KR20110066623A

KR20110066623A - Ｅｐｐｓ를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20110066623A
Application number: KR1020090123355A
Authority: KR
Inventors: 김동진; 김영수; 김혜연
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-17
Also published as: KR101173677B1; US8536178B2; US20110144111A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 EPPS는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하고, 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해함으로써 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제할 수 있으므로 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염과 같은 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

EPPS, 베타아밀로이드, 베타아밀로이드 올리고머, 베타아밀로이드 피브릴, 베타아밀로이드 집적, 베타아밀로이드 집적 저해, 베타아밀로이드 집적 분해, 베타아밀로이드 40, 베타아밀로이드 42, 베타아밀로이드 집적 관련 질환

Description

ＥＰＰＳ를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating diseases associated with beta amyloid accumulation containing EPPS as an active ingredient}

본 발명은 EPPS를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 평균수명이 늘어나고 노인 인구가 증가하는 고령화 사회로 되면서 알츠하이머병으로 대표되는 노인성 치매, 뇌졸중 또는 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 발병률이 크게 증가하고 있다. 보건사회연구원 조사통계에 따르면 우리나라의 노인 인구는 2000년에 7%를 넘어 고령사회에 진입한 이래 2003년 397만 명으로 노인인구의 비율이 8.3%에 이르렀고 2019년에는 14.4%에 이르러 완전고령사회에 진입할 것으로 예견된다. 우리나라의 경우, 75 내지 79세 노인인구의 15%가 치매를 앓고 있으며 80세 이상 노인인구의 39%가 치매환자이다. 또한 여성이 남성에 비해서 2 내지 3배 정도 높은 발병률을 갖는 것으로 알려져 있다.

치매는 나이가 들어감에 따라 정상적으로 발달한 뇌가 후천적인 외상이나 질병 등의 외부적 요인에 의해 기질적으로 손상되거나 파괴되어 언어, 학습, 지능 등에 대한 전반적인 인지기능과 고등정신기능이 비정상적으로 감퇴되는 복합적인 임상증후군을 포괄하는 것으로 점진적인 기억력 장애가 실어증, 실인증, 실행증 등의 행동적인 장애가 함께 나타나 사회 직업적 기능의 장애를 가져온다. 치매를 크게 원인별로 보면 알츠하이머병에 의한 치매, 혈관성 치매, 특정뇌질환 및 전신성 질환에 의한 치매 등으로 나눌 수 있으며 이 중 알츠하이머병에 의한 치매가 50% 이상을 차지한다.

알츠하이머병의 해부학적인 특징은 기억 및 인식을 담당하는 신경세포의 감소와 사멸이다. 병리학적인 특징은 신경세포 내부의 신경섬유 뭉치(neurofibrillary tangle)와 신경세포 외부의 노인성 반(senile plaque)의 발견이다. 상기 노인성 반의 중심부분에는 베타아밀로이드 집적물(deposit)이 발견되고 있으며, 이는 주로 베타아밀로이드가 서로 달라붙어 형성되는 머리카락 구조의 피브릴(fibril) 형태인 것으로 알려져 있다. 알츠하이머 질환은 면역학적 요인, 유전적 요인, 바이러스 감염, 독성물질을 포함한 다양한 환경적 요인, 머리를 다쳤을 경우 등 여러 요인에 의해 유발되는 것으로 알려져 있고, 지금까지 알려진 바에 의하면 베타아밀로이드 단백질이 뇌에 축적되어서 생기는 신경반의 신경독성에 의한 신경세포 파괴와, 과인산화타우 단백질이 뇌에 축적되어 신경섬유다발이 생성되고 이에 의해 신경퇴행을 일으키는 것이 알츠하이머성 치매의 주요 원인으로 보고되어 있다.

