KR20110018178A - Compound isolated from the bark of phellodendron amurense, isolating method of thereof and application - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 황벽나무 수피로부터 분리한 화합물, 이의 분리방법 및 상기 화합물의 용도에 관한 것으로 보다 상세하게는 황벽나무 수피로부터 분리한 하기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물, 이의 분리방법 및 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a compound separated from the bark of bark, a method for separating the same, and the use of the compound. More specifically, the compound of the following structural formulas (1) to (5) separated from the bark of bark; It relates to the use of the compound.
.....구조식(1) ..... Structure (1)
.....구조식(2) ..... Structure (2)
.....구조식(3) ..... Structure (3)
.....구조식(4) ..... Structure (4)
.....구조식(5) ..... Structure (5)
황벽나무(Phellodendron amurense)는 운향과(Rutaceae)의 낙엽교목으로 높이는 10m에 달하며 수피는 회색 또는 회갈색으로 깊이 갈라지고 코르크층이 잘 발달해 있다. 초여름에 길이 6∼8 ㎝의 원뿔꽃차례로 작은 꽃이 여러 개 달리고, 열매는 공모양으로 지름 약 1 ㎝의 핵과로 검게 익으며 그 속에 5핵과 5개의 씨가 들어 있다. 코르크층을 제거하여 납작하게 건조시킨 수피를 황벽이라 하여 건위제(健胃劑)로 사용하였고, 수피의 내피는 주로 염색에 이용하였다(김태욱, 1996). 잎 뒷면에 융모(絨毛)가 있는 것을 털황벽(P. molle Nak.), 소엽이 3∼5쌍인 것을 섬황벽(P. insulare Nak.), 코르크층이 얇고 연모(緣毛)가 적은 것을 넓은잎황벽(P. sachalinense Sarg.)이라고 한다. Phellodendron amurense is a deciduous arboreous tree of Rutaceae, reaching 10m in height, bark deeply divided into gray or greyish brown, and cork layer well developed. Conical inflorescences 6-8 ㎝ long in early summer, several small flowers are running, the fruit is ball-shaped and ripened into a core of about 1 ㎝ in diameter and contains 5 cores and 5 seeds. The bark dried flat by removing the cork layer was used as a dry agent as a yellow wall, and the inner skin of the bark was mainly used for dyeing (Kim Tae-wook, 1996). The hairs on the back of the leaves have villus ( P. molle Nak.), 3 ~ 5 pairs of lobule ( P. insulare Nak.), Thin cork layer and less bristles It is called P. sachalinense Sarg.
황벽나무의 목재는 건축, 가구, 기구, 상자 등의 재료 및 가로수로도 식재되었고, 씨는 쓴맛이 있고 약용이나 살충제로도 사용하였으며 한국을 비롯하여 중국 동북부, 일본 등에 분포하고 있다(이창복, 1993). 황벽나무 수피의 약리작용에 대한 주성분은 식물성 염기인 berberine이며 염색 할때의 황색색소 성분도 마찬가지이다. The wood of yellow wall trees was also planted as a building, furniture, utensils, boxes, etc., and the seeds were bitter, used as medicinal and insecticides, and distributed in Korea, northeastern China, and Japan (Lee Chang-bok, 1993). . The main component of the pharmacological action of the bark of the yellow bark is the berberine, which is a vegetable base.
황벽나무에 대한 연구로는 이종구 등(2007)은 황백(黃柏)으로부터 멜라닌 생합성 억제 물질을 분리하여 B-16 melanoma cell line에서의 멜라닌 생성 저해 활성을 측정한 것을 보고(이종구, 최지영, 오준석, 정희욱, 최은향, 이희상, 김정아, 장태수, 손종근, 이승호. 2007. 황백(黃柏)으로부터 멜라닌 생합성 억제 물질의 분리. 생약학회지 38(4): 387-393.)하였다. 또한 Ikuta 등(1998)은 황벽나무의 수피로부터 새로운 화합물인 7,8-dehydrorutaecarpine 외에 6개의 알칼로이드 계열의 화합물을 단리하여 보고(Ikuta, A., T. Nakamura, and H. Urabe. 1998. Indolopyridoquinazoline, Furoquinoline and Canthinone Type Alkaloids from Phellodendron Amurense Callus Tissues. Phytochemistry 48(2): 28-291.)하였다. Lee 등(2006)은 약용식물의 glutathione S-transferase(GST) 활성 화합물의 특성을 조사하는 연구에서 황벽나무가 174.8%로 가장높은 GST 활성을 나타냈다고 보고(Lee, J. H., D. H. Lee, H. E. Yu, J. H. Kim and J. S. Lee. 2006. Isolation and characterization of a novel glutathione S-transferase-activating peptide from the oriental medicinal plant Phellodendron amurense. PEPTIDES 27: 2069-2074.)하였으며, Kishi 등(1992)은 황벽나무의 열매로부터 7 개의 tirucallanes triterpenoid와 함께 2 개의 새로운 화합물인 kihadalactone A와 B를 단리하여 보고(Kishi, K., K. Yoshikawa and S. Arihara. 1992. Limonoids and protolimonoids from the fruits of Phellodendron amurense. Phytochemistry 31(4): 1335-1338.)하였다. Ida 등(1994)은 황벽나무의 수피로부터 9 개의 페놀성 화합물을 비롯하여 glycosides of (±)-5,5'-dimethoxylariciresinol, 2(p-hydroxy-phenyl)-ethanol, N-methylhigenamine을 단리하여 보고(Ida, Y., Y. Satoh, M. Ohtsuka, M. Nagsao and J. Shoji. 