KR20110058705A

KR20110058705A - Anti-oxidant fusion protein and use thereof

Info

Publication number: KR20110058705A
Application number: KR1020100117341A
Authority: KR
Inventors: 김용희; 임광석; 박용수; 박이진
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2011-06-01
Also published as: KR101249334B1

Abstract

PURPOSE: An anti-oxidant fusion protein having a protein transduction domain bound to an N-terminal is provided to prevent the damage of pancreatic beta cells and cardiac muscle cells and to prevent or treat diabetes or diabetic cardiomyopathy. CONSTITUTION: An anti-oxidant fusion protein contains a protein transduction domain which is bound to an N-terminal of metallothionein. The metallothionein is denoted by one kind of amino acid sequence selected from sequence numbers 1-4. The protein transduction domain has amino acid sequences of Tat(Trans Activator of Transcription) protein of HIV-1 virus, polyarginine(6 or more arginines), penetratin, transcription regulation protein of HSV-1 structure protein VP22, pep-1 peptide, or pep-2 peptide. A pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes or diabetic cardiomyopathy contains the fusion protein as an active ingredient.

Description

Anti-Oxidant Fusion Protein and Use Thereof}

본 발명은 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 투과율이 높아 당산화 및 당지질 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포의 파괴를 보호할 수 있는 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to an antioxidant fusion protein and its use. More particularly, the present invention relates to an antioxidant fusion protein and its use that can protect the destruction of pancreatic beta cells and cardiomyocytes from glycation and glycolipid stress due to high cell permeability.

비만은 인슐린 저항성, 당내성 및 이상지질혈증(dylipidemia)을 포함하는 대사성 질환(Metabolic Syndrome) 중 하나로, 췌장 베타세포의 파괴와 당뇨병을 유발한다. 심장 기능장애, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 심장병증, 및 혈관내피세포 기능장애와 같은 당뇨 합병증은 당뇨 환자의 주요한 사망원인이다. 이러한 당뇨병 및 당뇨 합병증을 설명하는 근거 중 하나로 고혈당과 저산소증에서의 활성 산소종(Reactive Oxygen Species: 이하 'ROS') 과량생산이 주목되고 있다(P.A. Low et al., Diabetes. 46 (1997) 38-42; J.W. Baynes et al., Diabetes. 40 (1991) 405-412) 고혈당은 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 양이온 생성 또는 글루코오스의 자동산화에 의해 ROS 수치를 증가시킬 수 있다. Obesity is one of the metabolic disorders (Metabolic Syndrome), including insulin resistance, glucose tolerance and dylipidemia, which causes pancreatic beta cell destruction and diabetes. Diabetic complications such as cardiac dysfunction, diabetic neuropathy, diabetic cardiopathy, and vascular endothelial dysfunction are major causes of death in diabetic patients. Reactive Oxygen Species (ROS) overproduction has been noted in hyperglycemia and hypoxia (PA Low et al. , Diabetes . 46 ( 1997 ) 38-38). 42; JW Baynes et al. , Diabetes . 40 (1991) 405-412) Hyperglycemia can increase ROS levels by the production of mitochondrial superoxide cations or the automatic oxidation of glucose.

ROS는 산소이온이나 유리기 또는 과산화물을 총칭하는 말로써, 분자 내에 존재하는 최외각 전자의 불안정함 때문에 반응성이 매우 높다. 이러한 ROS는 생체 내에서 일어나는 일반적인 호흡과 염증 반응 동안에 흔히 금속 촉매 반응에서 생성되며, 세포 신호전달에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. ROS는 높은 산화성으로 DNA, 단백질 등 세포 구성 성분에 손상을 준다. 또한 자외선이나 열에 노출되는 환경적인 스트레스가 반복이 되면 ROS의 수준이 급격히 증가할 수 있으며, 이는 세포의 구조에 막대한 피해를 입힐 수 있다. 이것을 산화 스트레스라고 부르며, 파킨슨씨병이나 치매 같은 신경성 퇴행질환이나 당뇨병 및 당뇨 합병증에서도 중요한 병인으로 여겨지고 있다. ROS is a generic term for oxygen ions, free radicals, and peroxides, and is highly reactive due to the instability of the outermost electrons present in the molecule. These ROS are commonly produced in metal catalyzed reactions during normal respiratory and inflammatory reactions in vivo, and are known to play an important role in cellular signaling. ROS is highly oxidative and damages cellular components such as DNA and proteins. In addition, repeated environmental stresses exposed to ultraviolet rays or heat can increase the level of ROS rapidly, which can cause enormous damage to cell structure. This is called oxidative stress and is considered to be an important etiology in neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and dementia, as well as in diabetes and diabetes complications.

특히, 당뇨병에서 ROS의 과잉 생산은 당뇨성 혈관 합병증 발생과 당뇨성 신증의 중요한 요소 중 하나이다. 또한 고혈당 상태에서 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 음이온 생성을 통해(T. Nishikawa, D. Edelstein, X.L. Du, et al., Nature. 404 (2000) 787-790) 또는 당의 자동 산화(S.P. Wolff et al., Free Radic Biol Med. 10 (1991) 339-352)에 의해 ROS가 과잉 생산될 가능성이 보고되고 있고, 무엇보다도 ROS는 췌장 베타세포의 기능장애를 가져온다고 알려져 있다.In particular, overproduction of ROS in diabetes is an important factor in the development of diabetic vascular complications and diabetic nephropathy. In addition, the production of mitochondrial superoxide anions in hyperglycemic states (T. Nishikawa, D. Edelstein, XL Du, et al. , Nature . 404 ( 2000 ) 787-790) or automatic oxidation of sugars (SP Wolff et al. , Free Radic) Biol Med . 10 ( 1991 ) 339-352) reported the possibility of overproduction of ROS, and above all, ROS is known to cause pancreatic beta cell dysfunction.

제1형 당뇨병에서 ROS는 베타세포의 사멸을 유도하고, 제2형 당뇨병에서는 고혈당 상태가 지속되면서 체내에서의 산화 스트레스는 계속해서 증가하게 된다. 고혈당 상태에서는 반응성 산소기의 상승과 함께, 항산화능의 감소가 일어난다. 글루타치온 산화환원반응 시스템(glutathion redox system), Vit C-Vit E 사이클, 알파-리포산/디하이드로리포산 산화환원 반응쌍 등을 포함한 중요한 세포 내 항산화 방어기전의 감소는 당뇨병 환자에 있어 산화성 자극에 대한 민감도를 증가시킨다. In type 1 diabetes, ROS induces beta cell death, and in type 2 diabetes, oxidative stress in the body continues to increase as hyperglycemia continues. In hyperglycemic state, a decrease in antioxidant capacity occurs along with an increase in reactive oxygen groups. Reduction of important intracellular antioxidant defense mechanisms, including the glutathione redox system, the Vit C-Vit E cycle, and the alpha-lipoic acid / dihydrolipoic acid redox reaction pairs, has been shown to reduce the sensitivity of oxidative stimuli to diabetics. Increase.

신병증, 망막병증, 신경병증, 대혈관과 미세혈관병증을 포함한 당뇨병의 많은 주된 합병증은 고혈당이 야기한다. 고혈당이 증가함에 따라 ROS의 생성이 증가하며 인슐린 저항성을 악화시키고 조직에 손상을 일으키며, 나아가 심혈관 질환이나 신장 및 안구질환과 같은 당뇨병성 합병증을 유발한다. 조절되지 않는 당뇨병에서는 슈퍼옥사이드 라디칼을 불활성화시키는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD) 및 항산화성 비타민 E, 알파-리포산이 감소된다. 즉, ROS 생성의 증가는 제1형, 제2형 당뇨병 모두에서 특히 베타세포의 사멸을 유도함으로써 당뇨병 및 합병증의 발병을 촉진하고, 악화시키는 것이다. Many major complications of diabetes, including nephropathy, retinopathy, neuropathy, macrovascular and microangiopathy, are caused by hyperglycemia. As hyperglycemia increases, ROS production increases, worsening insulin resistance, damaging tissues, and leading to diabetic complications such as cardiovascular disease and kidney and eye diseases. In uncontrolled diabetes, superoxide dismutase (SOD) and antioxidant vitamin E, alpha-lipoic acid, which inactivate superoxide radicals, are reduced. That is, the increase in ROS production promotes and worsens the onset of diabetes and complications by inducing beta cell death, especially in both type 1 and type 2 diabetes.

미토콘드리아의 대사과정에서 산소분자는 ATP 생성 과정 동안 포도당과 다른 기질의 완전한 대사에 필수적이다. 그러나 정상적인 산화성 인산화 과정 중에 소모되는 산소의 0.4~4%는 프리 라디칼 슈퍼옥사이드로 바뀐다. 결국 이는 다른 반응성 산소기와 반응성 질소기로 바뀔 수 있다. 유리기 과산화물은 정상적으로 항산화성 방어과정에 의해 제거 된다. 미토콘드리아 내 과산화물은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제에 의해 빠르게 과산화수소로 바뀐다. 그 후 과산화수소는 미토콘드리아 내 글루타치온 퍼옥시다제에 의해 물과 산소로 약독화 되거나 세포질내로 확산되어 퍼옥시좀 내에서 카탈라아제에 의해 약독화 된다. 그러나 구리와 철과 같은 환원된 전이 금속이 있는 상태에서 과산화수소는 반응성이 높은 수산화기로 바뀔 수 있다. 과도한 반응성 산소기는 세포 구성성분에 손상을 준다. 그래서 내재적 항산화성 시스템이 반응성 산소기를 중화하기 위해 세포 내에 존재하고, 이들 시스템은 적절한 세포기능을 유지하는데 중요하다. 주된 세포 항산화제는 글루타치온(GSH)과 환원된 NADP이다. 내재적 항산화성 단계가 세포의 산화환원반응 균형을 복구할만한 충분한 보상성 반응을 야기하는데 실패할 경우 GSH는 감소하고 산화성 스트레스가 발생한다. 위와 같은 반응에 의해 생성되는 대부분의 ROS는 미토콘드리아에서 생성되며 제거하는 역할 역시 미토콘드리아 내의 효소에 의해 이루어진다. 세포 내에서 특히 ROS와 밀접한 관련이 있는 미토콘드리아를 타겟으로 약물전달을 함으로써 약물의 효과를 극대화 시킬 수 있다.Oxygen molecules in mitochondrial metabolism are essential for complete metabolism of glucose and other substrates during ATP production. However, 0.4 to 4% of oxygen consumed during normal oxidative phosphorylation is converted to free radical superoxide. Eventually it may turn into another reactive oxygen group and a reactive nitrogen group. Free radical peroxides are normally removed by antioxidant defenses. Peroxides in mitochondria are rapidly converted to hydrogen peroxide by superoxide dismutase. Hydrogen peroxide is then attenuated by water and oxygen by glutathione peroxidase in mitochondria or diffused into the cytoplasm and attenuated by catalase in peroxysomes. However, in the presence of reduced transition metals such as copper and iron, hydrogen peroxide can be converted to highly reactive hydroxyl groups. Excessive reactive oxygen groups damage cell components. Thus, an intrinsic antioxidant system exists within the cells to neutralize reactive oxygen groups, and these systems are important for maintaining proper cellular function. The main cellular antioxidants are glutathione (GSH) and reduced NADP. GSH decreases and oxidative stress occurs when the intrinsic antioxidant stage fails to produce sufficient compensatory responses to restore the cell's redox balance. Most of the ROS produced by the above reaction is produced in the mitochondria and the role of elimination is also played by enzymes in the mitochondria. In particular, drug delivery can be maximized by targeting the mitochondria closely related to ROS in cells.

항산화제의 처리는 베타세포의 생존에 이롭다는 연구가 보고된 바 있다(Nishikawa T, Araki E et al., Antioxid Redox Signal 9 (2007) 343-353). 항산화제의 과발현을 통해 당뇨병에서 생성되는 ROS의 독성을 개선시킬 수 있고(Ha H et al., Diabetes Res Clin Pract 82 (2008) S42-S45), 전신적으로 투여하는 것 또한 제1형 당뇨병의 발병 시기를 늦출 수 있다는 연구결과도 있다(Hohmeier HE et al., J Clin Invest 101 (1998) 1811-20).
Antioxidant treatment has been reported to benefit beta cell survival (Nishikawa T, Araki E et al ., Antioxid Redox Signal 9 ( 2007 ) 343-353). Overexpression of antioxidants may improve the toxicity of ROS produced in diabetes (Ha H et al ., Diabetes Res Clin Pract 82 ( 2008 ) S42-S45), and systemic administration also leads to the development of type 1 diabetes. Some studies have shown that this may be delayed (Hohmeier HE et al ., J Clin Invest 101 ( 1998 ) 1811-20).

