KR20110044410A

KR20110044410A - 엔도글루칸아제-이 또는 소형 셀룰로오스 결합단백질-에이 유전자가 도입된 재조합 벡터, 그 재조합벡터를 포함하는 형질전환체 및 이를 이용한 소형-셀룰로좀의 생산 방법

Info

Publication number: KR20110044410A
Application number: KR1020090101056A
Authority: KR
Inventors: 한성옥; 한가희; 조현영
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-23
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-04-29
Also published as: KR101102458B1

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균의 저산소 고세포 집적 프로세스를 이용한 셀룰로오스 및 소형 셀룰로오스 결합단백질의 생산과 이를 이용한 셀룰로오스 분해효소 복합체인 소형 셀룰로좀 (mini-cellulosome)의 생산하기 위한 코리네박테리움 글루타미쿰 균에 클로스트리디움 속 (Clostridium sp.) 박테리아 유래의 셀룰라아제 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (endo-베타-1,4-glucanase E, 1,4-베타 D-glucan glucanohydrolase, carboxymetylcellulase, CMCase, CelE; EC 3.2.1.4))와 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 ((endo-베타1,4-glucanase B, EngB; EC 3.2.1.4)의 도커린 (dokerin) 부위를 갖는 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimeric CelE) 유전자와 셀룰로오즈 분해효소 골격단백질 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이 (mini cellulose binding protein A, miniCbpA) 유전자가 도입된 재조합 벡터 및 그 재조합벡터를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체 그리고 그 형질전환체로부터 발현된 단백질의 어셈블리를 통한 셀룰로좀의 생산에 관한 것이다.

본 발명의 클로스트리디움 속 미생물로부터 유래한 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이와 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이의 어셈블리를 통해 생성된 셀룰로좀은 효소 소단위체의 바이오매스 분해 효율을 극대화시키는 효소 복합체로 결정형 셀룰로오스 (crystalline cellulose)를 직접 분해할 수 있는 능력이 있어 이 유전자를 경제적으로 대량 생산하게 되면 공장에서의 바이오에탄올 공정 시 생산단가를 크게 절감할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 재조합 벡터는 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pMT1-s (E. coli-Corynebacterium shuttle expression vector pMT1-s)를 사용함으로 코리네박테리움 균에서 안정적으로 발현되는 유전자 (House keeping gene) 의 프로모터를 이용하여 별도의 발현유도제 없이 안정적으로 유전자를 발현할 수 있도록 하여 상기 제시한 목적에 부합시켰다.

코리네박테리움 글루타미쿰, 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이, 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이, 소형 셀룰로좀, 코리네박테리움

Description

엔도글루칸아제-이 또는 소형 셀룰로오스 결합단백질-에이 유전자가 도입된 재조합 벡터, 그 재조합벡터를 포함하는 형질전환체 및 이를 이용한 소형-셀룰로좀의 생산 방법{A recombinant vector comprising endo-glucanase E or miniCbpA, a transformant comprising the vector, and a method for producing mini cellulosome using the same}

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균의 저산소 고세포 집적 프로세스를 이용한 셀룰로오스 및 소형 셀룰로오스 결합단백질의 생산과 이를 이용한 셀룰로오스 분해효소 복합체인 소형 셀룰로좀 (mini-cellulosome)의 생산하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 균에 클로스트리디움 속 (Clostridium sp.) 박테리아 유래의 셀룰라아제 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (endo-beta-1,4-glucanase E, 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase, carboxymetylcellulase, CMCase, CelE; EC 3.2.1.4))와 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 ((endo-beta-1,4-glucanase B, EngB; EC 3.2.1.4)의 도커린 (dokerin) 부위를 갖는 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimeric CelE) 유전자와 셀룰로오즈 분해효소 골격단백질 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이 (mini cellulose binding protein A, miniCbpA) 유전자가 도입된 재조합 벡터 및 그 재조합벡터를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체 그리고 그 형질전환체로부터 발현된 단백질의 어셈블리를 통한 셀룰로좀의 생산에 관한 것이다.

