KR20110038303A

KR20110038303A - 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110038303A
Application number: KR1020090095534A
Authority: KR
Inventors: 박의균; 전소영
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2009-10-08
Filing date: 2009-10-08
Publication date: 2011-04-14
Also published as: KR101194821B1

Abstract

본 발명은 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 본 발명에 따라 동정된 킬레이팅제 용해성 치아 단백질, 이의 제조방법, 상기 단백질을 이용하여 지방 또는 골수 유래 줄기세포를 증식시키는 방법, 상기 단백질을 이용하여 치수 유래 줄기세포를 상아질모세포로 분화 촉진시키는 방법 및 상기 단백질을 이용하여 치아 또는 상아질을 재생시키는 방법에 관한 것이다.

킬레이팅제 용해성 치아 단백질, 상아질모세포

Description

킬레이팅제 용해성 치아 단백질 및 이의 용도{Chelating agent -soluble tooth protein and usage thereof}

본 발명은 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 본 발명에 따라 동정된 킬레이팅제 용해성 치아 단백질, 이의 제조방법, 상기 단백질을 이용하여 지방 또는 골수 유래 줄기세포를 증식시키는 방법, 상기 단백질을 이용하여 치수 유래 줄기세포를 상아질모세포로 분화시키는 방법 및 상기 단백질을 이용하여 치아 또는 상아질을 재생시키는 방법에 관한 것이다.

사람 치아에서, 에나멜, 상아질 및 시멘트질과 같은 단단한 조직은 무기 하이드록시아파타이트 및 콜라겐, 비콜라겐 단백질과 같은 유기 바탕질 단백질 및 생물활성 단백질로 구성되어 있다. 유기 바탕질 단백질에서, 콜라겐은 하이드록시아파타이트의 침착을 위한 구조적 바탕질을 형성하고, 비콜라겐 단백질은 하이드록시아파타이트 결정의 개시 및 성장을 조절하는 작용을 한다. 치아는 또한 성장 인자, 효소, 신호전달 물질 및 전사 인자와 같은 다양한 생물활성 분자를 포함한다. 따라서, 치아 바탕질 단백질은 치아 세포의 증식 및 분화와 같은 다양한 세포 반응 을 조절할 수 있는 많은 단백질을 포함한다.

사람 치아 조직으로부터 추출된 용해성 단백질은 상아질형성 및 광물질 침착을 조절하는 것으로 알려져 있다. 에나멜의 EDTA로의 탈회화는, 하이드록시아파타이트 결정의 핵형성제로서 작용하여, 에나멜의 결정 성장을 조절할 수 있는 에나멜린을 용해시킨다. 래빗의 앞니로부터 분리된 ESDP(EDTA-soluble dentin proteins)는 배양된 마우스 치아 유두 조직에 유의적인 영향을 미치지 않았으나, TGF(transforming growth factor)-β1 및 BMP2(bone morphogenic protein 2)와 조합되었을 때, 시험관내에서 상아질모세포 분화를 유의적으로 증가시켰다. 돼지의 ESDP 추출물은 시험관내에서 사람 DPSCs의 상아질모세포로의 분화와 광물질화를 또한 유도하였다. 또한, ESDPs는 in vivo deep Class V buccal cavity 모델에서, 수산화칼슘 및 레진이 수식된 글래스 아이오노머(glass ionomer) 보다 상아질 침착을 더욱 촉진하는 것으로 확인되었다. 구아니딘/EDTA로 소 및 사람 치아로부터 추출된 시멘트질 단백질의 경우에, 섬유아세포의 부착을 촉진하며, 이는 RGD(arginine-glycine-aspartic acid) 서열을 포함하는 합성 펩타이드에 의해 억제된다. 구아니딘/EDTA 추출물은 BSP-II(bone sialoprotein-II), 피브로넥틴과 같은 다수의 인자를 포함하는 것으로 확인되었다. 사람 시멘트질 추출물 성분은 잇몸 섬유아세포의 분열 활성을 갖는다.