1994. Phenolic constituents of Phellodendron amurense bark. Phytochemistry 35(1): 209-215.)하였으며 Kim과 Park (2007)은 황벽나무 천연염료를 이용하여 면섬유에 음이온성과 가소성을 가지는 작용기를 적용하여 염색함으로써 면직물에 대한 염색성을 향상시키는 연구를 수행하여 보고(Kim, H. and S. Park. 2007. Effects of introduced chemical groups on the dyeability of cotton fabrics with Phellodendron amurense Rupr.. Dyes and Pigments 75: 351-355.)하였다.As a study on the yellow bark tree, Lee Jong-gu et al. (2007) reported that melanin biosynthesis inhibitors were isolated from Hwangbaek (黄柏) and measured melanin production inhibitory activity in the B-16 melanoma cell line (Lee Jong-gu, Ji-young Choi, Jun-seok Oh, Hee-wook Jung , Choi Eun-hyang, Hee-sang Lee, Jung-a Kim, Tae-soo Jang, Jong-geun Son, Seung-ho Lee 2007. Isolation of Melanin Biosynthesis Inhibitors from Hwangbaek. Ikuta et al. (1998) also reported the isolation of six alkaloid compounds in addition to the new compound, 7,8-dehydrorutaecarpine, from the bark of the yellow bark (Ikuta, A., T. Nakamura, and H. Urabe. 1998. Indolopyridoquinazoline, Furoquinoline and Canthinone Type Alkaloids from Phellodendron Amurense Callus Tissues.Phytochemistry 48 (2): 28-291.). Lee et al. (2006) reported that yellow bark showed the highest GST activity of 174.8% in a study examining the properties of glutathione S-transferase (GST) active compounds in medicinal plants (Lee, JH, DH Lee, HE Yu, JH Kim and JS Lee. 2006.Isolation and characterization of a novel glutathione S-transferase-activating peptide from the oriental medicinal plant Phellodendron amurense.PEPTIDES 27: 2069-2074.), And Kishi et al. (1992) Two new compounds, kihadalactone A and B, along with seven tirucallanes triterpenoids were isolated (Kishi, K., K. Yoshikawa and S. Arihara. 1992. Limonoids and protolimonoids from the fruits of Phellodendron amurense . Phytochemistry 31 (4) : 1335-1338.) Ida et al. (1994) reported the isolation of glycosides of (±) -5,5'-dimethoxylariciresinol, 2 ( p -hydroxy-phenyl) -ethanol, and N -methylhigenamine, including nine phenolic compounds from the bark of a yellow bark. Ida, Y., Y. Satoh, M. Ohtsuka, M. Nagsao and J. Shoji. 1994. Phenolic constituents of Phellodendron amurense bark.Phytochemistry 35 (1): 209-215.), And Kim and Park (2007) Kim, H. and S. Park. 2007. Effects of introduced chemical groups on the dyeing of cotton fabric by applying functional groups having anionic properties and plasticity to cotton fiber dyeability of cotton fabrics with Phellodendron amurense Rupr .. Dyes and Pigments 75: 351-355.
황벽나무는 예로부터 한방과 민간요법의 소재로 사용되어 왔으며 황색 색소성분을 함유하고 있는 황벽나무에 대한 많은 연구가 수행되었지만, 아직 그 추출성 분을 이용하여 화장품 소재에 적용시키고자 하는 연구는 수행되어 있지 않고 있다.Yellow wall has been used for herbal medicine and folk medicine since ancient times, and many researches have been carried out on yellow wall trees containing yellow pigments. It is not done.
최근 소득의 증가 및 생활수준의 향상 등으로 인하여 건강에 대한 인식이 높아지면서 웰빙에 대한 관심이 크게 증가되고 있으며 아울러 인체에 이롭고 해가 없는 천연물에 대한 관심 또한 크게 증가함에 따라 천연소재에 관련된 연구도 매우 활발하게 이루어지고 있다. 따라서 본 발명은 황벽나무 수피의 추출성분을 분리하고 다양한 생리활성 시험을 통하여 기초자료를 확립하고자 하였으며 또한, 그러한 자료를 토대로 천연색소 및/또는 기능성 소재로서 기능성 화장품 첨가 소재로 응용하고자 한다.Recently, interest in well-being has increased due to rising awareness of health due to rising incomes and living standards, and research on natural materials has also increased as interest in natural products that are beneficial and harmless to humans has also increased. It is very active. Therefore, the present invention intends to establish the basic data by separating the extract components of the bark of bark tree and various physiological activity tests, and also to apply the functional cosmetic additives as natural pigments and / or functional materials based on such data.