계속되는 고유가와 온실 가스 배출에 대한 규제, 에너지 고갈에 대한 우려가 심각해지면서 대체 에너지 생산에 관한 관심이 집중되고 있으며, 차세대 연료로서 바이오연료의 보급이 급속히 진행되고 있다. 바이오연료는 자연계에 있는 바이오매스(Biomass)로부터 유도되는 지속가능한 에너지원으로, 바이오매스에 물리, 화학, 생물학적 기술들이 적용하여 고체, 액체, 기체 상태의 바이오연료로 전환하여 생성 될 수 있다. 기존 휘발유의 대체연료로 사용할 수 있는 바이오에탄올, 바이오메탄올, 바이오부탄올 등 바이오알코올과, 경유의 대체연료로 사용가능한 바이오디젤 등이 바이오연료에 속한다. 이 중 수송용 연료로 가장 활발하게 대두되고 있는 소재가 바로 바이오에탄올이다. 자동차의 최종 기술 목표인 전기자동차 또는 수소자동차의 개발단계가 아직 개발초기 단계여서 이의 완료까지 대체 할 수 있는 절충형의 대체 에너지가 필요하다. 바이오에탄올은 휘발유와 혼합하여 사용할 수 있어 바이오디젤과 더불어 대표적인 재생자원 에너지이며 바이오에탄올 연소 시 발생하는 이산화탄소는 교토의정서에서 규정한 온실가스 계산에서 예외 적용을 받아 온실가스 감축효과가 있다. 또한 보급에 별도의 인프라 (주유소 등) 구축이 필요한 다른 청정연료와는 달리 기존 인프라에서 보급이 가능해 조기 상용화가 용이하여 바이오연료 중 가장 각광받고 있다.

현재 바이오 에탄올은 주로 사탕수수 및 옥수수로 대표되는 당질계 바이오매 스, 목재와 같은 셀룰로오스계 바이오매스, 그리고 폐목자원, 잉여농산물 및 초본계 작물과 같은 리그노 셀룰로오스계 바이오매스로부터 생산될 수 있다. 전분질계의 사탕수수 및 옥수수는 현재 대표적인 바이오 에탄올 생산의 재료로 실제 브라질의 경우 풍부한 사탕수수 재배지를 근간으로 하여 이를 활용하여 에탄올의 연료상업화에 성공하여 2004년에 이르러 전체 차량 연료 소비량의 약 30%를 바이오 에탄올로 대체하는 데 성공하였다. 미국의 경우 풍부한 옥수수를 활용한 바이오 에탄올 생산의 상당한 상업화 기술을 축적하여 2017년까지 전체 수송용 에너지 수요의 20%를 바이오 에탄올로 대체할 예정이다.

기존에 사용되어 온 옥수수 등을 중심으로 한 당질계 바이오매스의 경우 2008년 초 곡물가격의 급등으로 인한 애그플레이션의 영향으로 원료수급 및 가격경쟁력의 측면에서 부정적인 평가를 받게 되어 최근 가장 많이 활용되고 있는 것이 목질계 또는 리그노 셀룰로오스계 바이오매스이다. 이들은 기존의 당질계 와는 달리 원료수급이나 윤리적인 문제에 제한이 없어 이러한 재료를 사용하여 바이오에탄올을 생산하려는 여러 연구가 시도되고 있다.

이러한 바이오매스의 생물학적 분해를 통한 바이오에탄올 생산시 중요한 과제 중 하나가 목질계 바이오매스 분해효소를 대량으로 생산하기에 적합한 균주를 동정하여 이용하는 것이다.

클로스트리디움 (Clostridium sp.) 균은 혐기중온성 세균으로, 다양한 섬유소 분해효소 (cellulase)를 생산하고 또한 효소 복합체인 셀룰로좀 (cellulosome)을 만들어내는 것으로 알려져 있다. 이 균주가 생산하는 섬유소 분해 효소들은 기 질 특이성과 반응기작에 큰 차이를 보이기는 하나 모두 베타-1,4-글루코시드(β-1,4-glucoside) 결합을 분해하며, 균체 외 배지로 분비되는 특징이 있다고 보고된다. 또한, 결정형 섬유소의 효과적인 분해에는 엔도글루칸아제 (endoglucanase), 엑소글루칸아제 (exoglucanase) (또는 셀로비오 하이드롤라제 cellobiohydrolase) 및 베타-글루코시다제(β-glucosidase)의 세가지의 섬유소 분해효소가 필요하며, 이들의 상승작용으로 섬유소의 분해능이 크게 증가한다고 보고되고 있다 (Murashima, K., Kosugi, A., Doi, R.H., 2002. Synergistic effects on crystalline cellulose degradation between cellulosomal cellulases from Clostridium cellulovorans. J Bacteriol 184(18), 5088-5095.B; Schwarz, 2001. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria. Appl Microbiol Biotechnol 56(5-6), 634-649.;Shoham, Y., Lamed, R., Bayer, E.A., 1999. The cellulosome concept as an efficient microbial strategy for the degradation of insoluble polysaccharides. Trends Microbiol 7(7), 275-281.).