따라서, 치아의 단단한 조직으로부터 추출된 용해성 단백질은 치아 세포의 부착, 성장 및 분화와 같은 생물학적 반응을 조절할 수 있다. 그러나, 치아 용해성 단백질의 조성에 대하여 알려진 바가 없고, 치아 용해성 단백질이 치아 조직으 로부터 유래된 세포만을 조절할 수 있는지에 대해서도 불분명하다.

본 발명자는 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 중에서 분자량이 50kDa 이상인 단백질을 분리하였고, 이 단백질들이 지방 및 골수 유래 줄기세포의 증식을 촉진하는 한편, 치수 유래 줄기세포의 상아질모세포로의 분화를 촉진하고 광물질 침착을 촉진하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 한 목적은 본 발명에 따라 동정된 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 (1) 치수와 치주인대가 제거된 치아를 킬레이팅제 용액으로 처리하여 탈회하는 단계; 및 (2) 상기 용액으로부터 분자량 50kDa 이상인 단백질을 분리하는 단계를 포함한 킬레이팅제 용해성 치아 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 지방 또는 골수 유래 줄기세포의 증식 유도제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 치수 유래 줄기세포의 상아질모세포로의 분화유도 촉진제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이팅제 용해성 치아 단백질이 코팅된 배양용기에 치수 유래 줄기세포를 배양하여 상기 줄기세포를 상아질모세포로 분화시 키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 치아 또는 상아질 재생제를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 지지체에 코팅하여 치아 또는 상아질을 재생하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 (1) 치수와 치주인대가 제거된 치아를 킬레이팅제(예, EDTA) 용액으로 처리하여 탈회하는 단계 및 (2) 상기 용액으로부터 분자량 50kDa 이상인 단백질을 분리하는 단계를 거쳐서 총 147개의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질(EDTA-soluble tooth proteins, ESTPs)(표 1)을 분리하였다.

상기 147개의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 기능별로 분류하면 표 2에 나타낸 바와 같다.

상기 147개의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 중에서 76개의 단백질은 킬레이팅제 용해성 치아 단백질에서만 특이적으로 동정된 반면, 그 외 71개의 단백질은 공지된 EDTA 불용성 상아질 바탕질 단백질(EDTA-insoluble dentin matrix protein)(Park, 2009)에서도 동정되었다(표 3 참조).

상기 표 3 중에서 킬레이팅제 용해성 치아 단백질에서만 특이적으로 동정된 76개의 단백질은 표 4에, 킬레이팅제 용해성 치아 단백질과 EDTA 불용성 상아질 바탕질 단백질에서 공통적으로 동정된 71개의 단백질은 표 5에 각각 나타내었다.

킬레이팅제 용해성 치아 단백질에서만 특이적으로 동정되는 76개의 단백질을 기능에 따라 분류하면 표 6과 같다.