메탈로치오네인(Metallothionein, MT)는 1957년 최초로 발견되었으며, 시스테인이 풍부한 저분자(3.5~14 kDa) 물질로서, 시스테인-X-시스테인, 시스테인-X-X-시스테인, 시스테인-시스테인의 구조가 반복되는 61개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 2가 금속이온과 결합하는 20개의 시스테인 잔기를 포함한다. 메탈로치오네인은 중금속, 기아, 열 또는 감염과 같은 스트레스 환경에서 과발현된다. 메탈로치오네인은 금속 독성에 대한 생체 방어의 중요한 수단으로 생각되어져 왔으며, 또한 산화성 스트레스에 대한 방어 작용도 하는 것으로도 알려져 있다. 흔히 ROS의 산화성 손상에 대한 생물학적 방어는 ROS를 제거하는 단백질들, 금속이온을 격리시키는 분자들 및 손상된 세포 구성성분을 복구하는 효소들로 구성되어 있다. 이중 MT는 지금까지 많은 연구를 통해 산화성 스트레스에 대한 세포반응에서 항산화제 역할을 한다는 것이 증명되어 왔다.Metallothionein (MT), first discovered in 1957, is a cysteine-rich low molecular (3.5-14 kDa) substance that repeats the structure of cysteine-X-cysteine, cysteine-XX-cysteine, and cysteine-cysteine. It consists of twenty amino acids and contains twenty cysteine residues which bind to divalent metal ions. Metallothionein is overexpressed in stress environments such as heavy metals, starvation, fever or infection. Metallothionein has been thought to be an important means of biological defense against metal toxicity and is also known to act as a defense against oxidative stress. Often, the biological defense against oxidative damage of ROS consists of proteins that remove ROS, molecules that sequester metal ions, and enzymes that repair damaged cell components. Much has been demonstrated to date that MT acts as an antioxidant in cellular responses to oxidative stress.

최근 메탈로치오네인이 생체외(in vitro)와 생체내(in vivo)에서 세포와 조직을 당뇨병과 당뇨 합병증으로부터 보호할 수 있고, 이는 메탈로치오네인이 갖는 항-아포토시스(anti-apoptotic) 및 항산화능 때문인 것으로 보고 되었다(K.G. Danielson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1982) 2301-04). 메탈로치오네인이 제거된 당뇨성 마우스(MT null diabetic mice)에 메탈로치오네인을 과발현시킨 결과, 당뇨성 심근병증은 감소되고, 심장의 악화된 허혈성 수축이 개선되었음이 보고된 바 있다(Q. Liang et al., Diabetes. 51 (2002) 174-181). 아연 또한 메탈로치오네인의 발현을 유도하고, 고혈당과 제2형 당뇨병에서 베타세포의 점진적 손상에 의해 유발된 당뇨성 손상으로부터 마우스를 보호할 수 있다. 또한 아연-메탈로치오네인은 생체외(in vitro)와 생체내(in vivo)에서 하이드록실 라디칼을 차단할 수 있음이 알려져 있다(C.G. Taylor et al., Biometals. 18 (2005) 305-312). Recently, metallothionein can protect cells and tissues from diabetes and diabetic complications in vitro and in vivo , which are anti-apoptotic and It has been reported to be due to antioxidant activity (KG Danielson et al ., Proc Natl Acad Sci USA . 79 ( 1982 ) 2301-04). Overexpression of metallothionein in MT null diabetic mice has been reported to reduce diabetic cardiomyopathy and improve aggravated ischemic contraction of the heart (Q). Liang et al ., Diabetes . 51 ( 2002 ) 174-181). Zinc can also induce the expression of metallothionein and protect mice from diabetic damage caused by gradual damage of beta cells in hyperglycemia and type 2 diabetes. It is also known that zinc-metallochionein can block hydroxyl radicals in vitro and in vivo (CG Taylor et al ., Biometals . 18 ( 2005 ) 305-312).

이와 같이 메탈로치오네인이 ROS를 제거함으로써 당뇨병 및 당뇨 합병증을 개선하거나 예방할 수 있지만, 메탈로치오네인은 세포막의 지질이중막구조를 통과하기 어렵기 때문에 치료제로서 응용하기에 어려운 한계점이 있다. 이에 따라 대부분의 연구는 메탈로치오네인을 유전자 재조합을 통해 세포 내 체내에서 과발현시키는데 그치고 있다. As described above, although metallothionein can improve or prevent diabetes and diabetic complications by removing ROS, metallothionein is difficult to apply as a therapeutic agent because it is difficult to pass through the lipid bilayer structure of cell membranes. Accordingly, most studies have only overexpressed metallothionein in the body through gene recombination.

한편, 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain, PTD)은 단백질, 유전자 및 입자등과 같이 생리적으로 활성인 거대 분자를 세포막을 통해 세포질 내로 효과적이고 비-특이적으로 수송 또는 흡수시킬 수 있다. HIV-1 바이러스 단백질의 Tat 펩타이드(49-57, YGRKKRRQRRR)는 이러한 단백질 형질 도입 영역으로 잘 알려져 있다. 알라닌으로 치환된 Tat 펩타이드는 세포 내로 이동될 수 없으며, 이는 Tat의 양이온 잔기가 세포 내 수송에 중요한 부분임을 의미한다. 그러나, 히스티딘, 라이신 및 오르니틴과 같은 양이온성 아미노산은 세포 내 수송 효율이 Tat 펩파이드 보다 떨어진다. 폴리아르기닌으로서 노나-아르기닌(9R)은 미카엘리스-멘튼 동역학(Michaelis-Menton kinetic) 분석 결과, Tat 펩타이드 보다 20배가량 세포 내 수송 효율이 높다(P. A. Wender et al., Proc Natl Acad Sci. 97 (2000) 13003-13008). Protein transduction domains (PTDs), on the other hand, can efficiently and non-specifically transport or absorb physiologically large molecules such as proteins, genes and particles into the cytoplasm through the cell membrane. Tat peptides of the HIV-1 viral protein (49-57, YGRKKRRQRRR) are well known as such protein transduction regions. Tat peptides substituted with alanine cannot be transported into cells, meaning that the cationic residues of Tat are an important part of intracellular transport. However, cationic amino acids such as histidine, lysine and ornithine have lower intracellular transport efficiency than Tat peptides. As a polyarginine, nona-arginine (9R) has a 20-fold higher intracellular transport efficiency than Tat peptides as a result of Michaelis-Menton kinetic analysis (PA Wender et al ., Proc Natl Acad Sci . 97 ( 2000 ) 13003-13008).

이에 본 발명자들은 세포막의 지질이중막 구조를 통과하기 어려워 약학적 치료제로서 적용되기 어려운 한계가 있는 메탈로치오네인을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 방법에 대해 예의 연구한 결과, 메탈로치오네인과 단백질 형질 도입영역이 결합된 융합 단백질을 제조하였고, 이러한 융합 단백질이 세포 내로 투과되어 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포를 보호할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have conducted a thorough study on the method of effectively delivering metallothionein into the cell, which is difficult to pass through the lipid bilayer structure of the cell membrane and is difficult to be applied as a pharmaceutical treatment. A fusion protein incorporating an introduction region was prepared, and it was confirmed that the fusion protein could be penetrated into cells to protect pancreatic beta cells and cardiomyocytes from glucolipotoxicity or hyperglycemic stress, thereby completing the present invention. .

따라서, 본 발명의 과제는 세포 내 효율적으로 유입되어 메탈로치오네인의 항산화 활성 및 항-아포토시스 효과를 발휘함으로써, 고혈당 또는 당지질 독성으로부터 세포를 보호할 수 있는 항산화 융합 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an antioxidant fusion protein capable of protecting cells from hyperglycemia or glycolipid toxicity and its use by efficiently entering the cells and exerting the antioxidant and anti-apoptotic effects of metallothionein. .

이를 위해, 본 발명은 To this end, the present invention

메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질을 제공한다.Protein transduction domains at the amino terminus of metallothionein provide a peptide-bound antioxidant fusion protein.

또한 본 발명은 메탈로치오네인(metallothionein) 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 전술한 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. In addition, the present invention is a recombinant polynucleotide encoding the above-described antioxidant fusion protein is bound to the cDNA encoding the protein transduction domain (CDNA) at the 5 'end of the cDNA encoding the metallothionein protein To provide.

또한 본 발명은 상기 단백질 형질 도입 영역의 카르복시 말단에 추가적으로 미토콘드리아 타겟팅 서열(Mitochondrial Targeting Sequence)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질을 제공한다. The present invention also provides an antioxidant fusion protein in which a mitochondrial targeting sequence is peptide-bonded to the carboxy terminus of the protein transduction region.

또한 본 발명은 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. In another aspect, the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide described above.

또한 본 발명은 상기한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.The present invention also provides a microorganism transformed with the expression vector described above.

또한 본 발명은 상기한 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes comprising the antioxidant fusion protein as an active ingredient.

아울러 본 발명은 상기한 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 심근병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetic cardiomyopathy comprising the antioxidant fusion protein as an active ingredient.

본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 내 투과율이 높아, 고혈당 및 고지질에 의한 당산화 및 당지질 스트레스로부터 세포를 보호한다. The fusion protein according to the present invention has high intracellular permeability and protects cells from glycation and glycolipid stress caused by hyperglycemia and hyperlipidemia.

도 1은 본 발명의 실시예 1 및 2에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다.
도 2의 (a)는 MT, Tat-MT 융합 단백질 및 11R-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과, (b)는 아연으로 안정화한 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Tat-MT, Tat-MTS-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 심근세포에서의 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합 단백질 세포투과능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 심근세포에서의 Tat-GFP와 Tat-MTS-GFP 융합 단백질 전달율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 Ins-1 췌장 베타세포에 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 H9c2 심근세포에 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 당지질 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 14는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 15는 당지질 스트레스에 의해 유도된 심근 세포 카스파제-3 활성에 대한 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스 조건 하에서 심근 세포의 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 염화코발트로 처리하여 유도된 외인성 아포토시스에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 심근세포 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 고혈당 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 저산소 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20는 고혈당 스트레스와 저산소 스트레스에 함께 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 나트륨 아비산염을 처리한 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 Tat-MTS-MT 투여에 따른 췌장의 활성 산소종 함량을 나타낸 그래프이다.
도 23은 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 24는 스트렙토조토신 유도 제2형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 25는 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 스트렙토조토신 투여 전과 후 Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 26은 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다. 1 is a genetic map of the fusion protein prepared in Examples 1 and 2 of the present invention.
Figure 2 (a) is MT, Tat-MT fusion protein and 11R-MT fusion protein analyzed by SDS-PAGE gel and stained with Coomassie blue, (b) shows the result after stabilizing with zinc will be.
Figure 3 shows the results of staining with Coomassie blue after analyzing the Tat-MT, Tat-MTS-MT fusion protein via SDS-PAGE gel.
Figure 4 is a graph showing the results of analyzing the cell permeability of Tat-GFP, Tat-MTS-GFP fusion protein in cardiomyocytes.
Figure 5 is a graph showing the results of analyzing the Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion protein delivery rate in cardiomyocytes.
6 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins to Ins-1 pancreatic beta cells from 1 μM to 7 μM.
7 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins to H9c2 cardiomyocytes from 1 μM to 7 μM.
8 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins for pancreatic beta cells exposed to glycolipid stress.
Figure 9 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein for pancreatic beta cells exposed to hypoxic stress with glycolipid stress.
Figure 10 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein for cardiomyocytes exposed to glycolipid stress.
11 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to glycolipid stress. .
12 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress. .
Figure 13 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress with glycolipid stress.
FIG. 14 shows survival rate of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT, and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress with glycolipid stress. Is a graph.
FIG. 15 is a graph comparing the degree of inhibition of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins against cardiomyocyte caspase-3 activity induced by glycolipid stress.
16 is a graph showing the degree of inhibition of caspase-3 activity of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins of cardiomyocytes under hypoxic stress conditions with glycolipid stress.
Figure 17 is a graph comparing the degree of inhibition of cardiomyocyte caspase-3 activity of MT, Tat-MT and 11R-MT protein against exogenous apoptosis induced by treatment with cobalt chloride.
Figure 18 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species of the fusion protein treatment group when the degree of expression of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hyperglycemia stress 100%.
19 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species of the fusion protein treatment group when the degree of expression of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hypoxic stress is 100%.
20 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species in the fusion protein treatment group when the expression level of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hyperglycemia and hypoxic stress is 100%.
21 is a graph showing the result of comparing the amount of active oxygen species in the fusion protein treatment group when the expression level of reactive oxygen species in the cardiomyocytes treated with sodium arsenite is 100%.
Figure 22 is a graph showing the reactive oxygen species content of the pancreas according to Tat-MTS-MT administration for streptozotocin induced type 1 diabetes animal model.
FIG. 23 is a graph showing blood glucose changes after MT and Tat-MT administration in streptozotocin-induced type 1 diabetes animal model.
24 is a graph showing changes in blood glucose after administration of MT and Tat-MT for streptozotocin-induced type 2 diabetes animal model.
FIG. 25 is a graph showing blood glucose changes according to administration of Tat-MT and Tat-MTS-MT before and after administration of streptozotocin in a streptozotocin-induced diabetic animal model.
FIG. 26 is a graph illustrating changes in blood glucose according to MT, Tat-MT, and Tat-MTS-MT administration for streptozotocin-induced diabetic animal models.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. The present invention is described in more detail below.