대표적인 아미노산 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 비병원성 토양 균주로 엘-글루탐산 (L-glutamic acid) 및 엘-라이신 (L-lysine) 등의 아미노산 생합성 생물공정분야에 이용되고 있다. 본 균주는 저산소 고세포 프로세스를 통해 균 안에서 안정적으로 발현되는 유전자 (House keeping gene) 의 프로모터를 이용하여 별도의 발현유도제 없이 안정적으로 유전자를 다량의 단백질로 발현할 수 있는 장점이 있다. 현재 바이오에탄올 공정시 생산단가 대부분을 바이오매스 전처리에 사용되는 셀룰로오즈 분해효소 비용임을 고려했을 때 효소의 생산단가의 절감은 바이오에탄올 생산에 중요한 요소라 할 수 있다. 따라서 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 장점을 셀룰로오즈 분해효소 생산에 이용가능하다면 효소 생산단가의 절감 및 바이오에탄올 생산의 효율성을 꾀할 수 있을 것이다.

바이오매스 분해 효율이 높은 셀룰로좀은 하나의 셀룰로오즈 결합 모듈 (cellulose-binding module, CBM)을 가지고 있는 기본골격 소단위체 (primary scaffolding subunit)가 주축이 되어 활성 모듈 (catalytic module)을 가진 9개의 셀룰라아제 혹은 헤미셀룰라아제의 효소 소단위체 (enzyme subunits)들이 합쳐져서 이루어진다. 소형 셀룰로좀 (mini cellulosome)은 하나의 셀룰로오즈 결합 모듈에 활성 모듈 하나를 갖는 가장 기본단위로 효소의 발현량 증가와 활성도 증가 연구에 유용한 모듈이다 (Fierobe, H.-P., Mingardon, F., Mechaly, A., Belaich, A., Rincon, M. T., Pages, S., Lamed, R., Tardif, C., Belaich, J.-P., Bayer, E. A. 2005. Action of designer cellulosomes on homogeneous versus complex substrates: controlled incorporation of three distinct enzymes into a defined trifunctional scaffoldin. J Biol Chem 280(16), 16325-16334.).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 셀룰로오스 분해효소 복합체인 소형 셀룰로좀 (mini-cellulosome)의 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 셀룰로오스 분해효소 복합체인 소형 셀룰로좀 (mini-cellulosome)에 필요한 단백질을 생산하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 셀룰로오스 분해효소 복합체인 소형 셀룰로좀 (mini-cellulosome)을 생산하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 클로스트리디움 속 (Clostridium sp .)으로부터 유래한 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 1의 단백질 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 부가 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 활성을 가지는 모든 변이 단백질을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 2에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 유전자에 포함된다.

본 발명의 명세서에서 '키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)'는 클로스트리디움 속 서머셀럼의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (CelE) 유전자와 클로스트리디움 속 셀룰로보란스의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 (EngB)의 도커린 (dokerin) 부위를 결합한 셀룰로오즈 분해활성을 갖는 키메라 효소를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE는 도 2a의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 클로스트리디움 속 (Chlostridium sp .)으로부터 유래한 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA)는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 서열번호 3의 단백질뿐만 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치 환, 결손, 역위, 부가 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 활성을 가지는 모든 변이 단백질을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 4에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 유전자에 포함된다.

본 발명의 명세서에서 '셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA)'는 셀룰로좀 기본골격 소단위체를 만드는 셀룰로오즈에 결합하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA는 도 2b의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터pMT1-s-miniCbpA인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 상기 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질 전환체는 대한민국 서울시 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 11040P로 2009년 10월 7일에 기탁한 형질 전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 C. glutamicum / pMT1scCelE인 형질전환체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 또한 상기의 본 발명의 형질전환체를 배양하여 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA로 형질 전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 대한민국 서울시 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 11039P로 2009년 10월 7일에기탁한 형질 전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 C. glutamicum/ pMT1sminiCbpA인 형질전환체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 또한 상기의 본 발명의 형질전환체를 배양하여 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 a) 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE로 형질 전환된 형질전환체; 및 b)재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA로 형질 전환된 형질전환체를 포함하는 소형-셀룰로좀 생성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 소형-셀룰로좀 생성용 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 소형-셀룰로좀을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.