Biological function	No. of Genes	Protein symbol
Response to stimulus	21	A2M ACTB ALMS1 ANG ANXA1 APOH C8G CFB CFH CFHR1 CP EP300 FGA IGHG4 IGHM IGKV1-5 KRT1 POLQ PROS1 PTN S100A8
Organ development	16	ACTB ANG COL11A2 COL12A1 EP300 FGA HRNR KRT1 KRT10 KRT14 KRT2 KRT5 KRT9 POSTN PTN TIMP1
Tissue development	10	FGA HRNR KRT1 KRT10 KRT14 KRT2 KRT5 KRT9 POSTN PTN
Cell differentiation	9	ACTB ANG ANXA1 C15orf2 C8G EP300 HRNR KRT14 TIMP1
Morphogenesis	9	ANG EP300 FGA HBB HRNR KRT1 KRT14 KRT2 KRT5
Cell proliferation	9	ANG ANXA1 FGA IGHM KRT2 KRT5 PRG4 PTN TIMP1
Immune response	8	C8G CFB CFH CFHR1 IGHG4 IGHM IGKV1-5 KRT1
maintenance of location	8	CLIC1 CRABP1 HPX KCTD12 MSN PMP2 TPM4 TTR
Proteolysis	8	C8G CFB CFH CFHR1 HPR KRT1 PRSS1 TIMP1
Defense response	8	ANXA1 APOH C8G CFB CFH CFHR1 KRT1 S100A8
Inflammatory response	7	ANXA1 C8G CFB CFH CFHR1 KRT1 S100A8
Ectoderm development	7	HRNR KRT1 KRT10 KRT14 KRT2 KRT5 KRT9
Extracellular organization	6	COL11A2 COL12A1 PCDHB6 POSTN PRG4 VCAN
transport	6	CLIC1 CRABP1 HPX KCTD12 PMP2 TTR
Skeletal development	5	COL11A2 COL12A1 LTBP3 POSTN PTN
DNA packaging	5	EP300 HIST1H1C HIST1H2AD HIST1H2BL JMJD2C
Complement activation	5	C8G CFB CFH CFHR1 KRT1
Wound healing	4	APOH FGA KRT1 PROS1
Nervous development	4	EP300 KRT2 PCDHB6 PTN
Cell adhesion	4	COL11A2 COL12A1 PCDHB6 POSTN
Hemostasis	4	APOH FGA KRT1 PROS1
Blood coagulation	4	APOH FGA KRT1 PROS1
Signaling pathway	3	LTBP3 PTN YWHAE
Cell death	3	ANXA1 C8G EP300
Cell maturation	3	ACTB ANG TIMP1
Glycolysis	3	ALDOA PGAM1 TPI1
Response to hypoxia	2	ANG EP300
Gas transport	2	HBB HBD
Angiogenesis	1	KRT1
Protein phosphorylation	1	S100A10
calcium binding	1	CALR3
Protein folding	1	LOC654188
detoxification	1	CRYZ
Tumor suppressor	1	ENO1
chemotaxis	1	RARRES2
Genes not classified	14	71 kDa protein A1BG FLJ50830 FLJ51034 HIST4H4 HRG HSP90AB3P IGHV4-31 KIAA1797 LOC100133739 MLLT6 QSER1 SERPINA10

본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질 중에는 종래에 치아 또는 단단한 조직 형성과 관련된 것으로 규명되지 않은 단백질(71 kDa protein, HPR, KIAA1797, RARRES2, FLJ50830, HPX, PCDHB6, S100A10, A2M, FLJ51034, EP300, HRG, S100A8, CFB, FGA, HRNR, PMP2, SERPINA10, HSP90AB3P, POLQ, TIMP1, CFHR1, IGHG4, CLIC1, HBD, IGHM, PRG4, COL11A2, HIST1H1C, IGHV4-31, LOC100133739, PROS1, APOH, COL12A1-1, HIST1H2AD, IGKV1-5, LOC654188, PRSS1, HIST1H2BL, JMJD2C, LTBP3, C8G, HIST4H4, MLLT6, QSER1)이 포함되어 있다.

본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질이 코팅된 배양 용기에서 지방 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 치수 유래 줄기세포를 배양한 결과, 지방 및 골수 유래 줄기세포의 증식(proliferation)이 촉진됨을 확인하였다(실시예 2-2 참조). 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 지방 또는 골수 유래 줄기세포의 증식 유도제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질이 코팅된 배양 용기에서 치아 유래 줄기세포를 치아형성/골형성 배지로 배양하여 치아형성/골형성을 유도한 결과, 광물질의 침착 즉, 상아질모세포로의 분화가 촉진됨을 확인하였다(실시예 2-3 참조). 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 킬레팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 치수 유래 줄기세포의 상아질모세포로의 분화유도 촉진제에 관한 것이다.

특히, 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질은 배양 배지에 직접 첨가되는 경우에는 광물질의 침착 즉, 상아질모세포로의 분화를 오히려 억제하는 것으로 확인되었다(도 4 참조). 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질이 코팅된 배양 용기에서 치수 유래 줄기세포를 배양하여 치수 유래 줄기세포를 상아질모세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

앞서 설명된 바와 같이 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질은 광물질의 침착을 촉진하므로, 본 발명은 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 포함하는 치아 또는 상아질 재생제를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질을 지지체(scaffold)에 코팅하여 치아 또는 상아질을 재생시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질은 지방 및 골수 유래 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다.

본 발명의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질은 치수 유래 줄기세포의 상아질모세포로의 분화를 촉진할 수 있다.

