KR20110071821A - Gene implicated in drought stress tolerance and transformed plants with the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A composition containing nucleotide sequence is provided to enhance drought stress tolerance and to develop a plant with novel functionality. CONSTITUTION: A composition for enhancing drought stress tolerance of a plant contains a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of sequence number 2. The composition contains a recombinant vector for plant expression comprising: a nucleotide of sequence number 2; a promoter which is operatively linked to the nucleotide sequence and forms RNA molecules in plant cells; and a poly A signal sequence causing polyadenylation of 3'-terminal of RNA molecule. A composition for promoting plant germination contains a nucleic acid molecule which suppresses the expression of the nucleotide sequence. The nucleic acid molecule is T-DNA.

Description

건조 스트레스 저항성 관련 유전자 및 형질전환 식물체{Gene Implicated in Drought Stress Tolerance and Transformed Plants with the Same}Gene Implicated in Drought Stress Tolerance and Transformed Plants with the Same}

본 발명은 건조 스트레스 저항성 관련 유전자 및 상기 유전자로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.The present invention relates to a dry stress resistance related genes and plants transformed with the genes.

유비퀴틴은 모든 진핵생물에서 발현되는 76개의 아미노산으로 구성된 단백질로써, E1-E2-E3(유비퀴틴 활성화, 유비퀴틴 결합, 유비퀴틴 연결효소) 연쇄 효소반응에 의해서 다양한 기질 단백질에 공유결합이 되는 특성을 가진다. 유비퀴틴이 붙게 되는 기질 단백질은 매우 다양하여 세포 내의 거의 모든 생리활동에 영향을 주며, 많은 질병이 이러한 기작과 연결되어져 있다는 연구결과들이 잘 밝혀져 있다. 유비퀴틴의 처음 알려진 기능은 다른 단백질에 결합함으로써 단백질의 분해를 촉진하는 것이었으나 최근 들어 유비퀴틴의 다른 기능들이 속속 밝혀지고 있다.Ubiquitin is a protein consisting of 76 amino acids expressed in all eukaryotes, and has the property of covalently binding to various substrate proteins by E1-E2-E3 (ubiquitin activation, ubiquitin binding, ubiquitin ligase) chain enzyme reaction. The substrate proteins to which ubiquitin attaches are so diverse that they affect almost every physiological activity in the cell, and studies show that many diseases are linked to this mechanism. Ubiquitin's first known function was to promote the breakdown of proteins by binding to other proteins, but recently, other functions of ubiquitin have been discovered one after another.

유비퀴틴은 세 종류의 단백질, 즉 E1, E2 및 E3의 순차적인 작용에 의해 기질에 결합하게 된다. 유비퀴틴의 C쪽 말단 도메인에 있는 글리신이 기질 단백질의 라이 신의 R기에 있는 NH3에 결합함으로써 기질과 공유 결합을 형성하게 된다. 일반적으로 유비퀴틴이 붙은 단백질은 프로테아좀에 의해 분해가 된다. 이 때, 프로테아좀에 의해 분해가 되기 위해서는 유비퀴틴이 여러 개가 붙은 폴리유비퀴틴이 기질에 붙어야 한다. 현재까지는 적어도 4개의 유비퀴틴이 결합한 폴리유비퀴틴이 기질에 붙을때만 기질의 프로테아좀 의존적인 분해가 일어난다고 알려져 있으나 이것은 in vitro 실험결과이기 때문에 논란의 여지는 있다. 프로테아좀 의존적인 분해를 일으키는 폴리유비퀴틴결합은, 유비퀴틴의 48번째 라이신에 다른 유비퀴틴이 결합하는 형태이다.Ubiquitin binds to the substrate by the sequential action of three proteins, E1, E2 and E3. Glycine in the C-terminal domain of ubiquitin binds to NH 3 in the R group of the lysine of the substrate protein to form a covalent bond with the substrate. Generally, ubiquitin-attached proteins are broken down by proteasomes. At this time, in order to be decomposed by the proteasome, polyubiquitin having several ubiquitins attached to the substrate. Until now at least 4, but of a poly-ubiquitin ubiquitin is only stick to the substrate a proteasome-dependent degradation of the substrate takes place is known and this is bonded in It is controversial because it is an in vitro experiment. Polyubiquitin bonds, which cause proteasome-dependent degradation, are forms in which other ubiquitin binds to the 48th lysine of ubiquitin.

E1 효소는 개체 내에 한 종류만이 존재하고, 개수가 가장 많다. E2는 여러 종류가 존재하고, 일반적으로 유비퀴틴을 E1에서 E3 또는 기질로 전달해주는 역할을 한다. E3는 E3 리가아제(ligase) 효소라고도 하며, 유비퀴틴을 기질에 붙게 하는 마지막 단계의 효소이다. E3가 유비퀴티네이션이 될 기질의 특이성을 결정하게 된다. 즉, 주어진 E3 효소와 상호작용할 수 있는 기질은 특이적으로 결정되어 있다. E3 효소는 크게 2가지 형태로 나눌 수 있는데, RING 도메인을 갖는 것과 HECT 도메인을 갖는 것이 그것이다. RING 도메인을 갖는 E3 효소들은 E2와 기질이 서로 가깝게 위치하도록 도와주는 역할을 한다. 즉, E2와 기질 두 물질이 E3와 결합을 하면, E2에 있는 유비퀴틴과 기질 사이에 충분히 가까운 거리가 형성되고 이 때 화학적으로 E2에 있던 유비퀴틴이 기질로 이동을 하게 된다. 반면 HECT 도메인을 갖고 있는 E3 효소에 속하는 것들은, E2에서 유비퀴틴을 전달받은 후, 이것을 기질로 이동을 시키게 된다.Only one type of E1 enzyme exists in an individual, and the largest number is. There are several types of E2, and in general, it plays a role in transferring ubiquitin from E1 to E3 or substrate. E3, also known as the E3 ligase enzyme, is the last step in attaching ubiquitin to the substrate. E3 determines the specificity of the substrate to be ubiquitated. That is, the substrate that can interact with a given E3 enzyme is specifically determined. E3 enzymes can be broadly divided into two types, one having a RING domain and one having an HECT domain. E3 enzymes with a RING domain help to keep E2 and substrate close together. In other words, when E2 and substrate combine with E3, a sufficiently close distance is formed between the ubiquitin in E2 and the substrate, and the ubiquitin in E2 chemically moves to the substrate. On the other hand, those belonging to the E3 enzyme having the HECT domain, after receiving the ubiquitin from E2, will be transferred to the substrate.

유비퀴틴의 63번째 라이신을 통한 폴리유비퀴틴 사슬은 신호 전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 대표적인 것으로는 염증 반응을 유발하는 NF-κB 의 활성화가 있다. 이 뿐만 아니라, 세포막의 엔도사이토시스(endocytosis)에는 유비퀴틴 한 분자가 붙어 관여하는 것이 알려져 있고, 전사가 일어나는 과정에 DNA의 올바른 전사를 결정하는 TCR(transcription coupled repair)에도 유비퀴틴이 관여하는 것으로 알려져 있다.The ubiquitin chain through the 63rd lysine of ubiquitin is known to be involved in signal transduction. Representative is the activation of NF-κB which causes an inflammatory response. In addition, ubiquitin molecules are known to be involved in endocytosis of cell membranes, and ubiquitin is also known to be involved in transcription coupled repair (TCR), which determines the correct transcription of DNA during transcription. .

유비퀴티네이션은 식물 뿐 아니라 모든 고등 생명체가 가지는 하나의 메카니즘으로써, 다양한 기능을 담당하고 있는 것으로 알려져 있으나, 비생물학적 스트레스에 관여하는 유전자는 거의 알려진 바가 없다. 본 발명은 애기장대의 비생물학적 스트레스 및 ABA 호르몬에 의해 발현이 유도되는 AtAIRP1 유전자를 분리획득 한 후, 이들 유전자의 과다발현 형질전환체 및 발현 억제 돌연변이체를 제작하여 이들의 생리적인 표현형을 분석하였다.Ubiquitation is a mechanism that all higher organisms, as well as plants, are known to have a variety of functions, but little is known about genes involved in abiotic stress. The present invention isolates and acquires the AtAIRP1 gene, which is induced by Abihormonal abiotic stress and ABA hormone, and analyzed the physiological phenotype of these genes by overexpressing transformants and expression inhibitory mutants. .

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인하였으며, 뿐만 아니라 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현 억제가 식물체의 발아를 촉진시킨다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors earnestly researched to find genes that can improve the resistance to dry stress of plants. As a result, when the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is involved in the trait of the above-described plant and is transformed into the plant, the improved trait described above It was confirmed that a transgenic plant having a can be obtained, as well as the fact that inhibition of expression of the nucleotide sequence promotes germination of the plant, thereby completing the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.Therefore, an object of the present invention to provide a composition for enhancing the dry stress resistance of plants.

본 발명의 다른 목적은 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention to provide a method for producing a transgenic plant with improved dry stress resistance.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 데 있다. It is another object of the present invention to provide a method for enhancing dry stress resistance of plants.

본 발명의 또 다른 목적은 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention to provide a composition for promoting germination of plants.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for enhancing dry stress resistance of a plant comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.

본 발명자들은 식물체의 건조 스트레스 저항성을 향상시킬 수 있는 유전자를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 바람직하게는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 상술한 식물체의 형질에 관여를 하고 이를 식물체에 형질전환시킨 경우에는 상술한 개선된 형질을 갖는 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 확인하였다.The present inventors earnestly researched to find genes that can improve the dry stress resistance of plants. As a result, when the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, preferably the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is involved in the trait of the plant described above and is transformed into the plant, the improved trait described above It was confirmed that a transgenic plant having a can be obtained.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진을 위하여 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleotide sequence used for enhancing the dry stress resistance of the plant is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.It is apparent to those skilled in the art that the nucleotide sequence used in the present invention is not limited to the nucleotide sequence described in the attached sequence listing.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. Variations in nucleotides do not result in changes in proteins. Such nucleic acids include functionally equivalent codons or codons that encode the same amino acid (eg, by degeneracy of the codon, six codons for arginine or serine), or codons that encode biologically equivalent amino acids. And nucleic acid molecules.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.Considering the above-described variations having biologically equivalent activity, the nucleic acid molecules used in the present invention are also interpreted to include sequences that exhibit substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing. Such substantial identity is at least 60% when the sequences of the present invention are aligned with each other as closely as possible and the aligned sequences are analyzed using algorithms commonly used in the art. By a sequence that shows homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol. 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215: 403-10 (1990)) is accessible from the National Center for Biological Information (NBCI) and the like, and is available on the Internet in blastp, blasm, It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLSAT is accessible at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparison methods using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b)상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c)식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention is (a) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence and forming an RNA molecule in a plant cell; And (c) provides a composition for enhancing the dry stress resistance of plants comprising a recombinant vector for plant expression comprising a poly A signal sequence that acts on plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.As used herein, the term “operably binding” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, whereby the regulatory sequence Will regulate transcription and / or translation of said other nucleic acid sequences.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).