본 발명은 황벽나무 수피로부터 유용한 성분을 분리한 화합물, 이의 분리방법 및 상기 화합물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a compound, a method for separating the same, and the use of the compound, which has been isolated from the bark of bark.
본 발명은 황벽나무 수피로부터 분리한 하기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물, 이의 분리방법 및 상기 화합물의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a compound of the following structural formulas (1) to (5) separated from yellow bark bark, a separation method thereof, and a use of the compound.
.....구조식(1) ..... Structure (1)
.....구조식(2) ..... Structure (2)
.....구조식(3) ..... Structure (3)
.....구조식(4) ..... Structure (4)
.....구조식(5) ..... Structure (5)
본 발명에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 항산화효과, 미백효과 등의 효과가 있어 화장품의 소재로 사용될 수 있다.Compounds of the above formulas (1) to (5) separated from the bark of the bark by the present invention can be used as a material of cosmetics because there is an effect such as antioxidant effect, whitening effect.
본 발명에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 항산화효과, 미백효과 이외에 피부암세포에 대한 독성을 지니고 있어 검버섯이나 노인성 색소침착에 대한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어 화장품, 특히 노인성 화장품 등의 기능성 첨가제로서의 역할을 할 수 있다.Compounds of the above formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark by the present invention is toxic to skin cancer cells in addition to the antioxidant effect, whitening effect, and may exhibit an effect on blotch or senile pigmentation It can be judged that it can serve as a functional additive, such as cosmetics, especially aging cosmetics.
본 발명은 황벽나무 수피로부터 분리한 하기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물을 나타낸다.The present invention represents the compounds of the following structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of yellow bark.
본 발명은 황벽나무 수피로부터 분리한 하기 구조식(1) 내지 구조식(5) 중에서 선택된 어느 하나의 화합물을 나타낸다.The present invention represents any one compound selected from the following structural formulas (1) to (5) isolated from bark of bark.
.....구조식(1) ..... Structure (1)
.....구조식(2) ..... Structure (2)
.....구조식(3) ..... Structure (3)
.....구조식(4) ..... Structure (4)
.....구조식(5) ..... Structure (5)
상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물에 있어서, 구조식(1)의 화합물은 페룰산(ferulic acid)을 나타내고, 구조식(2)의 화합물은 프로토카테추익산(protocatechuic acid)을 나타내고, 구조식(3)의 화합물은 프로토카테추익산바닐산(vanillic acid)을 나타내고, 구조식(4)의 화합물은 베르베린(berberin)을 나타내고, 구조식(5)의 화합물은 리모닌(limonin)을 나타낸다.In the compounds of the formulas (1) to (5), the compound of formula (1) represents ferulic acid, the compound of formula (2) represents protocatechuic acid, The compound of (3) represents vanillic acid, protocatechuic acid vanillic acid, the compound of formula (4) represents berberin, and the compound of formula (5) represents limonin.
본 발명은 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 분리방법을 나타낸다.The present invention shows a method for separating the compounds of the formulas (1) to (5) from the bark of bark.
본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(1) 내지 구조식(3)의 화합물의 분리방법은 황벽나무 수피를 증류수로 추출하고 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물을 물 가용부로 분획하는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 대해 칼럼크로마토그래피를 실시하여 분리순서에 의해 PAW-1 내지 PAW-3의 3개 부분의 분리물을 얻는 단계; 및 상기 3개의 분리물 중 PAW-3을 MeOH-H2O(1:1, 1:3, v/v)의 용출용매로 하여 연속적인 칼럼크로마토그래피 를 실시하여 PAW-3-2에서 하기 구조식(2)의 프로토카테추익산(protocatechuic acid)을 얻거나, PAW-3-31에서 하기 구조식(3)의 바닐산(vanillic acid)을 얻거나 또는 PAW-3-32에서 구조식(1)의 페룰산(ferulic acid)을 얻을 수 있다.Separation method of the compounds of the formulas (1) to (3) from the bark of bark of the present invention comprises the steps of extracting the bark of bark with distilled water and concentrating to obtain a bark of bark concentrate; Fractionating the yellow bark concentrate into a water soluble portion; Performing column chromatography on the water soluble portion of the bark concentrate of the yellow bark to obtain a separation of three portions of PAW-1 to PAW-3 in a separation order; And PAW-3 of the three isolates was subjected to continuous column chromatography using MeOH-H 2 O (1: 1, 1: 3, v / v) as an eluting solvent to obtain PAW-3-2. Protocatechuic acid of (2) is obtained, vanillic acid of the following structural formula (3) is obtained from PAW-3-31, or ferrule of structural formula (1) is obtained from PAW-3-32. You can get ferulic acid.