본 발명의 킬레이팅제 용해성 치아 단백질은 치아 또는 상아질을 재생하는데 이용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

1-1. ESTPs(EDTA-soluble tooth proteins)의 준비

사람의 치아를 치아교정 환자로부터 동의를 구한 후 수집하였다. 추출된 치아는 300IU/ml 페니실린 및 300mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 PBS(phosphate buffered saline)에 담아 실험실로 즉시 운반하였다. 치아의 치주인대 및 치수를 멸균된 도구로 즉시 제거하였다. 전체 치아를 프로테아제 억제제(Roche)를 함유한 0.5M EDTA 용액 (pH8.0)으로 4℃에서 2-3주 동안 처리하여 탈회화하고 이틀마다 용액을 수집하였다. EDTA로 용해된 단백질 분획물을 모두 혼합하고 투석하여 EDTA 염을 제거하였다. 성장 인자와 같은 저분자량 단백질 보다는 고분자량의 세포외기질 단백질을 수득하고자 하였으므로 투석된 용해 단백질을 분자량 컷 오프(cur off) 50 kDa centriplus(Millipore, Bedford, MA)로 농축하였다.

1-2. 콜로이드성 쿠마시 블루 염색 및 인-겔 다이제스쳔

ESTPs의 단백질 농도를 BCA 키트(Pierce)를 이용하여 제조업자의 설명문에 따라 측정하였다. ESTPs (10㎍)를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 상기 겔을 증류수에 용해한 0.25% 피어스 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(Pierce Coomassie Brilliant Blue G-250)으로 염색하였다. 그리고 겔을 15 피스로 자르고(도 1), 75mM 암모늄 비카르보네이트/40% 에탄올 (v/v, 1:1)에 정치하여 탈염색한 후 트립신으로 처리하였다.

1-3. LC-MS/MS 분석

LC-MS/MS 분석은 공지된 바에 따라 수행되었다. LC-MS/MS 분석은 NSI 소스 (San Jose, CA)가 장착된 써모 핀니간 프로테옴X 워크스테이션 LTQ 리니어 이온 트랩 MS(Finnigan's ProteomeX workstation LTQ linear ion trap MS, Thermo Electron, San Jose, CA)를 이용하여 수행되었다. 12㎕의 펩타이드 혼합물을 주입하고 펩타이드 트랩 카트리지(Agilent, Palo Alto, CA)에 로딩하였다. 상기 펩타이드를 5㎛, 직경 300Å의 C18 실리카겔이 하우스 안에 충진되어 있는 10-cm 역상 PicoFrit 컬럼 상에서 용출한 후 RP 컬럼상에서 그래디언트 용출에 의해 분리하였다. 이동상으로는 H₂O(A)와 ACN(B)를 각각 사용하였으며, 상기 두 용액은 모두 0.1%(v/v) 포름산을 포함하였다. 유속은 200nL/분으로 유지하였다. 그래디언트는 2% B에서 시작하여, 50분 내에 60% B로, 다음 5 분 내에 80% B로, 최종 15분 내에 100% A로 끌어올렸다. 데이터-의존 획득 모드(m/z 300-1800)가 가능하였고, 각 서베이(survey) MS 스캔 후 30초 다이나믹 배제 옵션(dynamic exclusion option) 작동 상태에서 5개의 MS/MS 스캔을 진행하였다. 스프레이 전압은 1.9kV이고, 이온 트랜스퍼 튜브의 온도는 195℃로 설정하였다. 표준화된 충돌 에너지는 35%로 설정하였다.