본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이 크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.Promoters suitable for the present invention can be used for any of the commonly used in the art for the gene introduction of plants, for example, SP6 promoter, T7 promoter, T3 promoter, PM promoter, ubiquitin promoter of corn, cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (nos) promoter, Pigwart Mozaic virus 35S promoter, sugacrein basilisform virus promoter, commelina yellow mottle virus promoter, ribulose-1,5-bis-phosphate Photoinducible promoters of the carboxylase small subunit (ssRUBISCO), rice cytosolic triosphosphate isomerase (TPI) promoters, adenine phosphoribosyltransferase (APRT) promoters of Arabidopsis and octopine synthase promoters Include.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열은 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end) (Bevan et al. Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 OCS 터미네이터(octopine synthase terminator)서열을 포함한다. 가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-말단 폴리 A 시그널 서열은 NOS 서열이다.According to a preferred embodiment of the invention, the poly A signal sequence leading to 3'-end polyadenylation suitable for the invention is derived from the nopaline synthase gene of Agrobacterium tumefaciens (NOS 3 'end ) (Bevan et al. Nucleic Acids Research , 11 (2): 369-385 (1983)), derived from the Octopine synthase gene of Agrobacterium tumerification, 3 'terminal portion of the protease inhibitor I or II gene of tomato or potato, CaMV 35S Terminator and OCS terminator (octopine synthase terminator) sequences. Most preferably the 3'-terminal poly A signal sequence causing the polyadenylation suitable for the present invention is a NOS sequence.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.Optionally, the vector may additionally carry genes encoding reporter molecules such as luciferase and β-glucuronidase. In addition, the vectors of the invention antibiotic as selective marker (e.g., neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin, hygromycin, etc.) resistant gene (e.g., neomycin phospho-transferase dehydratase (npt Ⅱ), high Gromycin phosphotransferase ( hpt ), and the like).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물발현용 재조합벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터이다.According to a preferred embodiment, a recombinant vector for plant expression of the invention is Agrobacterium (Agrobacterium) binary vector.

본 명세서에서 용어“바이너리 벡터”는 Ti(tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB(left border)와 RB(right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 두 개로 나누어 놓은 벡터를 말한다. 본 발명의 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 특히 본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)GV3101이 바람직하다. As used herein, the term “binary vector” refers to a plasmid having a left border (LB) and a right border (RB), which are necessary for movement in a tumor inducible (Ti) plasmid, and a plasmid having a gene necessary for transferring a target nucleotide. Say vector. The transforming Agrobacterium of the present invention may be any one suitable for the expression of the nucleotide sequence of the present invention, and in particular, the Agrobacterium strain for plant transformation in the present invention is usually Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium). tumefaciens ) GV3101 is preferred.

본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들면 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 및 열충격법(heat shock) 등이 있다. 바람직하게는 전기천공법을 사용한다. The method of introducing the recombinant vector of the present invention into Agrobacterium may be carried out through various methods known to those skilled in the art, for example, particle bombardment, electroporation, transfection. ), The lithium acetate method and the heat shock (heat shock). Preferably electroporation is used.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물세포를 제공한다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a plant cell transformed with the nucleotide sequence or the recombinant vector for plant expression.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 뉴클레오타이드 서열 또는 식물발현용 재조합 벡터로 형질 전환된 식물체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a plant transformed with the nucleotide sequence or recombinant vector for plant expression.

본 발명의 형질전환 식물세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, (1987))에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡 터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton et ai. Cell 11:263:271(1977)), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz et ai. Mol . Genet . 199:178-182;(1985)). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다. Methods generally known in the art for preparing transformed plant cells and transformed plants of the present invention of Enzymology , Vol. 153, (1987). A plant can be transformed by inserting an exogenous polynucleotide into a carrier such as a plasmid or a virus such as a virus, and can use Agrobacterium bacteria as a medium (Chilton et ai. Cell 11: 263: 271 (1977)). Plants can be transformed by introducing foreign polynucleotides directly into plant cells (Lorz et ai. Mol . Genet . 199: 178-182; (1985)). For example, when using a vector that does not include a T-DNA site, electroporation, microparticle bombardment, or polyethylene glycol-mediated uptake may be used.

일반적으로 식물을 형질전환시킴에 있어 많이 사용되는 것이 외래성 폴리뉴클레오티드로 형질전환 된 아그로박테리움 투메페이시언스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포나 종자 등을 감염시키는 방법이다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). 당업자는 공지된 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포나 종자를 배양 또는 재배하여 식물로 발육시킬 수 있다.In general, agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium) transformed with foreign polynucleotides are widely used in transforming plants. tumefaciens ) to infect plant cells, seeds and the like (see US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011). A person skilled in the art can develop a plant by culturing or culturing the transformed plant cell or seed under known and appropriate conditions.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.In the present specification, the term “plant (body)” is understood as meaning including not only mature plants but also plant cells, plant tissues and seeds of plants that can develop into mature plants.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있으며, 특히 토마토와 같이 과피가 얇아 노화에 따른 품질 저하가 급격히 나타나는 식용 채소 또는 과일 그리고 잎이 주된 상품으로 거래되는 식물 등에 적용할 경우 저장 효율을 높이는 데 효과적이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.The plant to which the method of the present invention can be applied is not particularly limited. As a plant to which the method of the present invention can be applied, most dicotyledonous plants including lettuce, cabbage, potato and radish or monocotyledonous plants such as rice, barley and banana can be used. It is effective to increase the storage efficiency when applied to edible vegetables or fruits that show a sharp deterioration due to aging due to thin skins such as tomatoes and plants whose leaves are traded as main products. Preferably, the method of the present invention comprises food crops including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and sorghum; Vegetable crops including arabidopsis, cabbage, radish, peppers, strawberries, tomatoes, watermelons, cucumbers, cabbages, melons, pumpkins, green onions, onions, and carrots; Special crops, including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanuts and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, leeks, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas; Flowers, including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, and tulips; And feed crops, including lygras, redclover, orchardgrass, alphaalpha, tolsquescue and perennial lygragrass.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공한다: According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for producing a transgenic plant having enhanced dry stress resistance, comprising the following steps:

(a) 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및 (a) introducing a nucleotide or a plant expression recombinant vector of the present invention into a plant cell; And

(b) 상기 식물세포로부터 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(b) obtaining a transformed plant having enhanced dry stress resistance from the plant cells.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다: According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for enhancing dry stress resistance of a plant comprising the following steps:

(a) 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 식물발현용 재조합 벡터를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및 (a) introducing a nucleotide or a plant expression recombinant vector of the present invention into a plant cell; And

(b) 상기 식물세포로부터 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(b) obtaining a transformed plant having enhanced dry stress resistance from the plant cells.

식물발현용 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시될 수 있다.The method of introducing a recombinant expression vector for plant expression into plant cells may be carried out by various methods known in the art.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제(예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자, 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다(참조: 미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).Selection of transformed plant cells can be performed by exposing the transformed culture to a selection agent (eg metabolic inhibitors, antibiotics and herbicides). Plant cells that are transformed and stably contain marker genes that confer selective resistance are grown and divided in the cultures described above. Exemplary labels include, but are not limited to, the hygromycin phosphotransferase gene, glycophosphate resistance gene, and neomycin phosphotransferase (nptII) systems. Methods for the development or regeneration of plants from plant protoplasts or various exploits are well known in the art. Development or regeneration of plants comprising foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (see US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅 콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the plant of the present invention is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and sorghum; Vegetable crops including arabidopsis, cabbage, radish, peppers, strawberries, tomatoes, watermelons, cucumbers, cabbages, melons, pumpkins, green onions, onions, and carrots; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, ground beans and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, leeks, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas; Flowers, including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, and tulips; And fodder crops, including lygras, redclover, orchardgrass, alphaalpha, tolsquescue and perennial lygragrass. More preferably, the plant is a food crop comprising rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and sorghum.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제할 경우, 미숙발아를 억제하는 ABA 호르몬에 대한 민감성이 감소되면서 발아율이 증가된 것을 확인하였다(도 6b). According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for promoting germination of a plant comprising a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the nucleotide sequence of the present invention. According to the present invention, when inhibiting the expression of the nucleotide sequence of the present invention, it was confirmed that the germination rate was increased while reducing the sensitivity to the ABA hormone that inhibits immature germination (Fig. 6b).

본 명세서에서 용어“발현 억제”는 표적 유전자의 기능 저하를 야기하는 뉴클레오타이드 서열상의 변형을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다. As used herein, the term “inhibition of expression” means a modification on the nucleotide sequence that causes a decrease in the function of the target gene, and preferably means that the target gene expression becomes undetectable or present at a meaningless level.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 핵산분자는 T-DNA이다.According to a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid molecule of the invention is T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, peptide nucleic acids (PNA) or antisense oligonucleotides. More preferably, the nucleic acid molecule of the present invention is T-DNA.

본 명세서에서 용어 “siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전 자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.As used herein, the term “siRNA” refers to a short double-chain RNA capable of inducing RNA interference (RNAi) through the cleavage of a particular mRNA. It consists of a sense RNA strand having a sequence homologous to mRNA of a target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. Since siRNA can inhibit expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knockdown method or as a method of gene therapy.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음)등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 타겟 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.siRNAs are not limited to the complete pairing of double-stranded RNA pairs paired with RNA, but paired by mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (there are no bases corresponding to one chain), etc. May be included. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, most preferably 20 to 70 bases. The siRNA terminal structure can be blunt or cohesive, as long as the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect. The cohesive end structure is possible in both a three-terminal protruding structure and a five-terminal protruding structure. The number of protruding bases is not limited. For example, the number of bases may be 1 to 8 bases, preferably 2 to 6 bases. In addition, siRNA is a low-molecular RNA (e.g., a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, viral RNA or artificial RNA) in the protruding portion of one end to the extent that can maintain the expression inhibitory effect of the target gene Molecules). The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure at both sides, and may be a stem loop type structure in which one terminal portion of the double chain RNA is connected by a linker RNA. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with pairing of stem portions.