또한 본 발명은 a) 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE로 형질 전환된 형질전환체를 배양하는 단계; b) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 키메라 엔도-베타-1,4- 글루칸아제-이 (chimera-CelE)를 수득하는 단계; c) 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; d) 상기 c) 단계의 배양액으로부터 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 수득하는 단계; 및 e) 상기 b)와 d) 단계에서 수득한 단백질을 혼합하는 단계를 포함하는 소형-셀룰로좀의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명의 명세서에서 '소형 셀룰로좀'은 한 개의 셀룰로좀 기본 골격 단백질과 한 개의 셀룰라아제-도커린 복합체로 이루어진 셀룰로오즈 분해효소 복합체를 의미한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움( Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터( Enterobacter)속, 리조비움( Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속,아시네토박터 (Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리 움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 유전자 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 (E. coli-C. glutamicum shuttle expression vector) 인 pMT1-s를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

프로모터는, 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명에 관한 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 생성축적시켜, 배양물로부터 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범 위에서 배양함으로써 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이의 취득은, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음 이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이의 생산과 균체 내에의 축적, 및, 균체로부터의 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 또는 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 클로스트리디움 균으로 유래한 키메라 엔도글루칸아제-이 유전자 및 소형 셀룰로오즈 결합단백질 유전자가 삽입된 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질 전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체를 개발하여 이를 대한민국 서울시 서대문구 홍제동 소재 한국미생물보존센터에 각각 기탁번호 KCCM 11039P와 KCCM 11040P로 2009년 10월 7일에 기탁하였으며 상기 형질 전환체로부터 얻어진 단백질의 어셈블리를 통한 소형 셀룰로좀을 생산 및 셀룰로오즈의 분해능이 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 실시예에서는 키메라 CelE 와 miniCbpA 유전자를 클로스트리디움의 지노믹 디엔에이를 주형으로 한 PCR반응을 통하여 얻었고, 얻어진 상기 유전자를 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 (E. coli-C. glutamicum shuttle expression vector)에 서브 클로닝하여 재조합 벡터를 제작하였다. 이후, 상기 키메라 CelE와 miniCbpA가 삽입된 재조합 벡터를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 숙주 세포를 형질 전환하였다. 이후, 상기 유전자로부터 발현되는 단백질이 균에서 세포 외로 발현되며 효소활성을 나타내는지 조사하기 위하여, 키메라 CelE가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체를 배양하여 상등액에서 엔도글루칸아제 활성을 측정하였다. 또한 miniCbpA가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체를 배양하여 상등액을 셀룰로오즈 친화 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 키메라 CelE와 miniCbpA가 도입된 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체로부터 세포 외로 목적하는 단백질이 발현되어 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한 보다 높은 셀룰로오즈 분해능을 갖는 셀룰로좀 형성을 위해 발현된 상기 단백질의 어셈블리를 통한 소형 셀룰로좀의 생성 및 효소 활성을 조사한 결과 키메라 CelE-miniCbpA의 셀룰로좀 형성이 성공적으로 이루어졌으며 효소 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이로써, 본 발명에 따라 재조합되고 코리네박테리움 글루타미쿰 균에 형질 전환된 키메라 CelE와 miniCbpA의 세포 외 분비 발현 및 상기 효소의 어셈블리를 통한 소형 셀룰로좀 miniCbpA-cCelE는 섬유소를 분해하는 기능이 효율적으로 이루어진다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 저산소 고세포 집적 프로세스에 효과 적인 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 엔도글루칸아제와 셀룰로오즈 결합단백질을 각각 도입하였다. 이 후, 상기 엔도글루칸아제 유전자와 셀룰로오즈 결합단백질 유전자가 상기 균주에서 높은 수준으로 발현되어 분비되는 것을 확인하였다. 발현된 단백질은 어셈블리를 통해 셀룰로오즈 분해 효소 복합체인 셀룰로좀으로 용이하게 작동하는 것을 확인하였다. 본 발명에 따라 클로스트리디움 속 균주로부터 유래한 엔도글루칸아제 유전자와 셀룰로오즈 결합단백질이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체 및 상기 유전자로부터 발현되는 효소의 어셈블리를 통한 소형-셀룰로좀의 대량생산은 바이오매스 (Biomass)의 분해에 있어 경제적으로 저렴하고 생산적으로 효율적인 셀룰로오즈 분해효소 생산으로 공장에서 바이오 에탄올 공정의 생산단가 절감에 유용한 발명인 것으로 기대된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 엔도글루칸아제와 셀룰로좀 기본골격소단위 유전자의 증폭

클로스트리디움 유래의 서머셀럼의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (CelE) 유전자와 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 (EngB)의 도커린 (dokerin) 부위를 갖는 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimeric CelE) 유전자를 클로닝하기 위하여 키메라 CelE의 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머 (Forward primer)의 5'에는 제한효소 BamHI, 역방향 프라이머 (Reverse primer)의 5'에는 제한효소 NotI 인식서열이 각각 삽입된 프라이머 (Forward primer - 5'AAAGGATCCGTCGGGAACAAAGCTTTTG3'(서열번호 5); Reverse primer - 5'CCCGCGGCCGCTCATAAAAGCATTTTTTTAAGAACA3'(서열번호 6), 밑줄은 제한효소 자리를 의미)를 합성하였다. 이 후, 상기 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 1.3kbp의 클로스트리디움 유래의 키메라 CelE 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 이를 도면 1(A)에 도시하였다.