본 발명의 항산화 융합 단백질은 메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합되어 있다. In the antioxidant fusion protein of the present invention, a protein transduction domain (Protein Tranduction Domain) is peptide-linked to the amino terminus of metallothionein.

상기 메탈로치오네인(metallothionein)은 인간으로부터 유래되는 것이라면 유형 I, II, III 및 IV, 이의 아형(isoform) 어떠한 것이라도 가능하다. 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된 것이다. The metallothionein can be any of the types I, II, III and IV, isoforms thereof, as long as they are of human origin. Preferably it is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

본 발명의 융합 단백질은 메탈로치오네인이 펩타이드, 단백질 등을 세포 내로 효율적으로 전달 또는 흡수시키는 단백질 형질 도입 영역과 융합됨으로써, 세포 내로 융합 단백질이 효과적으로 투과될 수 있다. The fusion protein of the present invention is fused with a protein transduction region through which metallothionein efficiently delivers or absorbs peptides, proteins, and the like into cells, thereby effectively penetrating the fusion protein into cells.

상기 단백질 형질 도입 영역은 메탈로치오네인과 융합되어 세포 내로 투과시킬 수 있는 것으로, 이 분야에서 알려진 것이라면 제한 없이 사용가능하다. 일예로, HIV-1 바이러스의 Tat 단백질, 폴리아르기닌(아르기닌 6개 이상), 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 또는 Pep-2 펩타이드 등이 가능하다. 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat(Trans Activator of Transcription) 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리아르기닌을 사용한다. The protein transduction region may be fused with metallothionein and penetrated into cells, and any protein known in the art may be used without limitation. For example, the Tat protein of HIV-1 virus, polyarginine (6 or more arginines), penetratin (Penetratin), the transcriptional regulator protein of HSV-1 structural protein VP22, Pep-1 peptide, or Pep-2 peptide It is possible. Preferably, Tat (Trans Activator of Transcription) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or polyarginine represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is used.

이때 메탈로치오네인과 단백질 형질 도입 영역은 화학적 또는 생물학적으로 융합될 수 있으며, 이러한 방법은 당 업계에서 널리 알려진 공지 기술이므로, 본 명세서에서 더욱 자세한 설명은 생략하기로 한다. In this case, the metallothionein and the protein transduction region may be chemically or biologically fused, and since such a method is well known in the art, a detailed description thereof will be omitted.

활성 산소종(ROS)은 대부분 미토콘드리아에서 생성되므로, 항산화 활성을 갖는 본원발명의 융합단백질이 세포 내 특히 ROS와 밀접한 관련이 있는 미토콘드리아 내로 전달되면 메탈로치오네인의 효과를 극대화할 수 있다. Since reactive oxygen species (ROS) are mostly produced in mitochondria, when the fusion protein of the present invention having antioxidant activity is delivered into the mitochondria which are closely related to ROS in the cell, the effect of metallochionein can be maximized.

이를 위해, 상기 단백질 형질 도입 영역의 카르복시 말단에 추가적으로 미토콘드리아 타겟팅 서열(Mitochondrial Targeting Sequence)이 펩타이드 결합될 수 있다.To this end, a mitochondrial targeting sequence may be peptide-bound to the carboxy terminus of the protein transduction region.

이때, 상기 미토콘드리아 타겟팅 서열은 미토콘드리아 단백질로부터 유래된 것이라면 본 발명에서 특별히 제한하지 않는다. 대표적으로, 미토콘드리아 타겟팅 서열은 말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 단백질로부터 유래될 수 있다. 바람직하기로 말레이트 디하이드로게나아제로부터 유래되며 서열번호 7로 표시되는 것을 사용한다. In this case, the mitochondrial targeting sequence is not particularly limited as long as it is derived from a mitochondrial protein. Typically, mitochondrial targeting sequences include malate dehydrogenase, human cytochrome c subunit oxidase VIII, PI subtypes of human ATP synthase subunit c, aldehyde dehydrogenase targeting sequence, human ATP synthase subunit FI beta And it may be derived from one protein selected from the group consisting of BCS1 protein. Preferably, those derived from malate dehydrogenase and represented by SEQ ID NO: 7 are used.

상기 융합 단백질은 단백질 형질 도입 영역 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합될 수 있다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 융합 단백질을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 바람직하기로 폴리히스티딘 영역으로 헥사히스티딘을 사용한다.
The fusion protein may have a poly-His region coupled to the amino terminus of the protein transduction region. The polyhistidine (poly-His) region is one of the labeling peptides, and may be used to separate and purify the fusion protein of the present invention by binding to histidine binding resin. Preferably hexahistidine is used as the polyhistidine region.

또한 본 발명은 메탈로치오네인 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. The present invention also binds a cDNA encoding a protein transduction region to the 5 'end of the cDNA encoding a metallothionein protein, and includes a recombinant polynucleotide encoding the antioxidant fusion protein of the present invention.

이러한 폴리뉴클레오티드는 메탈로치오네인, 단백질 형질 도입 영역, 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.
Such polynucleotides can be prepared according to conventional methods from known nucleic acid sequences encoding metallocionein, protein transduction regions, mitochondrial targeting sequences.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용가능한 것이라면 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일예로, pRSET, pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis 등이 가능하다. 상기 벡터로 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터를 사용할 수 있다. The present invention also provides an expression vector comprising the polynucleotide. The vector is not particularly limited as long as it can be used as a cloning vector. For example, pRSET, pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis and the like are possible. As the vector, a vector into which DNA encoding a poly-His region is inserted can be used.

이러한 벡터는 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 공지된 통상의 방법으로 삽입하여 제조할 수 있다.
Such a vector can be prepared by inserting a gene encoding the fusion protein into a cloning vector digested with an appropriate restriction enzyme by a conventional method known in the art.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 포함한다. 상기 미생물은 상기 융합 단백질이 효과적으로 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 가능하다. 대표적으로, E. Coli, 피키아 속(Pichia genus) 균주 등을 예시할 수 있다.
The present invention also includes a microorganism transformed with the vector. The microorganism may be anything as long as the fusion protein can be effectively expressed. Representative examples include E. Coli , Pichia genus strains, and the like.

본 발명의 융합 단백질은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:Fusion proteins of the present invention can be prepared by the following method:

(a) 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 형질 도입 영역을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계;(a) a protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 at the 5 'end of the cDNA encoding a metallothionein represented by one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 Transforming the microorganism with a recombinant expression vector to which the cDNA encoding the transduction region is bound and comprising the recombinant polynucleotide encoding the antioxidant fusion protein of the present invention;

(b) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 항산화 융합 단백질을 발현하는 단계; 및(b) culturing the transformed microorganism to express an antioxidant fusion protein; And

(c) 발현된 항산화 융합 단백질을 정제하는 단계(c) purifying the expressed antioxidant fusion protein

이때 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적으로 상기 단백질 형질 도입 영역을 코팅하는 cDNA의 3' 말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코팅하는 cDNA가 결합될 수 있다. In this case, the recombinant polynucleotide may additionally bind the cDNA coating the mitochondrial targeting sequence represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 to the 3 'end of the cDNA coating the protein transduction region.

상기 방법에 있어서, 상기 형질전환 단계는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 운반시켜 실시된다. 상기 형질전환 방법은 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법, Hanahan 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 봄바드먼트 등에 의해 발현 벡터를 숙주 세포인 미생물 내로 주입 할 수 있다. 미생물 내로 주입된 발현 벡터는 미생물 내에서 발현되어 목적의 융합 단백질을 얻게 된다. In this method, the transformation step is carried out by transporting the expression vector into a host cell. The transformation method may be carried out by the CaCl ₂ method, Hanahan method and electroporation method when the host cell is a prokaryotic cell. When the host cell is a eukaryotic cell, the expression vector is injected into the host cell microorganism by micro injection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment and gene bombardment. can do. The expression vector injected into the microorganism is expressed in the microorganism to obtain the desired fusion protein.

발현된 융합 단백질은 변성상태 또는 자연 상태에서, 당 업계에 공지된 일반적인 정제방법을 통해 정제될 수 있다. 정제방법은, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 분획화 (fractionation), 크기 구별 여과 (한외여과) 및 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피를 포함한다.The expressed fusion protein can be purified in a denatured or natural state through common purification methods known in the art. Purification methods include, for example, fractionation with ammonium sulfate, size differential filtration (ultrafiltration) and metal chelating affinity chromatography.

본 발명에 따른 항산화 융합 단백질은 세포 내 효율적으로 투과되어 메탈로치오네인의 항산화 활성 및 항-아포토시스 효과를 발휘함으로써, 고혈당 또는 당지질 독성으로부터 췌장 베타세포와 심근세포를 보호한다. The antioxidant fusion protein according to the present invention efficiently penetrates the cells and exerts the antioxidant and anti-apoptotic effects of metallothionein, thereby protecting pancreatic beta cells and cardiomyocytes from hyperglycemia or glycolipid toxicity.

따라서, 상기 항산화 융합 단백질은 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다. Thus, the antioxidant fusion protein can be used as a prophylactic or therapeutic agent for diabetes or diabetic cardiomyopathy.

본 발명은 또한 본 발명의 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다. The present invention also includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes mellitus or diabetic cardiomyopathy comprising the antioxidant fusion protein of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention can be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.

본 발명에 의한 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하고 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용할 수 있으며, 제제화 할 경우에는 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.The composition according to the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration, and can be used in the form of general pharmaceutical preparations, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. Diluents or excipients may be used.

경구투여를 위한 고형제제는 본 발명에 따른 융합 단백질에 적어도 하나의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등의 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
Solid preparations for oral administration may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin in the fusion protein according to the present invention. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions or syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. can be used in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있으며, 상기 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent or the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, etc. may be used, and the bases of the suppositories may include Utopepsol, macrogol, Tween 61, Cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여용량은 체중 1kg 당 0.01 내지 1000 mg 의 양을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이때 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다. The composition of the present invention can be administered parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage is in the range of 0.01 to 1000 mg per kg of body weight. Administration may be divided into several times or several times. In this case, the dosage may be adjusted according to the weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the patient.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.

실시예 1: PTD-MT 융합 단백질 제조Example 1: Preparation of PTD-MT Fusion Proteins

1-1. PTD-MT 융합 단백질 제조를 위한 벡터 제작1-1. Vector Fabrication for PTD-MT Fusion Protein Preparation

PTD-MT 융합 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 pRSET 발현벤터(Invitrogen)를 이용하였다. 먼저, 벡터에 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 TAT를 코딩하는 cDNA 또는 11R을 코딩하는 cDNA를 클로닝 하였다. PRSET expression venter (Invitrogen) was used to prepare a vector expressing PTD-MT fusion protein. First, cDNA encoding TAT represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or cDNA encoding 11R was cloned into a vector.

