KR20110026272A

KR20110026272A - 지의류 추출물 및/또는 이로부터 유래한 화합물을 포함하는 항산화제

Info

Publication number: KR20110026272A
Application number: KR1020090084095A
Authority: KR
Inventors: 허재선; 고영진; 나항
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-07
Filing date: 2009-09-07
Publication date: 2011-03-15
Also published as: KR101083653B1

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 가지는 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 또는 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)의 지의류 추출물, 및 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 추출물로부터 유래한 항산화 활성을 가지는 호모세키카산 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 지의류 추출물 및/또는 호모세키카산 화합물은 천연물로부터 유래하고 항산화 활성이 있으므로 식품, 사료, 화장품, 의약품 산업에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

지의류 추출물, 호모세키카산 화합물, 항산화

Description

지의류 추출물 및/또는 이로부터 유래한 화합물을 포함하는 항산화제{Antioxidants comprising the extracts of lichens and/or compounds}

본 발명은 항산화 활성을 가지는 지의류 추출물 및 이로부터 유래한 화합물, 및 이들의 산업적 용도에 관한 것이다.

인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소(O₂)를 이용하여 에너지 대사를 진행하며 생존하고 있다. 그러나 생체 내 산소가 각종 물리적, 화학적, 생물학적인 스트레스를 받으면 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O₂ ^-), 과산화수소(H₂O₂), 히드록시 라디칼(hydroxy radical, OH) 등의 유해한 활성산소종(active oxygen species)으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으키고 심할 경우는 질병을 유발하고 생명을 잃게 한다.

생체는 활성산소종을 제거하는 자기방어기구로서 항산화기구(antioxidative mechanism)를 발달시키면서 진화하여 왔다고 생각되지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소종의 발생은 단백질, DNA, 효소 및 T 세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질환의 원인이 된다. 또한 활성산소종은 세포 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화반응을 일으키고 이로 인해 생체내 축적된 과산화지질은 노화와 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다(Halliwell, B., Drugs, 42: 569, 1991; Fukuzawa, K. and Takaishi, Y., J. Act . Dxyg . Free Rad . 1: 55, 1990; Neuzil, J., Gebicki, J. M. and Stocker, R., Biochem . J. 293: 601, 1993; Sies, H., ed., Oxidative stress, 1985; Steinberg, D., et al., N. Engl . J. Med . 320: 915, 1989).

최근 노화와 성인병 질환의 원인이 활성산소종에 기인된 것이라는 학설이 인정됨에 따라 활성산소종를 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제의 개발연구가 활발히 진행되어 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 카탈라아제(catalase), 글루타티온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 등의 항산화효소와 토코페롤(tocopherol), 아스코베이트(ascorbate), 카로테노이드 (carotenoid), 글루타티온(glutathione) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며(Chang, S. S., et al., J. Food Sci . 42: 1102, 1977; Hammerschmidt, P. A. and Pratt, D. E., J. Food Sci . 43: 556, 1977; Pratt, D. E. and Watts, B. W., J. Food Sci . 29: 17, 1964), 2,6'-디-tert-부틸-4-히드록시 톨루엔(2,6'-di-tert -butyl-4-hydroxytoluene, BHT), 2,6'-디-터트-부틸-4-히드록시아니졸(2,6-di-tert -butyl-4-hydroxyanisole, BHA) 등의 합성 항산화제가 많이 개발되어 의약품과 식품분야에서 이용되고 있다(Kitahara, K., et al., Chem . Pharm . Bull . 40: 2208, 1992; Hatano, T., Natural Medicines 49: 357, 1995; Masaki, H., et al., Biol . Pharm . Bull . 18: 162, 1995).

그러나 합성 항산화제에 대한 소비자의 기피성향과 합성 항산화제가 대량으로 투여된 동물실험에서 발암성이 보고되고 있어(Branen, A. L., JAOCS 52: 59, 1975) 합성 항산화제의 사용이 점점 제한되고 있다. 이로 인하여 효력이 탁월하고 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구된다.