1-4. 데이터 분석 및 기능별 분류

데이터 분석은 공지된 바에 따라 수행되었다. 데이터베이스 조사에 있어서, SORCERER 버전 3.4 베타 2에 의해 직렬 질량 스펙트럼이 추출되었다. 전하 상태 디컨볼루션(deconvolution) 및 디이소토핑(deisotoping)은 진행되지 않았다. 모든 MS/MS 시료는, 비 특이적인 소화 효소를 추정하는 ipiHUMAN3.49 데이터베이스(unknown version, 74017 entries)를 조사하도록 설정된, SEQUEST (ThermoFinnigan, San Jose, CA; version v.27, rev. 11)를 이용하여 분석하였다. SEQUEST는 1.0Da의 단편 이온 질량 오차 및 1.5Da의 모(parent) 이온 오차를 허용하도록 조사되었다. SEQUEST에서 시스테인의 이오도아세트아미드 유도체가 고정된 수석으로서 특정되었다. 거짓-양성 통계를 개선하기 위해, SORCERER 프로그램에서 데이터 조사 과정 동안에 데코이 옵션(decoy option)이 선택되었고, 이로 인해 노이즈 영향이 감소됨으로써 결과의 퀄리티를 개선할 수 있다. SEQUEST에서 메티오닌의 산화는 다양한 수식으로서 특정되었다.

단백질 동정을 위해, Scaffold (version Scaffold-01_07_00, Proteome Software Inc., Portland, OR)를 이용하여 MS/MS 기반 펩타이드 및 단백질 동정을 검증하였다. Peptide Prophet 알고리즘(Keller A, et al. 2002 Anal Chem 74(20):5383-92; Nesvizhskii AI et al. 2003 Anal Chem 75(17):4646-58)에서 특정된 바와 같이 95.0% 이상의 확률이 확립되고 적어도 2개의 펩타이드가 포함되는 경우 펩타이드 동정이 허용되었다. 유사한 펩타이드를 포함하고 있고 MS/MS 분석만으로는 구분할 수 없는 단백질은 파르시모니(parsimony)의 원칙을 충족하도록 그룹핑하였다.

DAVID(database for annotation, visualization and integrated discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)를 이용하여 유전자 온톨로지 분석을 수행하였다. DAVID를 통해 단백질 심볼로 세포생리적 기능에 따라 그룹핑하였다.

1-5. 사람 성체 줄기세포의 분리 및 배양

치아, 골수 및 지방은 경북대학교 병원에서 치아절제술과 고관절절제술을 받는 환자로부터 동의를 구한 후 수집하였다. DPSCs의 분리를 위해, 치수를 분리하여 매스(mass)로 세절한 후 3mg/ml의 콜라게나제 타입 I (Worthington, Lakewood, NJ) 및 4mg/ml 디스파제(Invitrogen, Grand Island, NY)로 30분 동안 처리하였다. 세포 현탁액을 100㎛ 나일론 메쉬로 여과한 후 100mm 배양기로 옮겼다. 이 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen), 100 units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 α-MEM(α-minimum essential medium)에 넣어 37℃에서 5% CO₂ 의 습한 항온기에서 배양하였다. BMSCs 분리를 위해, 골수를 histopaque(Sigma; St. Louis, MO) 그래디언트 원심분리를 통해 회전시켰다. 골수 단핵구세포를 10% FBS 및 항생제가 보충된 α-MEM에서 24시간 동안 배양하였다. 비부착성 세포를 제거하고 BMSCs를 포함하는 부착성 세포를 배양하여 확장하였다. ATSCs의 배양을 위해, 지방 조직을 수집하여 멸균된 가위로 세절한 후 콜라게나제(콜라게나제 타입 II, Boehringer, Mannheim, Germany)로 소화시켰다. 현탁액을 100㎛ 나일론 메쉬로 여과하고, 원심분리한 후 조직 배양 플라스크에 옮겼다. 10% FBS 및 항생제를 함유하는 α-MEM 배양 배지는 매 3일마다 교환해주었다. 계대 수 4회 이하의 세포를 이용하였다.

1-6. 세포 증식 및 치아형성/골형성 분화 분석

세포 증식에 대한 ESTPs의 영향을 분석하기 위해, MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] 분석을 수행하였다. 세포를 배양하기에 앞서 바닥이 편평한 96구 플레이트를 4℃에서 2일 동안 0.1㎍ ESTPs/구로 코팅한 후 세포를 구 당 700 세포의 밀도로 배양하였다. 배양 1, 3, 5, 또는 7일째에, MTS 분석을 제조업자의 설명문에 따라 수행하였다.