.....구조식(1) ..... Structure (1)
.....구조식(2) ..... Structure (2)
.....구조식(3) ..... Structure (3)
상기에서 본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(1) 내지 구조식(3)의 화합물의 분리시, 황벽나무 수피 농축물은 황벽나무 수피 1kg에 대하여 4.5리터(ℓ)의 증류수로 냉수추출하고 상기 냉수추출물의 함량이 0.8∼1.2리터(ℓ), 바람직하게는 1리터(ℓ)가 되도록 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻을 수 있다. 이때 황벽나무 수피는 절단기 또는 분쇄기로 절단하거나 분쇄하여 크기가 5∼10mm로 절단 및/또는 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 또한 이와 같이 절단 및/또는 분쇄한 황벽나무 수피를 증류수에 넣고 20∼26℃에서 40∼80시간 동안, 바람직하게는 25∼26℃에서 70∼75시간 동안 냉수추출할 수 있다.Upon separation of the compounds of the above formulas (1) to (3) from the bark of the present invention, the bark concentrate is cold water extracted with 4.5 liter (L) of distilled water per 1 kg of the bark of the bark and the cold water. The yellow bark concentrate can be obtained by concentrating the extract to 0.8 to 1.2 liter (l), preferably 1 liter (l). At this time, the bark of the yellow bark may be cut or crushed by a cutter or a grinder to cut and / or crushed to a size of 5 ~ 10mm. The cut and / or crushed yellow bark bark may be placed in distilled water for cold water extraction at 20 to 26 ° C. for 40 to 80 hours, preferably at 25 to 26 ° C. for 70 to 75 hours.
상기에서 칼럼크로마토그래피는 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20, Merck)을 충진물질로 충진된 것을 사용할 수 있다.In the above column chromatography may be used to fill the Sephadex LH-20 (Sephadex LH-20, Merck) with a filling material.
상기에서 칼럼크로마토그래피는 메탄올 수용액(MeOH:H2O=3:1, v/v)을 용출용매로 사용할 수 있다.In the column chromatography, an aqueous methanol solution (MeOH: H 2 O = 3: 1, v / v) may be used as the elution solvent.
상기에서 칼럼크로마토그래피는 충진물질로 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20, Merck)을 사용하고, 용출용매로 메탄올 수용액(MeOH:H2O=3:1, v/v)을 사용할 수 있다.In the column chromatography, Sephadex LH-20 (Mephadex LH-20, Merck) may be used as a filling material, and an aqueous methanol solution (MeOH: H 2 O = 3: 1, v / v) may be used as the elution solvent. .
본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(4)의 화합물의 분리방법은 황벽나무 수피를 증류수로 추출하고 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물을 물 가용부로 분획하는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 묽은 염산을 첨가한 다음 항온수조에서 반응시킨 후 생성된 침전물을 재결정법으로 정제하여 하기 구조식(4)의 베르베린(berberin)을 얻을 수 있다. Separation method of the compound of formula (4) from the yellow bark bark of the present invention comprises the steps of extracting the yellow bark bark with distilled water and concentrating to obtain a yellow bark bark concentrate; Fractionating the yellow bark concentrate into a water soluble portion; Dilute hydrochloric acid is added to the water soluble portion of the bark concentrate of the yellow bark, and then reacted in a constant temperature water bath. The resulting precipitate is purified by recrystallization to obtain berberin of the formula (4).
.....구조식(4) ..... Structure (4)
상기에서 본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(4)의 화합물의 분리시, 황벽나무 수피 농축물은 황벽나무 수피 1kg에 대하여 4.5리터(ℓ)의 증류수로 냉수추출하고 상기 냉수추출물의 함량이 0.8∼1.2리터(ℓ), 바람직하게는 1리터(ℓ)가 되도록 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻을 수 있다. 이때 황벽나무 수피는 절단기 또는 분쇄기로 절단하거나 분쇄하여 크기가 5∼10mm로 절단 및/또는 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 또한 이와 같이 절단 및/또는 분쇄한 황벽나무 수피를 증류수에 넣고 20∼26℃에서 40∼80시간 동안, 바람직하게는 25∼26℃에서 70∼75시간 동안 냉수추출할 수 있다.When separating the compound of formula (4) from the yellow bark bark of the present invention, the yellow bark bark concentrate is extracted with 4.5 liters (L) of distilled water with respect to 1 kg of yellow bark bark and the cold water extract content is 0.8 Concentrate to ˜1.2 liter (L), preferably 1 liter (L) to obtain a yellow bark concentrate. At this time, the bark of the yellow bark may be cut or crushed by a cutter or a grinder to cut and / or crushed to a size of 5 ~ 10mm. The cut and / or crushed yellow bark bark may be placed in distilled water for cold water extraction at 20 to 26 ° C. for 40 to 80 hours, preferably at 25 to 26 ° C. for 70 to 75 hours.
상기에서 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 묽은 염산을 첨가하고 반응시킬 때 물 가용부 200㎖에 대하여 묽은 염산 8∼12㎖g을 첨가하고 2∼3시간 동안, 바람직하게는 묽은 염산 10㎖g을 첨가하고 2.5시간 동안 반응시킬 수 있다.When dilute hydrochloric acid is added to the water soluble part of the yellow bark bark concentrate and reacted above, 8-12 ml g of dilute hydrochloric acid is added to 200 ml of the water soluble part, and for 2 to 3 hours, preferably 10 ml g of dilute hydrochloric acid is used. Can be added and reacted for 2.5 hours.