본 명세서에서 용어 “shRNA”는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오 타이드를 의미하며, in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있다. 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성한다.As used herein, the term “shRNA” refers to a nucleotide consisting of 50-70 single strands, in Stem-loop structure in vivo . Long RNAs of 19-29 nucleotides complementary to both loop regions of 5-10 nucleotides form base pairs to form a double stranded stem.

본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 유전자 발현을 조절하며, 전장 20-50개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20-45개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 20-40개 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20-30개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21-23개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일 가닥 RNA분자를 의미한다. miRNA는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드이며, 짧은 스템-루프 구조를 가진다. miRNA는 1 또는 2이상의 mRNA(messenger RNA)와 전체 또는 부분적으로 상동성을 가지며, 상기 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제시킨다.As used herein, the term “miRNA (microRNA)” regulates gene expression and has a total length of 20-50 nucleotides, preferably 20-45 nucleotides, more preferably 20-40 nucleotides, even more preferably 20- It refers to a single stranded RNA molecule consisting of 30 nucleotides, most preferably 21-23 nucleotides. miRNAs are oligonucleotides that are not expressed intracellularly and have a short stem-loop structure. miRNAs are homologous, in whole or in part, with one or more mRNAs (messenger RNAs) and inhibit target gene expression through complementary binding to the mRNAs.

본 명세서에서 용어 “리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 전령 RNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 되어 있다.As used herein, the term “ribozyme” refers to an RNA molecule having a function such as an enzyme that recognizes a base sequence of a specific RNA and cleaves it by itself as a kind of RNA. Ribozyme is a complementary nucleotide sequence of a target messenger RNA strand consisting of a region that binds with specificity and a region that cleaves the target RNA.

본 명세서에서 용어 “PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지고 있는 분자로서, DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 핵산염기(nucleobase)가 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1999년에 처음 보고되었다(문헌 [Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine- substituted polyamide", Science 1991, Vol. 254: pp1497-1500]). PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성된다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 이중가닥을 형성한다. 길이가 같은 경우 PNA/DNA 이중가닥은 DNA/DNA 이중가닥보다, PNA/RNA 이중가닥은 DNA/RNA 이중가닥보다 안정하다. 펩티드 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이며, 이 경우 펩티드 핵산의 기본골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산염기는 공간적 크기와 핵산염기 사이의 거리가 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.As used herein, the term “PNA (Peptide nucleic acid)” is a molecule having both the properties of a nucleic acid and a protein, and means a molecule capable of complementarily binding to DNA or RNA. PNA was first reported in 1999 as analogous DNA with nucleobases linked by peptide bonds (Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O, "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-"). substituted polyamide ", Science 1991, Vol. 254: pp 1497-1500]. PNA is not found in nature but is artificially synthesized by chemical methods. PNAs hybridize with native nucleic acids of complementary base sequences to form double strands. PNA / DNA double strands are more stable than DNA / DNA double strands and PNA / RNA double strands are more stable than DNA / RNA double strands. It is most commonly used as a peptide basic skeleton that N- (2-aminoethyl) glycine is repeatedly connected by an amide bond. In this case, the backbone of the peptide nucleic acid is electrically different from that of the negatively charged natural nucleic acid. As neutral. The four nucleic acid bases present in the PNA have approximately the same spatial size and distance between nucleic acid bases as for natural nucleic acids. PNA is not only chemically stable than natural nucleic acids, but also biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 오타이드 본 발명의 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 타겟 유전자의 mRNA에 상보적이고 타겟 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 타겟 유전자의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(trans의 cation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내 40 염기이다.As used herein, the term “antisense oligonucleotide” refers to DNA or RNA or derivatives thereof that contain a nucleotide sequence complementary to a sequence of a particular mRNA, and binds to a complementary sequence within the mRNA to inhibit translation of the mRNA into a protein. Antisense nucleotide sequence of the present invention means a DNA or RNA sequence complementary to the mRNA of the target gene and capable of binding to the mRNA of the target gene, translation of the target gene mRNA, translocation into the cytoplasm (trans cation ), Inhibition of maturation or essential activity on all other global biological functions. The antisense oligonucleotides are 6 to 100 bases in length, preferably 10 to 40 bases.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.The antisense oligonucleotides can be modified at one or more bases, sugars or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol . , 5 (3): 343-55, 1995). Oligonucleotide backbones can be modified with phosphorothioates, phosphoroesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic intersaccharide bonds, and the like. In addition, antisense nucleic acids may comprise one or more substituted sugar moieties. Antisense oligonucleotides may comprise modified bases. Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-me pyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. There is this.

본 명세서에서 용어“T-DNA”는 Agrobacterium 종의 Ti(tumor-inducing) 플라스미드의 전달(transfer) DNA로서 숙주 식물세포의 핵으로 전달되는 DNA 절편을 말한다. T-DNA의 양 끝 가장자리에는 25 bp의 반복서열이 존재하며, 전달은 왼쪽 경계(border)에서 전달이 시작되어 오른쪽 경계에서 종료된다. 박테리아 T-DNA는 약 20,000 bp 길이로서 이들의 삽입에 의하여 타겟 유전자를 붕괴시킴으로서 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis)를 일으키는 데에 사용되며, 삽입된 T-DNA 서열은 돌연변이를 일으킬 뿐 아니라 타겟 유전자를 표지하기도 한다. 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 Ti 플라스미드의 형질도입을 통하여 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체를 제작하였으며, T-DNA 보더 프라이머(boder primer)(LB_6313R)와 T-DNA가 삽입된 부위의 앞, 뒤 부분의 프라이머를 이용하여 지노타이핑 PCR을 진행한 결과 T-DNA가 네 번째 엑손에 삽입된 것을 확인하였으며, 발현억제 돌연변이체의 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 유전자의 발현이 억제되었음을 확인하였다.As used herein, the term “T-DNA” refers to Agrobacterium. Refers to a DNA fragment that is transferred to the nucleus of a host plant cell as transfer DNA of a species-inducing (Ti) plasmid. 25 bp repeats exist at both edges of the T-DNA, and delivery starts at the left border and ends at the right border. The bacterial T-DNA is about 20,000 bp long and is used to cause insertional mutagenesis by disrupting the target gene by their insertion, and the inserted T-DNA sequence not only causes mutation but also labels the target gene. do. According to the present invention, the present inventors produced the expression inhibitory mutant of the AtAIRP1 gene by transduction of Ti plasmid, and the front and rear of the T-DNA border primer (LB_6313R) and the T-DNA insertion site As a result of genotyping PCR using the primer of the part, it was confirmed that T-DNA was inserted into the fourth exon, and RNA expression of the expression inhibitory mutant was extracted to confirm that gene expression was inhibited by RT-PCR. .

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물, 상기 조성물이 도입된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for enhancing the dry stress resistance of a plant, a transformed plant into which the composition is introduced, a method for producing the transformed plant, and a method for enhancing dry stress resistance of the plant.

(b) 본 발명은 식물체의 발아 촉진용 조성물을 제공한다.(b) The present invention provides a composition for promoting germination of plants.

(c) 본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성 및 발아능에 관여를 하며, 이를 이용하여 식물체를 형질전환 또는 발현 억제를 함으로서 탁월하여 가뭄 내성이 탁월하거나 또는 속성재배가 가능한 신기능 식물체로서 유용하게 이용될 수 있다.(c) The nucleotide sequence used in the present invention is involved in the resistance to the dry stress of plants and germination ability, by using this to transform or suppress the expression of plants excellence by excellent drought resistance or rapid cultivation It can be usefully used as a plant.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험방법Experiment method

유전자의 분리 획득Gene acquisition

본 발명자들은 ABA 호르몬 및 비생물학적 스트레스에 의해서 유도되는 AtAIRP1 유전자를 애기장대의 cDNA로부터 분리 획득하였다. 10일된 야생형 애기장대의 유묘를 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 파우더로 만든 다음 1 g 당 2 ml 의 추출 완충액(4 M 구아니딘-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA(USB), 0.5% 사르코실(SIGMA, pH 9)과 β-머캅토에탄올(SIGMA-ALDRICH)을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI(페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 = 25 : 24 : 1)와 혼합하여 5분간 흔들어 준 다음 3,500 rpm에서 25분간 원심분리(한일 원심분리기, HA-1000-3)하였다. 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고, 동량의 PCI를 혼합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 수행하고, 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2회 에탄올 침전 및 1회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다. 정량을 통해 2 μg 의 RNA를 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소(Fermentas)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Takara) 5 ㎕, dNTP 혼합액(각 1.25 mM) 8 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Takara)를 넣어 총 부피를 50 ㎕ 로 만들었다. Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머는 5'- ATGGGTTGCTGCTGTTGTCTC-3'(AtAIRP1 ORF FW: 서열목록 제 3 서열) 및 5'-TTATGATTCAGTGAGCACTAAT-3'(AtAIRP1 ORF RV: 서열목록 제 4 서열)이다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 30회 수행하였고, 30회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 전기영동 방법을 이용하여 AtAIRP1 유전자의 증폭을 확인하였고, 이 DNA를 시퀀싱하여 다시 한번 확인하였다. We have isolated and obtained the AtAIRP1 gene induced by ABA hormone and abiotic stress from cDNA of Arabidopsis. Seedlings of 10-day wild-type Arabidopsis larvae were ground in a mortar with liquid nitrogen and powdered, followed by 2 ml of extraction buffer (4 M guanidine-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA (USB), 0.5 per g). Extract with% Sarcosyl (SIGMA, pH 9) and β-mercaptoethanol (SIGMA-ALDRICH), transfer to conical tubes, and then add the same amount of PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24: 1) After shaking for 5 minutes and centrifuged at 3,500 rpm for 25 minutes (Hanil Centrifuge, HA-1000-3) After centrifugation, the upper organic solvent layer was removed, the same amount of PCI was mixed and shaken, followed by centrifugation. The procedure was repeated two times, and the resulting aqueous layer was separated from the RNA using two ethanol precipitation and one LiCl precipitation methods, quantitatively raising 2 μg of RNA and dT primer and MMLV reverse transcriptase. Single-stranded cDNA using Fermentas 20 ng of cDNA was used as a template for PCR, and two primers each were used at 10 pmole, 5 μl of 10 × Taq polymerase buffer (Takara), 8 μl of dNTP mixture (1.25 mM each), and 1 A total volume of 50 μl was added to the unit by Taq DNA polymerase (Takara) PCR was performed with a Perkin Elmer DNA thermal cycler Primer used was 5′-ATGGGTTGCTGCTGTTGTCTC-3 ′ (AtAIRP1 ORF FW: Sequence Listing 3). Sequence) and 5'-TTATGATTCAGTGAGCACTAAT-3 '(AtAIRP1 ORF RV: SEQ ID NO: 4 sequence), first denature at 94 ° C for 2 minutes, then 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 52 ° C, 1 minute at 72 ° C. After repeating 30 times, the polymerization was further performed for 5 minutes at 72 ℃ after the end of 30 iterations and then confirmed the amplification of the AtAIRP1 gene using an electrophoresis method, the DNA was sequenced and confirmed again It was.