세포 형태에 대한 ESTPs의 영향을 조사하기 위해, 사람 DPSCs, ATSCs 및 BMSCs를 6구 플레이트에 배양하고 50㎍/ml α-아스코르브산, 10mM β-글리세로포스페이트 및 100nM 덱사메타손 및 항생제를 포함한 치아형성/골형성 배지로 7일 동안 분화를 유도하였다. 최적의 분화 조건을 선택하기 위해, 두 가지 다른 방식을 수행하였다. 첫 번째는, 상기된 바와 같이 ESTPs (1㎍/구)로 6구판을 코딩하는 것이다. 두 번째는, ESTPs(동일 농도)를 배양 배지에 직접 첨가하는 것이다. 세포(6구판의 각 구에 1 x 10⁴)를 7일 동안 배양하였다. 분화를 유도하기 위해, 배지를 3주 동안 치아형성/골형성 배지로 교환해주었다. 광물질화된 소절의 형성은 알리자린 레드 S(alizarin S) 염색으로 확인하였다.

1-7. RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

DPSCs를 7, 14 및 21일 동안 배양한 후 총 RNA를 추출하여 SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitroge)로 역전사하였다. DSPP, ALP(alkaline phosphatase), COL1(type I collagen), ON(osteonectin), OPN(osteopontin), BSP (Bone sialoprotein) 및 OC(osteocalcin)에 대한 프라이머 서열 및 PCR 증폭 조건은 표 7에 나타내었다. 프라이머는 Primer 3 프로그램(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)을 사용하여 디자인하였다. GAPDH를 내부 대조군으로 이용하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, 이미지를 photodocumentation 시스템(BioRad, Hercules, CA)으로 캡쳐하였다.

실시예 2: 결과

2-1. ESTPs의 프로테오믹 분석 및 기능별 분류

ESTPs의 조성을 분석하기 위해, 치주인대 및 치수가 없는 사람 치아를 준비한 후 EDTA 용해성 분획물을 수집, 투석, 농축 및 트립신 처리하였다. 트립신으로 처리된 펩타이드를 LC-MS/MS를 이용하여 동정하였다. 거짓-양성 통계를 개선하기 위해, SORCERER 프로그램에서 데이터 조사 과정 동안에 데코이 옵션(decoy option)이 선택되었고, 이로 인해 노이즈 영향이 감소됨으로써 결과의 퀄리티를 개선할 수 있다. 총 147개의 단백질을 동정하였다(표 1).

ESTPs를 세포생리적 과정에 기초하여 33개의 카테고리로 분류하였다. 여기에는 위치의 유지(44개 단백질), 소기관 발달(39개 단백질), 세포이동 (33개 단백질), 상처에 대한 반응(26개 단백질), 세포 분화(26개 단백질), 세포생리적 과정의 양성적인 조절(23개 단백질), 염증 반응(22개 단백질), 세포 부착(20개 단백질) 및 다른 세포생리적 기능이 포함되어 있다(표 2).

치아에서 가장 풍부한 기질 단백질은 콜라겐이다. ESTPs에서 동정된 콜라겐은 1A1, 1A2, 5A1, 6A1/2/3, 11A1 및 12A1 콜라겐이다. 펩타이드 히트 수에 의해 확인된 주요 콜라겐 타입은 11A2 콜라겐이다(펩타이드 히트 수가 162임). 다른 콜라겐 타입 12A1, 6A3, 1A1, 6A1, 6A2 및 5A1의 펩타이드 히트 수는 각각 51, 44, 10, 10, 3 및 2이었다. 높은 펩타이드 히트를 보여준, 동정된 NCPs는 BGN(biglycan, 펩타이드 히트 83), VIM(vimetin, 78), SPARC(osteonectin; ON, 65), VTN(vitronectin, 52), LUM(lumican, 33), OMD(31), DSPP(25), OGN(osteoglycin, 24), TNC(23), POSTN(periostin, 20), VCAN(versican, 6), ASPN(asporin, 6), MGP(matrix Gla protein, 4) 및 FN(fibronectin, 2)이었다. 에나멜 단백질인 ANXA2(annexin a2, 115)가 동정되었으나, 아멜로게닌(amelogenin), 에나멜린(enamelin), 아멜로블라스틴(ameloblastin) 및 투프텔린(tuftelin)과 같은 다른 에나멜 단백질은 ESTPs에서 동정되지 않았다. ANXA1(43), ANXA5(41) 및 ANXA6(7)과 같은 다른 ANX 단백질 또한 동정되었다. 시멘트질은 BSP, OPN, OC 및 AHSG(α-2-hs-glycoprotein)과 같은 NCPs를 가지고 있으나, ESTPs는 단지 AHSG만을 포함하였다. 동정된 생물활성 분자는 TGF-β1 및 IGFBP5(insulin-like growth binding protein 5)이었다. 치아형성, ECM, 광물질화에 관여하는 다른 단백질 또한 동정되었다. 그러한 단백질은 TIMP1, FN, THBS1(thrombospondin1), F2(prothrombin), KRTs(keratins) 1, 2, 5, 6, 9, 10, 14, 71, 및 75, actin, SOD3, MMP-20(Matrix metalloproteinase-20; enamelysin), PTN(pleiotrophin) 및 CLU(clusterin)를 포함하였다.