상기에서 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 묽은 염산을 첨가시 묽은 염산은 1∼5% 농도의 묽은 염산, 바람직하게는 3% 농도의 묽은 염산을 사용할 수 있다.When dilute hydrochloric acid is added to the water soluble portion of the bark bark concentrate, the dilute hydrochloric acid may be diluted hydrochloric acid at a concentration of 1 to 5%, preferably dilute hydrochloric acid at a concentration of 3%.
상기에서 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 묽은 염산을 첨가한 다음 항온수조에서 반응시 항온수조의 온도는 35∼45℃를 유지하여 반응시킬 수 있다.Dilute hydrochloric acid is added to the water soluble portion of the bark concentrate of the yellow bark, and the temperature of the constant temperature bath can be reacted by maintaining the temperature in the constant temperature bath at 35 to 45 ° C.
상기에서 황벽나무 수피 농축물의 물 가용부에 묽은 염산을 첨가한 다음 항온수조에서 반응시 항온수조의 온도는 40℃를 유지하여 반응시킬 수 있다.When dilute hydrochloric acid is added to the water soluble part of the bark concentrate of the yellow bark, the temperature of the constant temperature bath can be reacted while maintaining the temperature in the constant temperature bath.
본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(4)의 화합물의 분리방법은 황벽나무 수피를 증류수로 추출하고 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물을 에틸 아세테이트 가용부로 분획하는 단계; 상기 황벽나무 수피 농축물의 에틸 아세테이트 가용부를 농축하여 생성된 침전물을 재결정법으로 정제하여 하기 구조식(5)의 리모닌(limonin)을 얻을 수 있다.Separation method of the compound of formula (4) from the yellow bark bark of the present invention comprises the steps of extracting the yellow bark bark with distilled water and concentrating to obtain a yellow bark bark concentrate; Fractionating the yellow bark concentrate with an ethyl acetate soluble portion; The precipitate produced by concentrating the ethyl acetate soluble part of the yellow bark bark concentrate may be purified by recrystallization to obtain limonin of the following structural formula (5).
.....구조식(5) ..... Structure (5)
상기에서 본 발명의 황벽나무 수피로부터 상기 구조식(5)의 화합물의 분리시, 황벽나무 수피 농축물은 황벽나무 수피 1kg에 대하여 4.5리터(ℓ)의 증류수로 냉수추출하고 상기 냉수추출물의 함량이 0.8∼1.2리터(ℓ), 바람직하게는 1리터 (ℓ)가 되도록 농축하여 황벽나무 수피 농축물을 얻을 수 있다. 이때 황벽나무 수피는 절단기 또는 분쇄기로 절단하거나 분쇄하여 크기가 5∼10mm로 절단 및/또는 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 또한 이와 같이 절단 및/또는 분쇄한 황벽나무 수피를 증류수에 넣고 20∼26℃에서 40∼80시간 동안, 바람직하게는 25∼26℃에서 70∼75시간 동안 냉수추출할 수 있다.Upon separation of the compound of formula (5) from the yellow bark bark of the present invention, the yellow bark bark concentrate is extracted with 4.5 liter (L) of distilled water with respect to 1 kg of yellow bark bark and the cold water extract content is 0.8 Concentrate to ˜1.2 liter (L), preferably 1 liter (L) to obtain a bark concentrate. At this time, the bark of the yellow bark may be cut or crushed by a cutter or a grinder to cut and / or crushed to a size of 5 ~ 10mm. The cut and / or crushed yellow bark bark may be placed in distilled water for cold water extraction at 20 to 26 ° C. for 40 to 80 hours, preferably at 25 to 26 ° C. for 70 to 75 hours.
본 발명은 상기 황벽나무 수피로부터 분리한 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 함유하는 화장품을 포함한다.The present invention includes cosmetics containing any one or more compounds selected from the group of the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of the yellow bark.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 함유하는 화장품을 포함한다.The present invention includes cosmetics containing any one or more compounds selected from the group of the compounds of the formulas (1) to (5) separated from the bark of bark by the above-mentioned method.
상기에서 화장품은 미백효과를 지닌 화장품일 수 있다.The cosmetic may be a cosmetic having a whitening effect.
상기에서 화장품은 검버섯 제거의 기능을 지닌 노인용 화장품일 수 있다.In the above cosmetics may be a cosmetic for the elderly having the function of removing blotch.
상기에서 화장품은 노인성 색소침착 제거의 기능을 지닌 노인용 화장품일 수 있다.In the above cosmetics may be a cosmetic for the elderly having the function of removing the aging pigmentation.
상기에서 화장품은 검버섯 제거 및/또는 노인성 색소침착 제거의 기능을 지닌 노인용 화장품일 수 있다.In the above cosmetics may be a cosmetic for the elderly having the function of removing the blotch and / or aging pigmentation.