이를 위해, 서열번호 8의 Tat 올리고뉴클레오티드 또는 11R 올리고뉴클레오티드를 각각 정제한 뒤 pRSET-A 벡터에 클로닝하여 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다. To this end, the Tat oligonucleotide or 11R oligonucleotide of SEQ ID NO: 8 was purified and cloned into pRSET-A vector to prepare pRSET-Tat or pRRET-11R vector. The produced vector was confirmed by DNA sequencing.

인간 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA를 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터에 클로닝하기 위해, 메탈로치오네인 1H를 코딩하는 염기서열을 센스 프라이머(5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3': 서열번호 10)과 안티센스 프라이머(5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3': 서열번호 11)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 정제된 부분을 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터에 hoI과 EcoRI 제한효소 부위를 사이에 클로닝 하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다. In order to clone the cDNA encoding human metallochionein into a pRSET-Tat or pRRET-11R vector, a nucleotide sequence encoding metallothionein 1H was added to a sense primer (5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3 ': SEQ ID NO: 10). Amplified by PCR using antisense primer (5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3 ': SEQ ID NO: 11). The purified portion was cloned between hoI and EcoRI restriction enzyme sites in the pRSET-Tat or pRRET-11R vector. The produced vector was confirmed by DNA sequencing.

Tat-GFP 융합 단백질 제조를 위해 pAcGFP1-N(invitrogen)로부터 얻은 GFP 유전자를 XhoI 및 NotI 위치에서 절단하여 제작된 pRSET-Tat 벡터 내로 삽입하였다. 이후 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.To prepare the Tat-GFP fusion protein, the GFP gene obtained from pAcGFP1-N (invitrogen) was inserted into the pRSET-Tat vector prepared by cleaving at XhoI and NotI positions. Then it was confirmed through DNA sequencing.

1-2. PTD-MT 발현과 정제1-2. PTD-MT Expression and Purification

제작된 벡터를 형질전환용 세포(Escherichia coli BL21 (DE)pLysS)에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 50ug/ml의 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 배양액 내 박테리아 농도, 600nm에서의 OD값이 0.4 내지 0.6이 되었을 때 단백질 발현을 위해 1mM의 IPTG를 넣고 26 ℃에서 하룻밤 동안 배양을 하였다. IPTG를 넣을 때, 단백질의 안정화를 위하여 1mM의 ZnSO₄를 넣고 배양하였다. 배양 후에 원심분리기를 이용하여 펠렛을 모으고 이를 용해성 버퍼와 100mM의 PMSF를 넣고 초음파처리를 30초씩 8번을 하여 세포를 깼다. 이를 통해 상층액을 모은 뒤 0.45um의 필터를 이용하여 여과하고, FPLC를 이용하여 니켈-니트릴로트리아세트산 레진 칼럼의 결합을 이용하여 정제하였다. 3500MW의 막을 이용하여 정제된 단백질로부터 염을 제거하고, 수득한 단백질에 단백질 분해효소 억제제 칵테일을 첨가하여 4 ℃에서 안정하게 보관하였다. Colonies obtained by transforming the prepared vector into transforming cells ( Esherichia coli BL21 (DE) pLysS) were incubated for 4 hours at 37 ℃ in LB medium to which 50ug / ml of ampicillin was added. Then, when the bacterial concentration in the culture medium, the OD value at 600nm was 0.4 to 0.6 and put 1 mM IPTG for protein expression and incubated overnight at 26 ℃. When the IPTG was added, 1mM ZnSO ₄ was added and cultured to stabilize the protein. After incubation, pellets were collected using a centrifugal separator and soluble buffer and 100 mM PMSF were added and sonication was performed 8 times for 30 seconds to separate cells. Through this, the supernatant was collected and filtered using a 0.45 um filter, and purified using a combination of a nickel-nitrilo triacetic acid resin column using FPLC. The salt was removed from the purified protein using a 3500 MW membrane and the protease inhibitor cocktail was added to the obtained protein and stored stably at 4 ° C.

1-3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅1-3. SDS-PAGE and Western Blotting

발현된 단백질을 확인하기 위하여 12%의 SDS-PAGE를 이용하였다. 이중 하나는 쿠마시 블루로 60분 동안 염색하였고, 다른 하나는 웨스턴 블롯으로 메탈로치오네인을 확인하기 위해 PVDF 막으로 이동시켜, 40 mA로 4 ℃에서 하룻밤 동안 이동을 진행하였다. 이를 5% 탈지유를 포함하는 TBS에 넣고 4 ℃에서 60분간 블로킹을 한 뒤, 메탈로치오네인 토끼 다클론성 항체 IgG(1/1000 희석도)를 넣고 2 시간 동안 4 ℃에서 반응하였다. 이후 염소 항-토끼 IgG-HRP(1/1000 희석도)를 넣고 4 ℃에서 2시간 동안 반응을 시키고, 막은 Opti4-CN을 이용하여 확인하였다. 12% SDS-PAGE was used to identify the expressed protein. One of them was stained with Coomassie blue for 60 minutes and the other was transferred to PVDF membranes to identify metallothionein by Western blot, followed by overnight migration at 4 ° C. at 40 mA. This was placed in TBS containing 5% skim milk and blocked for 60 minutes at 4 ° C., and then metallothioneine rabbit polyclonal antibody IgG (1/1000 dilution) was added and reacted at 4 ° C. for 2 hours. Then goat anti-rabbit IgG-HRP (1/1000 dilution) was added and reacted for 2 hours at 4 ℃, the membrane was confirmed using Opti4-CN.

도 1의 (a)는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다. Figure 1 (a) is a genetic map of the fusion protein prepared in Example 1 of the present invention.

도 1에 나타낸 바와 같은 Tat-MT, 11R-MT 융합 단백질 및 MT 제조를 위한 발현벡터가 제대로 제작되었으며, 제작된 벡터의 염기서열은 염기서열 분석을 통해 확인하였다. The expression vector for Tat-MT, 11R-MT fusion protein and MT preparation as shown in Figure 1 was properly prepared, and the nucleotide sequence of the prepared vector was confirmed by sequencing.

1-4. 아연의 유무에 따른 단백질의 안정성 평가1-4. Evaluation of protein stability with or without zinc

메탈로치오네인은 4개의 아연 이온이 결합되는 11개의 시스테인 잔기를 포함하는 알파 도메인과 3개의 아연 이온이 결합되는 9개의 시스테인 잔기를 포함하는 베타 도메인으로 이루어져 있다. 아연 이온이 메탈로치오네인의 시스테인 잔기와 결합하여 두 개의 메탈/티올레이트 클러스터를 형성함으로써 메탈로치오네인은 산화환원 성질을 갖게 된다(W. Maret et al., Proc.Natl.Acad.Sci U S A. 95 (1998) 3478-3482). 더욱이, 이러한 메탈로치오네인의 특이적인 구조는 아연에 의해 열역학적 안정성이 증가되고, 세포 내 공간에서 메탈로치오네인 클러스터에 대한 산화환원반응 활성을 부여한다. 이와 같이 아연은 메탈로치오네인이 항산화 단백질로 작용하기 위해 필수적인 것으로 알려져 있다(M. Wan et al., Biochem. J. 292 (1993) 609-615; M. Grattarola et al., Mol Biol Rep. 33 (2006) 265-272; Z.E. Suntres et al., Chem Biol Interact. 162 (2006) 11-23). The metallothionein consists of an alpha domain containing 11 cysteine residues to which 4 zinc ions are bound, and a beta domain containing 9 cysteine residues to which 3 zinc ions are bound. The zinc ion combines with the cysteine residues of the metallothione to form two metal / thiolate clusters, giving the metallothionein redox properties (W. Maret et al ., Proc . Natl . Acad . Sci US). A. 95 ( 1998 ) 3478-3482). Moreover, the specific structure of such metallothionein increases the thermodynamic stability by zinc, and confers redox activity on the metallothionein cluster in the intracellular space. As such, zinc is known to be essential for metallothionein to act as an antioxidant protein (M. Wan et al ., Biochem. J. 292 ( 1993 ) 609-615; M. Grattarola et al ., Mol Biol Rep . 33 ( 2006 ) 265-272; ZE Suntres et al ., Chem Biol Interact . 162 ( 2006 ) 11-23).

아연이 있거나 없는 조건하에서 MT, PTD-MT 융합단백질 발현을 유도하여, 이를 통해 메탈로치오네인 안정성 및 구조에 대한 아연의 영향을 확인하였다. Induction of MT, PTD-MT fusion protein expression in the presence or absence of zinc, thereby confirming the effect of zinc on metallochionein stability and structure.

도 2의 (a)는 MT, Tat-MT 융합 단백질 및 11R-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과, (b)는 아연으로 안정화한 후의 결과를 나타낸 것이다. Figure 2 (a) is MT, Tat-MT fusion protein and 11R-MT fusion protein analyzed by SDS-PAGE gel and stained with Coomassie blue, (b) shows the result after stabilizing with zinc will be.

도 2의 (a)를 참조하면, 아연이 없는 경우 메탈로치오네인과 본 발명의 융합 단백질은 자기 응집을 통해 다수 개의 밴드를 나타냄을 알 수 있다. 이와 달리 도 2의 (b)를 참조하면, 아연이 있는 경우 메탈로치오네인과 본 발명의 융합 단백질은 단일 밴드로 나타남을 알 수 있다. 이러한 결과는 아연이 산화환원반응 활성뿐만 아니라 메탈로치오네인의 안정성을 유지하는데 필수적인 요소임을 나타낸다. Referring to FIG. 2 (a), it can be seen that in the absence of zinc, the metallothionein and the fusion protein of the present invention exhibit multiple bands through self-aggregation. On the contrary, referring to FIG. 2 (b), it can be seen that when zinc is present, the metallothionein and the fusion protein of the present invention are represented by a single band. These results indicate that zinc is an essential factor for maintaining the stability of metallothionein as well as redox activity.

또한 MT, Tat-MT 및 11R-MT의 분자량은 아미노산 서열로부터 계산할 결과, 각각 13.2 kDa, 12.9 kDa 및 12.7 kDa로 확인되었다. The molecular weights of MT, Tat-MT and 11R-MT were found to be 13.2 kDa, 12.9 kDa and 12.7 kDa, respectively, as calculated from the amino acid sequence.

도 2에 나타낸 바와 같이, MT, Tat-MT 및 11R-MT의 단일 밴드는 각각 예상 크기에서 나타났다.
As shown in FIG. 2, single bands of MT, Tat-MT and 11R-MT each appeared at the expected size.

실시예 2: PTD-MTS-MT 융합 단백질 제조Example 2: Preparation of PTD-MTS-MT Fusion Proteins

2-1. PTD-MTS-MT 융합 단백질 제조를 위한 벡터제작2-1. Vector preparation for the preparation of PTD-MTS-MT fusion protein

PTD-MTS-MT 융합 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 pRSET 발현벤터(Invitrogen)를 이용하였다. 먼저, 벡터에 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 TAT를 코딩하는 cDNA 또는 11R을 코팅하는 cDNA를 클로닝 하였다. PRSET expression venter (Invitrogen) was used to prepare a vector expressing the PTD-MTS-MT fusion protein. First, a cDNA encoding TAT represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a cDNA coated with 11R was cloned into a vector.

이를 위해, 서열번호 7의 Tat 올리고뉴클레오티드 또는 11R 올리고뉴클레오티드와 서열번호 9의 MTS 올리고뉴클레이티드를 각각 정제한 뒤 pRSET-A 벡터에 클로닝하여 pRSET-Tat-MTS 벡터와 pRSET-11R-MTS를 제작하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다. To this end, the Tat oligonucleotide or SEQ ID NO: 11R oligonucleotide of SEQ ID NO: 7 and the MTS oligonucleotide of SEQ ID NO: 9 were respectively purified and cloned into a pRSET-A vector to prepare a pRSET-Tat-MTS vector and pRSET-11R-MTS. It was. The produced vector was confirmed by DNA sequencing.

인간 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA를 pRSET-Tat-MTS와 pRSET-11R-MTS벡터에 클로닝하기 위해, 메탈로치오네인 1H를 코딩하는 염기서열을 센스 프라이머(5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3': 서열번호 10)과 안티센스 프라이머(5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3': 서열번호 11)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 정제된 부분을 pRSET-Tat-MTS 벡터에 hoI과 EcoRI 제한효소 부위를 사이에 클로닝 하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다. In order to clone the cDNA encoding human metallochionein into pRSET-Tat-MTS and pRSET-11R-MTS vectors, a base sequence encoding metallothionein 1H was used as a sense primer (5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3 ': sequence No. 10) and antisense primers (5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3 ': SEQ ID NO: 11) were amplified by PCR. The purified portion was cloned between the hoI and EcoRI restriction enzyme sites in the pRSET-Tat-MTS vector. The produced vector was confirmed by DNA sequencing.

