizzino, et al ., Cancer Res ., 48: 4266(1988))을 참조하여 NIH3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 이용한 SRB(Sulforhodamine B, Sigma)의 비색법을 이용하여 측정하였다.In order to analyze the similar efficacy of growth hormone for the peptide prepared through the synthesis example, the method of Rizzino et al. (Rizzino, et al . , Cancer Res . , 48: 4266 (1988)) was measured using the colorimetric method of SRB (Sulforhodamine B, Sigma) using NIH3T3 fibroblasts (Korea Cell Line Bank).

NIH3T3 섬유아세포를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 Earle's minimal essential media(EMEM, Gibco, 미국)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 4 X 103 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 각 합성 펩타이드를 10% DMSO에 멸균상태로 녹인 뒤 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포의 생존상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존상태를 측정하였다. NIH3T3 fibroblasts were cultured in Earle's minimal essential media (EMEM, Gibco, USA) containing 10% FBS (fetal bovine serum) using a 250 ml tissue culture flask. The cultured cell lines were removed from the bottom of the culture vessel with a 0.25% trypsin solution, and then centrifuged to collect only the cell precipitate. This was re-suspended in the EMEM culture solution containing no FBS, and then placed in a 96-well tissue culture plate to be 4×10 3 cells per well and cultured under conditions of 37° C. and 7% CO 2 for 24 hours. After 24 hours, after replacing the medium with the same culture medium excluding serum, dissolve the blank sample for standardization and each synthetic peptide sterilized in 10% DMSO, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, At concentrations of 1 μg/ml and 10 μg/ml, culture was performed for 72 hours under the same conditions as above. After the culture was completed, the culture supernatant was removed and washed once with phosphate buffer saline (PBS). After the washing solution was removed, the cells were treated with a colorimetric SRB solution and sufficiently washed with PBS, and then the viability of the cells was observed under a microscope, and the viability of the cells was measured by measuring the absorbance at 590 nm of ultraviolet light.

도 2는 본 발명의 펩타이드에 의한 섬유아세포의 성장 효과를 나타내는 그래프이다. 또한, 섬유아세포에 펩타이드를 처리하고 72시간 뒤 세포의 생존상태를 현미경으로 검경하여 섬유아세포의 성장을 확인하였다(참조: 도 3). 도 2 및 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드 3종은 모두 섬유아세포의 성장을 농도-의존적으로 크게 촉진시키며, 이러한 효과는 제2서열 펩타이드에서 가장 두드러졌다.
Figure 2 is a graph showing the growth effect of fibroblasts by the peptide of the present invention. In addition, after 72 hours after the fibroblasts were treated with the peptide, the viability of the cells was examined under a microscope to confirm the growth of fibroblasts (see FIG. 3). As can be seen in FIGS. 2 and 3, all three peptides of the present invention greatly promote the growth of fibroblasts in a concentration-dependent manner, and this effect was most pronounced in the second sequence peptide.

시험예Test example 2: 합성 2: synthesis 펩타이드들의Peptides 세포 내 효능 Intracellular efficacy

본 발명의 펩타이드류를 섬유아세포에 처리하여 피부주름 개선의 표지 인자인 콜라겐, 파이브로넥틴 및 히알루론산의 농도 변화를 측정하였다. 먼저 48시간을 배양한 섬유아세포에 본 발명의 펩타이드 3종을 1 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 72시간 경과 후, 콜라겐 및 파이브로넥틴의 농도를 측정하였다. 농도 측정은 콜라겐 ELISA 키트(R&D, 미국) 및 파이브로넥틴 ELISA 키트(R&D, 미국)을 이용하여 실시하였다. The peptides of the present invention were treated with fibroblasts to measure changes in the concentration of collagen, fibronectin, and hyaluronic acid, which are markers for skin wrinkle improvement. First, fibroblasts cultured for 48 hours were treated with 3 kinds of peptides of the present invention at a concentration of 1 μg/ml, and after 72 hours, the concentrations of collagen and fibronectin were measured. The concentration measurement was performed using a collagen ELISA kit (R&D, USA) and a fibronectin ELISA kit (R&D, USA).