클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 셀룰로좀 기본골격소단위인 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이 (miniCbpA) 유전자를 클로닝하기 위하여 miniCbpA의 염기서열을 참고로 하여 정방향 프라이머 (Forward primer) 의 5'에는 제한효소 BamHI, 역방향 프라이머 (Reverse primer)의 5'에는 제한효소 NotI 인식서열이 각각 삽입된 프라이머 (Forward primer - 5'CCCGGATCCAGCAGCGACATCATCAATGTC3'(서열번호 7); Reverse primer - 5'CCCGCGGCCGCTCATATAGGATCTCCAATATTTA3'(서열번호 8), 밑줄은 제한효소 자리를 의미)를 합성하였다. 그 결과 1.6kbp의 클로스트리디움 유래의 셀룰로보란스의 miniCbpA 유전자가 포함되어 있는 PCR 밴드를 확인할 수 있었고 이를 도면 1(B)에 도시하였다.

실시예 2: 엔도글루칸아제와 셀룰로좀 기본골격소단위 유전자의 클로닝

상기 실시예 1에서 얻은 키메라 CelE와 miniCbpA 증폭산물을 0.8% 아가로즈 젤 상에서 전기영동 하였고 아가로즈 젤 상의 DNA 절편은 gel extraction kit (Geneall)를 사용하여 회수하였다.

그 후, 키메라 CelE와 miniCbpA는 BamHI과 NotI으로 절단한 후 본 연구실에서 제작한 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 (E. coli-C. glutamicum shuttle expression vector) 인 pMT1-s에 라이게이션 (ligation) 시켜 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질 전환하였다. 이어 형질 전환체로부터 라이게이션 (ligation)된 재조합 플라스미드 DNA를 분리하였다. 상기 재조합 벡터를 각각 pMT1-s-chimeric-CelE, pMT1-s-miniCbpA라 명명하였고 도면 2a, 2b에 도식하였다. 이후, 상기 재조합 벡터들은 전기 천공법 (electroporation) 에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환 시켰다.

이후, 카나마이신 (kanamycine) 이 25mg/l 포함된 LB (Luria-Bertami) 배지 (10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride)를 이용하여 형질 전환체를 선별하였으며, 이를 C. glutamicum / pMT1scCelE, C. glutamicum/ pMT1sminiCbpA라 각각 명명하였다.

실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체의 엔도글루칸아제 활성 측정

상기 실시예 2에서 확보한 형질 전환체의 효소 단백질 발현을 확인하기 위하여, 배지상에서 효소 활성대 (halo) 측정, SDS-PAGE를 실행하였다. 이 후, 상기 발현된 효소의 어셈블리를 통한 소형-셀룰로좀 생산을 확인하기 위하여, Native PAGE 와 Zymograme을 실행하였다.

C. glutamicum / pMT1scCelE와 C. glutamicum / pMT1sminiCbpA를 발현 유도제 없이 키메라 CelE와 miniCbpA 단백질이 배양액으로 분비되도록 하는 조건을 조성하 여 30℃에서 48시간동안 배양 후 원심 분리하여 상등액을 준비하고 농축하였다 (Millipore, amicon 10kDa cut off).

키메라 CelE 단백질이 균에서 세포 외로 분비 발현 되는 것을 확인하기 위해 카나마이신 (kanamycin) 이 25mg/l 포함된 LB 한천배지에 0.3% CMC (carboxy methyl cellulose)을 녹여 효소반응의 기질로 사용하여 효소활성대 (halo) 를 확인하였다. 형질 전환된 코리네박테리움 글루타미쿰의 콜로니를 LKC 한천배지 (LB+kanamycin+carboxy methyl cellulose) 에 접종하여 48시간동안 30℃에서 배양하고, 카나마이신 (kanamycin) 이 25mg/l 포함된LB 액상배지에서 48시간동안 30℃에서 배양한 배양액 5을 기질 (CMC, carboxy methyl cellulose, Sigma) 이 포함된 한천배지에 올려 흡수시킨 후 50℃에서 24시간 반응시켰다. 0.25% 콩고레드 (Congo-Red, Sigma) 로 20분간 염색 후 1몰 염화 소듐 (NaCl, sodium chloride) 로 여러 번 헹구어 낸 후 효소 활성대 (halo)를 확인하였고 그 결과를 각각 도면 3에 도시하였다.