한편, 지의류(lichens)는 균류(fungi)와 조류(algae) 또는/및 시아노박테리아(cyanobacteria)의 공생 복합체로서, 약 14,000 종으로 분류된다. 한때 지의류의 2차 대사물(secondary metabolites)을 항균제(antimicrobial agent) 또는 항초식동물제(antiherbivore agent)로 사용하는 것이 제안된 바 있다. 또한, 몇몇 지의류 추출물은 민간에서 다양한 치료제로 이용되어 왔으며, 지의류 대사물이 항생(antibiotic agent), 항마이코박테리아(antimycobacterial), 항바이러스(antiviral), 진통(analgesic), 해열능(antipyretic properties) 등의 다양한 생물학적 활성을 갖는다는 사실이 밝혀지고 있다.

따라서, 본 발명자들은 지의류로부터 천연 항산화제를 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과 남극 또는 고산 지역에서 서식하는 일부 지의류의 경우 열대 또는 온대 지역에서 서식하는 지의류들에 비하여 더 많은 산화적 스트레스를 극복하기 위하여 잠재적인 항산화 물질을 생산하고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 항산화 활성을 가지는 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 또는 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)의 지의류 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia)의 추출물로부터 유래한 호모세키카산 화합물 및 이를 포함하는 식품용 항산화제, 사료첨가용 항산화제, 화장품용 항산화제 또는 의약품 첨가용 항산화제 등의 산업적 용도를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 항산화 활성을 가지는 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 또는 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)의 지의류 추출물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, “지의류”는 균류(fungi)와 조류(algae) 또는/및 시아노 박테리아(cyanobacteria)의 공생 복합체로서, 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 및 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)를 말한다. 상기 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica)는 본 발명자들에 의해 남극의 킹조지섬으로부터 수집된 지의류이며, 그 외 지의류는 본 발명자들에 의해 중국 운남성(Yunnan)의 고산 지대로부터 수집된 지의류이다. 이들 지의류들은 강하고 건조한 바람, 수분과 영양분의 불규칙한 변동, 연중 강한 자외선 등의 일반 생물이 살아가기에는 부적합한 환경에서 서식하는 지의류 중의 일종이다.

본 발명에 있어서, “추출물”은 지의류로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 항산화 활성을 가지는 지의류의 대사 산물을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 “추출물”은 상기 추출액 뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에서 지의류 추출물은 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포 름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.

여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

하나의 구체적 실시예에서, 본 발명의 지의류 추출물은, 건조된 지의류, 바람직하게는 건조된 지의류의 지의체를 무게(g)의 0.1배 내지 5배, 바람직하게는 0.1배 내지 3배의 유기용매, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 헥산 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 아세톤 용매; 10 내지 40℃, 바람직하게는 15 내지 37℃ 추출 온도; 5시간 내지 15일, 바람직하게는 10시간 내지 3일의 시간; 1회 내지 5회, 바람직하게는 1회 내지 3회의 회수; 냉침, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 바람직하게는 냉침 추출 방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압 농축함으로써 수득하였다.

본 발명의 지의류 추출물은 리놀레산 과산화 억제 효과(anti-linoleic acid peroxidation activity), 유리 라디칼 소거능(free radical scavenging activity), 수퍼옥사이드 음이온 소거능(superoxide anion scavenging activity), 환원력(reducing power) 등에 있어서 열대 또는 온대에서 서식하는 지의류 추출물 및 대조군에 비하여 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 지의류 추출물은 항산화 활성이 우수하며, 천연으로부터 유래한 것이므로 안전하게 인체에 적용할 수 있을 것이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항산화 활성을 가지는 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 추출물로부터 유래한 호모세키카산(homosekikaic acid) 화합물에 관한 것이다.

상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산(homosekikaic acid) 화합물은 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia)의 추출물로부터 분리된 주요한 화합물 중의 하나이다. 또한 본 발명에 있어서, 상기 호모세키카산 화합물은 경우에 따라 호모세키카산 화합물의 약제학적, 식품학적 및 농학적으로 허용가능한 염을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 호모세키카산의 약제학적, 식품학적 및 농학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 허용 가능한 염은 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약제학적으로 허용 가능한 염으로는 이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만텔레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에 서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 약제학적, 식품학적 및 농학적으로 허용가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유기산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycolic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약제학적, 식품학적 및 농학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응 하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