상술한 베타아밀로이드는 알츠하이머병 환자에서 발견되는 단백질로, 아밀로이드 단백질 전구체(APP)에서 유래된 39-43개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩타이드이다(Seubert, P., C. Vigo-Pelfrey, et al.(1992). "Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids." Nature 359(6393): 325-7., Shoji, M., T. E. Golde, et al.(1992). "Production of the Alzheimer amyloid beta protein by normal proteolytic processing." Science 258(5079):126-9., Busciglio, J., D. H. Gabuzda, et al. (1993). "Generation of beta-amyloid in the secretory pathway in neuronal and nonneuronal cells." Proc Natl Acad Sci USA 90(5):2092-6). 아밀로이드 단백질 전구체(APP)는 β-, γ-분해효소(β-, γ-secretase) 중 β-분해효소에 의하여 베타아밀로이드 40 또는 42(Aβ40 또는 Aβ42) 단량체(monomer)가 된 후 집적하여 올리고머(oligomer)를 형성하고 이 올리고머의 집적으로 피브릴(fibril)의 단계를 거치게 된다. 이러한 여러 단계의 베타아밀로이드 중에서 올리고머가 되는 상태부터 뇌에 강한 신경 독성을 나타내어 뇌세포를 사멸시키게 된다(Walsh, D. M., I. Klyubin, et al. (2002). "Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo." Nature 416(6880):535-9., Stine, W. B., Jr., K. N. Dahlgren, et al. (2003). "In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis." J Biol Chem 278(13):11612-22., Ferreira, S. T., M. N. Vieira, et al . (2007). "Soluble protein oligomers as emerging toxins in Alzheimer's and other amyloid diseases." IUBMB Life 59(4-5):332-45). 그러므로 집적된 베타아밀로이드를 분해하거나 집적을 억제하는 것이 알츠하이머병을 치료하는데 중요하다.

집적된 아밀로이드에서 대부분을 이루고 있는 베타아밀로이드의 동종형(isoform)은 아미노산 40개와 42개로 이루어진 베타아밀로이드 40과 42이며(Huang, T. H., D. S. Yang, et al. (2000). "Structural studies of soluble oligomers of the Alzheimer beta-amyloid peptide." J Mol Biol 297(1):73-87., Bitan, G., M. D. Kirkitadze, et al. (2003). "Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways." Proc Natl Acad Sci USA 100(1):330-5), 이들이 집적될 때 관여하는 여러 요인들 중 집적을 도와주는 물질로 글루코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)과 프로테오글리칸(proteoglycan, PG)이 있다. 세포막에 존재하고 있는 글루코사미노글리칸/프로테오글리칸은 베타아밀로이드와 결합하여 구조적 변화를 일으켜 베타아밀로이드가 집적되도록 도와주고 있다. 특히 글루코사미노글리칸/프로테오글리칸의 황산염 구조(sulfate moiety) 부분이 베타아밀로이드의 40 혹은 42개의 아미노산 중 13-16번째에 해당하는 HHQK 부분에 결합하여 집적을 시키는 중요한 요인으로 작용하게 된 다(Giulian, D., Haverkamp, L.J., Yu, J., Karshin, W., Tom, D., Li, J., Kazanskiaia, A., Kirkpatrick, J., and Roher, A.E. (1998). "The HHQK domain of beta-amyloid provides a structural basis for the immunopathology of Alzheimer's disease. J Biol Chem 273, 29719-29726).

현재까지 개발된 치료제로는 알츠하이머형 치매 환자들의 뇌에서 아세틸콜린이라는 물질이 정상인에 비해 감소한다는 점에 착안하여 뇌 내의 아세틸콜린의 양을 증가시키거나 콜린성 신경세포의 활성을 증가시키는 방향으로 개발된 약제들이 있다. 그러나 이와 같은 계열로 시중에 판매중인 도네페질(Donepezil), 리바스티그민(Rivastigmin), 갈란타민(Galantamin), 메만틴(Memantine) 등은 병을 근본적으로 치료하기 위한 것이 아니라 기억력 장애 증상을 개선하기 위한 약물로 부작용 및 치료의 한계가 있기 때문에 개선이 필요하다.

한편, EPPS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판술폰산))는 25 ℃에서 pKa 값이 8이며, 일반적으로 완충용액으로 사용될 때의 pH는 7.3 내지 8.7인 물질이다. EPPS에 대한 종래기술을 살펴보면 다음과 같다. 국제공개특허 제7520호는 완충용액으로서 EPPS를 포함하는 단백질의 산화성 손상을 예방하는 조성물 및 방법을 개시하였다. 유럽공개특허 제167057호는 완충용액으로서 EPPS를 포함하는 손상된 신경 재생을 위한 조성물을 개시하였다. 국제공개특허 제9927791호는 치료학적으로 유효한 양의 EPPS를 포함하는 양쪽성 지방산을 도포하는 염증의 치료방법을 개시하였다. 그러나 종래 EPPS의 베타아밀로이드 집적에 대한 저해 활성에 대해서는 전혀 알려진바 없다.