miniCbpA 단백질이 균에서 세포 외로 분비 발현 되는 것을 확인하기 위해 위에서 준비된 농축된 miniCbpA 상등액을 셀룰로오즈 친화 컬럼 크로마토그래피 (Cellulose affinity column chromatography)로 정제하였다. 효소의 정제도를 확인하기 위해 10% poly-acrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE에 따라 단백질을 영동하였다. 그 결과 58kDa 위치에서 단백질 밴드를 확인하였다.

세포 외로 분비 발현된 키메라 CelE와 miniCbpA의 어셈블리를 통해 소형 셀룰로좀을 생산하기 위해 위에서 준비된 농축된 키메라 CelE와 miniCbpA 상등액을 50mM 염화 포타슘 (KCl, potassium chloride)이 포함된 완충용액에 1:1의 비율로 혼합하여 4에서 12시간 반응 시킨 뒤 상등액을 셀룰로오즈 친화 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 효소의 정제도를 확인하기 위해 10% poly-acrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE에 따라 단백질을 영동하였다. 그 결과 47kDa 과 58kDa 위치에서 키메라 CelE와 miniCbpA 단백질 밴드를 확인하였다.

정확한 위치에서의 소형 셀룰로좀의 생산을 확인하기 위하여 5% poly-acrylamide gel을 사용하여 Native PAGE에 따라 단백질을 영동하여 Zymogram을 실행하였다. 이를 실시하기 위해 기질이 첨가된 renature 완충용액 (100mM Succiniate, 10mM CaCl₂, 1mM dTT) 에 2시간동안 1시간 마다 renature 완충용액을 교환 한 후 50℃ 에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 젤을 0.25% 콩고레드 (Congo-Red) 로 30분간 염색 후 1M NaCl로 수차례 헹구어 내어 키메라 CelE-miniCbpA 단백질 사이즈와 동일한 위치에서 효소 활성대 (halo)를 확인할 수 있었다.

도 1(A)는 본 발명에서 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, (A) Lane 1, 1kbp DNA 마커; Lane 2, 키메릭 CelE PCR 산물이며,

도 1(B)는 본 발명에서 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이 유전자의 PCR 산물을 확인한 그림이고, (B) Lane 1, 1kbp DNA 마커; Lane 2, miniCbpA PCR 산물이다.

도 2a는 본 발명에서 제시된 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 유전자가 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pMT1-s에 연결된 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric CelE의 모식도이며,

도 2b는 본 발명에서 제시된 소형 셀룰로오즈 결합단백질 에이 유전자가 대장균-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pMT1-s에 연결된 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA이다.