본 발명의 황벽나무 수피로부터 분리한 화합물, 이의 분리방법에 대해 다양 한 조건에 의해 조사한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 화합물, 이의 분리방법을 제공하는 것이 바람직하다.The compound isolated from the bark of the present invention, the separation method thereof was investigated under various conditions, in order to achieve the object of the present invention, the compound separated from the bark of bark by the conditions mentioned above, the separation method thereof It is desirable to provide.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Test Examples. However, these are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1>≪ Example 1 >
황벽나무 수피 2kg을 7mm 크기로 분쇄 후 상온에서 9리터(ℓ)의 증류수에 첨가하고 25℃에서 72시간(3일) 동안 냉수추출을 한 다음 상기 냉수추출물이 1ℓ가 되도록 농축하였으며, 농축된 황벽나무 수피 추출물은 분획깔때기를 이용하여 헥산(hexane) 가용부, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 가용부 및 물 가용부로 각각 분획하였다.2kg of yellow bark bark was crushed into 7mm size and added to 9 liters of distilled water at room temperature, followed by cold water extraction at 25 ° C. for 72 hours (3 days), and the cold water extract was concentrated to 1 L. Tree bark extract was fractionated into hexane soluble part, ethyl acetate soluble part and water soluble part using a separatory funnel.
상기에서 얻은 황벽나무 수피의 물 가용부(95.8g)에 대하여 충진물질로는 Sephadex LH-20 (Merck)을 사용하였고, MeOH-H2O(3:1, v/v)을 용출용매로 사용한 칼럼크로마토그래피를 실시하여 분리순서에 의해 3개의 부분으로 분리하였으며 PAW로 표기하였다. PAW-3을 MeOH-H2O(1:1, 1:3, v/v)으로 연속적인 칼럼크로마토그래피를 실시하여 PAW 3-2에서 하기 구조식(2)의 프로토카테추익산(Protocatechuic acid, 21mg)을 얻었으며, PAW-3-31에서 하기 구조식(3)이 발린산(Vanillic acid, 27mg)을 얻었으며, PAW-3-32에서 하기 구조식(1)의 페눌산(Ferulic acid, 58 mg)을 얻었다. Sephadex LH-20 (Merck) was used as a filler for the water soluble part (95.8 g) of the bark of the bark obtained above, and MeOH-H 2 O (3: 1, v / v) was used as the elution solvent. Column chromatography was performed to separate the three parts according to the separation order, which was designated as PAW. PAW-3 was subjected to continuous column chromatography with MeOH-H 2 O (1: 1, 1: 3, v / v) to protocatechuic acid of the following formula (2) in PAW 3-2 21 mg), and PAW-3-31 obtained the following formula (3) to obtain Valinic acid (Vanillic acid, 27 mg), and PAW-3-32 represented the following formula (1) by phenolic acid (Ferulic acid, 58 mg). )
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(1) 내지 구조식(3)의 화합물의 확인은 Cellulose F(20×20cm, Merck) TLC plate를 사용하여 박층크로마토그래피를 실시하였다. 이때 전개용매는 t-butanol:acetic acid:H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% HOAc(solvent B)를 사용하였으며 UV램프(Beckman Du-70)로 254nm에서 관찰하였다. In the above, the compounds of the formulas (1) to (3) isolated from the bark of the bark were identified by thin layer chromatography using Cellulose F (20 × 20 cm, Merck) TLC plate. The developing solvent used t -butanol: acetic acid: H 2 O (3: 1: 1, v / v, TBA (solvent A)) and 6% HOAc (solvent B) and UV lamp (Beckman Du-70) It was observed at 254nm.
.....구조식(1) ..... Structure (1)
.....구조식(2) ..... Structure (2)
.....구조식(3) ..... Structure (3)
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(1) 내지 구조식(3)인 단리 화 합물의 구조 분석은 Bruker Advance DPX 400 ㎒ spectrometor (Germany)를 사용하여 1H--NMR(400㎒), 13C-NMR(100㎒)을 분석하였고, 2D-NMR인 DEPT, COSY, HMBC 등을 분석하였으며 분석용매는 CD3OD 및 DMSO를 사용하였다. 질량 분석은 EI-MS를 사용하여 분자량을 측정하여 하기 (A) 내지 (C)에 이들의 측정결과를 나타내었다. Structural analysis of the isolated compounds of the formulas (1) to (3) isolated from the bark of the yellow bark was performed using Bruker Advance DPX 400 MHz spectrometor (Germany) for 1 H--NMR (400MHz), 13 C- NMR (100MHz) was analyzed, DEPT, COSY, HMBC, etc., 2D-NMR were analyzed, and CD 3 OD and DMSO were used as analytical solvent. Mass spectrometry measured the molecular weight using EI-MS and showed the result of these measurement in following (A)-(C).
(A)구조식(1)의 화합물인 Ferulic acid (125.3㎎)(A) Ferulic acid (125.3 mg), a compound of formula (1)
EI-MS m/z : 194 ([M]+, Base ion), 179, 133, 105, 77.EI-MS m / z: 194 ([M] + , Base ion), 179, 133, 105, 77.