식물 성장조건 및 시료 채취Plant Growth Conditions and Sampling

AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭션을 하였다. 먼저 pENTR SD Topo 벡터(Invitrogen, USA)에 AtAIRP1-sGFP를 넣어준 후, LR clonase 효소(Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pEarlygate 100 벡터(Arabidopsis research center, USA)에 치환시켰다. AtAIRP1 발현억제 돌연변이 식물체는 AtAIRP1의 유전자에 T-DNA가 삽입된 돌연변이 애기장대의 종자(종자번호: Salk_110094)를 SIGNAL Salk Institute Genomuc Analysis Laboratory (http://signal.salk.edu/)에서 구입하였다. AtAIRP1 The construct was constructed using the Invitrogen gateway system for the overexpression of the gene. First, AtAIRP1-sGFP was added to the pENTR SD Topo vector (Invitrogen, USA), and then substituted with plant pEarlygate 100 vector (Arabidopsis research center, USA) using LR clonase enzyme (Invitrogen). AtAIRP1 Expression inhibitory mutant plants were purchased from the SIGNAL Salk Institute Genomuc Analysis Laboratory (http://signal.salk.edu/) for mutant Arabidopsis seeds (Texas Salk_110094) in which T-DNA was inserted into the AtAIRP1 gene.

이러한 AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체, AtAIRP1 유전자가 파괴된 돌연변이체 및 야생형 애기장대 종자를 30% 락스(유한-크로락스)와 0.025%의 트리톤 X-100에 10분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 세척하였다. 처리된 종자는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/L), 0.8% 아가로 구성-되어있는 MS 배지(Duchedfa Biochemie)에 수직으로 심은 후 약 2주간 생장 챔버(16시간 광 조건/ 8시간 암 조 건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. 빛 조건의 전체 식물체(Green whole plant)를 재료로 사용한 경우는 종자를 Sunshine MIX #5 (Sun GroHorticulture) 흙을 넣어 준 화분에 심어서 약 3주간 생장 챔버(16시간 광 조건/8시간 암 조건)에서 성장시킨 식물을 재료로 하여 수행하였다.Such AtAIRP1 Gene overexpression of the gene, AtAIRP1 Mutant and wild type Arabidopsis seeds whose genes were destroyed were sterilized with 30% Lax (finite-Clox) and 0.025% Triton X-100 for 10 minutes and washed with water at least 10 times. Treated seeds were grown vertically in MS medium (Duchedfa Biochemie) consisting of 3% sucrose, B5 vitamins (12 mg / L) and 0.8% agar, followed by a growth chamber for about 2 weeks (16 hours light condition / 8 hours). Under conditions of the dark). When using green whole plant under light conditions, seeds are planted in pots in which Sunshine MIX # 5 (Sun GroHorticulture) soil is put in a growth chamber for about 3 weeks (16 hours light condition / 8 hours dark condition). Plants grown at were carried out with the material.

스트레스(염, 저온, 건조) 처리Stress (salt, low temperature, dry) treatment

스트레스에 대한 AtAIRP1 유전자의 발현을 확인하기 위해, 건조 스트레스는 배지에서 2주간 키운 야생형 애기장대 유묘를 공기 중에 노출한 후 1시간 및 2시간 후에 샘플링하였다. 염 스트레스는 2주간 키운 애기장대에 100 mM 의 염화나트륨을 처리한 후 1시간, 2시간이 경과한 후 샘플링하였다. 저온 스트레스는 배지에서 2주간 키운 애기장대 유묘를 4℃가 유지되는 인큐베이터에서 6시간, 12시간 동안 배양하고 조직을 샘플링하였다. ABA 호르몬 처리는 2주간 키운 애기장대 유묘를 100 μM의 ABA(SIGMA)를 처리한 후 1.5시간 및 3시간이 경과한 후 샘플링 하였다. 샘플링 된 조직을 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 가루로 만든 다음 1 g 당 2 ml의 추출 완충액(4 M 구아니딘-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA(USB), 0.5% 사르코실(SIGMA), pH 9)과 β-머캅토에탄올(SIGMA-ALDRICH)을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI(페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 = 25 : 24 : 1)와 혼합하여 5분간 흔들어 준 다음 3,500 rpm에서 25분간 원심분리(한일 원심분리기, HA-1000-3)하였다. 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고, 동량의 PCI를 혼합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복 하여 수행하고, 이때 형성된 아래의 수용액 층을 2회 에탄올 침전 및 1회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다.To confirm the expression of the AtAIRP1 gene against stress, dry stress was sampled 1 and 2 hours after exposure to air of wild type Arabidopsis seedlings grown for 2 weeks in medium. Salt stress was sampled after 1 hour and 2 hours after treatment with 100 mM sodium chloride in Arabidopsis cultivars grown for 2 weeks. Cold stress was cultured Arabidopsis seedlings grown for 2 weeks in the medium for 6 hours, 12 hours in an incubator maintained at 4 ℃ and sampled tissue. For ABA hormone treatment, Arabidopsis seedlings grown for 2 weeks were sampled after 1.5 and 3 hours after 100 μM of ABA (SIGMA). The sampled tissue was ground in a mortar with liquid nitrogen and then ground to powder, then 2 ml of extraction buffer per g (4 M guanidine-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA (USB), 0.5% sarcosyl) SIGMA), pH 9) and β-mercaptoethanol (SIGMA-ALDRICH), extracted and transferred to conical tubes and mixed with the same amount of PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24: 1) After shaking for 5 minutes and centrifuged for 25 minutes at 3,500 rpm (Hanil Centrifuge, HA-1000-3). After centrifugation, the upper organic solvent layer was removed, the same amount of PCI was mixed and shaken, and then the centrifugation process was repeated twice. At this time, the formed aqueous layer was subjected to two ethanol precipitation and one LiCl precipitation methods. RNA was isolated.

정량적 Quantitative 역전사효소Reverse transcriptase (( RTRT )-) - PCRPCR

발현억제 돌연변이 식물체 및 과발현 형질전환 식물체와 야생종의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하여 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소(Fermentas)를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole 씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액(Intron) 5 ㎕, dNTP 혼합액(각 1.25 mM) 8 ㎕ 및 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(intron)를 넣어 총 부피를 50 ㎕ 로 만들었다. Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 25회 수행하였고, 25회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. 사용된 유전자의 프라이머는 아래의 표 1과 같다.Whole RNA was extracted from the expression suppressing mutant plants, overexpressing transgenic plants, and leaves of wild species to synthesize single stranded cDNA using oligo dT primers and MMLV reverse transcriptase (Fermentas). 20 ng of cDNA was used as a template for PCR. Two primers were used at 10 pmole, 5 μl of 10 × Taq polymerase buffer (Intron), 8 μl of dNTP mixture (1.25 mM each), and 1 unit of Taq. DNA polymerase (intron) was added to make a total volume of 50 μl. PCR was performed with a Perkin Elmer DNA thermal cycler. First, denatured at 94 ° C. for 2 minutes, followed by repeating 25 times at 94 ° C. for 30 seconds, at 52 ° C. for 30 seconds, and at 72 ° C. for 25 minutes. The reaction was carried out and then stored frozen at -20 ℃. Primers of the genes used are shown in Table 1 below.

RT-PCR에 사용된 유전자의 프라이머 Primer of gene used for RT-PCR 프라이머primer 서열order AtAIRP1 FW1(서열목록 제 5 서열)AtAIRP1 FW1 (SEQ ID NO: 5 Sequence) 5'- GAGCTGCTATACACTGATCTGAG -3'5'- GAGCTGCTATACACTGATCTGAG -3 ' AtAIRP1 FW2(서열목록 제 6 서열)AtAIRP1 FW2 (SEQ ID NO: 6 Sequence) 5'- GAGATTGATAACCCGAAATTGC -3'5'- GAGATTGATAACCCGAAATTGC -3 ' AtAIRP1 RV1(서열목록 제 7 서열)AtAIRP1 RV1 (SEQ ID NO: 7 Sequence) 5'- CTCTGAATTTTCAGGCTCTTCT -3'5'- CTCTGAATTTTCAGGCTCTTCT -3 ' AtAIRP1 RV2(서열목록 제 8 서열)AtAIRP1 RV2 (SEQ ID NO: 8 Sequence) 5'- ACAAATTGGACATTCATCG -3'5'- ACAAATTGGACATTCATCG -3 ' AtAIRP1 ORF FW(서열목록 제 9 서열)AtAIRP1 ORF FW (SEQ ID NO: 9 Sequence) 5'- ATGGGTTGCTGCTGTTTCTC -3'5'- ATGGGTTGCTGCTGTTTCTC -3 ' AtAIRP1 ORF RV(서열목록 제 10 서열)AtAIRP1 ORF RV (SEQ ID NO: 10 Sequence) 5'- GTGAGCACTAATTCCTTATCGC -3'5'- GTGAGCACTAATTCCTTATCGC -3 ' Rab18 FW(서열목록 제 11 서열)Rab18 FW (SEQ ID NO: 11 Sequence) 5'- GCGTCTTACCAGAACCGTCC -3'5'- GCGTCTTACCAGAACCGTCC -3 ' Rab18 RV(서열목록 제 12 서열)Rab18 RV (SEQ ID NO: 12 Sequence) 5'-CCCTTCTTCTCGTGGTGC -3'5'-CCCTTCTTCTCGTGGTGC -3 ' RD29a FW(서열목록 제 13 서열)RD29a FW (SEQ ID NO: 13 Sequence) 5'- CAGGTGAATCAGGAGTTGTT -3'5'- CAGGTGAATCAGGAGTTGTT -3 ' RD29a RV(서열목록 제 14 서열)RD29a RV (SEQ ID NO: 14 Sequence) 5'- CCGGAAATTTATCCTCTTCT -3'5'- CCGGAAATTTATCCTCTTCT -3 ' UBC10 FW(서열목록 제 15 서열)UBC10 FW (SEQ ID NO: 15 Sequence) 5'- TGGATATGGCGTCGAAGC -3'5'- TGGATATGGCGTCGAAGC -3 ' UBC10 RV(서열목록 제 16 서열)UBC10 RV (SEQ ID NO: 16 Sequence) 5'- GTGGGATTTTCCATTTAGCC -3'5'- GTGGGATTTTCCATTTAGCC -3 '