도 3은 본 발명에서 제시된 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환체 C. glutamicum/ pMT1scCelE의 콜로니에서의 효소활성이 보임으로 효소분비를 확인한 그림이다. 그림에서 1은 C. glutamicum/pMT1s 형질 전환체; 2는 C. glutamicum/pMT1scCelE 형질 전환체를 나타낸다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> A recombinant vector introduced with gene which effectively degrade cellulose, a transformant comprising the vector and a method for producing ethanol using the same <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Active region <400> 1 Ser Gly Thr Lys Leu Leu Asp Ala Ser Gly Asn Glu Leu Val Met Arg 1 5 10 15 Gly Met Arg Asp Ile Ser Ala Ile Asp Leu Val Lys Glu Ile Lys Ile 20 25 30 Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Leu Asp Ala Pro Thr Glu Thr Ala Trp 35 40 45 Gly Asn Pro Arg Thr Thr Lys Ala Met Ile Glu Lys Val Arg Glu Met 50 55 60 Gly Phe Asn Ala Val Arg Val Pro Val Thr Trp Asp Thr His Ile Gly 65 70 75 80 Pro Ala Pro Asp Tyr Lys Ile Asp Glu Ala Trp Leu Asn Arg Val Glu 85 90 95 Glu Val Val Asn Tyr Val Leu Asp Cys Gly Met Tyr Ala Ile Ile Asn 100 105 110 Leu His His Asp Asn Thr Trp Ile Ile Pro Thr Tyr Ala Asn Glu Gln 115 120 125 Arg Ser Lys Glu Lys Leu Val Lys Val Trp Glu Gln Ile Ala Thr 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Gly 340 345 350 Val Glu Pro Leu Val Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Leu Met Pro Thr 355 360 365 Pro Ser Pro Thr Val Thr Ala Asn Ile Leu Tyr Gly Ser Gly Thr Lys 370 375 380 Leu Leu Asp Ala Ser Gly Asn Glu Leu Val Met Arg Gly Met Arg Asp 385 390 395 400 Ile Ser Ala Ile Asp Leu Val Lys Glu Ile Lys Ile Gly Trp Asn Leu 405 410 415 Gly Asn Thr Leu Asp Ala Pro Thr Glu Thr 420 425 <210> 2 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> active region <400> 2 tcgggaacaa agcttttgga tgcaagcgga aacgagcttg taatgagggg catgcgtgat 60 atttcagcaa tagatttggt taaagaaata aaaatcggat ggaatttggg aaatactttg 120 gatgctccta cagagactgc ctggggaaat ccaaggacaa ccaaggcaat gatagaaaag 180 gtaagggaaa tgggctttaa tgccgtcaga gtgcctgtta cctgggatac gcacatcgga 240 cctgctccgg actataaaat tgacgaagca tggctgaaca gagttgagga agtggtaaac 300 tatgttcttg actgcggtat gtacgcgatc ataaatcttc accatgacaa tacatggatt 360 atacctacat atgccaatga gcaaaggagt aaagaaaaac ttgtaaaagt ttgggaacaa 420 atagcaaccc gttttaaaga ttatgacgac catttgttgt 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Ser Val Asn Phe Ser Ser Thr Val Ser Gly Ser Thr Ile Lys Leu 325 330 335 Leu Phe Leu Asp Asp Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ile Thr Lys Asp Gly 340 345 350 Val Phe Ala Thr Ile Thr Phe Lys Ala Lys Ala Ile Thr Gly Thr Thr 355 360 365 Ala Lys Val Thr Ser Val Lys Leu Ala Gly Thr Pro Val Val Gly Asp 370 375 380 Ala Gln Leu Gln Glu Lys Pro Cys Ala Val Asn Pro Gly Thr Val Thr 385 390 395 400 Ile Asn Pro Ile Asp Asn Arg Met Gln Ile Ser Val Gly Thr Ala Thr 405 410 415 Val Lys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Val Pro Val Thr Leu Thr Ser Val 420 425 430 Pro Ser Thr Gly Ile Ala Thr Ala Glu Ala Gln Val Ser Phe Asp Ala 435 440 445 Thr Leu Leu Glu Val Ala Ser Val Thr Ala Gly Asp Ile Val Leu Asn 450 455 460 Pro Thr Val Asn Phe Ser Tyr Thr Val Asn Gly Asn Val Ile Lys Leu 465 470 475 480 Leu Phe Leu Asp Asp Thr Leu Gly Ser Gln Leu Ile Ser Lys Asp Gly 485 490 495 Val Phe Val Thr Ile Asn Phe Lys Ala Lys Ala Val Thr Ser Thr Val 500 505 510 Thr Thr Pro Val Thr Val Ser Gly Thr Pro Val Phe Ala Asp Gly Thr 515 520 525 Leu Ala Glu Val Gln Ser Lys Thr Ala Ala Gly Ser Val Thr Ile Asn 530 535 540 Ile Gly Asp Pro Ile 545 <210> 6 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCbpA <400> 6 gcagcgacat catcaatgtc agttgaattt tacaactcta acaaatcagc acaaacaaac 60 tcaattacac caataatcaa aattactaac acatctgaca gtgatttaaa tttaaatgac 120 gtaaaagtta gatattatta cacaagtgat ggtacacaag gacaaacttt ctggtgtgac 180 catgctggtg cattattagg aaatagctat gttgataaca ctagcaaagt gacagcaaac 240 ttcgttaaag aaacagcaag cccaacatca acctatgata catatgttga atttggattt 300 gcaagcggac gagctactct taaaaaagga caatttataa ctattcaagg aagaataaca 360 aaatcagact ggtcaaacta cactcaaaca aatgactatt catttgatgc aagtagttca 420 acaccagttg taaatccaaa agttacagga tatataggtg gagctaaagt acttggtaca 480 gcaccaggtc cagatgtacc atcttcaata attaatccta cttctgcaac atttgataaa 540 aatgtaacta aacaagcaga tgttaaaact actatgactt taaatggtaa cacatttaaa 600 acaattacag atgcaaacgg tacagctcta aatgcaagca ctgattatag tgtttctgga 660 aatgatgtaa caataagcaa agcttattta gcaaaacaat cagtaggaac aactacatta 720 aactttaact ttagtgcagg aaatcctcaa aaattagtaa ttacagtagt tgacacacca 780 gttgaagctg taacagctac aattggaaaa gtacaagtaa atgctggaga aacggtagca 840 gtaccagtta acttaacaaa agttccagca gctggtttag caacaattga attaccatta 900 acttttgatt ctgcatcatt agaagtagta tcaataactg ctggagatat cgtattaaat 960 ccatcagtaa acttctcttc tacagtaagt ggaagcacaa taaaattatt attcttagat 1020 gatacattag gaagccaatt aatcactaag gatggagttt ttgcaacaat aacatttaaa 1080 gcaaaagcta taactggaac aactgcaaaa gtaacttcag ttaaattagc tggaacacca 1140 gtagttggtg atgcgcaatt acaagaaaaa ccttgtgcag ttaacccagg aacagtaact 1200 atcaatccaa tcgataatag aatgcaaatt tcagttggaa cagcaacagt aaaagctgga 1260 gaaatagcag cagtgccagt aacattaaca agtgttccat caactggaat agcaactgct 1320 gaagcacaag taagttttga tgcaacatta ttagaagtag catcagtaac tgctggagat 1380 atcgtattaa atccaacagt aaacttctct tatacagtaa acggaaatgt aataaaatta 1440 ttattcctag atgatacatt aggaagccaa ttaattagta aagatggagt ttttgtaaca 1500 ataaacttca aagcaaaagc tgtaacaagc acagtaacaa caccagttac agtatcagga 1560 acacctgtat ttgcagatgg tacattagca gaagtacaat ctaaaacagc agcaggtagc 1620 gttacaataa atattggaga tcctata 1647 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 7 gcgcggatcc aagaaatgat ggtaaatgaa atagg 35 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 8 gaaatctcat gaaaagagcg cgga 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3 <400> 9 cgctcttttc atgagatttc cttcaatt 28 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 <400> 10 gcgcgaattc gtcttttatc caaagatacc 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCelE P1 <400> 11 atatgcggcc gcatcgggaa caaagctttt g 31 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCelE P2 <400> 12 tttgttaaca tcaccgtaca aaatattgct gtc 33 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCelE P3 <400> 13 attttgtacg gtgatgttaa caaagatgga aagg 34 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cCelE P4 <400> 14 gcgcactagt gctaaaagca tttttttaag aacag 35 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCbpA_f <400> 15 atatgcggcc gcgcagcgac atcatcaat 29 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCbpA_r <400> 16 gcgcactagt gctataggat ctccaatatt tatt 34 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl1_f <400> 17 ggcgaattca agtcccaatt caaaactata c 31 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl1_r <400> 18 atatgcggcc gcaatagtaa acaggacaga tgt 33