1H-NMR (400 ㎒, δ, CD3OD) : 3.88 (3H, s, H-OCH3), 6.31 (1H, d, J = 15.76 ㎐, H-8), 6.81 (1H, d, J = 8.11 ㎐, H-5), 6.86 (1H, d, J = 8.46 ㎐, H-5'), 7.06 (1H, dd, J = 1.90 ㎐ and J = 8.20 ㎐, H-6), 7.17 (1H, d, J = 1.89 ㎐, H-2), 7.59 (1H, d, J = 15.89 ㎐, H-7). 1 H-NMR (400 MHz, δ , CD 3 OD): 3.88 (3H, s , H-OCH 3 ), 6.31 (1H, d , J = 15.76 Hz, H-8), 6.81 (1H, d , J = 8.11 kPa, H-5), 6.86 (1H, d , J = 8.46 kPa, H-5 '), 7.06 (1H, dd , J = 1.90 kPa and J = 8.20 kPa, H-6), 7.17 (1H , d , J = 1.89 μs, H-2), 7.59 (1H, d , J = 15.89 μs, H-7).
13C-NMR (100 ㎒, δ, CD3OD) : 56.84 (C-OCH3), 112.07 (C-2), 116.35 (C-8), 116.87 (C-5), 124.40 (C-6), 128.21 (C-1), 147.32 (C-7), 149.76 (C-3), 150.89 (C-4), 171.45 (C-9). 13 C-NMR (100 MHz, δ, CD 3 OD): 56.84 (C-OCH 3 ), 112.07 (C-2), 116.35 (C-8), 116.87 (C-5), 124.40 (C-6) , 128.21 (C-1), 147.32 (C-7), 149.76 (C-3), 150.89 (C-4), 171.45 (C-9).
구조식(1)의 화합물은 시나믹산(cinnamic acid) 계열의 화합물로서 1H-NMR 스펙트럼에서 3.88ppm에서 methoxyl기의 전형적인 피크(peak)가 나타나고 있으며, 7.59ppm과 6.31ppm의 doublet signal은 H-7과 H-8에 대한 peak로 J = 15.89㎐ 및 J = 15.76㎐인 것으로 보아 서로 trans 형태로 결합되어 있음을 알 수 있다. 13C-NMR 스펙트럼에서 methoxyl기의 signal이 56.84ppm에서 나타나고 있으며 171.45ppm의 signal은 C-9의 ketone기의 peak이고, 147.32ppm과 116.35ppm의 signal은 C-7과 C-8로서 전형적인 cinnamic acid 계열 화합물의 이중결합에 대한 peak를 보여주는 것이다. 116.87ppm의 signal은 C-5를 나타내는 것으로 인접한 탄소에 결합된 OH기 때문에 upfield되어 나타나고 있다. 112.07ppm의 signal은 C-2의 peak로 C-3에 OH기가 있을 경우에는 C-5와 비슷한 값을 보이지만 methoxyl기가 치환되어 있으므로 upfield되어 나타나는 차이를 보이고 있다. Gentry 등(1998)은 hycandinic acid esters-1의 C-5는 114.7ppm, C-2는 109.4ppm으로 5ppm 정도 upfield 되어 나타났고, C-3은 146.8ppm, C-4는 148.1ppm으로서 1ppm정도의 차이를 보인다고 하였다(Gentry, E. J., H. B. Jampani, A. K-S, M. D. Morton, D. V. Velde, H. Telikepalli, and L. A. Mitscher. 1998. Antitubercular Natural Products: Berberine from the roots of commercial Hydrastis canadensis powder. Isolation of inactive 8-oxotetrahydrothalifendine, canadine, β-hydrastine, and two new quinic acid esters, hycandinic acid esters-1 and -2. J. Nat. Prod. 61(10): 1187-1193.). 그러므로 C-3의 OH기가 methoxyl기로 치환되었음을 알 수 있다. EI-MS 스펙트럼에 의한 분자량 분석은 [M]+ m/z 194로서 이 화합물의 분자량 194와 일치하였다.The compound of formula (1) is a cinnamic acid-based compound, showing a typical peak of the methoxyl group at 3.88 ppm in the 1 H-NMR spectrum, and the doublet signal of 7.59 ppm and 6.31 ppm is H-7. The peaks for and H-8 are J = 15.89㎐ and J = 15.76 보, indicating that they are combined in a trans form. In the 13 C-NMR spectrum, the signal of methoxyl group is shown at 56.84ppm, the signal of 171.45ppm is the peak of ketone group of C-9, and the signals of 147.32ppm and 116.35ppm are typical cinnamic acid, C-7 and C-8. It shows the peak of the double bond of the series compound. The signal of 116.87ppm represents C-5, which appears to be upfielded due to the OH group bonded to the adjacent carbon. The signal of 112.07ppm is the peak of C-2. When OH group is present in C-3, the signal is similar to C-5, but the methoxyl group is substituted. Gentry et al. (1998) showed that the C-5 of hycandinic acid esters-1 was 114.7ppm and C-2 was 109.4ppm, which was upfield about 5ppm, C-3 was 146.8ppm and C-4 was 148.1ppm. (Gentry, EJ, HB Jampani, A. KS, MD Morton, DV Velde, H. Telikepalli, and LA Mitscher. 1998. Antitubercular Natural Products: Berberine from the roots of commercial Hydrastis canadensis powder.Isolation of inactive 8 -oxotetrahydrothalifendine, canadine, β -hydrastine, and two new quinic acid esters, hycandinic acid esters-1 and -2.J. Nat. Prod. 61 (10): 1187-1193.). Therefore, it can be seen that the OH group of C-3 is substituted with a methoxyl group. Molecular weight analysis by EI-MS spectrum was consistent with the molecular weight 194 of this compound as [M] + m / z 194.