T-T- DNADNA 가 삽입된 돌연변이체의 지놈 Genome of mutant DNADNA 추출 및 동형접합 돌연변이체 획득 Extraction and homozygous mutants

야생형 및 발현억제 돌연변이 애기장대의 종자를 흙에 심어 2주 동안 키운 뒤 각각의 잎을 샘플링한 후 액체질소를 이용하여 간 후 CTAB 완충액(2 % CTAB, 100 mM Tris pH 8, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2 % PVP) 700 ml 를 넣고 혼합하고 65℃에서 10분 동안 가열하였다. 클로로포름 200 ml 를 넣고 혼합한 후 원심분리를 통해 상층액을 얻어내고 이소프로판올을 섞어 DNA를 침전시켰다. 원심분리 후 얻어진 침전물을 70% 에탄올로 세척한 뒤 말려서 얻어진 지놈 DNA를 물로 녹여서 사용하였다. 이후 T-DNA 보더 프라이머(boder primer)(LB_6313R)와 T-DNA가 삽입된 부위의 앞, 뒤 부분의 프라이머를 이용하여 지노타이핑 PCR을 진행하였다.Seeds of wild-type and expression-suppressive mutant Arabidopsis cultivars were grown in soil for 2 weeks, each leaf was sampled, and then flown using liquid nitrogen, followed by CTAB buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8, 20 mM EDTA, 1.4). 700 ml of M NaCl, 2% PVP) was added thereto, mixed and heated at 65 ° C. for 10 minutes. 200 ml of chloroform was added to the mixture, followed by centrifugation to obtain a supernatant, and isopropanol was mixed to precipitate DNA. The precipitate obtained after centrifugation was washed with 70% ethanol and dried to dissolve the obtained genome DNA with water. Then, genotyping PCR was performed using primers in front and rear of the T-DNA border primer (LB_6313R) and the T-DNA insertion site.

지노타이핑 PCR에 사용된 프라이머Primers Used for Genotyping PCR 프라이머primer 서열order LB_6313R(서열목록 제 17 서열)LB_6313R (SEQ ID NO: 17 Sequence) 5'- GAGCTGCTATACACTGATCTGAG -3'5'- GAGCTGCTATACACTGATCTGAG -3 ' AtAIRP1 FW1(서열목록 제 18 서열)AtAIRP1 FW1 (SEQ ID NO: 18 Sequence) 5'- GAGATTGATAACCCGAAATTGC -3'5'- GAGATTGATAACCCGAAATTGC -3 ' AtAIRP1 FW2(서열목록 제 19 서열)AtAIRP1 FW2 (SEQ ID NO: 19 Sequence) 5'- CTCTGAATTTTCAGGCTCTTCT -3'5'- CTCTGAATTTTCAGGCTCTTCT -3 ' AtAIRP1 RV1(서열목록 제 20 서열)AtAIRP1 RV1 (SEQ ID NO: 20 Sequence) 5'- ACAAATTGGACATTCATCG -3'5'- ACAAATTGGACATTCATCG -3 ' AtAIRP1 RV2(서열목록 제 21 서열)AtAIRP1 RV2 (SEQ ID NO: 21 Sequence) 5'- ATGGGTTGCTGCTGTTTCTC -3'5'- ATGGGTTGCTGCTGTTTCTC -3 '

AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체에 있어서 T-DNA가 네 번째 엑손에 삽입된 것을 알 수 있었고, T-DNA가 삽입된 지역의 앞, 뒤 부분 및 T-DNA의 보더 프라이머를 이용하여 PCR의 방법으로 T-DNA가 삽입됨을 보여준다. 또한 발현억제 돌연변이체의 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 유전자의 발현이 억제된 것을 알 수 있었다(도 4a). In the expression inhibitory mutant of the AtAIRP1 gene, T-DNA was inserted into the fourth exon, and PCR was performed using the front and rear portions of the region where T-DNA was inserted and the border primers of T-DNA. T-DNA is inserted. In addition, it was found that the expression of the gene was inhibited by extracting RNA of the expression inhibitory mutant (RT-PCR) (FIG. 4A).

AtAIRP1AtAIRP1 유전자의 벡터 구축물의 제조 Preparation of Vector Constructs of Genes

말토오즈에 결합하는 단백질과 AtAIRP1을 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해 AtAIRP1의 코딩 부분의 5' 및 3'쪽에 EcoRI 제한효소에 해당하는 서열을 연결한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X 벡터(New England Biolabs, Beverly,MA)를 EcoRI 제한효소로 자른 다음 T4 DNA 라이가제(New England Bio Lab) 효소를 이용하여 라이게이션(ligation) 하였다. 재조합된 MBP-AtAIRP1을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3) RIL(스트라테이진)에 발현시킨 후, 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제하였다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다. 또한, 본 발명에서는 형질전환체 제작을 위하여 Invitrogen gateway 시스템을 이용하여 컨스트럭션을 하였다. 먼저 pENTR SD topo 벡터(Invitrogen, USA)에 AtAIRP1-sGFP를 넣어준 후, LR clonase 효소(Invitrogen)를 이용하여 식물체의 pEarlygate 100 벡터(Arabidopsis research center, USA)에 치환시켰다.In order to recombine the protein binding to maltose and the plasmid to be expressed by fusion of AtAIRP1, PCR was performed using a primer set connecting sequences corresponding to Eco RI restriction enzymes on the 5 'and 3' sides of the AtAIRP1 coding portion. PCR products and pMAL-X vectors (New England Biolabs, Beverly, MA) were cut with Eco RI restriction enzymes and then ligated using T4 DNA ligase (New England Bio Lab) enzymes. Recombinant MBP-AtAIRP1 was expressed in E. coli BL21-CodonPlus (DE3) RIL (stratagene) and then purified using amylose column chromatography. Protein was quantified using BSA as standard protein. In the present invention, the construct was constructed using the Invitrogen gateway system for the production of transformants. First, AtAIRP1-sGFP was added to the pENTR SD topo vector (Invitrogen, USA), and then substituted with plant pEarlygate 100 vector (Arabidopsis research center, USA) using LR clonase enzyme (Invitrogen).

아그로박테리움으로 To Agrobacterium AtAIRP1AtAIRP1 형질전환 및 형질전환 애기장대 식물체의 제조Transformation and Preparation of Transgenic Arabidopsis Plants

제작된 구축물은 아그로박테리움(GV3101)에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다. 약 4 주된 애기장대(columbia [Col-0])의 지상 부위를 0.05% 실웨트가 포함된 MS 배지(Duchefa Biochemie)에 1분 30초간 담구는 방법으로 형질전환 시켰다(clough and Bent, 1998, Plant J 16; 735-743). 약 3주간 23℃의 생장 챔버에서 배양하고, 종자를 받은 후(T1), 25 ㎍/㎖ 의 카나마이신과 250 ㎍/㎖의 카르베니실린이 포함된 배지에서 살아남는 개체들을 골라 형질전환 유전자의 존재 여부를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 검증하였다. 과다발현은 항-GFP 항체를 이용해 관찰하였고 단백질양은 항-액틴 항체를 이용해 보정하였다.The constructed construct was transformed into Agrobacterium (GV3101) using electroporation, and the presence or absence of the gene was confirmed by PCR. The ground parts of approximately 4 weeks old Arabidopsis (columbia [Col-0]) were transformed by immersion in MS medium (Duchefa Biochemie) containing 0.05% silwet for 1 minute and 30 seconds (clough and Bent, 1998, Plant). J 16; 735-743). After culturing in a growth chamber at 23 ° C. for about 3 weeks and receiving seeds (T1), individuals who survived the medium containing 25 μg / ml kanamycin and 250 μg / ml carbenicillin were selected for the presence of the transgene. Was verified via RT-PCR and Western blot. Overexpression was observed with anti-GFP antibody and protein amount was corrected with anti-actin antibody.

AtAIRP1AtAIRP1 단백질의 효소활성 분석 Enzyme Activity Analysis of Proteins

본 발명에서는 AtAIRP1 단백질의 효소활성 분석을 위해, pMAL-X 벡터에 AtAIRP1 유전자의 ORF를 MBP(maltose binding protein) 프레임에 맞게 서브클로닝을 수행하였다. 또한, 효소 활성을 결정짓는 링 핑거 도메인(Ring finger domain)의 127번째 히스티딘 아미노산을 타이로신으로 치환한 유전자 역시 서브클로닝을 수행하였다. 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 2mM ATP, 2 mM 디티오트레이톨(DTT), 300 ng/㎕ 유비퀴틴(Sigma), 25 μM MG132(A.G. Scientific Inc.), 500 ng UBA1(ABRC, http://www.arabidopsis.org), 500 ng UBC8(ABRC, http://www.arabidopsis.org), MBP-AtAIRP1 500 ng을 각각의 튜브에 넣어준 후 30℃ 배양기에서 배양하였다. 샘플 완충용액을 넣어준 다음 100℃에서 5분간 끓이고 항-MBP(New England Bio Labs), 항-유비퀴틴(Santa Cruz) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.In the present invention, for the enzymatic activity analysis of the AtAIRP1 protein, subcloning of the ORF of the AtAIRP1 gene in the pMAL-X vector was performed in accordance with the MBP (maltose binding protein) frame. In addition, the gene which substituted tyrosine for the 127th histidine amino acid of the ring finger domain which determines the enzyme activity was also subjected to subcloning. 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl 2 , 2 mM ATP, 2 mM dithiothreitol (DTT), 300 ng / μl ubiquitin (Sigma), 25 μΜ MG132 (AG Scientific Inc.), 500 ng UBA1 ( ABRC, http://www.arabidopsis.org), 500 ng UBC8 (ABRC, http://www.arabidopsis.org), and MBP-AtAIRP1 500 ng were added to each tube and incubated in a 30 ° C. incubator. Sample buffer was added and then boiled at 100 ° C. for 5 minutes and Western blot was performed using anti-MBP (New England Bio Labs) and anti-ubiquitin (Santa Cruz) antibodies.