이에 본 발명자들은 베타아밀로이드의 집적을 저해하는 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 황산염 구조를 가지는 EPPS가 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하고, 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해함으로써 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제할 수 있으므로 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염과 같은 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 EPPS를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 EPPS는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하고, 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해함으로써 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제할 수 있으므로 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염과 같은 베타아밀로 이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 EPPS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판술폰산))를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 분자량이 232.55이며, 녹는점이 237 내지 239 ℃이고, 25 ℃에서 pKa 값이 8이며, 일반적으로 완충용액으로 사용될 때의 pH는 7.3 내지 8.7인 화합물이다.

상기 베타아밀로이드 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 봉입체 구염 등을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 집적 저해 활성 측정 실험결과, 베타아밀로이드의 집 적을 저해하는 화합물로 알려진 트라미프로세이트를 처리한 대조군에 비해 약 절반 정도의 형광세기를 나타냄으로써 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다(실시예 1 및 도 1 참조).

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정 실험결과, 대조군에 비하여 낮은 형광 세기를 나타냄으로써 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다(실시예 2 및 도 2 참조).

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 SDS-PAGE를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정 실험결과, Aβ40의 단량체 크기인 4.3 KD 부근에서 밴드가 나타나 베타아밀로이드 피브릴이 단량체로 분해되는 것을 확인함으로써 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다(실시예 3 및 도 3 참조).

나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 전자현미경을 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정 실험결과, 베타아밀로이드 피브릴이 나타나지 않음으로써 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다(실시예 4, 도 4 및 도 5 참조).

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 베타아밀로이드에 대한 독성 경감 효과 검사 실험결과, EPPS만을 처리하는 경우에 95% 이상의 세포 생존율을 나타내며, 베타아밀로이드로 처리된 세포의 독성을 현저하게 감소시켜 세포의 생존율을 증가시킴으로써 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제하는 것을 알 수 있다(실시예 5 및 도 6 참조).

따라서, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 EPPS는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하고, 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해함으로써 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제할 수 있으므로 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효 성분으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 EPPS를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효 성분으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 유효성분으로서 상기 화학식 1의 EPPS를 약 0.1 내지 1,500 ㎎의 단위용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치 료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 500 ㎎ 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로는 분리하여 하루에 보통 약 5 내지 300 ㎎의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다,

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 티오플라빈 T(ThT) 형광세기를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 집적 저해 활성 측정 실험

본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 피브릴 집적 저해 활성을 측정하기 위해 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용하여 하기의 실험을 수행하였다. 티오플라빈 T(ThT)는 용액 중에 있는 베타아밀로이드 피브릴에 잘 결합하여 베타아밀로이드 피브릴의 농도가 증가함에 따라 형광 세기가 증가하는 경향을 나타낸다.

Aβ40이 5 mM의 농도를 갖도록 DMSO 용액 하에 만들고, EPPS로 100배로 희석하여 Aβ40의 최종농도가 50 μM이 되도록 제조하였다. 이때 사용한 EPPS의 농도는 20 mM이었다. 대조군으로 EPPS 대신 트라미프로세이트(tramiprosate)를 사용하였다. 트라미프로세이트(tramiprosate)는 베타아밀로이드의 집적을 저해하여 알츠하이머병 및 관련 질환의 치료에 기인할 수 있는 물질로 알려진 화합물이다(F. Gervais, J. et al.(2007)). 이후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 0일째, 2일째, 4일째, 7일째의 반응용액을 각 웰에 25 ㎕씩 분주하고, 티오플라빈 T(ThT) 75 ㎕를 가하여, 티오플라빈 T(ThT)의 농도가 5 μM이 되도록 하였다. 이를 추가적으로 15분 동안 배양한 후, 하프 웰(half well) 96 형광 마이크로플레이트를 다중 표시 계수기(Envision 2103 multilabel reader, Perkin-Elmer)로 형광 세기를 측정하였다. 형광 세기 측정시, 여기(excitation) 및 발광(emission) 파장은 450 ㎚와 485 ㎚를 사용하였고, 계수 시간은(counting time)은 0.5초로 하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 베타아밀로이드의 집적을 저해하는 화합물로 알려진 트라미프로세이트를 처리한 대조군은 시간이 지남에 따라 형광 세기가 약 3.5배 증가하는데 비해, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 군은 형광 세기가 약 1.7배 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 군은 7일째에 트라미프로세이트를 처리한 대조군에 비해 약 절반 정도의 형광세기를 나타냄으로써 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

< 실시예 2> 티오플라빈 T( ThT ) 형광세기를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정 실험

본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성을 측정하기 위해 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용하여 하기의 실험을 수행하였다. 티오플라빈 T(ThT)는 용액 중에 있는 베타아밀로이드 피브릴에 잘 결합하여 베타아밀로이드 피브릴의 농도가 증가함에 따라 형광 세기가 증가하는 경향을 나타낸다.