하나의 구체적 예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산 화합물은 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia)의 추출물을 실리카겔 컬럼상에서 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤 등의 용매를 이용하여 분획할 수 있다. 다른 하나의 구체적 예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산 화합물은 TLC 플레이트의 활성 스팟 부분에 위치하는 실리카겔을 수집하고, 그 실리카겔을 아세톤으로 용해 및 여과하여 분리할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 지의류 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산 화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 상기 지의류 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산 화합물은 우수한 항산화 활성을 가지고 있음과 동시에 천연으로부터 유래하여 안전하므로, 항산화제로서 식품, 사료 및 화장품 등에 첨가하는 경우 이외에도 우수한 생체 내 항산화 활성을 이용한 각종 의약품으로서 사용 가능하다. 의약품으로 사용할 경우에는 본 발명의 상기 지의류 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 하며 그에 상응하는 무기 또는 유기 담체를 가하여, 고체, 반고체 또는 액체의 형태로 제제화하고 경구 투여제 뿐만 아니라 외상용 등 비경구투여 제로 제제화할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제화에는 정제, 환제, 과립제, 캡슐제, 펠렛제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제, 현탁제, 시럽제 등을 열거할 수 있으며, 비경구 투여제로는 주사제, 점적제, 수액, 연고, 스프레이제, 현탁제, 유제, 좌제 등을 들 수 있다.

본 발명의 상기 지의류 추출물 또는 상기 화학식 1로 표시되는 호모세키카산 화합물을 유효성분으로 하여 제제화하기 위하여 당업계에 공지된 방법에 따라 비교적 쉽게 제제화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색제, 착향제, 보존제, 안정제, 완충제, 현탁제 등도 당업계에 공지된 바에 따라 적당히 선별하여 사용할 수 있다.

본 발명의 항산화 활성을 가지는 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 및 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)의 지의류 추출물은 리놀레산 과산화 억제 효과(anti-linoleic acid peroxidation activity), 유리 라디칼 소거능(free radical scavenging activity), 수퍼옥사이드 음이온 소거능(superoxide anion scavenging activity), 환원력(reducing power) 등이 있어서 항산화제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 추출물로부터 항산화제 활성을 나타내는 호모세키카산 화합물을 분리하였으며, 그 호모세키카산 화합물을 항산화제로서도 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 좀더 구체적으로 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명이 좀더 이해될 수 있도록 예시적으로 제시되는 것이므로, 이들 실시예로서 본 발명의 범위를 한정해서는 안 될 것이다.

실시예 1 : 지의류 수집 및 동정

남극 반도의 남쉐틀랜드 군도에 속한 킹조지섬의 남서쪽에서 수집한 8종의 지의류(Cetraria aculeate, Cladonia furcata, Pseudephebe pubescens, Sphaerophorus globo년, Stereocaulon alpinum, Umbilicaria antarctica, Usnea antarctica 및 Usnea aurantiacoatra)(이하, 편의상 ‘남극 지의류’라 한다)와 중국 운남성(Yunnan)의 고산 지대에서 수집한 10종의 지의류(Lobaria retigera (Bory) Trevis, L. yunnanensis Yoshim., Oropogon secalonicus Essl., P. canina(L.) Willd., Peltigera praetextata(Flex Sommerf.) Vain., Pilophorus aciculare(Ach.) Th. Fr., R. conduplicans Vain., R. intermedia Delise ex Nyl., Ramalina sinensis Jatta, S. nylanderiana Zahlbr.)(이하, 편의상 ‘중국 지의류’라 한다)를 수집하였다. 8종의 남극 지의류는 김 등(2006)에 기재한 방법(Kim et al, Lichen Flora around Korean Antarctic Scientific Station, King George Island, Antartic. J Microbiol 44:480-491 (2006))에 의해 동정하여 순천대학교의 한국지의류연구센터 내에 보관하였으며, 9종의 중국 지의류는 중국 과학아카데미(Chinese Academy of Science(CAS))의 쿤밍 식물학 연구소(Kunming Institute of Botany)에서 동정하여 중국 CAS에 보관하였고, 이의 복제물을 순천대학교의 한국지의류연구센터 내에도 보관하였다.