식물체 생장 비교Plant growth comparison

ABA 호르몬에 대한 표현형을 비교하기 위해서 야생형, AtAIRP1 발현억제 돌연변이 식물체, AtAIRP1 과다발현 식물체에서 얻어진 종자를 ABA 호르몬이 0, 0.1, 0.5 및 1 μM 로 첨가된 배지에서 5일 동안 키운 후 발아된 정도를 비교하였다. 또한 식물의 성장을 비교하기 위해서 0, 0.1, 0.5 및 1 μM 로 첨가된 배지에서 10일 동안 키운 후 유묘의 생장 차이를 비교하였다.To compare phenotypes for ABA hormones, seedlings obtained from wild-type, AtAIRP1 inhibitory mutant plants, and AtAIRP1 overexpressing plants were grown for 5 days in medium supplemented with 0, 0.1, 0.5 and 1 μM of ABA hormone, and then germinated. Compared. In addition, to compare the growth of the plants were grown for 10 days in medium added at 0, 0.1, 0.5 and 1 μM and compared the growth of seedlings.

성체 식물의 건조 스트레스에 대한 민감도 측정Determination of sensitivity to dry stress in adult plants

야생형 및 AtAIRP1 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 종자를 흙에서 2주 동안 키운 뒤, 각각 10일 또는 11일 동안 물을 주지 않다가 다시 물을 준 후 건조 스트레스에 내성을 갖는 정도를 측정하였다. Seeds of wild type and AtAIRP1 expression inhibitory mutant plants and overexpressed plants were grown in soil for 2 weeks, and then watered for 10 or 11 days, respectively, and then watered again to determine the degree of resistance to dry stress.

기공개폐(Pore opening and closing stomatalstomatal apertureaperture ) 측정) Measure

5주 동안 흙에서 키운 야생형 및 AtAIRP1 발현억제 돌연변이 식물체, 과다발현 식물체의 잎을 딴 후 기공 개방 용액(10mM MES-KOH, 50 mM CaCl2, 10 mM KCl)에 2시간 동안 담근 후 기공이 모두 열리면 농도별로 ABA호르몬이 첨가된 개방 용액으로 옮겨 2시간 동안 담궈 놓았다. 이후 광학 현미경을 통하여 기공개폐의 정도를 측정하였다. Wild-type and AtAIRP1 expression-suppressive mutant plants grown in soil for 5 weeks, overexpressed plants were picked and soaked in pore open solution (10 mM MES-KOH, 50 mM CaCl 2 , 10 mM KCl) for 2 hours, and then the pores were opened. Each concentration was transferred to an open solution containing ABA hormone and soaked for 2 hours. Then, the degree of pore openness was measured through an optical microscope.

실험결과Experiment result

스트레스(염, 저온, 건조) 처리시 When stress (salt, low temperature, dry) processing AtAIRP1AtAIRP1 의 발현양상Expression of

다양한 비생물학적 스트레스에서 AtAIRP1 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 저온(6시간, 12시간) 및 건조 스트레스(1시간, 2시간)(도 2a) (B)100 mM 농도의 소금물을 1.5 시간 및 3시간 처리한 후(도 2b), 100 μM ABA 호르몬을 1.5시간 및 3시간 처리한 후(도 2c) 각각의 RNA를 뽑아서 그 유전자의 발현 패턴을 확인한 결과 각각의 스트레스 및 호르몬을 처리하지 않았을 때보다 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 이에 AtAIRP1 유전자는 저온, 건조, 염분 스트레스 및 ABA 호르몬에 의해서 발현이 유도됨을 확인하였다. AtAIRP1 gene expression was confirmed by RT-PCR at various abiotic stresses. Low temperature (6 hours, 12 hours) and dry stress (1 hour, 2 hours) (FIG. 2A) (B) 100 μM ABA hormone was applied 1.5 hours and 3 hours after 100 hours of brine at 100 mM concentration (FIG. 2B). after an hour and 3 hours treatment pulling each RNA (Fig. 2c) was than did not deal with the gene expression result of each of the stress, and hormone confirming the pattern of the confirmation that the expression of the gene increase, and thus AtAIRP1 gene low temperature It was confirmed that expression is induced by drying, salt stress, and ABA hormone.

AtAIRP1AtAIRP1 단백질의 효소활성 분석 Enzyme Activity Analysis of Proteins

AtAIRP1 단백질들에 MBP(maltose binding protein)를 붙인 다음 셀프-유비퀴티네이션을 수행하기 위하여 UBA1, UBC8, 유비퀴틴, AtAIRP1WT 또는 AtAIRP1H127Y (127번째 아미노산인 히스티딘을 타이로신으로 치환시킨 돌연변이 단백질)를 1시간 동안 30℃에서 배양 후 단백질 변화를 확인하기 위해서 MBP 및 유비퀴틴의 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. MBP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 AtAIRP1WT 단백질의 분자량이 증가한다는 사실과 AtAIRP1H127Y 단백질은 반응이 일어나지 않는다는 사실을 확인하였고, 유비퀴틴 항체를 이용하여 이들의 증가가 유비퀴틴에 의한 것임을 확인하였다(도 3). 이 결과를 토대로 AtAIRP1 단백질은 유비퀴틴 단백질을 붙여주는 리가아제의 효소활성 능력을 가짐을 알 수 있었다. 반면 MBP-AtAIRPH127Y 의 경우 링 핑거 도메인의 기능을 상실하여 리가아제의 효소활성 능력을 잃은 것을 확인하였다.Attach the maltose binding protein (MBP) to AtAIRP1 proteins and then perform UBA1, UBC8, ubiquitin, AtAIRP1 WT or AtAIRP1 H127Y to perform self-ubiquitination (Mutant protein substituted with histidine, tyrosine, 127th amino acid) was cultured at 30 ° C. for 1 hour, and Western blot analysis was performed using specific antibodies of MBP and ubiquitin to confirm protein changes. Western blot analysis using MBP antibody showed increased molecular weight of AtAIRP1 WT protein and AtAIRP1 H127Y The protein was confirmed that the reaction does not occur, using ubiquitin antibody was confirmed that their increase is due to ubiquitin (Fig. 3). Based on these results, the AtAIRP1 protein was found to have the enzymatic activity of ligase to attach the ubiquitin protein. On the other hand, MBP-AtAIRP H127Y was found to lose the function of the ring finger domain and lost the enzyme activity of ligase.

식물체 생장 비교Plant growth comparison

ABA 호르몬을 각각 0.1, 0.5, 1 μM 의 농도로 처리된 배지에 야생형, atairp1 돌연변이체, 벡터 컨트롤 및 AtAIRP1 - sGFP 과다발현 형질전환 식물체를 심은 후 10일 동안 키운 결과, AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환 식물체의 경우 ABA호르몬에 민감성을 보이는 것을 알 수 있었고, 해당 유전자의 돌연변이체는 같은 조건에서 저항성을 보임을 알 수 있었다(도 6a). AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이 및 과다발현 형질전환 식물체의 발아 테스트를 한 결과, 역시 ABA호르몬에 의해 과다발현 형질전환체는 발아율이 떨어지며, 발현억제 돌연변이체는 발아율이 증가된 것을 알 수 있었다(도 6b).The ABA hormone was grown for 10 days after planting wild-type, atairp1 mutant, vector control, and AtAIRP1 - sGFP overexpressing transgenic plants in media treated with concentrations of 0.1, 0.5 and 1 μM, respectively, and overexpressing the AtAIRP1 gene. In the case of plants, it could be seen that they are sensitive to ABA hormone, and the mutants of the genes were shown to be resistant under the same conditions (FIG. 6A). As a result of the germination test of the expression inhibitory mutations and overexpressing transgenic plants of the AtAIRP1 gene, it was also found that the overexpressing transformants decreased germination rate by the ABA hormone, and the expression suppressing mutants increased germination rate (FIG. 6B). ).

성체 식물의 건조 스트레스에 대한 민감도 측정Determination of sensitivity to dry stress in adult plants

AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체와 야생형 애기장대의 건조 스트레스에 대한 저항성을 측정하기 위하여 2주 동안 키운 각각의 식물체에 10일 동안 물을 주지 않고 건조 스트레스를 가한 후, 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 돌연변이체가 야생형에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 저항성이 낮은 것으로 나타났다(도 4b). AtAIRP1 In order to measure the resistance of the gene expression inhibitory mutant and the wild type Arabidopsis to dryness, each plant grown for 2 weeks was subjected to dry stress without watering for 10 days, and then compared with the number of surviving individuals. It was. The results showed that the mutants were less resistant to drought stress than the wild type (FIG. 4B).

AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체와 야생형 애기장대의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교하기 위해 흙에서 2주 동안 키운 각각의 식물체에 10일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후, 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 야생형 식물체의 경우 85%가 생존해 있는 반면 발현억제 돌연변이체는 25% 만이 생존해 있어 돌연변이 식물체가 야생형에 비해 건조스트레스에 대한 저항성이 낮은 것을 알 수 있었다. AtAIRP1 Number of surviving individuals after drought stress for 10 days without watering each plant grown for 2 weeks in soil to compare gene expression suppression mutant and resistance to drought stress of wild type Arabidopsis. Was compared. As a result, 85% of the wild type plants survived, whereas only 25% of the expression inhibitory mutants survived, indicating that the mutant plants were less resistant to dry stress than the wild type.

AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체 및 GFP만 과다발현 시킨 형질전환체의 유전자 구조를 나타내었다. Basta selection을 통해 얻어진 각각의 형질전환체의 동형접합 식물체를 확보하였다. 여기서 얻어진 종자를 배지에 심어 RNA를 추출해여 RT-PCR을 수행한 결과 A1, A7번의 식물체에서 AtAIRP1 유전자가 과다발현 된 것을 알 수 있었다(도 5a). The gene structure of the overexpressed transformant of AtAIRP1 gene and the transformant overexpressed only GFP was shown. Homozygous plants of each transformant obtained by Basta selection were obtained. The seed obtained here was planted in a medium to extract RNA, and RT-PCR showed that the AtAIRP1 gene was overexpressed in plants A1 and A7 (FIG. 5A).