도 4 및 도 5에서 볼 수 있듯이, 콜라겐 및 파이브로넥틴의 양이 본 발명의 펩타이드 3종을 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 6에서 볼 수 있듯이, 같은 농도의 처리 군에 대해 히알루론산 ELISA 키트(R&D, 미국)를 이용한 히알루론산을 측정한 결과, 본 발명의 제2서열 펩타이드를 처리한 군에서 히알루론산이 약 50% 정도 증가했음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 제1서열 및 제3서열 펩타이드가 콜라겐 및 파이브로넥틴의 단백질 생산량을 농도-의존적으로 현저하게 증가시켰으며, 본 발명의 제2서열 펩타이드는 콜라겐, 파이브로넥틴 및 히알루론산 모두를 증가시켰는데, 이는 본 발명의 펩타이드 3종이 매우 우수한 피부 개선 효능을 가진다는 것을 의미한다.As can be seen in FIGS. 4 and 5, it was confirmed that the amount of collagen and fibronectin was very high in the group treated with the three peptides of the present invention compared to the non-treated group. In addition, as can be seen in Figure 6, as a result of measuring hyaluronic acid using a hyaluronic acid ELISA kit (R&D, USA) for the treatment group of the same concentration, about 50 hyaluronic acid in the group treated with the peptide of the second sequence of the present invention It could be confirmed that it increased by about %. Therefore, the first and third sequence peptides of the present invention significantly increased the protein production amount of collagen and fibronectin in a concentration-dependent manner, and the second sequence peptide of the present invention was used for both collagen, fibronectin and hyaluronic acid. Was increased, which means that the three peptides of the present invention have a very good skin improvement effect.

한편, 6일 동안 본 발명의 제3서열 펩타이드(10 ㎍/ml)를 HaCat 각질 세포주에 처리하여 배양액 내 EGF의 양을 ELISA키트(R&D. 미국)를 이용하여 측정한 결과, 본 발명의 제3서열 펩타이드 처리군에서 처리하지 않은 군에 비해 약 2.5배의 높은 EGF를 검출할 수 있었다(도 7). 또한 각질 세포를 배양하고 혈청-결핍 배지로 옮긴 뒤, 제3서열 펩타이드를 100 ng/ml 및 1 ㎍g/ml의 농도로 5분, 15분 동안 처리하여 배양하였다. 이후 세포를 회수하여 세포 내 발현된 인산화 EGFR 단백질을 Phospho-EGFR 항체(SantaCruz, 미국)를 사용하여 웨스턴 블롯팅한 결과, 본 발명의 제3서열 펩타이드를 처리한 군에서 EGFR의 인산화가 증가하였음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명의 제3서열 펩타이드가 에피레귤린(Epiregulin)의 기능과 동일하게 또는 유사하게 기능한다는 것을 의미한다(도 8).
On the other hand, the third sequence peptide (10 μg/ml) of the present invention was treated with the HaCat keratin cell line for 6 days, and the amount of EGF in the culture medium was measured using an ELISA kit (R&D. USA). In the sequence peptide-treated group, about 2.5 times higher EGF could be detected compared to the non-treated group (FIG. 7). In addition, keratinocytes were cultured and transferred to a serum-deficient medium, and then the third sequence peptide was treated at concentrations of 100 ng/ml and 1 μgg/ml for 5 minutes and 15 minutes to be cultured. Subsequently, as a result of Western blotting of the phosphorylated EGFR protein expressed in the cell by recovering the cells using a Phospho-EGFR antibody (SantaCruz, USA), phosphorylation of EGFR was increased in the group treated with the peptide of the third sequence of the present invention. Could know. These results mean that the peptide of the third sequence of the present invention functions in the same or similar to that of Epiregulin (FIG. 8).

시험예Test example 3: 합성 3: synthesis 펩타이드의Peptide 열안정성Thermal stability

합성예를 통해 제조된 펩타이드류와 R&D(미국)에서 구입한 표준폼 성장인자류를 0.11 mg/ml의 농도로 조제한 뒤, 37℃에서 0, 5, 10, 20, 30, 40, 그리고 70일 간을 보관한 뒤 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다. 합성 펩타이드의 경우 천연의 성장인자들보다 잔존량이 높았으며, 이를 시료로 삼아 시험예 1과 동일한 방법으로 세포에 처리하였다. MTT방법을 사용하여 흡광도를 측정함으로써 펩타이드의 열에 대한 안정성을 시험하였다. 모든 경우에 있어 성장 인자류보다 본 발명의 펩타이드의 활성도가 더 높음을 확인하였다(결과를 보이지 않음).
Peptides prepared through the synthesis example and standard foam growth factors purchased from R&D (USA) were prepared at a concentration of 0.11 mg/ml, followed by 0, 5, 10, 20, 30, 40, and 70 days at 37°C. After storing the liver, the denatured peptide or protein was removed by centrifugation, and the supernatant was taken and quantified using HPLC. In the case of the synthetic peptide, the residual amount was higher than that of the natural growth factors, and this was used as a sample and treated on the cells in the same manner as in Test Example 1. The stability against heat of the peptide was tested by measuring the absorbance using the MTT method. In all cases, it was confirmed that the activity of the peptide of the present invention was higher than that of the growth factors (results not shown).