실시예 2 : 지의류 추출물의 제조

남극 지의류 지의체를 분리하고 이를 상온 건조한 후, 지의류 지의체 5g을 200ml 아세톤으로 2번 추출하고, 실온에서 24시간 동안 진탕기(shaking attachment)에서 메탄올로 추출하였다. 그 아세톤 및 메탄올 추출물을 여과지(Whatman filter paper No.1)을 사용하여 여과하고, 40℃ 진공상태에서 회전농축기로 농축하였다. 그 농축물은 아세톤과 메탄올의 각기 다른 농도로 용해시키고, 추후 연구를 위하여 -20℃에서 동결하여 저장하였다.

또한 중국 지의류 지의체를 분리하고 이를 상온 건조한 후, 지의류 지의체 10g을 실온에서 24시간 동안 메탄올 500ml로 2번 추출하였다. 추출물을 여과지(Whatman filter paper No.1)을 사용하여 여과하고, 40℃ 진공상태에서 회전농축기로 농축하였다. 그 다음으로 농축물을 2mg extract/ml이 되도록 메탄올로 용해한 후, 추후 연구를 위하여 -20℃에서 동결하여 저장하였다.

실시예 3 : 지의류 추출물의 항산화 효과 조사

3-1. 리놀레산 과산화 억제 효과( Anti - linoleic acid peroxidation activity; ALPA ) 분석

실시예 2에서 제조한 지의류 추출물의 리놀레산 산화에 대한 억제 활성을 티오시안산염 방법(Mitsuda H, Yuasumoto K, Iwami K (1996) Antioxidant action of indole compounds during the autoxidation of linoleic acid. Eiyo Shokuryo 19:210-214)을 약간 변형하여 조사하였다. 구체적으로 100ml 트윈 20과 100ml 인산염 완충액(0.2M, pH 7.0)을 리놀레산과 혼합하고 균질화하여 리놀레산 에멀젼을 제조하였고, 그 제조된 0.5ml 리놀레산 에멀젼(0.02M, pH 7.0)에 지의류 추출물(0.1ml, 2mg/ml)과 0.5ml 인산염 완충액(0.2M, pH 7.0)을 혼합하였다. 그리고 나서 상기 혼합액(0.1ml)에 티오시안산암모늄(3%, w/v) 1ml와 FeCl₂ (0.02M, in 1 M HCl) 0.1ml를 첨가하였다. 항산화 활성은 흡광도 500nm에서 측정하였으며, 지의류 추출물이 없는 용액을 음성 대조군으로, 동일 농도의 아스코르브산이 첨가된 용액을 양성 대조군으로 사용하였다. 항산화 활성(inhibition percentage, I%)은 하기 실험식으로 계산하였으며, 이를 도 1 및 2에 나타내었다.

[실험식 1]

I% = (1-A_sample/A_blank)×100

A_blank : 음성대조군의 흡광도

A_sample : 테스트된 추출물의 흡광도

도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 남극 지의류 및 중국 지의류 추출물은 일반적으로 리놀레산 과산화에 대한 억제 활성이 매우 우수함을 나타내었다. 그 중에서, 남극 지의류 8종에 대한 메탄올 추출물 및 C. furcata 및 U. antarctica의 아세톤 추출물이 양성 대조군인 아스코르빈산에 비하여 매우 높은 활성을 나타내었으며, 중국 지의류 추출물 5종(Peltigera canina , Peltigera praetextata, Ramalina conduplicans , Ramalina intermedia , Sticta nylanderiana)이 양성 대조군인 아스코르빈산에 비하여 매우 높은 활성을 나타내었다. 또한, 중국 지의류 추출물 중 리놀레산 과산화 억제 활성이 가장 우수한 S. nylanderiana의 추출물을 24시간 간격으로 6일 동안 측정한 결과 시간에 비례하여 억제 활성을 나타내었으며, 특히 리놀레산 과산화 억제율에서 아스코르빈산은 62.4%에서 6일 후 7.8%로 감소하였으나, S. nylanderiana의 추출물은 85.5%에서 6일 후 52.7%로 감소율이 적어 여전히 리놀레산 과산화 억제 활성을 유지하고 있었다(도 3 참조). 이러한 결과들로부터 지의류 추출물은 리놀레산 과산화 억제 활성이 우수할 뿐만 아니라 안정적인 억제 활성을 유지하고 있음을 알 수 있었다.