Tat-MTS-GFP 융합 단백질 제조를 위해 pAcGFP1-N(invitrogen)로부터 얻은 GFP 유전자를 XhoI 및 NotI 위치에서 절단하여 제작된 pRSET-Tat-MTS 벡터 내로 삽입하였다. 이후 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.To prepare the Tat-MTS-GFP fusion protein, the GFP gene obtained from pAcGFP1-N (invitrogen) was inserted into the pRSET-Tat-MTS vector prepared by cleaving at XhoI and NotI positions. Then it was confirmed through DNA sequencing.

2-2. PTD-MTS-MT 발현과 정제2-2. PTD-MTS-MT Expression and Purification

제작된 벡터를 상기 실시예 1의 1-2와 동일한 방법으로 발현, 정제하였다. The produced vector was expressed and purified in the same manner as in Example 1-2.

2-3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅2-3. SDS-PAGE and Western Blotting

발현된 단백질을 확인하기 위하여 12%의 SDS-PAGE를 이용하여, 상기 실시예 1의 1-3과 동일하게 수행하였다. 12% SDS-PAGE was used to identify the expressed protein, and the same procedure as in Example 1 to 1-3 was performed.

도 1의 (b)는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다. Figure 1 (b) is a genetic map of the fusion protein prepared in Example 2 of the present invention.

도 3은 Tat-MTS-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 밴드는 Tat-MT, 오른쪽 밴드는 Tat-MTS-MT를 보여준다. Figure 3 shows the results of staining with Coomassie blue after analyzing the Tat-MTS-MT fusion protein via an SDS-PAGE gel. The left band shows Tat-MT and the right band shows Tat-MTS-MT.

Tat-MTS-MT의 분자량은 아미노산 서열로부터 계산한 결과, 13.6 kDa이었으며, 겔 분석 결과 융합 단백질이 정확한 크기에서 발현되었음을 확인하였다. 또한, Tat-MTS-MT가 조금 높게 나온 것으로 보아, MTS 삽입에 따라 분자량이 커졌음을 확인할 수 있었다.
The molecular weight of Tat-MTS-MT was 13.6 kDa as calculated from the amino acid sequence, and gel analysis confirmed that the fusion protein was expressed at the correct size. In addition, Tat-MTS-MT appeared to be a little high, it was confirmed that the molecular weight was increased by the insertion of MTS.

실험예 1: PTD-MTS-MT 융합 단백질의 세포 투과능 확인Experimental Example 1: Confirmation of cell permeability of PTD-MTS-MT fusion protein

상기 실시예 2에서 제조한 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질의 세포투과능을 확인하기 위해 H9c2 세포를 6-웰 플레이트에 2ㅧ10⁵ 개씩 넣은 후 하루 동안 안정화시켰다. 이후 FBS가 없는 배지에서 3uM Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질을 각각의 웰에 처리한 후 1시간 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 고정 완충액으로 고정시키고 형광-활성화된 세포 분류기 (Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 검출하였다.In order to confirm the cell permeability of the Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion proteins prepared in Example 2, H9c2 cells were placed in 6-well plates 2 × 10 ⁵ and stabilized for one day. Thereafter, 3uM Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion proteins were treated in each well in a medium without FBS, and then cultured for 1 hour and 30 minutes. Cells were fixed with FACS fixation buffer and detected using Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS).

도 4는 심근세포에서의 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합 단백질후 세포투과능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. Figure 4 is a graph showing the results of analyzing the cell permeability after Tat-GFP, Tat-MTS-GFP fusion protein in cardiomyocytes.

상기 실시예 2에서 제조한 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질의 전달율을 확인하기 위해 H9c2 세포를 6-웰 플레이트에 2ㅧ10⁵ 개씩 넣은 후 하루 동안 안정화시켰다. 이후 FBS가 없는 배지에서 3uM Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질을 각각의 웰에 처리한 후 1시간 30분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, FBS가 있는 배지로 바꿔준다음 다시 1시간 30분 동안 배양하였다. 이후 세포를 FACS 고정 완충액으로 고정시키고 형광-활성화된 세포 분류기(Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 검출하였다.In order to confirm the delivery rate of the Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion proteins prepared in Example 2, H9c2 cells were placed in 6-well plates 2 × 10 ⁵ and stabilized for one day. Thereafter, 3uM Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion proteins were treated in each well in a medium without FBS, and then cultured for 1 hour and 30 minutes. Cells were washed with PBS, changed to medium with FBS and incubated for another 1 hour and 30 minutes. Cells were then fixed with FACS fixed buffer and detected using Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS).

도 5는 심근세포에서의 Tat-GFP와 Tat-MTS-GFP 융합 단백질 전달율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. Figure 5 is a graph showing the results of analyzing the Tat-GFP and Tat-MTS-GFP fusion protein delivery rate in cardiomyocytes.

도 4에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 타겟팅 서열이 GFP의 세포내 투과에 영향을 주지 않으며, 이를 통해 Tat-MTS-MT가 세포막 투과에 문제가 없을 것으로 판단하였다. 또한, 도 5를 참조하면, 미토콘드리아 타겟팅 서열을 포함하지 않는 Tat-GFP 융합 단백질은 시간이 지남에 따라 GFP 발현양이 감소하였다. 그러나, Tat-MTS-GFP 융합 단백질은 시간이 지나도 상대적으로 높은 강도를 유지하였다. 이러한 결과는 미토콘드리아 타겟팅 서열을 통해 세포 내 위치하는 시간이 더욱 증가함을 보여준다.
As shown in FIG. 4, the mitochondrial targeting sequence did not affect intracellular permeation of GFP, and it was determined that Tat-MTS-MT had no problem in permeation of cell membranes. In addition, referring to Figure 5, the Tat-GFP fusion protein that does not contain the mitochondrial targeting sequence decreased the amount of GFP expression over time. However, the Tat-MTS-GFP fusion protein maintained a relatively high intensity over time. These results show that the time to locate in cells further increases through mitochondrial targeting sequences.

실험예 2: 세포 독성 확인Experimental Example 2: Checking Cytotoxicity

메탈로치오네인은 시토졸 단백질이므로 시토졸로 전달되어야 한다. 그러나, 메탈로치오네인의 세포 내 전달효율이 매우 낮다. PTD와 융합된 메탈로치오네인은 메탈로치오네인의 세포 내 전달 효율을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한 본 발명의 융합 단백질은 세포 독성 없이 최적의 농도에서 세포 내 전달이 이루어져야 한다. 이를 위해 MT, Tat-MT 및 11R-MT의 췌장 세포와 심근 세포에 대한 세포 독성을 확인하였다. Metallothionein is a cytosolic protein and must be delivered to the cytosol. However, the intracellular delivery efficiency of metallothionein is very low. Metallothionein fused with PTD is expected to increase the intracellular delivery efficiency of metallothionein. In addition, the fusion protein of the present invention should be intracellular delivery at the optimal concentration without cytotoxicity. To this end, the cytotoxicity of pancreatic and cardiomyocytes of MT, Tat-MT and 11R-MT was confirmed.

2-1. 세포 배양2-1. Cell culture

Ins-1 췌장 베타 세포를 RPMI 1640 배지와 10% 혈청 및 100U/ml 페니실린과 100 g/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37 ℃에서 95% 공기, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다. 심근 세포는 마우스 심근세포 H9c2를 이용하였고, DMEM 배지와 10% 혈청 및 100U/ml의 페니실린과 100 g/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37 ℃에서 95% 공기, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다. Ins-1 pancreatic beta cells were cultured at 37 ° C. under 95% air, 5% CO ₂ conditions with RPMI 1640 medium, 10% serum, 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin. Cardiomyocytes were used as mouse cardiomyocyte H9c2, and cultured under DMEM medium, 10% serum, 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin at 37 ° C. under 95% air and 5% CO ₂ .

2-2. 세포 독성 평가2-2. Cytotoxicity Assessment

MT 및 PTD-MT 융합단백질을 1uM에서 7uM까지 Ins-1 췌장 베타세포 및 H9c2 심근세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 분석하기 위하여 세포 계수 키트(CCK-8)를 사용하여 비색 분석을 수행하였다. 10ul의 CCK 반응액과 90ul의 DMEM배지를 섞어서 각 웰을 2 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 그리고 ELISA를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 비교하였다. MT and PTD-MT fusion proteins were treated with Ins-1 pancreatic beta cells and H9c2 cardiomyocytes from 1 uM to 7 uM and incubated for 24 hours. Colorimetric analysis was performed using Cell Counting Kit (CCK-8) to analyze cell viability. Each well was incubated at 37 ° C. for 2 hours by mixing 10ul of CCK reaction solution and 90ul of DMEM medium. And cell viability was compared by measuring the absorbance at 450nm using ELISA.

도 6은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 Ins-1 췌장 베타세포에 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. 6 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins to Ins-1 pancreatic beta cells from 1 μM to 7 μM.

도 7는 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 H9c2 심근세포에 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. 7 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins to H9c2 cardiomyocytes from 1 μM to 7 μM.

도 6 및 도 7을 참조하면, MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 모두 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다. 6 and 7, all of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins did not show significant cytotoxicity.

실험예 3: PTD-MT 융합 단백질의 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당에 의해 유도된 아포토시스(apoptosis)에 대한 베타 세포 보호 효과 확인Experimental Example 3: Confirmation of the beta cell protective effect of glucolipotoxicity or hyperglycemia induced apoptosis of PTD-MT fusion protein

고혈당은 ROS 및 산화 스트레스를 증가시킴으로써 작용하는 유해 요소 중 하나로, 제1형 및 제2형 당뇨병에 중요하게 관련되어 있다. 정상 상태에서 혈당 수치는 좁은 농도 범위로 유지되나, 당뇨병에 있어서 짧은 시간 동안 혈장의 혈당 수치가 현저하게 변화한다. 이러한 혈장 혈당 수치의 급속한 변화는 혈관내피세포 기능장애 및 심근 아포토시스를 동반한 산화 스트레스를 유도한다. 고혈당과 고지혈증이 함께하는 당지질 독성 상태는 소포체(endoplasmic reticulum)의 스트레스를 유발한다. 이러한 소포체 스트레스는 베타세포 기능 및 팔미테이트 존재하에 배양 후 세포괴(mass)와 관련되어 있는 것으로 보고된 바 있다(E. Karaskov, C et al., Endocrinology. 147 (2006) 3398-3407). 메탈로치오네인의 항산화 기능을 통해 저산소 및 당지질 독성 상태에서 활성 산소종을 제거함으로써 세포의 생존율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질이 당지질 독성 및 저산소 조건 하에서 소포체 스트레스를 감소시킴으로써, 베타 세포의 기능을 보호할 수 있는지 확인하였다. Hyperglycemia is one of the detrimental factors that act by increasing ROS and oxidative stress and is importantly associated with type 1 and type 2 diabetes. In steady state, blood glucose levels remain in a narrow concentration range, but in diabetes, blood glucose levels in the blood change significantly over a short time. This rapid change in plasma glucose levels is associated with vascular endothelial dysfunction and myocardial apoptosis. Induces accompanying oxidative stress. Glycolipid toxicity with hyperglycemia and hyperlipidemia causes stress in the endoplasmic reticulum. These vesicle stresses have been reported to be associated with cell mass after culture in the presence of beta cell function and palmitate (E. Karaskov, C et al., Endocrinology . 147 ( 2006 ) 3398-3407). The antioxidant function of metallothionein can increase cell viability by removing reactive oxygen species in hypoxia and glycolipid toxicity. Therefore, it was confirmed whether the fusion protein according to the present invention can protect the function of the beta cells by reducing the vesicle stress under glycolipid toxicity and hypoxic conditions.