Claims

클로스트리디움 속 (Clostridium sp .)으로부터 유래한 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE.
제 1항에 있어서, 상기 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE) 유전자는 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2a의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pMT1-s-chimeric-CelE.
클로스트리디움 속 (Chlostridium sp .)으로부터 유래한 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA.
제 5항에 있어서, 상기 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA)는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA.
제 5항에 있어서, 상기 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이 (miniCbpA) 유전자는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 재조합 벡터 pMT1-s-miniCbpA.
제 5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2b의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터pMT1-s-miniCbpA.
제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제 9항에 있어서, 상기 형질 전환체는 기탁번호가 KCCM 11040P인 형질 전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 / pMT1scCelE인 형질전환체.
제 9항 또는 제 10항의 형질전환체를 배양하여 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)를 생산하는 방법.
제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질 전환된 형질전환체.
제 11항에 있어서, 상기 형질전환체는 기탁번호가 KCCM 11039P인 형질 전환체 코리네박테리움 글루타미쿰 / pMT1sminiCbpA인 형질전환체.
제 12항 또는 제 13항의 형질전환체를 배양하여 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 생산하는 방법.
a) 제 9항 또는 제 10항의 형질전환체; 및

b)제 12항 또는 제 13항의 형질전환체를 포함하는 소형-셀룰로좀 생성용 조성물.
a) 제 9항 또는 제 10항의 형질전환체를 배양하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 키메라 엔도-베타-1,4-글루칸아제-이 (chimera-CelE)를 수득하는 단계;

c) 제 12항 또는 제 13항의 형질전환체를 배양하는 단계;

d) 상기 c) 단계의 배양액으로부터 셀룰로좀 기본골격 소단위 소형 셀룰로오즈 결합 단백질 에이를 수득하는 단계; 및

e) 상기 b)와 d) 단계에서 수득한 단백질을 혼합하는 단계를 포함하는 소형- 셀룰로좀의 대량 생산방법.