3-2. 환원력 조사

실시예 2에서 제조한 지의류 추출물의 환원력(reducing power)은 오야이추 방법(Oyaizu M (1986) Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine. Jpn J Nutr 44:307-315)에 의해 측정되었다. 구체적으로, 지의류 추출물(0.1ml, 2mg/ml)을 0.25ml 인산염 완충액(0.2M, pH 6.6)과 0.25ml 페르시안화 칼륨(K₃Fe(CN)₆, 10g/l)과 혼합한 후, 그 혼합물을 50℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 그 후 트라이클로로아세트산(TCA) 0.15ml를 첨가하고 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액 0.3ml를 FeCl₃ (1g/l) 0.3ml와 혼합하였다. 지의류 추출물의 환원력을 반응 혼합물의 A₇₀₀ (700nm에서의 흡광도)으로 나타내었다. 추출물 없는 반응 혼합물을 음성 대조군으로 사용하였고, 동일 농도의 BHA 혼합물을 양성 대조군으로 사용하였다. 이에 대한 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 지의류 추출물의 환원력은 양성 대조군인 BHA와 비교하여 매우 우수하지는 않더라도 잠재적인 환원력이 있음을 알 수 있었다. 특히, S. nylanderiana (1.48), R. conduplicans (1.34), P. praetextata (1.04), P. canina (0.66) 순으로 환원력이 우수하였으며, 중국 지의류 추출물이 남극 지의류 추출물에 비하여 전반적으로 환원력이 우수하였다.

3-3. 유리 라디칼 소거능 ( free radical scavening activity ) 조사

실시예 2에서 제조한 지의류 추출물의 유리 라디칼 소거능을 블로이스 방법(Blois MS (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 26:1199-1200.)을 사용하여 DPPH로 측정하였다. 구체적으로, 메탄올 용액에 0.1mM의 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil; DPPH)을 혼합한 후, DPPH 용액 1ml와 0.1ml의 지의류 추출물(40㎍/㎖ 내지 330㎍/㎖의 농도 범위)을 혼합하였다. 그리고는 실온에서 30분 동안 항온처리한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 지의류 추출물 없는 혼합물을 음성 대조군으로, 동일 농도의 BHA가 혼합된 혼합물을 양성 대조군으로 하였다. SPSS 15.0 소프트웨어(회귀분석)을 이용하여 유리 라디칼 소거능을 IC₅₀(50% 억제 농도)으로 나타내었으며, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.

도 1 및 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 몇몇 지의류 추출물은 유리 라디칼 소거에 대한 높은 활성을 나타내었다. 남극 지의류 추출물 중에서 U. antarctica의 아세톤 추출물이 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 특히 U. antarctica의 아세톤 추출물은 다른 남극 지의류 추출물에 비하여 매우 낮은 농도에서도 라디칼 소거능(IC₅₀=121.3±8.4㎍/㎖)을 나타내었다. 그리고 중국 지의류 추출물 중에서 S. nylanderiana의 추출물이 가장 높은 라디칼 소거능이 가장 높았으며, 다음으로 P. praetextata, P. canina, R. conduplicans 및 R. intermedia의 추출물이 높았다. 비록 상기 지의류 추출물의 IC₅₀ 값이 BHA의 IC₅₀ 값에 비하여 높았지만, 지금까지 보고된 지의류 추출물의 라디칼 소거능(B.C. Behera et al., Determination of antioxidative potential of lichen Usnea ghattensis in vitro, Lebensm. Wiss. Technol. 39(2006) 80-85; M. Gulluce et al., Screening the antioxidant and antimicrobial properties of the lichens Parmelia saxatilis, Platismatia glauca, Ramalina pollinaria, Ramalina polymorpha and Umbilicaria nylanderiana, Phymed. 13(2006) 515-521)과 비교하여 현저하게 높은 라디칼 소거능을 나타내고 있음을 알 수 있었다.