GFP 항체를 이용하여 형질전환체에서 단백질이 잘 만들어짐을 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 5b). AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체와 야생형 애기장대그리고 GFP 과다발현 식물체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교하기 위하여 2주 동안 키운 각각의 식물체에 11일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후, 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 야생형의 경우 12.5%, GFP 과다발현 식물체는 22.5%, AtAIRP1 과다발현 식물체인 A1은 75%, A7은 82.5% 살아난 것을 알 수 있었다. 따라서 과다발현 형질전환체가 야생형 또는 GFP 과다발현 식물체들에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 저항성이 높다는 것을 알 수 있었다(도 5c). Western blot confirmed that the protein was well formed in the transformant using the GFP antibody (FIG. 5B). AtAIRP1 To compare the drought stress resistance of the overexpressed transformants of genes and wild-type Arabidopsis and GFP overexpressed plants, each plant grown for 2 weeks was subjected to drought stress without watering for 11 days, and then The numbers of survivors were compared. Wild type 12.5%, GFP overexpressed plants 22.5%, AtAIRP1 overexpressed plants A1 75%, A7 82.5% was found to have survived. Thus, it was found that the overexpressing transformants were more resistant to drought stress than wild type or GFP overexpressing plants (FIG. 5C).

기공개폐(Pore opening and closing stomatalstomatal apertureaperture ) 측정) Measure

흙에서 5주 동안 키운 야생형 애기장대와 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체 및 과다발현 형질전환체의 잎을 따서 기공 개방 용액에 2시간 동안 담궈 모든 기공을 열어준 후에 ABA 호르몬이 농도별로 (0, 0.1, 1, 10 μM)로 처리된 개방 용액에 옮긴 후 다시 2시간 동안 담구어둔 후 광학 현미경을 통해 기공의 개폐 정도를 비교했다. 그 결과 AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환 식물체의 경우 ABA 호르몬에 민감성을 보여 야생형과 발현억제 돌연변이체에 비해서 낮은 농도의 ABA를 처리했을 경우에도 기공이 닫히는 경향을 보였고, 발현억제 돌연변이체는 같은 조건에서 ABA에 대해 저항성을 보여 야생형과 과다발현 형질전환체에 비해서 기공이 높은 농도에서도 상대적으로 열려있는 결과를 보였다(도 7a). 각 해당 식물체에 ABA 호르몬을 각각 0.1, 1, 10 μM의 농도로 처리한 후 광학현미경으로 기공을 분석항 결과 AtAIPR1 유전자의 과다발현 형질전환체는 0.1 μM 의 ABA 처리시에 기공이 0.042-0.050로 야생형에 비해 약 2배 이상 기공이 닫혀 있지만, AtAIRP1 발현억제 돌연변이체는 10 μM 의 ABA 처리 시에도 기공이 0.086로 야생형에 비해서 약 2.6배 열려 있음을 알 수 있었다.The ABA hormone was released in the pore open solution for 2 hours after picking up the leaves of wild type Arabidopsis larvae grown at soil for 5 weeks, AtAIRP1 gene suppression mutant and overexpressing transformant, and then immersed in pore open solution for 2 hours. , 1, 10 μM) was transferred to an open solution and soaked for 2 hours, and compared with the degree of opening and closing of pores through an optical microscope. As a result, the overexpressed transgenic plants of AtAIRP1 gene showed susceptibility to ABA hormones, and showed a tendency to close pores even when low concentrations of ABA were treated compared to wild type and expression inhibitory mutants. Resistant to ABA showed relatively open pores at high concentrations compared to wild-type and overexpressing transformants (Fig. 7a). The ABA hormone was treated at each concentration of 0.1, 1, and 10 μM, respectively, and the pore was analyzed by optical microscopy. The overexpressing transformants of the AtAIPR1 gene showed 0.042-0.050 pores when treated with 0.1 μM of ABA. Although pores were closed more than twice as much as the wild type, the AtAIRP1 expression inhibitory mutant was found to be about 2.6 times more open than the wild type at 0.086 ABA treatment.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1은 AtAIRP1 유전자 및 단백질 서열을 분석한 그림이다. AtAIRP1(Arabidopsis Thaliana : ABA insensitive Ring protein 1) 유전자는 애기장대에 단일 카피로 존재하며, 5개의 엑손과 4개의 인트론으로 으로 구성된 1904 bp 유전자이다(도 1a). 도 1b는 애기장대 AtAIRP1 단백질과 유사도를 보이는 다른 종에서의 단백질들과의 다중 정렬(multiple alignment) 결과이다. N-말단 부근의 잘 보존된 시퀀스 조합과, C-말단 부근의 C3H2C3 타입의 링 핑거 도메인을 가지는 것을 알 수 있었다. 애기장대의 AtAIRP1 단백질은 냉이(capsella)와 가장 가까운 유사도를 보이며, 다른 종들과도 그림과 같은 유사성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 1c). 1 is a diagram analyzing the AtAIRP1 gene and protein sequence. AtAIRP1 (Arabidopsis Thaliana : The ABA insensitive Ring protein 1) gene is a single copy in the Arabidopsis, a 1904 bp gene consisting of five exons and four introns (FIG. 1A). 1B is the result of multiple alignments with proteins in other species showing similarity to Arabidopsis AtAIRP1 protein. It was found that they had well-conserved sequence combinations near the N-terminus and C3H2C3 type ring finger domains near the C-terminus. AtAIRP1 protein of Arabidopsis showed the closest similarity to capsella and showed similar similarity with other species (Fig. 1c).

도 2는 다양한 비생물학적 스트레스에서 AtAIRP1 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 도 2a는 저온 및 건조 스트레스, 도 2b는 소금물 100 mM의 농도로 처리를 하였을 때, 도 2c는 ABA 호르몬을 각각 처리한 후 각각의 RNA를 뽑아서 그 유전자의 발현 패턴을 확인하였다. 저온, 건조 및 염분 처리의 대표적인 컨트롤 유전자로 RD29a를 사용하였고, ABA 처리구에서는 Rab18 유전자를 사용하였다. Figure 2 shows the results of analyzing the expression of the AtAIRP1 gene in a variety of abiotic stress. Figure 2a is a low temperature and dry stress, Figure 2b when treated with a concentration of 100 mM brine, Figure 2c after each treatment with the ABA hormone extract each RNA to confirm the expression pattern of the gene. RD29a was used as a representative control gene for low temperature, drying and salt treatment, and Rab18 gene was used in ABA treatment.

도 3은 AtAIRP1 단백질의 효소 활성을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. AtAIRP1 단백질들에 MBP(maltose binding protein)를 붙인 UBA1, UBC8, 유비퀴틴, AtAIRP1WT 또는 AtAIRP1H127Y 를 배양 후 웨스턴 블롯으로 단백질 변화를 확인한 결과 AtAIRP1WT 단백질의 분자량이 증가하고 AtAIRP1H127Y 단백질은 반응이 일어나지 않음을 알 수 있었다.3 is a diagram showing the results of analyzing the enzyme activity of the AtAIRP1 protein. After incubation of UBA1, UBC8, Ubiquitin, AtAIRP1 WT or AtAIRP1 H127Y with MBP (maltose binding protein) to AtAIRP1 proteins, Western blot showed protein change and the molecular weight of AtAIRP1 WT protein increased and AtAIRP1 H127Y protein did not react. And it was found.

도 4는 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체 제작 및 건조스트레스 저항성을 분석한 결과를 나타낸 그림이다. 도 4a는 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체에 관한 그림이다. 유전자의 엑손에 T-DNA가 삽입된 위치를 보여주며, 이들 유전자와 T-DNA 부근의 프라이머를 이용하여 PCR의 방법으로 T-DNA가 삽입됨을 보여준다. 돌연변이체의 RNA를 추출하여 RT-PCR의 방법으로 유전자의 발현을 조사한 것이다. 이들 결과를 토대로 atairp1 돌연변이체는 해당 유전자의 발현이 억제됨을 알 수 있었다. 도 4b는 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체와 야생형 애기장대의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교한 그림이다. 2주 동안 키운 각각의 식물체에 10일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후, 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 돌연변이체가 야생형에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 저항성이 낮은 것으로 나타났다. 4 is AtAIRP1 This figure shows the results of analysis of gene expression inhibitory mutants and dry stress resistance. 4A is AtAIRP1 This is a picture of a gene suppression mutant. The T-DNA is inserted into the exon of the gene, and the T-DNA is inserted by PCR using primers near the gene and the T-DNA. Mutant RNA was extracted and gene expression was examined by RT-PCR. Based on these results, the atairp1 mutant was found to inhibit the expression of the gene. 4B is AtAIRP1 This figure compares the gene expression suppressor mutant and resistance to drought stress in wild-type Arabidopsis. Each plant grown for 2 weeks was subjected to drought stress without watering for 10 days, and then watered enough to compare the number of surviving individuals. The results show that the mutants are less resistant to drought stress than the wild type.

도 5는 AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체 제작 및 건조 스트레스 저항성을 분석한 그림이다. 도 5a는 AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체에 관한 그림이다. 35S:: AtAIRP1 - GFP 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대를 제작하여 RT-PCR을 통하여 확인을 한 것이다. 본 그림은 상기 과다발현 식물체는 야생형 또는 GFP만 과다발현되는 형질전환체에 비해서 AtAIRP1 유전자를 과다발현하고 있다는 것을 알 수 있었다. 도 5b는 면역 블롯팅 분석을 나타낸 그림이다. RT-PCR을 통하여 AtAIRP1 유전자가 과다 발현되는 것이 확인된 형질전환체를 GFP 항체를 이용하여 이들 단백질이 잘 만들어진 것을 확인할 수 있었고, 로딩 컨트롤로 액틴 항체를 이용하여 확인하였다. AtAIRP1-sGFP단백질이 과다발현되는 것을 다시 확인할 수 있었다. 도 5c는 AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환체와 야생형 애기장대의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 비교한 그림이다. 2주 동안 키운 각각의 식물체에 11일 동안 물을 주지 않고 가뭄 스트레스를 가한 후, 물을 충분히 주고 살아난 개체 수를 비교하였다. 그 결과 과다발현 형질전환체가 야생형 또는 GFP만 과다발현되는 형질전환체에 비해서 가뭄 스트레스에 대해 저항성이 높은 것으로 나타났다. 5 is a diagram illustrating an overexpression of the AtAIRP1 gene and the analysis of dry stress resistance. 5A is a diagram of an overexpressed transformant of the AtAIRP1 gene. 35S :: AtAIRP1 - GFP Arabidopsis transformed with a recombinant vector was produced and confirmed by RT-PCR. This figure shows that the overexpressed plant is AtAIRP1 compared to a wild type or a GFP overexpressed transformant. The gene was overexpressed. 5B is a diagram showing an immune blotting analysis. The RT-PCR confirmed that the AtAIRP1 gene was overexpressed by the GFP antibody, which confirmed that these proteins were well formed, and the loading control was confirmed using the actin antibody. AtAIRP1-sGFP protein over-expression was confirmed again. 5C is AtAIRP1 This is a comparison of the gene overexpression transformant and the resistance to drought stress in wild-type Arabidopsis. Each plant grown for 2 weeks was subjected to drought stress without watering for 11 days, and then watered enough to compare the number of surviving individuals. As a result, the overexpressing transformants were more resistant to drought stress than the wild type or GFP overexpressing transformants.