베타아밀로이드의 올리고머 및 피브릴을 형성하기 위해, 베타아밀로이드 원액을 준비하였다. 베타아밀로이드 원액을 Aβ40이 5 mM, 또는 Aβ42가 2.5 mM의 농도를 갖도록 DMSO 용액 하에 만들고, 증류수를 이용하여 10배로 희석하여 최종농도가 각각 Aβ40 500 μM, Aβ42 250 μM이 되도록 제조하였다. 이에 증류수를 각각 가하여 10배로 희석된 베타아밀로이드를 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 그 후, 다시 각각의 베타아밀로이드에 본 발명에 따른 EPPS 또는 증류수를 10배로 희석되게 가하여 준 후, 7일 동안 배양하였다. 대조군으로는 EPPS 대신 증류수를 사용하였다. 이때, EPPS의 최종농도는 20 mM, 베타아밀로이드의 최종농도는 Aβ40이 50 μM, Aβ42가 25 μM이 되도록 하였다. EPPS를 추가한 후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 증류수 또는 EPPS를 가하여 준 후, 0일째, 3일째, 7일째의 반응용액을 각 웰에 25 ㎕씩 분주하고, 티오플라빈 T(ThT) 75 ㎕를 가하여, 티오플라빈 T(ThT)의 농도가 5 μM이 되도록 하였다. 이를 추가적으로 15분 동안 배양한 후, 하프 웰(half well) 96 형광 마이크로플레이트를 다중 표시 계수기(Envision 2103 multilabel reader, Perkin-Elmer)로 형광세기를 측정하였다. 형광세기 측정시, 여 기(excitation) 및 발광(emission) 파장은 450 ㎚와 485 ㎚를 사용하였고, 계수 시간은(counting time)은 0.5초로 하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. Aβ40을 사용한 경우의 형광 세기를 도 2의 (a)에 나타내었으며, Aβ42를 사용한 경우의 형광 세기를 2의 (b)에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 군은 시간이 지남에 따라 형광 세기가 낮아지는 것을 알 수 있다. 낮은 형광 세기는 베타아밀로이드 피브릴의 양이 적은 것을 의미하므로, 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 것을 알 수 있다. 이에 반해, 증류수를 처리한 대조군은 시간이 지남에 따라 형광 세기가 거의 변하지 않거나 또는 증가하는 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

< 실시예 3> SDS - PAGE 를 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정

본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성을 측정하기 위해 SDS-PAGE를 이용하여 하기의 실험을 수행하였다. 티오플라빈 T(ThT) 형광세기를 이용한 방법은 베타아밀로이드 피브릴을 관찰할 수 있으나, 베타아밀로이드 피브릴에서 단량체로 분해되는 것을 직접적으로 확인하는 것은 불가능하다. 따라서 베타아밀로이드 피브릴에서 단량체로 분해되는 것을 관찰하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다.