3-1. 고혈당 및 당지질 스트레스 유도3-1. Induction of hyperglycemia and glycolipid stress

상기 실험예 1에서 배양한 베타세포 Ins-1에 다음과 같이 당지질 스트레스를 주었다. 20 mM의 팔미테이트를 0.01M NaOH에 70 ℃에서 30분간 녹이고, 지방산 비누를 5% BSA를 함유하는 PBS와 지방산 대 BSA의 몰비가 8:1이 되도록 섞어주었다. 그리고 팔미테이트/BSA 융합체를 배지에 넣고 세포에 당지질 스트레스를 주었다. 이때 췌장 베타세포에 300 uM의 팔미테이트와 50 mM의 당을 함께 처리하여 24시간동안 당지질 스트레스를 주었다. 심근세포 H9c2의 경우에는 350 mM의 글로코스만을 24 시간 동안 주어 고혈당 스트레스를 유도하였다. 이러한 스트레스를 주는 동안 함께 융합 단백질을 3uM을 처리하고 상기한 바와 같이 CCK를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. The beta cell Ins-1 cultured in Experimental Example 1 was given glycolipid stress as follows. 20 mM palmitate was dissolved in 0.01 M NaOH for 30 minutes at 70 ° C., and the fatty acid soap was mixed so that the molar ratio of fatty acid to BSA with PBS containing 5% BSA was 8: 1. Palmitate / BSA fusions were placed in the medium and the cells were subjected to glycolipid stress. The pancreatic beta cells were treated with 300 uM palmitate and 50 mM of sugar to give glycolipid stress for 24 hours. In the case of cardiomyocyte H9c2, only 350 mM of glycos was given for 24 hours to induce hyperglycemia stress. During this stressing the fusion protein was treated with 3 uM and cell viability was measured using CCK as described above.

3-2. 저산소(Hypoxia) 상태 유도3-2. Induces Hypoxia

저산소 상태에서의 본 발명에 따른 융합 단백질의 세포 보호 효과를 평가하기 위하여, 고혈당 및 당지질 스트레스를 유도 상태에서 저산소 스트레스를 함께 유도하였다. 이를 위해 고혈당 및 당지질 스트레스가 주어진 세포를 37 ℃, 95 % N₂, 5 % CO₂조건의 저산소 인큐베이터에 배양하여 저산소 스트레스를 함께 주었다. 24 시간 뒤에 이를 CCK를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다 In order to evaluate the cellular protective effect of the fusion protein according to the present invention in the hypoxic state, hyperglycemia and glycolipid stress were induced together with the hypoxic stress in the induced state. To this end, cells given high blood sugar and glycolipid stress were cultured in a hypoxic incubator at 37 ° C., 95% N ₂ , and 5% CO ₂ conditions to give hypoxic stress. After 24 hours it was assessed for cell viability using CCK.

도 8은 당지질 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. 8 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins for pancreatic beta cells exposed to glycolipid stress.

도 8을 참조하면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, 11R-MT와 Tat-MT를 처리한 경우 당지질 스트레스에 노출된 베타세포의 생존율이 46.5%에서 각각 54.19%, 67.67%로 증가하였음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 당지질 스트레스에 노출된 베타 세포의 생존율을 유의하게 증가시켰음을 나타낸다. Referring to FIG. 8, MT showed no effect, whereas treatment of 11R-MT and Tat-MT increased the survival rate of beta cells exposed to glycolipid stress from 46.5% to 54.19% and 67.67%, respectively. Can be. These results indicate that the fusion protein according to the present invention significantly increased the survival rate of beta cells exposed to glycolipid stress.

도 9는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. Figure 9 is a graph showing the survival rate (%) of beta cells after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein for pancreatic beta cells exposed to hypoxic stress with glycolipid stress.

도 9를 참조하면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, 11R-MT와 Tat-MT를 처리한 경우 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 베타세포의 생존율이 37.31%에서 각각 40.05%, 48.33%로 증가하였음을 알 수 있다. Referring to FIG. 9, while MT did not show any effect, the survival rate of beta cells exposed to hypoxic stress with glycolipid stress was increased from 37.31% to 40.05% and 48.33% when 11R-MT and Tat-MT were treated. It can be seen that the increase.

메탈로치오네인의 정확한 메커니즘은 보고된 바 없으나, 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 항산화 작용을 통해 세포 생존율을 증가시킴으로써 당뇨병의 진행을 억제할 수 있음을 의미한다.
The exact mechanism of metallothionein has not been reported, but these results indicate that the fusion protein according to the present invention can inhibit the progression of diabetes by increasing cell viability through antioxidant activity.

실험예 4: PTD-MT, PTD-MTS-MT 융합 단백질의 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당에 의해 유도된 아포토시스(apoptosis)에 대한 심근 세포 보호 효과 확인Experimental Example 4: Confirmation of cardiomyocyte protective effect against glucolipotoxicity or hyperglycemia-induced apoptosis of PTD-MT, PTD-MTS-MT fusion proteins

본 발명의 융합 단백질이 세포의 아포토시스를 유의하게 방지하는 것과 비교하여, 메탈로치오네인 그 자체는 세포 생존율에 어떠한 효과도 나타내지 아니하였고, 이는 본 발명의 융합 단백질의 세포 내 전달 효율이 높다는 것을 의미한다. Compared to the fusion protein of the present invention significantly prevents apoptosis of the cells, metallothionein itself did not show any effect on cell viability, which means that the fusion protein of the present invention has high intracellular delivery efficiency. do.

당뇨병 환자에 있어서, 심근병증은 고혈압과 죽상동맥경화증으로 설명될 수 없는 일반적인 증상이다. 당뇨병성 심근병증은 대사 이상, 세포이하의 결함, 유전자의 비정상적 발현 및 고혈당으로 인한 심근 세포사멸과 관련되어 있다. 더욱이, 심근병증의 원인은 섬유증과 같은 기관 손상 또는 심근세포의 직접적인 손상을 포함하며, ROS도 이러한 손상의 원인이라고 최근 보고된 바 있다. ROS는 고혈당 조건에 있는 세포에서 증가되고 생체내(in vivo)에서 심근에서의 세포 아포토시스를 유발한다(L. Cai et al., Diabetes. 51 (2002) 1938-1948). 본 발명에 따른 융합 단백질의 심근세포에 대한 보호 효과와 항산화능을 확인하기 위해, 고혈당 아래 저산소 조건을 있거나 없게 하여 쥐의 심근세포주인 H9c2에 대한 세포 생존율을 평가하였다. 구체적인 조건은 상기 실험예 3과 동일하게 수행하였다. In diabetics, cardiomyopathy is a common symptom that cannot be explained by hypertension and atherosclerosis. Diabetic cardiomyopathy is associated with metabolic abnormalities, subcellular defects, abnormal expression of genes and myocardial cell death due to hyperglycemia. Moreover, the cause of cardiomyopathy includes organ damage such as fibrosis or direct damage of cardiomyocytes, and ROS have also recently been reported to be the cause of such damage. ROS is increased in cells in hyperglycemic conditions and induces cellular apoptosis in myocardium in vivo (L. Cai et al ., Diabetes . 51 ( 2002 ) 1938-1948). In order to confirm the protective effect and antioxidant capacity of the fusion protein according to the present invention on cardiomyocytes, cell survival rate of H9c2, a rat cardiomyocyte line, was evaluated with or without hypoxic conditions under hyperglycemia. Specific conditions were carried out in the same manner as in Experiment 3.

도 10은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. Figure 10 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to glycolipid stress.

도 11은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. Control은 처리하지 않은 정상 세포 대조군, HG는 처리하지 않은 당지질 스트레스 세포군, MT는 메탈로치오네인 처리군, RMT는 11R-MT 처리군, TMT는 Tat-MT 처리군, RMM은 11R-MTS-MT 처리군, TMM은 Tat-MTS-MT 처리군을 나타낸다. 11 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to glycolipid stress. . Control was not treated normal control group, HG was not treated glycolipid stress cell group, MT was metallothionein treatment group, RMT 11R-MT treatment group, TMT Tat-MT treatment group, RMM 11R-MTS-MT Treatment group and TMM represent Tat-MTS-MT treatment group.

도 11에 나타낸 바와 같이, 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 세포 생존율이 가장 높았다. As shown in FIG. 11, cardiomyocytes exposed to glycolipid stress significantly reduced cell viability compared to normal cell controls. However, the survival rate of the PTD-MT treated group was higher than that of the metallothionein itself treated group, and the cell survival rate was highest in the PTD-MTS-MT fusion protein treated group.

도 12는 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. HP는 처리하지 않은 저산소 스트레스 세포군을 나타낸다. 12 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment of MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress. . HP represents an untreated hypoxic stress cell population.

도 12를 참조하면, 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 세포 생존율이 가장 높았다.Referring to FIG. 12, cardiomyocytes exposed to hypoxic stress have a significant decrease in cell viability compared to normal cell controls. However, the survival rate of the PTD-MT treated group was higher than that of the metallothionein itself treated group, and the cell survival rate was highest in the PTD-MTS-MT fusion protein treated group.

도 13은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. Figure 13 is a graph showing the survival rate (%) of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT and 11R-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress with glycolipid stress.

도 14는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. HG+HP는 처리하지 않은 당지질과 함께 저산소 스트레스에 노출된 세포군을 나타낸다. FIG. 14 shows survival rate of cardiomyocytes after treatment with MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT, and 11R-MTS-MT protein 3uM for cardiomyocytes exposed to hypoxic stress with glycolipid stress. This is a graph. HG + HP represents a population of cells exposed to hypoxic stress with untreated glycolipids.

도 10 및 도 13을 참조하면, 본 발명에 따른 융합 단백질을 처리한 경우 심근세포 생존율이 60%까지 유의하게 증가한 반면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않았다. Referring to FIGS. 10 and 13, the cardiomyocyte survival rate was significantly increased by 60% when the fusion protein was treated according to the present invention, whereas MT did not show any effect.

또한 11R-MT 융합 단백질은 Tat-MT 융합 단백질과 비교하여 Ins-1 및 H9c2 세포에 대해 세포 아포토시스를 보호하는 효과가 낮았다. 이는 단백질 형질 도입 영역인 11R이 Tat 보다 세포 내 전달 효율이 낮기 때문이라고 생각된다. In addition, the 11R-MT fusion protein had a lower effect of protecting cellular apoptosis against Ins-1 and H9c2 cells than the Tat-MT fusion protein. This is thought to be because 11R, a protein transduction region, has lower intracellular delivery efficiency than Tat.

도 14에 나타낸 바와 같이, 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 가장 높은 세포 생존율이 나타내었다.
As shown in FIG. 14, cardiomyocytes exposed to hypoxic stress with glycolipid stress significantly reduced cell viability compared to normal cell controls. However, the survival rate of the PTD-MT-treated group was higher than that of the metallothionein-treated group, and the highest cell viability was shown in the group treated with the PTD-MTS-MT fusion protein.

실험예 4: PTD-MT 융합 단백질의 심근 세포에 대한 항-아포토시스 효과 확인Experimental Example 4: Confirmation of anti-apoptotic effect of PTD-MT fusion protein on cardiomyocytes

본 발명에 따른 PTD-MT 융합 단백질의 항-아포토시스 효과를 확인하기 위해, 저산소 상태가 있거나 없는 두 가지 종류의 아포토시스 조건을 유도하였다. 본 발명의 PTD-MT 융합 단백질의 항-아포토시스 효과는 포유동물 세포에서 아포토시스의 중요한 중재인자로 작용하는 카스파제-3의 세포 내 활성을 특정하여 평가하였다. In order to confirm the anti-apoptotic effect of the PTD-MT fusion protein according to the present invention, two kinds of apoptosis conditions with or without hypoxia were induced. The anti-apoptotic effect of the PTD-MT fusion protein of the present invention was evaluated by specifying the intracellular activity of caspase-3, which acts as an important mediator of apoptosis in mammalian cells.

4-1. 내인성 아포토시스(Apoptosis) 유도4-1. Induction of endogenous apoptosis

H9c2 세포를 두 개의 96-웰 플레이트에 시딩한 후 MT와 PTD-MT 융합 단백질로 처리하였다. 하나의 플레이트는 7시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 다른 플레이트는 7시간 동안 저산소 챔버에서 배양하였다. 이어서, 융합 단백질 투여 군에서 카스파제-3의 활성이 얼마나 억제되었는지 카스파제-3 분석 키트를 이용하여 평가하였다. H9c2 cells were seeded in two 96-well plates and treated with MT and PTD-MT fusion proteins. One plate was hyperglycemic stressed for 7 hours and the other plate was incubated in a hypoxic chamber for 7 hours. Subsequently, the degree of inhibition of caspase-3 activity in the fusion protein administration group was evaluated using the Caspase-3 Assay Kit.