도 6은 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체 및 과다발현 형질전환체의 ABA호르몬에 관한 표현형 분석을 나타낸 그림이다. 도 6a는 ABA 호르몬을 각각 0.1, 0.5, 1 μM 의 농도로 처리된 배지에 야생형, atairp1 돌연변이체, 벡터 컨트롤 및 AtAIRP1 - sGFP 과다발현 형질전환 식물체를 심은 후 10일 동안 키운 사진을 찍은 것이다. AtAIRP1 유전자의 과다발현 형질전환 식물체의 경우 ABA호르몬에 민감성을 보이는 것을 알 수 있었고, 또한 해당 유전자의 발현억제 돌연변이체는 같은 조건에서 저항성을 보임을 알 수 있었다. 도 6b는 AtAIRP1 유전자의 돌연변이 및 과다발현 형질전환 식물체의 발아 테스트를 한 결과이다. 역시 ABA호르몬에 의해 과다발현 형질전환체는 발아율이 떨어지며, 발현억제 돌연변이체는 발아율이 증가된 것을 알 수 있었다. 6 is a diagram showing a phenotypic analysis of the ABA hormone of the expression inhibitory mutants and overexpression of the AtAIRP1 gene. Figure 6a is a 10-day photograph taken after planting wild type, atairp1 mutant, vector control and AtAIRP1 - sGFP overexpressing transgenic plants in medium treated with ABA hormone at concentrations of 0.1, 0.5 and 1 μM, respectively. The overexpressed transgenic plants of AtAIRP1 gene showed susceptibility to ABA hormone, and the expression inhibitory mutants of the gene showed resistance under the same conditions. Figure 6b is a result of the germination test of the mutant and overexpressed transgenic plants of the AtAIRP1 gene. It was also found that overexpression of the transformants caused by ABA hormone decreased germination rate, and expression suppression mutants increased germination rate.

도 7은 AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체 및 과다발현 형질전환체의 ABA호르몬에 관한 기공 개폐를 분석한 그림이다. 도 7a는 흙에서 5주 동안 키운 야생형 애기장대, AtAIRP1 유전자의 발현억제 돌연변이체 및 과다발현 형질전환체의 잎에 ABA 호르몬을 각각 0.1, 1, 10 μM 의 농도로 처리한 후 기공 개폐의 정도를 비교한 그림이다. 도 7b는 각 해당 식물체에 ABA 호르몬을 각각 0.1, 1, 10 μM 의 농도로 처리한 후 광학현미경으로 기공 개폐의 정도를 분석하여 그래프로 나타낸 그림이다. Figure 7 is a figure analyzing the pore opening and closing of the ABA hormone of the expression inhibitory mutant and overexpression of the AtAIRP1 gene. Figure 7a shows the degree of pore opening after treatment with ABA hormone at concentrations of 0.1, 1 and 10 μM, respectively, on the leaves of wild type Arabidopsis cultivars , AtAIRP1 gene expression inhibitory mutants and overexpressing transformants, which were grown in soil for 5 weeks. This is a comparison picture. Figure 7b is a graph showing the degree of pore opening and closing after the treatment of the ABA hormone 0.1, 1, 10 μM to each plant, respectively, using an optical microscope.

<110> Industry-academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> Gene Implicated in Drought Stress Tolerance and Transformed Plants with the Same <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 462 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atgggttgct gctgttgtct cccgagtata cccgaaagct caagaactat agatgagcat 60 cttcccttat ctcgtgccac gccttcctct ctctctaatg catacagttc acctctttcg 120 ccgcctattc ctttagccat cacgaatata aatcttcaaa ctagtccacc gaaattgcca 180 agaactcagg gcaattcgag tgaagcatcc ccgggactca cacaagttgt tccagagaag 240 aaaacatggc atgttgatga tctaactgat tttgagctaa agaaacagta tcgagaagca 300 atcgatgaat gtccaatttg cttagaagaa tatgagattg ataacccgaa attgctcact 360 aaatgtggcc atgactttca tctcgcttgc attcttgcat ggatggaaag aagcgaggcg 420 tgtccagttt gcgataagga attagtgctc actgaatcat aa 462 <210> 2 <211> 153 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Gly Cys Cys Cys Cys Leu Pro Ser Ile Pro Glu Ser Ser Arg Thr 1 5 10 15 Ile Asp Glu His Leu Pro Leu Ser Arg Ala Thr Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Asn Ala Tyr Ser Ser Pro Leu Ser Pro Pro Ile Pro Leu Ala Ile Thr 35 40 45 Asn Ile Asn Leu Gln Thr Ser Pro Pro Lys Leu Pro Arg Thr Gln Gly 50 55 60 Asn Ser Ser Glu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Gln Val Val Pro Glu Lys 65 70 75 80 Lys Thr Trp His Val Asp Asp Leu Thr Asp Phe Glu Leu Lys Lys Gln 85 90 95 Tyr Arg Glu Ala Ile Asp Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Glu Tyr Glu 100 105 110 Ile Asp Asn Pro Lys Leu Leu Thr Lys Cys Gly His Asp Phe His Leu 115 120 125 Ala Cys Ile Leu Ala Trp Met Glu Arg Ser Glu Ala Cys Pro Val Cys 130 135 140 Asp Lys Glu Leu Val Leu Thr Glu Ser 145 150 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgggttgct gctgttgtct c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttatgattca gtgagcacta at 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagctgctat acactgatct gag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagattgata acccgaaatt gc 22 <210> 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ccgcctattc ctttagccat cacgaatata aatcttcaaa ctagtccacc gaaattgcca 180 agaactcagg gcaattcgag tgaagcatcc ccgggactca cacaagttgt tccagagaag 240 aaaacatggc atgttgatga tctaactgat tttgagctaa agaaacagta tcgagaagca 300 atcgatgaat gtccaatttg cttagaagaa tatgagattg ataacccgaa attgctcact 360 aaatgtggcc atgactttca tctcgcttgc attcttgcat ggatggaaag aagcgaggcg 420 tgtccagttt gcgataagga attagtgctc actgaatcat aa 462 <210> 2 <211> 153 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Gly Cys Cys Cys Cys Leu Pro Ser Ile Pro Glu Ser Ser Arg Thr   1 5 10 15 Ile Asp Glu His Leu Pro Leu Ser Arg Ala Thr Pro Ser Ser Leu Ser              20 25 30 Asn Ala Tyr Ser Ser Pro Leu Ser Pro Pro Ile Pro Leu Ala Ile Thr          35 40 45 Asn Ile Asn Leu Gln Thr Ser Pro Pro Lys Leu Pro Arg Thr Gln Gly      50 55 60 Asn Ser Ser Glu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Gln Val Val Pro Glu Lys  65 70 75 80 Lys Thr Trp His Val Asp Asp Leu Thr Asp Phe Glu Leu Lys Lys Gln                  85 90 95 Tyr Arg Glu Ala Ile Asp Glu Cys Pro Ile Cys Leu Glu Glu Tyr Glu             100 105 110 Ile Asp Asn Pro Lys Leu Leu Thr Lys Cys Gly His Asp Phe His Leu         115 120 125 Ala Cys Ile Leu Ala Trp Met Glu Arg Ser Glu Ala Cys Pro Val Cys     130 135 140 Asp Lys Glu Leu Val Leu Thr Glu Ser 145 150 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgggttgct gctgttgtct c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttatgattca gtgagcacta at 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagctgctat acactgatct gag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagattgata acccgaaatt gc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctctgaattt tcaggctctt ct 22 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acaaattgga cattcatcg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgggttgct gctgtttctc 20 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctctgaattt tcaggctctt ct 22 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acaaattgga cattcatcg 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 atgggttgct gctgtttctc 20  

Claims (11)

서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.A composition for enhancing dry stress resistance of a plant comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.According to claim 1, wherein the nucleotide sequence is a composition for enhancing the dry stress resistance of the plant, characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 sequence. (a) 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 식물세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 식물세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 식물발현용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물. (a) the nucleotide sequence of claim 1 or 2; (b) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence and forming an RNA molecule in a plant cell; And (c) a plant-expressing recombinant vector comprising a poly A signal sequence which acts on plant cells to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 식물세포.Plant cells transformed with the composition of any one of claims 1 to 3. 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물로 형질전환된 식물체.Plant transformed with the composition of any one of the preceding claims. 다음의 단계를 포함하는 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제조하는 방법:A method for producing a transformed plant having enhanced dry stress resistance, comprising the following steps: (a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및 (a) introducing the composition of any one of claims 1 to 3 into a plant cell; And (b) 상기 식물세포로부터 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(b) obtaining a transformed plant having enhanced dry stress resistance from the plant cells. 제 6 항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부 터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.7. The plant of claim 6, wherein the plant comprises: food crops including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats, and sorghum; Vegetable crops including arabidopsis, cabbage, radish, peppers, strawberries, tomatoes, watermelons, cucumbers, cabbages, melons, pumpkins, green onions, onions, and carrots; Special crops, including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanuts and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, leeks, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas; Flowers, including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies, and tulips; And fodder crops comprising lysis, redclover, orchardgrass, alphaalpha, tolsquescue and perennial lygragrass. 다음의 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법: Method for enhancing the dry stress resistance of a plant comprising the following steps: (a) 상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및 (a) introducing the composition of any one of claims 1 to 3 into a plant cell; And (b) 상기 식물세포로부터 발아능 또는 생장능이 증가된 형질전환 식물체를 수득하는 단계.(b) obtaining a transformed plant having increased germination or growth ability from the plant cells. 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 억제하는 핵산 분자를 포함하는 식물체의 발아 촉진용 조성물.A composition for promoting germination of a plant comprising a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the nucleotide sequence of claim 1 or 2. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 9, wherein the nucleic acid molecule is T-DNA, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, peptide nucleic acids or antisense oligonucleotides. 제 10 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 T-DNA인 것을 특징으로 하는 조성물. The composition of claim 10, wherein the nucleic acid molecule is T-DNA.
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