SDS 젤에서 펩타이드나 단백질 등을 전기영동하면, SDS 용액에서 단백질의 2차 구조가 깨지므로, 교차결합(cross-linking)시켜 그 구조를 고정시키는 과정이 필요하다. 이는 SDS-PAGE 젤에 전기영동을 수행하기 전에 집적된 베타 아밀로이드의 구조가 깨지기 않도록 빛을 이용하여(photo-induced) 교차결합시킴으로써 이루어진다. 구체적으로, 베타아밀로이드 원액을 Aβ40이 5 mM, 또는 Aβ42가 2.5 mM의 농도를 갖도록 DMSO 용액 하에 만들고, 증류수를 이용하여 10배로 희석하여 최종농도가 각각 Aβ40 500 μM, Aβ42 250 μM이 되도록 제조하였다. 이에 증류수를 각각 가하여 10배로 희석된 베타아밀로이드를 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 그 후, 다시 각각의 베타아밀로이드에 본 발명에 따른 EPPS 또는 증류수를 10배로 희석되게 가하여 준 후, 7일 동안 배양하였다. 대조군으로는 EPPS 대신 증류수를 사용하였다. 이때, EPPS의 최종농도는 20 mM, 베타아밀로이드의 최종농도는 Aβ40이 50 μM, Aβ42가 25 μM이 되도록 하였다. EPPS를 추가한 후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 증류수 또는 EPPS를 가하여 준 후의 0일째, 3일째, 7일째의 반응용액 20 μL를 벽이 얇고 투명한 튜브에 담은 후, 과황산암모늄(Ammonium Persulfate, APS)과 Ru(II)(트리스(2,2'-바이피리딜)디클로로루테늄(II)을 각각 1.5 μL씩 첨가한 후 빛에 1초씩 3 내지 5번 노출시켰다. 빛에 노출되면, 단백질의 2차 구조가 영구적으로 고정되어, SDS 용액에서도 구조 유지가 가능하다. 상기 과정을 통해 교차 결합된 반응액을 1.0 ㎜ 두께의 16.5% 트리스-트리신 젤(Criterion^TMPrecastGel, BIO-RAD)에 120 V(볼트)로 2시간 20분 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤을 실버염색(silver staining kit-Amersham Biosciences)하여 밴드를 관찰하였고 Aβ40을 사용한 경우의 SDS-PAGE 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 증류수를 처리한 대조군(1번 레인 : 0일째, 2번 레인 : 3일째, 3번 레인 : 7일째)은 약 250 KD 부근에서 밴드가 나타나 Aβ40 피브릴 형태로 존재하나, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 군(4번 레인 : 3일째, 5번 레인 : 7일째)은 Aβ40의 단량체 크기인 4.3 KD 부근에서 밴드가 나타나므로, 베타아밀로이드 피브릴이 단량체로 분해된 것을 알 수 있다.

< 실시예 4> 전자현미경을 이용한 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성 측정

본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 피브릴 분해 활성을 측정하기 위해 전자현미경을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.

베타아밀로이드 원액을 Aβ40이 5 mM, 또는 Aβ42가 2.5 mM의 농도를 갖도록 DMSO 용액 하에 만들고, 증류수를 이용하여 10배로 희석하여 최종농도가 각각 Aβ 40 500 μM, Aβ42 250 μM이 되도록 제조하였다. 이에 증류수를 각각 가하여 10배로 희석된 베타아밀로이드를 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 그 후, 다시 각각의 베타아밀로이드에 본 발명에 따른 EPPS 또는 증류수를 10배로 희석되게 가하여 준 후, 7일 동안 배양하였다. 대조군으로는 EPPS 대신 증류수를 사용하였다. 이때, EPPS의 최종농도는 20 mM, 베타아밀로이드의 최종농도는 Aβ40이 50 μM, Aβ42가 25 μM이 되도록 하였다. EPPS를 추가한 후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 증류수 또는 EPPS를 가하여 준 후의 0일째, 3일째, 7일째의 반응용액을 각각 전자현미경(analytical transmission electron microscope)을 이용하여 베타아밀로이드 피브릴의 집적 및 분해 정도를 관찰하였다. Aβ40을 사용한 경우의 전자현미경 이미지를 도 4에 나타내었으며, Aβ42를 사용한 경우의 전자현미경 이미지를 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 군은 0일째에는 실처럼 긴 형태의 베타아밀로이드 피브릴이 나타나나, 3일째 및 7일째에는 베타아밀로이드 피브릴이 모두 나타나지 않는 것을 알 수 있다. 또한, 증류수를 처리한 대조군은 0일째에는 실처럼 긴 형태의 베타아밀로이드 피브릴이 나타나며, 3일째 및 7일째로 갈수록 베타아밀로이드 피브릴의 길이가 더 길어지면서 집적물이 많이 형성되는 것을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 베타아밀로이드 집적된 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 알 수 있다.