실시예Example 1: One: 나노화Nanoization 펩타이드의Peptide 제조 Produce

상기 합성예에서 얻은 3종의 펩타이드를 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml에 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 및 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 증류수로 총량을 1 L로 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.
After accurately weighing 50 mg of the three peptides obtained in Synthesis Example, it was sufficiently stirred and dissolved in 500 ml of distilled water. After mixing the mixture solution with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol and a little oil, adjust the total amount to 1 L with distilled water, and then use high pressure with a microfluidizer. Then, it was emulsified to prepare nanosomes having a size of about 100 nm. The prepared nanosomes had a final concentration of about 50 ppm and were used alone or in combination for the manufacture of cosmetics.

제형예Formulation example 1: 유연화장수 1: flexible lotion

상기 실시예 1에서 제조된 3종의 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.A flexible lotion comprising the three kinds of peptide nanosomes prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to a general lotion preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 6.06.0 글리세린glycerin 4.04.0 PEG 1500PEG 1500 1.01.0 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 1.01.0 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.50.5 에탄올ethanol 8.08.0 방부제, 색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 벤조페논-9Benzophenone-9 0.050.05 향incense 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 2: 영양크림 2: nourishing cream

상기 실시예 1에서 제조된 3종의 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조 방법에 따라 제조하였다.A nutritional cream comprising the three kinds of peptide nanosomes prepared in Example 1, and consisting of the following composition, was prepared according to a general nutritional cream preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 메도우폼오일Meadow Foam Oil 3.03.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 1.51.5 스테아린산Stearic acid 1.51.5 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.51.5 유동 파라핀Liquid paraffin 10.010.0 밀납Beeswax 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate60 0.60.6 솔비탄 세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 2.52.5 스쿠알란Squalane 3.03.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 3.03.0 글리세린glycerin 5.05.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.50.5 토코페릴아세테이트 Tocopheryl acetate 0.5 0.5 방부제, 색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 향incense 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 3: 영양화장수 3: nourishing lotion

상기 실시예 1에서 제조된 3종의 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.A nutrient lotion containing the three kinds of peptide nanosomes prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to a general lotion preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0020.002 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 4.04.0 글리세린glycerin 4.04.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 0.80.8 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.01.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.130.13 토코페릴아세테이트Tocopheryl acetate 0.30.3 유동파라핀Floating paraffin 5.05.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 마카다미아너트오일Macadamia Nut Oil 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate60 1.51.5 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitansquioleate 0.50.5 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 1.01.0 방부제,색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 향incense 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 4: 에센스 4: essence

상기 실시예 1에서 제조된 3종의 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.An essence comprising the three kinds of peptide nanosomes prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to a general method for preparing an essence.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0050.005 글리세린glycerin 10.010.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 PEG 1500PEG 1500 2.02.0 알란토인Allantoin 0.10.1 DL-판테놀DL-panthenol 0.30.3 EDTA-2NaEDTA-2Na 0.020.02 히드록시에틸 셀룰로오스Hydroxyethyl cellulose 0.10.1 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 8.08.0 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 0.20.2 트리에탄올아민Triethanolamine 0.180.18 옥틸도데세스-16Octyldodeces-16 0.40.4 에탄올ethanol 6.06.0 향, 방부제, 색소Fragrance, preservative, color 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

실시예Example 2: 합성된 2: synthesized 펩타이드에Peptide 의한 상처 치료 효과 Wound healing effect

합성한 펩타이드의 유용성과 생체 내 효능을 알아보기 위하여 상기 나노좀으로 제조한 용액을 펩타이드가 들어 있지 않은 공나노좀과 비교하여 마우스를 이용한 하기의 실험을 수행하였다.In order to examine the usefulness and efficacy of the synthesized peptide in vivo, the following experiment was performed using a mouse by comparing the solution prepared with the above nanosomes with empty nanosomes containing no peptide.