도 15는 당지질 스트레스에 의해 유도된 심근세포 카스파제-3 활성에 대한 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.15 is a graph comparing the degree of inhibition of MT, Tat-MT and 11R-MT protein against cardiomyocyte caspase-3 activity induced by glycolipid stress.

도 15를 참조하면, 아무 처리도 안 한 대조군(control group)의 경우 카스파제-3 활성이 17 배나 증가하였으나, MT, 11R-MT 및 Tat-MT를 처리한 경우 각각 13, 9, 7배가 증가하였다. Referring to FIG. 15, in the control group without any treatment, caspase-3 activity was increased by 17 times, but when MT, 11R-MT, and Tat-MT were treated, 13, 9, and 7 times increased, respectively. It was.

도 16은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스 조건 하에서 심근 세포의 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.16 is a graph showing the degree of inhibition of caspase-3 activity of MT, Tat-MT and 11R-MT proteins of cardiomyocytes under hypoxic stress conditions with glycolipid stress.

도 16을 참조하면, 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 당지질 스트레스에만 노출된 심근세포 보다 카스파제-3의 활성이 더욱 증가하였다. 또한 심근 세포에서 아무 처리도 안한 대조군(control group)의 경우 카스파제-3 활성이 30배나 증가한 반면, MT, Tat-MT 및 11R-MT를 처리한 경우 카스파제-3의 활성이 유의하게 저하되었다. Referring to FIG. 16, cardiomyocytes exposed to hypoxic stress in combination with glycolipid stress increased more caspase-3 activity than cardiomyocytes exposed to glycolipid stress only. In addition, the control group without any treatment in cardiomyocytes showed a 30-fold increase in caspase-3 activity, whereas the treatment of MT, Tat-MT, and 11R-MT significantly decreased caspase-3 activity. .

특히, Tat-MT 및 11R-MT 융합 단백질은 MT와 비교하여 아포토시스 보호 효과가 현저히 우수하였으며, 이는 본 발명의 융합 단백질에 세포 내로 전달되어 세포를 아포토시스로부터 보호하는 것임을 나타낸다. In particular, the Tat-MT and 11R-MT fusion proteins had a markedly superior apoptosis protective effect compared to MT, indicating that they are delivered intracellularly to the fusion protein of the present invention to protect cells from apoptosis.

4-2. 외인성 아포토시스 유도4-2. Exogenous Apoptosis Induction

염화코발트는 미토콘드리아 독립 경로를 통해 ROS 형성을 증가시키는 저산소 유발물질로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 융합 단백질의 외인성 아포토시스 유사 환경에서의 항-아포토시스 효과를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다. Cobalt chloride is known to be a hypoxic trigger that increases ROS formation through mitochondrial independent pathways. In order to confirm the anti-apoptosis effect in the exogenous apoptosis-like environment of the fusion protein according to the present invention, the experiment was performed as follows.

H9c2 세포를 두 개의 96-웰 플레이트에 시딩한 후 MT와 PTD-MT 융합 단백질로 처리하였다. 하나의 플레이트는 7시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 다른 플레이트는 7시간 동안 저산소 챔버에서 배양하였다. 이어서, 세포 사멸 중 카스파제 신호를 활성화하는 CoCl₂을 200uM 처리하여 6시간 동안 배양하고, 융합 단백질 투여 군에서 카스파제-3의 활성이 얼마나 억제되었는지 카스파제-3 분석 키트를 이용하여 평가하였다. H9c2 cells were seeded in two 96-well plates and treated with MT and PTD-MT fusion proteins. One plate was hyperglycemic stressed for 7 hours and the other plate was incubated in a hypoxic chamber for 7 hours. Subsequently, CoCl ₂ , which activates caspase signal during cell death, was incubated for 6 hours with 200 uM treatment, and the caspase-3 assay kit evaluated how inhibited caspase-3 activity in the fusion protein administration group.

도 17은 염화코발트로 처리하여 유도된 외인성 아포토시스에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 심근세포 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다. Figure 17 is a graph comparing the degree of inhibition of cardiomyocyte caspase-3 activity of MT, Tat-MT and 11R-MT protein against exogenous apoptosis induced by treatment with cobalt chloride.

도 17에 나타낸 바와 같이, 11R-MT와 Tat-MT 융합 단백질을 처리함에 따라 카스파제-3의 활성이 대조군에 비해 각각 60%, 40% 감소된 반면, MT는 카스파제-3 활성에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 카스파제-3 활성을 저해함을 나타내는 것으로, 아포토시스로부터 세포를 보호할 수 있음을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 융합 단백질이 메탈로치오네인 자체 보다 세포 내 투과율이 높기 때문이다.
As shown in FIG. 17, the treatment of 11R-MT and Tat-MT fusion proteins resulted in a 60% and 40% decrease in caspase-3 activity, respectively, compared to the control group, whereas MT had no effect on caspase-3 activity. Was not crazy either. These results indicate that the fusion protein according to the present invention inhibits caspase-3 activity, which means that the cells can be protected from apoptosis. This is because the fusion protein according to the present invention has a higher intracellular permeability than the metallothionein itself.

실험예 5: 활성 산소종 발현억제 확인Experimental Example 5: Confirmation of inhibition of reactive oxygen species expression

본 실험은 세포 생존율을 평가하였던 실험에서 사용한 세포 스트레스 환경에 대한 활성 산소종의 발현양을 평가하고, 메탈로치오네인을 처리하여 활성 산소종의 감소를 확인하고자 진행하였다. This experiment was carried out to evaluate the expression level of reactive oxygen species in the cell stress environment used in the experiment that evaluated the cell survival rate, and to confirm the reduction of reactive oxygen species by treatment with metallothionein.

이를 위해 상기 실험예 3의 스트레스 환경과 동일한 시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 또한 저산소 스트레스 환경도 동일하게 진행하였다. 스트레스에 심근 세포가 노출되기 직전 각각의 융합 단백질을 3uM 처리하였고, 스트레스 후 활성 산소종의 양을 평가하기 위하여 H₂-DCFDA를 사용하였다. To this end, high blood sugar stress was given for the same time as the stress environment of Experimental Example 3, and the hypoxic stress environment was also performed in the same manner. Each fusion protein was treated with 3 uM immediately before cardiomyocytes were exposed to stress, and H ₂ -DCFDA was used to assess the amount of reactive oxygen species after stress.

도 18은 고혈당 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. HG는 처리하지 않은 고혈당 스트레스에 노출된 세포군, MT는 메탈로치오네인 처리군, RMT는 11R-MT 처리군, TMT는 Tat-MT 처리군, RMM은 11R-MTS-MT 처리군, TMM은 Tat-MTS-MT 처리군을 나타낸다. Figure 18 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species of the fusion protein treatment group when the degree of expression of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hyperglycemia stress 100%. HG treated cell group exposed to hyperglycemic stress, MT treated with metallothionein, RMT treated with 11R-MT, TMT treated with Tat-MT, RMM treated with 11R-MTS-MT, TMM with Tat -Represents the MTS-MT treatment group.

도 18에 나타낸 바와 같이, 메탈로치오네인 자체는 활성 산소종 억제효과가 전혀 보이지 않았으며, 11R-MT와 Tat-MT의 경우 각각 61.60%와 50.67%를 보여주었다. 이에 비해 11R-MTS-MT와 Tat-MTS-MT의 경우 32.46%와 18.06%를 보여 주어 보다 효과적으로 활성 산소종의 발생을 억제한 것을 알 수 있었다. As shown in FIG. 18, the metallothionein itself showed no inhibitory effect on reactive oxygen species, and showed 61.60% and 50.67% for 11R-MT and Tat-MT, respectively. On the other hand, 11R-MTS-MT and Tat-MTS-MT showed 32.46% and 18.06%, indicating that the generation of reactive oxygen species was more effectively suppressed.

도 19는 저산소 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. HP는 처리하지 않은 저산소 스트레스에 노출된 세포군을 나타낸다. 19 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species of the fusion protein treatment group when the degree of expression of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hypoxic stress is 100%. HP represents a population of cells exposed to untreated hypoxic stress.

도 19를 참조하면, 도 18의 결과와 마찬가지로 메탈로치오네인 자체는 활상산소종 발현 억제효과를 보이지 않았다. 또한 11R-MT와 Tat-MT는 86%와 78%의 활성 산소종 발현 정도를 보인 반면, Tat-MTS-MT의 경우 다른 군과 비교하여 상당히 높은 활성 산소종 발생 억제 효과를 보여주었다. Referring to FIG. 19, as in the result of FIG. 18, metallothionein itself did not show an inhibitory effect on the expression of active oxygen species. In addition, 11R-MT and Tat-MT showed 86% and 78% expression levels of reactive oxygen species, whereas Tat-MTS-MT showed significantly higher inhibitory effect on the generation of reactive oxygen species than other groups.

도 20는 고혈당 스트레스와 저산소 스트레스에 함께 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 20 is a graph showing the result of comparing the expression level of reactive oxygen species in the fusion protein treatment group when the expression level of reactive oxygen species in the cardiomyocytes exposed to hyperglycemia and hypoxic stress is 100%.

도 20에 나타낸 바와 같이, 메탈로치오네인 자체는 효과가 없었고, 11R-MT와 Tat-MT는 각각 76%와 70%의 활성 산소종 발현 정도를 보였으며, Tat-MTS-MT 처리군이 42%로 가장 높은 활성 산소종 억제 효과를 보여주었다. As shown in FIG. 20, metallothionein itself was ineffective, and 11R-MT and Tat-MT showed 76% and 70% free radical species expression, respectively, and the Tat-MTS-MT treated group was 42 It showed the highest active oxygen species inhibition effect in%.

나트륨 아비산염(NaAsO₂)은 활성 산소종의 발현을 증가시키는 물질로, 이를 세포에 처리하면 활성 산소종이 증가하게 된다. 10uM의 나트륨 아비산염을 24시간 동안 처리한 군을 100%로 두고, 융합 단백질 처리군의 상대적인 활상 산소종 발현을 평가하여, 그 결과를 도 21에 나타내었다. Sodium arsenite (NaAsO ₂ ) is a substance that increases the expression of reactive oxygen species. When treated in cells, the reactive oxygen species increases. The group treated with 10 uM sodium arsenite for 24 hours was 100%, and the relative active oxygen species expression of the fusion protein treated group was evaluated, and the results are shown in FIG. 21.

도 21은 나트륨 아비산염을 처리한 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. 21 is a graph showing the result of comparing the amount of active oxygen species in the fusion protein treatment group when the expression level of reactive oxygen species in the cardiomyocytes treated with sodium arsenite is 100%.

도 21을 참조하면, 다른 융합 단백질 처리군과 비교하여, Tat-MTS-MT 처리군이 31%의 활성 산소종 발현정도를 보여 TMM이 활성 산소종 발현을 가장 잘 억제하고 있는 것을 알 수 있었다.
Referring to FIG. 21, the Tat-MTS-MT treated group showed 31% reactive oxygen species expression compared to other fusion protein treated groups, indicating that TMM inhibited the reactive oxygen species expression best.

실험예 6: 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대한 치료효과 확인Experimental Example 6: Confirmation of therapeutic effect on streptozotocin-induced diabetic animal model

5-1. 당뇨 동물모델에서 활성 산소종 감소 효과5-1. Reducing Oxygen Species in a Diabetic Animal Model

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 제1형 당뇨 모델로 120mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 1회 투여하고, 제2형 당뇨 모델로 40mg/kg로 5회 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. 투여 후 4시간 뒤에 단백질을 투여하는 방식으로 진행하였다. 제1형 당뇨 모델은 STZ 투여하고 4시간 뒤에 단백질을 500ug씩 투여하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하였다. 또한 2형 당뇨모델의 경우 8시간 동안 굶기고 STZ를 투여하였다. 투여 후 4시간 뒤에 500ug의 단백질을 투여하고 이를 5일 동안 반복하고 혈당은 매일 측정하였다. 14일 동안 평가하여 혈당의 변화를 관찰하였다. The experiment was conducted using a 6-week-old white animal model and the animal's weight was about 20-23g. Streptozotocin (STZ) was administered once at 120 mg / kg in the type 1 diabetes model and 5 times at 40 mg / kg in the type 2 diabetes model. Animals were starved for 8 hours and administered STZ for STZ administration. 4 hours after administration, the protein was administered in a manner of administration. Type 1 diabetes model was administered 500ug each protein 4 hours after STZ administration. Since then, the blood glucose is measured daily to determine the effect of protein changes in blood glucose. In addition, the type 2 diabetes model was starved for 8 hours and administered STZ. Four hours after administration, 500 ug of protein was administered and repeated for 5 days and blood glucose was measured daily. Evaluation for 14 days observed changes in blood glucose.