< 실시예 5> 베타아밀로이드에 대한 독성 경감 효과 검사

본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드에 의한 독성의 경감 정도를 측정하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

베타아밀로이드의 올리고머 및 피브릴을 형성하기 위해, 베타아밀로이드 원액을 준비하였다. 베타아밀로이드 원액을 Aβ40이 5 mM, 또는 Aβ42가 2.5 mM의 농도를 갖도록 DMSO 용액 하에 만들고, 증류수를 이용하여 10배로 희석하여 최종농도가 각각 Aβ40 500 μM, Aβ42 250 μM이 되도록 제조하였다. 이에 증류수를 각각 가하여 10배로 희석된 베타아밀로이드를 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 그 후, 다시 각각의 베타아밀로이드에 본 발명에 따른 EPPS 또는 증류수를 10배로 희석되게 가하여 준 후, 7일 동안 배양하였다. 대조군으로는 EPPS 대신 증류수를 사용하였다. 이때, EPPS의 최종농도는 20 mM, 베타아밀로이드의 최종농도는 Aβ40이 50 μM, Aβ42가 25 μM이 되도록 하였다. EPPS를 추가한 후, 37 ℃에서 7일 동안 배양하였다. 증류수 또는 EPPS를 가하여 준 후의 0일째, 3일째, 7일째의 반응용액을 아래의 세포주를 이용하여 세포독성을 측정하였다.

생쥐의 신경세포주인 HT-22를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 실험 전 HT-22 세포를 96 웰 플레이트에 3×10³ 세포/웰의 밀도로 평판 배양하고 혈청이 제거된(FBS 2%) DMEM 배지에서 하루 동안 배양하였다. 위에서 준비한 베타아밀로이드 집적물을 첨가, 배양 하였다. 이때 상기 베타아밀로이드의 세포에 첨가된 최종농도는 각각 25배 희석된, Aβ40는 2 μM, Aβ42는 1 μM로 처리한 후 18시간 동안 배양하여 베타아밀로이드 독성에 의한 세포 괴사를 유도하였다. 5 ㎎/㎖ MTT 용액을 웰 당 10 ㎕씩 넣고, 4시간 배양 후 용해화 완충액을 100 ㎕씩 첨가하여 반응시켰다. 18시간 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 아무런 처리를 하지 않은 세포의 살아있는 세포들을 100%로 환산하여 비교하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. Aβ40를 사용한 경우의 세포생존율을 도 6의 (a)에 나타내었으며, Aβ42를 사용한 경우의 세포생존율을 도 6의 (b)에 나타내었다.

도 6의 (a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 베타아밀로이드를 처리한 경우에는 세포 생존율이 약 70%까지 감소함으로써, 베타아밀로이드가 세포 독성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 본 발명에 따른 EPPS를 처리한 경우에는 베타아밀로이드로 처리된 세포의 독성을 현저하게 감소시킴으로써 세포 생존율이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 95% 이상의 세포 생존율을 나타냄으로써 세포에 독성을 유발하지 않음을 알 수 있다.

이로부터 본 발명에 따른 EPPS 화합물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제하는 것을 알 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 EPPS는 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하고, 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해함으로써 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제할 수 있으므로 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염과 같은 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 EPPS는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 산제의 제조

화학식 1의 EPPS 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

화학식 1의 EPPS 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

화학식 1의 EPPS 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

화학식 1의 EPPS 100 ㎎

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

도 1은 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용한 집적된 베타아밀로이드 피브릴 집적 저해 정도를 나타낸 그래프이고;

도 2는 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 티오플라빈 T(ThT) 형광 세기를 이용한 집적된 베타아밀로이드 분해 정도를 나타낸 그래프이고((a)Aβ40, (b)Aβ42);

도 3은 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 SDS-PAGE를 이용한 집적된 베타아밀로이드 피브릴 분해 정도를 나타낸 전기영동 이미지이고(1번 레인:0일째, 2번 레인:대조군 처리 후 3일째, 3번 레인:대조군 처리 후 7일째, 4번 레인:EPPS 처리 후 3일째, 5번 레인:EPPS 처리 후 7일째);

도 4는 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 40 피브릴 분해 정도를 나타낸 전자현미경 이미지이고;

도 5는 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드 42 피브릴 분해 정도를 나타낸 전자현미경 이미지이고;

도 6은 본 발명에 따른 EPPS 화합물의 베타아밀로이드에 의한 독성의 경감 정도를 측정하기 위해 세포생존율을 측정한 그래프이다((a)Aβ40, (b)Aβ42).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 EPPS를 유효성분으로 함유하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 베타아밀로이드 집적 관련 질환은 치매, 알츠하이머병, 다운증후군, 아밀로이드맥관병증, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증 및 봉입체 구염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EPPS는 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머의 집적을 저해하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EPPS는 집적된 베타아밀로이드 피브릴 및 올리고머를 분해하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EPPS는 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EPPS는 베타아밀로이드에 의한 독성을 억제하는 것을 특징으로 하는 베타아밀로이드 집적 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.