ESTPs 프로필과 EDTA 불용성 상아질 바탕질 프로테옴 프로필(Park ES, et al. J Proteome Res 2009 Mar;8(3):1338-1346)을 비교함으로써 기존에 치아 또는 상아질모세포 분화와 관련된 것으로 공지되지 않은 새로운 단백질을 동정하였다(표 3). 76개의 단백질은 ESTPs에서 특이적으로 동정되었고, 71개의 단백질은 ESTPs 및 EDTA 불용성 상아질 단백질 모두에서 공통적으로 확인되었다.

2-2. 사람 MSCs의 증식에 대한 ESTPs의 영향

사람 MSCs의 세포 반응에 대한 ESTPs의 영향을 조사하기 위해, DPSCs, BMSCs 및 ATSCs의 증식에 대해 ESTPs의 영향을 분석하였다. 상기 세포를 ESTPs가 코팅된 96-구판에서 배양하고, MTS 분석을 배양 1, 3, 5 및 7일째에 수행하였다. ESTPs가 코팅된 배양기에서 배양된 DPSCs, BMSCs 및 ATSCs의 형태학은 서로 매우 유사하였다(도 1). MTS 분석 결과 ESTPs가 코팅된 배양기에서 배양된 DPSCs의 증식은 대조군에 비해 배양 7일째에 평균 19.3%로 약간 감소하였다(도 2A). 그러나, BMSCs 및 ATSCs는 배양 7일째에 각각 11.5, 37.7%까지 증식이 증가하는 것으로 나타났다(도 2B 및 2C).

2-3. 사람 MSCs의 상아질모세포 증식에 대한 ESTPs의 영향

ESTPs가 MSCs의 치아형성 및 골형성 분화를 조절할 수 있는지 조사하기 위해, ESTPs가 코팅된 배양기에서 배양된 DPSCs, BMSCS 및 ATSCs를 골형성/치아형성 배지로 자극하였다. 코팅되지 않은 조건에서 DSPCs의 광물질 침착은 배양 14-15일째에 개시되었다. 그러나, ESTPs에서 배양된 DPSCs는 코팅되지 않은 배양기에서 배양된 세포 보다 빠른 3-5일째부터 유의적인 양의 칼슘 침착을 보였다(도 3A, 좌측 칼럼). 반면에, BMSCs 및 ATSCs는 ESTPs가 코팅된 배양기에서 배양되었을 때 이 세포의 광물질화에 영향을 미치지 않았다(도 3A 중간 및 우측 칼럼). DPSCs의 상아질모세포 분화에 대한 ESTPs의 영향을 확인하기 위해, 4명의 추가 기증자로부터 수득한 DPSCs를 검사하였다. 검사한 모든 DPSCs는 ESTPs 코팅에 의해 광물질 침착이 유의적으로 증가되었다(도 4). 흥미롭게도 ESTPs가 배양 배지에 직접 처리된 경우에는, 5명의 기증자로부터 수득한 DPSCs의 광물질화는 무처리 대조군에 비해 억제되었다(도 4 우측 칼럼).