3-4. 슈퍼옥사이드 음이온 소거능 ( superoxide anion scavening activity ) 조사

지의류 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거능은 니시미키 방법(Nishimiki M, Rao NA, Yagi K (1972) Ther occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun 46:849-853.)을 약간 변형하여 실시하였다. 구체적으로, 1ml의 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium; NBT) 용액(100mM 인산염 완충액에 100uM NBT, pH 7.4), 1ml의 NADH 용액(100mM 인산염 완충액에 468uM NADH, pH 7.4) 및 1ml의 지의류 추출물(2mg/ml)을 혼합하였다. 그 혼합물에 100ul의 페나진 메토술페이트(phenazine methosulphate; PMS) 용액(100mM 인산염 완충액에 60uM PMS, pH 7.4)을 첨가한 후, 30℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 그 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 지의류 추출물 없는 반응 혼합물을 음성 대조군으로, 동일 농도의 BHA 혼합물을 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 실시예 3에서 사용된 아스코르브산-리놀레산 검정 방식과 동일한 방법으로 슈퍼옥사이드 음이온 소거능을 I%로 하 여 조사하였으며, 이의 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 높은 슈퍼옥사이드 음이온 소거능이 지의류 추출물에서 나타났는데, U. antarctica(91.1±1.1%)가 가장 높았고, 다음으로 S. globosus(74.7±0.5%)가 높은 소거능을 나타내었다. 그리고, 이들 지의류 추출물의 슈퍼옥사이드 음이온 소거능은 양성 대조군인 BHA(86.8±2.8%)와 비교하여 더 높거나 약간 유사하였다.

3-5. 총 페놀 함량의 측정

페놀성 화합물은 이들의 산화환원반응(redox), 수소공여 및 단일의 산소 제거 성질 때문에 고수준의 항산화제로 고려된다(C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, P.G. Bolwell, P.M. Barmley, J.B. Pridham, The relative antioxidant activities of plant derived polyphenolic flavonoids, Free Radic. Res. 22 (1995) 375-383). 지의류는 뎁시드(depsides), 뎁시돈(depsidones) 및 디벤조퓨란(dibenzofurans)과 같은 수많은 페놀성 화합물을 생산하는 것으로 알려져 있다(C.F. Culberson, Chemical and Botanical Guide to Lichen Products, The University of North Carolina Press, Chapel Hill, USA, 1969; U. Zeybek, A. Yildiz, Studies on the Northeast Anatolian lichens Lobaria scrobiculata and L. pulmonaria, Sci. Pharm. 68(2000) 317322). 그러나 이들 페놀성 화합물과 지의류의 항산화 활성과 관련하여 이견이 있어 왔으므로, 본 발명자들은 중국 지의류 10종의 총 페놀 함량(Total Phenolic Contents; TPC)을 조사한 후, TPC와 리놀레산 과산화 억제 활성(anti-linoleic acid peroxidation activity; ALPA), 유리 라디칼 소거능(free radical scavenging activity; FRSA), 환원력(reducing power; RP) 사이의 관계를 Pearson's bivariate correlation test를 통하여 확인하였다.

먼저, 실시예 2에서 제조된 지의류 추출물에 용해된 총 페놀 함량은 스린카드 및 신글레톤 방법(K. Slinkard, V.L. Singleton, Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods, Am. J. Enol. Vitic. 28(1977) 49-55)에 따라 Folin-Ciocateu 시약으로 측정하였으며, 이의 대조값은 카테콜을 사용하였다. 구체적으로, 지의류 추출물(0.1ml)은 Folin-Ciocateu 시약(1: 10으로 희석됨, v/v)과 혼합하고 3분 후 Na2CO3 (7.5%, w/v) 0.4ml를 첨가하였다. 그 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 간헐적 진탕을 한 후, 765nm의 흡광도에서 총 페놀 함량을 측정하였다. 총 페놀 함량은 지의류 추출물 1mg 당 카테콜의 1mg 등가값(equivalent)으로 나타내었다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, TPC는 지의류 종들 사이에서 2.8 (L. yunnanensis)에서부터 156.1 (S. nylanderiana) ㎍ 카테콜 등가값/㎎ 추출물의 범위로 다양하게 나타났다. 또한, Pearson's bivariate correlation test에서 ALPA와 TPC, FSA와 TPC, RP와 TPC는 현저한 관련성이 있는 것으로 확인되었다(도 4 내지 6 참조).