Tat-MTS-MT 융합 단백질의 투여한 제1형 당뇨 동물모델의 췌장에서의 활성 산소종 변화를 확인하기 위해 다음과 같이 실시하였다.In order to confirm the change of reactive oxygen species in the pancreas of the type 1 diabetic animal model administered with the Tat-MTS-MT fusion protein, it was performed as follows.

제1형 당뇨 모델에 복강 주사를 통해 10uM의 H₂DCFDA 염료(2,7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetylester)을 투여한 뒤 췌장을 분리하여 활성 산소종 발현양을 측정하였다. 이를 위해 형광 이미징 박스를 이용하여 활성 산소종에 의해 시약에서 발현되는 형광의 강도(intesnsity)를 측정하여 정량하였으며, 그 결과는 도 22에 나타내었다.10 uM of H ₂ DCFDA dye (2,7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetylester) was administered to the type 1 diabetic model and the pancreas was isolated to measure the expression of reactive oxygen species. To this end, the fluorescence imaging box was used to measure and quantify the intensity of fluorescence expressed in the reagent by reactive oxygen species, and the results are shown in FIG. 22.

도 22는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 Tat-MTS-MT 투여에 따른 췌장의 활성 산소종 함량을 나타낸 그래프이다. control은 처리하지 않은 정상 세포 대조군, STZ는 처리하지 않은 제1형 당뇨 모델군, STZ+TMM은 Tat-MTS-MT 처리한 제1형 당뇨 모델군을 나타낸다. Figure 22 is a graph showing the reactive oxygen species content of the pancreas according to Tat-MTS-MT administration for streptozotocin induced type 1 diabetes animal model. Control represents a normal cell control group, STZ untreated type 1 diabetes model group, STZ + TMM represents a type 1 diabetes model group treated with Tat-MTS-MT.

도 22에 나타낸 바와 같이, 정상 동물의 췌장과 비교하여 스트렙토조토신 투여에 의해 유도된 제1형 당뇨 동물 모델은 췌장 내 활성 산소종의 함량이 증가한다. 이러한 당뇨 동물 모델에 Tat-MTS-MT 융합 단백질 투여 결과, 췌장의 활성 산조종이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 22, the type 1 diabetic animal model induced by streptozotocin administration compared to the pancreas of normal animals has an increased content of reactive oxygen species in the pancreas. As a result of administration of the Tat-MTS-MT fusion protein to the diabetic animal model, it was confirmed that the activity of the pancreas significantly decreased.

5-2. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 투여에 따른 혈당 변화5-2. Blood Glucose Changes According to Fusion Protein Administration in Diabetic Animal Models

도 23는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.FIG. 23 is a graph showing blood glucose changes after administration of MT and Tat-MT for streptozotocin-induced type 1 diabetes animal model.

도 23을 참조하면, 세포 내로 유입되지 않는 MT는 혈당 변화에 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, Tat-MT를 투여한 동물 모델의 경우 혈당 수치가 감소하여, 당뇨 진행 속도를 지연할 수 있음을 알 수 있다. Referring to FIG. 23, the MT that does not enter the cell does not show any effect on the change in blood glucose, whereas in the animal model administered Tat-MT, the blood glucose level decreases, which may delay the progression of diabetes. have.

도 24는 스트렙토조토신 유도 제2형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다. 24 is a graph showing changes in blood glucose after administration of MT and Tat-MT for streptozotocin-induced type 2 diabetes animal model.

도 24에 나타낸 바와 같이, MT는 제1형 당뇨 동물모델에서와 마찬가지로 혈당 수치에 효과가 없었으며, Tat-MT를 투여한 동물 모델의 경우 혈당 수치가 감소하여, 당뇨 진행 속도를 지연할 수 있음을 알 수 있다. As shown in FIG. 24, MT had no effect on blood glucose levels as in type 1 diabetes animal models, and in animal models administered Tat-MT, blood glucose levels decreased, which could delay the progression of diabetes. It can be seen.

5-3. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 투여시기에 따른 혈당 변화5-3. Blood Glucose Variation According to Timing of Fusion Protein in Diabetic Animal Models

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 당뇨 모델로 80mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 --회 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. STZ 투여 전 --시간, STZ 투여 후 4시간 뒤에 Tat-MT, Tat-MTS-MT 단백질을 500ug씩 투여하는 방식으로 진행하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하고, 그 결과를 도 --에 나타내었다.The experiment was conducted using a 6-week-old white animal model and the animal's weight was about 20-23g. In the diabetic model, streptozotocin (STZ) was administered-80 mg / kg. Animals were starved for 8 hours and administered STZ for STZ administration. Pretreatment was performed in a manner of administering 500 μg of Tat-MT and Tat-MTS-MT proteins 4 hours after the STZ administration and 4 hours after the STZ administration. Since the blood glucose is measured daily to determine the effect of the change in blood glucose, the results are shown in Fig.

도 25는 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 스트렙토조토신 투여 전과 후 Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다. FIG. 25 is a graph showing blood glucose changes according to administration of Tat-MT and Tat-MTS-MT before and after administration of streptozotocin in a streptozotocin-induced diabetic animal model.

도 25를 참조하면, 융합 단백질을 투여하지 않은 대조군(STZ)에서 이틀째 혈당이 당뇨로 판단할 수 있는 기준인 300 mg/dl에 도달하였고, 스트렙토조토신 투여 전 Tat-MTS-MT를 투여한 실험군이 혈당이 가장 낮게 유지되었다. Referring to FIG. 25, the control group (STZ) that did not receive the fusion protein reached 300 mg / dl, which is a criterion for diagnosing diabetes as the second day, and treated with Tat-MTS-MT before streptozotocin administration. This blood sugar remained the lowest.

5-4. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 장기 투여에 따른 혈당 변화5-4. Blood Glucose Changes with Long-term Administration of Fusion Proteins in Diabetic Animal Models

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 당뇨 모델로 80mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 5회 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. STZ 투여 4시간 뒤에 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 단백질을 500ug씩 투여하는 방식으로 진행하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.The experiment was conducted using a 6-week-old white animal model and the animal's weight was about 20-23g. Streptozotocin (STZ) was administered 5 times at 80 mg / kg in the diabetic model. Animals were starved for 8 hours and administered STZ for STZ administration. After 4 hours of STZ administration, 500 μg of MT, Tat-MT, and Tat-MTS-MT proteins were administered. Thereafter, the blood sugar was measured daily to determine the change in blood sugar to determine the effect of the protein, and the results are shown in FIG. 26.

도 26은 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다. FIG. 26 is a graph illustrating changes in blood glucose according to MT, Tat-MT, and Tat-MTS-MT administration for streptozotocin-induced diabetic animal models.

도 26을 참조하면, 융합 단백질을 투여하지 않은 대조군(STZ)에서 이틀째 혈당이 당뇨로 판단할 수 있는 기준인 300 mg/dl에 도달하였고, 스트렙토조토신 투여 전 Tat-MTS-MT를 투여한 실험군이 혈당이 10일째까지 가장 낮게 유지되었다. Referring to FIG. 26, the control group (STZ) that did not receive the fusion protein reached 300 mg / dl, which is a criterion for diagnosing diabetes as the second day, and treated with Tat-MTS-MT before streptozotocin administration. This blood sugar remained the lowest until day 10.

<110> Industry-University Cooperation Foundation, Hanyang University <120> Anti-Oxidant Fusion Protein and Use thereof <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Metallothionein 1H <400> 1 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ser Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ser Cys Ala Cys Lys Asn Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ser Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Val Cys Lys Gly Ala Ala Asp Lys Cys Thr Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> metallothionein 2 <400> 2 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> metallothionein 3 <400> 3 Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp 35 40 45 Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys 50 55 60 Ser Cys Cys Gln 65 <210> 4 <211> 62 <212> PRT <213> metallothionein 4 <400> 4 Met Asp Pro Arg Glu Cys Val Cys Met Ser Gly Gly Ile Cys Met Cys 1 5 10 15 Gly Asp Asn Cys Lys Cys Thr Thr Cys Asn Cys Lys Thr Cys Arg Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Pro Cys Cys Pro Pro Gly Cys Ala Lys Cys Ala Arg Gly 35 40 45 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Pro 50 55 60 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Tat <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> 11R <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> MTS <400> 7 Ile Thr Met Val Ala Ser Leu 1 5 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Tat oligonucleotide <400> 8 tatggcagga agaagcggag acagcgacga cga 33 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> MTS oligonucleotide <400> 9 attaccatgg tgtccgctct 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> MT sense primer <400> 10 tgcagactcg agcctagaat ggac 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> MT antisense primer <400> 11 ctggaattcg cccttttcgt caca 24 <110> Industry-University Cooperation Foundation, Hanyang University <120> Anti-Oxidant Fusion Protein and Use <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Metallothionein 1H <400> 1 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ser Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ser Cys Ala Cys Lys Asn Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ser Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Val Cys Lys Gly Ala Ala Asp Lys Cys Thr Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> metallothionein 2 <400> 2 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> metallothionein 3 <400> 3 Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp 35 40 45 Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys 50 55 60 Ser Cys Cys Gln 65 <210> 4 <211> 62 <212> PRT <213> metallothionein 4 <400> 4 Met Asp Pro Arg Glu Cys Val Cys Met Ser Gly Gly Ile Cys Met Cys 1 5 10 15 Gly Asp Asn Cys Lys Cys Thr Thr Cys Asn Cys Lys Thr Cys Arg Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Pro Cys Cys Pro Pro Gly Cys Ala Lys Cys Ala Arg Gly 35 40 45 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Pro 50 55 60 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Tat <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> 11R <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> MTS <400> 7 Ile Thr Met Val Ala Ser Leu 1 5 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Tat oligonucleotide <400> 8 tatggcagga agaagcggag acagcgacga cga 33 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> MTS oligonucleotide <400> 9 attaccatgg tgtccgctct 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> MT sense primer <400> 10 tgcagactcg agcctagaat ggac 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> MT antisense primer <400> 11 ctggaattcg cccttttcgt caca 24

Claims

An antioxidant fusion protein in which a protein transduction domain is peptide-bound to an amino terminus of metallothionein.

The method of claim 1,
The metallothionein is a fusion protein, characterized in that represented by one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.

The method of claim 1,
The protein transduction region is a Tat (Trans Activator of Transcription) protein of HIV-1 virus, polyarginine (6 or more arginines), penetratin (Penetratin), HSV-1 structural protein VP22 transcription regulator protein, Pep-1 A fusion protein, characterized in that it has one amino acid sequence selected from the group consisting of a peptide and Pep-2 peptide.

The method of claim 3,
The protein transduction region is a fusion protein, characterized in that Tat represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or polyarginine represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

The method of claim 1,
Fusion protein, characterized in that the mitochondrial targeting sequence (Mitochondrial Targeting Sequence) is additionally coupled to the carboxy terminus of the protein transduction region.

The method of claim 5,
The mitochondrial targeting sequence is maleate dehydrogenase, human cytochrome c subunit oxidase VIII, PI subtype of human ATP synthase subunit c, aldehyde dehydrogenase targeting sequence, human ATP synthase subunit FI beta and BCS1 A fusion protein, which is derived from one protein selected from the group consisting of proteins.

The method of claim 6,
The mitochondrial targeting sequence is derived from malate dehydrogenase and a fusion protein, characterized in that represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

According to claim 1, wherein the fusion protein is a fusion protein, characterized in that a polyhistidine (poly-His) region is coupled to the amino acid terminal of the protein transduction region.

A recombinant polynucleotide encoding the antioxidant fusion protein of claim 1, wherein the cDNA encoding the protein transduction region is bound to the 5 'end of the cDNA encoding the metallothionein protein.

An expression vector comprising the polynucleotide of claim 9.

Microorganism transformed with the expression vector of claim 10.

A pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes, comprising the fusion protein of claim 1 as an active ingredient.

A pharmaceutical composition for preventing and treating diabetic cardiomyopathy comprising the fusion protein of claim 1 as an active ingredient.