실험에 사용한 Balb C 마우스(중앙실험동물, 한국)는 6주령 수컷으로서 구입 후 일주일 동안 안정기를 거친 뒤 전신마취를 하고 등 부위를 티오글리콜산이 함유된 크림을 이용해 제모하였다. 제모 후 동물의 등 피부를 펀치를 이용해 0.3 mm 두께로 상처를 유발하였다. 동물을 회복시킨 뒤, 본 발명의 펩타이드가 함유되지 않은 나노좀을 처리한 군 및 본 발명의 펩타이드 50 ppm을 함유한 나노좀을 각각 처리한 세 가지 군을 아침 8시 30분, 오후 1시 및 저녁 6시에 200 ㎕ 씩 상처한 부위에 발라주었다. 10일 동안 나노좀을 처리한 뒤 동물을 경추 탈골시켜 치사하고 상처가 있는 피부의 조직을 잘라서 파라핀으로 고정시켰다. 마이크로톰으로 5 ㎛의 두께로 박편 시료를 만든 뒤 슬라이드에 고정시켜 헤마톡실린/에오신 염색을 하여 광학 현미경으로 검경을 하였다(도 9). Balb C mice used in the experiment (Central Experimental Animal, Korea) were males of 6 weeks of age, were stabilized for a week after purchase, were subjected to general anesthesia, and the back area was depilated using cream containing thioglycolic acid. After hair removal, the animal's back skin was injured to a thickness of 0.3 mm using a punch. After recovering the animals, the group treated with the nanosomes without the peptide of the present invention and the three groups treated with the nanosomes containing 50 ppm of the peptide of the present invention were respectively treated at 8:30 am, 1 pm and At 6 o'clock in the evening, 200 µl each was applied to the wounded area. After treatment with nanosomes for 10 days, the animal was dislocated and killed by the cervical spine, and the tissue of the wounded skin was cut and fixed with paraffin. After making a flake sample to a thickness of 5 μm with a microtome, it was fixed on a slide, stained with hematoxylin/eosin, and speculum was performed under an optical microscope (FIG. 9 ).

도 9에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드가 함유되지 않은 나노좀을 처리하여 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서 현저하게 상처 부위가 치료되는 것을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 9, it was confirmed that the wound site was significantly treated in the group treated with the peptide of the present invention by treating the nanosomes that did not contain the peptide of the present invention.

<110> Caregen <120> Growth Factor-Derived Peptides and Uses Thereof <130> PN110357 <150> KR 10-2009-0063055 <151> 2009-07-10 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Ala Thr Phe Leu Arg Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Ser Gly Asp Arg Cys 1 5 10 <110> Caregen <120> Growth Factor-Derived Peptides and Uses Thereof <130> PN110357 <150> KR 10-2009-0063055 <151> 2009-07-10 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Ala Thr Phe Leu Arg Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Ser Gly Asp Arg Cys 1 5 10

Claims (8)

서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드.
Peptides showing growth factor activity consisting of the amino acid sequence of the second sequence of the sequence.
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제2서열 펩타이드는 인간 성장호르몬에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
[Claim 2] The peptide of claim 1, wherein the sequence SEQ ID NO: 2 peptide is derived from human growth hormone.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포의 성장 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
According to claim 1, wherein the peptide is a peptide, characterized in that having a growth promoting ability of the cell.
제 3 항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
4. The peptide of claim 3, wherein said cell is a fibroblast.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 콜라겐 및 파이브로넥틴의 생성을 농도-의존적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
The peptide of claim 1, wherein the peptide increases the production of collagen and fibronectin in a concentration-dependent manner.
제 1 항에 있어서, 상기 서열목록 제2서열의 펩타이드는 히알루론산의 생성을 농도-의존적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
The peptide of claim 1, wherein the peptide of SEQ ID NO: 2 sequence increases concentration-dependently production of hyaluronic acid.
상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물.
A composition for improving skin conditions comprising the peptide of any one of claims 1 to 6 as an active ingredient.
제 9 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처 제거 및 피부재생인 것을 특징으로 하는 조성물.10. The composition according to claim 9, wherein the improvement of the skin condition is wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, skin hydration improvement, blotch removal, acne treatment, wound removal and skin regeneration.
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