광물화에 대한 ESTPs의 영향을 조사하기 위해, 상아질모세포 분화와 관련된 유전자의 발현이 RT-PCR에 의해 분석되었다. ESTPs가 코팅되거나 또는 코팅되지 않은 배양기에 DPSCs를 지정된 시간 동안 배양하고, 유전자 발현을 분석하였다. ALP, COL1, OPN 및 ON mRNA의 발현이 ESTPs 코팅에 의해 실질적으로 증가하였다. BSP는 ESTP 코팅에 의해 21일째에 높게 발현되었다. DSPP의 mRNA는 ESTP가 코팅된 배양기에서 배양된 DPSCs에서 14일째에 높게 발현되었고, 이 후 21일까지 점진적으로 감소되었다(도 3B).

도 1은 본 발명의 ESTPs가 코팅된 또는 코팅되지 않은 배양기에서 배양된 DPSCs, BMSCs 및 ATSCs의 형태를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 ESTPs가 코팅된 또는 코팅되지 않은 배양기에서 배양된 DPSCs, BMSCs 및 ATSCs의 증식능 나타낸 것이다.

도 3A는 본 발명의 ESTPs가 코팅된 또는 코팅되지 않은 배양기에서 치아형성/골형성이 유도된 DPSCs, BMSCs 및 ATSCs의 광물질 침착 정도를 나타낸 것이고, 3B는 본 발명의 ESTPs가 코팅된 또는 코팅되지 않은 배양기에서 치아형성/골형성이 유도된 DPSCs에서의 발현 유전자를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 ESTPs가 코팅된 또는 코팅되지 않은 배양기 또는 ESTPs가 첨가된 배지에서 치아형성/골형성이 유도된 5종의 상이한 DPSCs에서의 광물질 침착 정도를 나타낸 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Chelating agent-soluble tooth protein and usage thereof <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctccaacatg gacattgacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctggtaagcc acaccctcat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacatgctca gctttgtgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cctgtggtcc aacaactcct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgcagtgat ttgcttttgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acactatcac ctcggccatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgcctgatga gacagaggtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagtggcagg aagagtcgaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcagcatttt gggaatggcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaggttgttg tcttcgaggt 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggtggcagcc tttgtgtcca agc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcaagggga agaggaaaga ag 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cctaaagaaa atgaagataa tt 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tagaaaaact cttccctcct ac 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cctgcttcac caccttcttg 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccactggcgt cttcaccac 19

Claims

표 4에 나타낸 단백질 중 적어도 한 단백질을 포함하는 킬레이팅제 용해성 치아 단백질.

[표 4]
제 1항에 있어서,

71 kDa protein, HPR, KIAA1797, RARRES2, FLJ50830, HPX, PCDHB6, S100A10, A2M, FLJ51034, EP300, HRG, S100A8, CFB, FGA, HRNR, PMP2, SERPINA10, HSP90AB3P, POLQ, TIMP1, CFHR1, IGHG4, CLIC1, HBD, IGHM, PRG4, COL11A2, HIST1H1C, IGHV4-31, LOC100133739, PROS1, APOH, COL12A1-1, HIST1H2AD, IGKV1-5, LOC654188, PRSS1, HIST1H2BL, JMJD2C, LTBP3, C8G, HIST4H4, MLLT6, QSER1 중 적어도 한 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 킬레이팅제 용해성 치아 단백질.
제 1항에 있어서,

표 5에 나타낸 단백질 중 적어도 한 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 킬레이팅제 용해성 치아 단백질.

[표 5]
(1) 치수와 치주인대가 제거된 치아를 킬레이팅제 용액으로 처리하여 탈회하는 단계; (2) 상기 용액으로부터 분자량 50kDa 이상인 단백질을 분리하는 단계를 포함한, 제1항 또는 제2항에 따른 킬레이팅제 용해성 치아 단백질의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 지방 또는 골수 유래 줄기세포의 증식 유도제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 치수 유래 줄기세포의 상아질모세포로의 분화 촉진제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단백질이 코팅된 배양용기에 치수 유래 줄기세포를 배양하여 상기 줄기세포를 상아질모세포로 분화시키는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 치아 또는 상아질 재생제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 지지체에 코팅하여 치아 또는 상아질을 재생하는 방법.