실시예 4 : 지의류 추출물로부터 항산화 물질의 분리 및 효과 조사

4-1. 움비리카리아 안타르티카 ( Umbilicaria antarctica ) 아세톤 추출물의 라디칼 소거능에 대한 생체자가기록 TLC 검정

지의류 추출물 내의 다양한 화합물 중에서 항산화 활성 물질의 검출을 위하여 생체자가기록(bioautographic) TLC 방법을 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 생체자가기록(bioautographic) TLC 방법은 카입 방법(Chaaib F, Queiroz EF, Ndjoko K, Diallo D, Hostettmann K (2003) Antifungal and antioxidant compounds from the root bark of Fagara zanthoxyloides. Planta Med 69:316-320)에 기초하였다. 우선 항산화 효과가 우수한 U. antarctica, R. conduplicans 및 S. nylanderiana의 추출물(40㎕) 각각을 TLC 플레이트(실리카겔 60, Merck)에 점적한 후 톨루엔: 아세트산 (85:15, v/v) 용매를 처리하고 건조하였다. 그 다음으로 DPPH (4mg/ml in methanol)를 TLC 플레이트에 스프레이하고 30분 후에 검사하였다. 이에 대한 결과를 도 7 및 9에 나타내었으며, 활성 화합물은 보라색 배경에 대하여 노란 백색 스팟이다. 또한 항산화 활성이 있는 활성 화합물을 동정하기 위하여 다른 TLC 플레이트에 DPPH 대신에 10% 황산을 스프레이하여 검사하였다.

4-2. 활성 화합물의 HPLC 분석

생체자가기록 TLC는 동일 용매로 처리된 TLC 플레이트 상의 항산화 화합물의 위치를 나타내는데 사용된다. 따라서 활성 스팟 부분에 위치하는 실리카겔을 수집하고, 이를 아세톤으로 용해하였다. 그 후 이를 여과시킨 후 HPLC 분석을 하였다. HPLC (LC-10AT, Shimadzu, Japan) 분석은 다음과 같은 조건에서 실시하였다: 컬럼, YMC-PAck ODS-AS-5um 150×4.6mm I.D. (Co.); 용매계, MeOH: H2O: H3PO4 (80: 20: 1, v/v); 유속, 1ml/min; PDA, range 254-400nm; 온도, 40℃. 지의류 유래 물질은 대조 물질과 잔류 시간 및 UV 스펙트럼 데이터를 비교하여 동정되었다 (Yoshimura I, Kinoshita Y, Yamamoto Y, Huneck S, Yamada Y (1994) Analysis of secondary metabolites from lichen by high performance liquid chromatography with a photodiode array detector. Phytochem Anal 5:197-205).

4-3. 실험 결과

도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, U. antarctica 추출물의 생체자가기록 TLC 실험 결과 스팟 A와 스팟 B가 검출되었다. 그 중 스팟 A는 스팟 B에 비하여 상대적으로 뚜렷하였다. 이는 스팟 A가 U. antarctica의 주요 항산화 화합물의 하나임을 의미한다. 스팟 A을 동정하기 위하여 TLC 플레이트에 DPPH 대신에 10% 황산을 스프레이하고, 자외선과 가시광선으로 Rf 값 및 색 정도를 확인하고 동정한 결과, 스팟 A는 레카노르산(lecanoric acid)으로 확인되었다. 또한 HPLC 분석 및 자외선 흡광광도계에 의해서도 스팟 A는 레카노르산임을 확인하였다(도 8 참조).

도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, R. conduplicans의 주요 항산화 화합물은 스팟 A 및 B이고, S. nylanderiana의 주요 항산화 화합물은 스팟 C임을 확인하였 다. 상기와 동일하게 TLC, HPLC 및 자외선 흡광광도계를 이용하여 확인한 결과, 스팟 A는 호모세키카산(homosekikaic acid), 스팟 B는 세키카산(sekikaic acid), 스팟 C는 레카노르산(lecanoric acid)임을 확인하였다(도 10 및 도 11, 도 8 참조).

도 1은 남극 지의류의 메탄올 또는 아세톤 추출물에 대한 유리 라디칼 소거능(free radical scavenging activity; FRSA), 리놀레산 과산화 억제 활성(anti-linoleic acid peroxidation activity; ALPA), 슈퍼옥사이드 음이온 소거능(superoxide anion scavenging activity; SSA), 환원력(reducing power; RP)을 조사하고 나타낸 그림이다.

도 2는 중국 지의류의 아세톤 추출물에 대한 유리 라디칼 소거능(free radical scavenging activity; FRSA), 리놀레산 과산화 억제 활성(anti-linoleic acid peroxidation activity; ALPA), 환원력(reducing power; RP) 및 총 페놀 함량(total phenolic contents; TPC)을 조사하고 나타낸 그림이다.

도 3은 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana) 추출물의 리놀레산 과산화 억제 활성을 6일 동안 관찰한 그림이며, 선은 아스코르빈산(AA; ■)과 스틱타 나란데리아나(LE; □)의 시간에 대한 억제 활성을 나타낸다. AA: 아스코르빈산, LE : 스틱타 니란데리아나 추출물, Con. : 음성 대조군.

도 4는 10종의 중국 지의류 추출물에서 ALPA와 TPC의 관계를 나타낸 그림이다(r=0.915, **: p<0.01).

도 5는 10종의 중국 지의류 추출물에서 FRSA와 TPC의 관계를 나타낸 그림이다(r=0.763, * : p<0.05).

도 6은 10종의 중국 지의류 추출물에서 RP와 TPC의 관계를 나타낸 그림이다(r=0.807, ** : p<0.01).

도 7은 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica)의 아세톤 추출물에 대한 생체자가기록 TLC 분석을 한 그림이다(플레이트 a : DPPH 메탄올 용액을 스프레이한 TLC 플레이트, 플레이트 b : 10% 황산을 스프레이하고 가시광선을 조사한 TLC 플레이트, 플레이트 c : 10% 황산을 스프레이하고 자외선을 조사한 TLC 플레이트, 스팟 A: 레카노르산, 스팟 B : 미지 화합물).

도 8은 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica)의 아세톤 추출물에 대한 HPLC 크로마토그램 및 레카노르산의 자외선 흡광광도계를 이용하여 조사한 그림이다.

도 9는 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans; lane R) 및 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana; lane S)의 아세톤 추출물에 대한 생체자가기록 TLC 분석을 한 그림이다(플레이트 a : DPPH 메탄올 용액을 스프레이한 TLC 플레이트, 플레이트 b : 10% 황산을 스프레이하고 가시광선을 조사한 TLC 플레이트, 플레이트 c : 10% 황산을 스프레이하고 자외선을 조사한 TLC 플레이트, 스팟 A: 호모세키카산, 스팟 B : 세키카산, 스팟 C : 레카르노산).

도 10은 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans)의 아세톤 추출물에 대한 HPLC 크로마토그램 및 레카노르산의 자외선 흡광광도계를 이용하여 조사한 그림이다. 3번째 피크(RT=7.502min) 및 4번째 피크(RT=13.296min)은 테스트된 시료의 주요 성분이다(1번째 피크(RT=1.833)는 아세톤임).

도 11은 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)의 아세톤 추출물에 대한 HPLC 크로마토그램 및 레카노르산의 자외선 흡광광도계를 이용하여 조사한 그림이 다. 3번째 피크(RT=2.790min)은 테스트된 시료의 주요 성분이다(1번째 피크(RT=1.820min)는 아세톤임).

Claims

항산화 활성을 가지는 움비리카리아 안타르티카(Umbilicaria antarctica), 펠티게라 카니나(Peltigera canina), 펠티게라 프라에텍스타타(Peltigera praetextata), 라마리나 콘두프리칸스(Ramalina conduplicans), 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 및 스틱타 니란데리아나(Sticta nylanderiana)로 이루어진 군으로부터 선택된 지의류의 추출물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로부터 추출한 것인 지의류의 추출물.
제1항에 있어서, 라마리나 인터메디아(Ramalina intermedia) 추출물은 호모세키카산 화합물을 포함하는 것인 지의류의 추출물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지의류 추출물을 식품첨가제, 사료첨가제, 화장품 및 의약품 중 선택된 어느 하나의 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는 지의류의 추출물.
호모세키카산 화합물을 포함하는 식품용 항산화제.
호모세키카산 화합물을 포함하는 사료첨가용 항산화제.
호모세키카산 화합물을 포함하는 화장품용 항산화제.
호모세키카산 화합물을 포함하는 의약품 첨가용 항산화제.