(B)구조식(2)의 화합물인 Protocatechuic acid (186.7 ㎎)(B) Protocatechuic acid (186.7 mg), a compound of formula (2)
EI-MS m/z : 154 [M]+, 137 (Base ion), 109, 81, 57.EI-MS m / z: 154 [M] + , 137 (Base ion), 109, 81, 57.
1H-NMR (400 ㎒, δ, CD3OD) : 6.80 (1H, d, J = 7.61 ㎐ H-5), 7.42 (1H, d, J = 2.06 ㎐, H-6), 7.44 (1H, s, H-2). 1 H-NMR (400 MHz, δ , CD 3 OD): 6.80 (1H, d , J = 7.61 ㎐ H-5), 7.42 (1H, d , J = 2.06 ㎐, H-6), 7.44 (1H, s , H-2).
13C-NMR (100 ㎒, δ, CD3OD) : 116.18 (C-2), 118.13 (C-5), 123.52 (C-1), 124.32 (C-6), 146.47 (C-3), 151.95 (C-4), 170.69 (C-7). 13 C-NMR (100 MHz, δ , CD 3 OD): 116.18 (C-2), 118.13 (C-5), 123.52 (C-1), 124.32 (C-6), 146.47 (C-3), 151.95 (C-4), 170.69 (C-7).
구조식(2)의 화합물은 벤조익산(benzoic acid) 계열인 피로카테콜(pyrocatechol)의 유도체로서 benzoic acid의 C-3과 C-4의 위치에 OH기가 결합된 형태의 화합물로서 1H-NMR 스펙트럼에서 H-5의 피크(peak)는 6.80ppm에서 doublet으로 나타나는데, J = 7.61 ㎐인 것으로 보아 H-6과 ortho coupling 되었음을 알 수 있고, H-6은 7.42ppm에서 doublet peak로, H-2는 7.44ppm에서 singlet peak로 귀속하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서 170.69ppm의 signal은 전형적인 carboxyl기의 peak를 나타내고 있으며 OH기가 결합하고 있는 C-3과 C-4는 146.47 ppm과 151.95 ppm에서 각각 특징적인 peak를 주고 있다. 이상의 데이터는 Cha 등(2000)이 보고한 protocatechuic acid의 데이터(Cha, B. C., S. B. Lee, T. J. Rhim, and K. H. Lee. 2000. Constituents of Antioxidative Activity and Free Radical Scavenging Effect from Galla Rhois(Rhus javanica Linne). Kor. J. Pharmacognosy 31(2): 185-189.)와 일치하였으며, EI-MS 스펙트럼에 의한 분자량 분석은 [M]+ m/z 154로서 이 화합물의 분자량 154와 일치하였다.The compound of formula (2) is a derivative of pyrocatechol, a benzoic acid family, and has a 1 H-NMR spectrum as a compound in which an OH group is bonded to C-3 and C-4 of benzoic acid. The peak of H-5 is shown as doublet at 6.80ppm, J = 7.61 보, it can be seen that ortho coupling with H-6, H-6 is doublet peak at 7.42ppm, H-2 is At 7.44 ppm it was attributed to a singlet peak. In the 13 C-NMR spectrum, the signal of 170.69ppm shows typical peak of carboxyl group, and C-3 and C-4 with OH group show characteristic peaks at 146.47 ppm and 151.95 ppm, respectively. The above data is based on data of protocatechuic acid reported by Cha et al. (2000) (Cha, BC, SB Lee, TJ Rhim, and KH Lee. 2000. Constituents of Antioxidative Activity and Free Radical Scavenging Effect from Galla Rhois ( Rhus javanica Linne). Kor. J. Pharmacognosy 31 (2): 185-189.), And molecular weight analysis by EI-MS spectrum was consistent with the molecular weight 154 of this compound as [M] + m / z 154.
(C)구조식(3)의 화합물인 Vanillic acid (56.4㎎)(C) Vanillic acid (56.4 mg), a compound of formula (3)
EI-MS m/z : 168 ([M]+, Base ion), 153 , 151, 125, 97.EI-MS m / z: 168 ([M] + , base ion), 153, 151, 125, 97.
1H-NMR (400 ㎒, δ, CD3OD) : 3.89 (3H, s, H-OCH3), 6.84 (1H, d, J = 8.87 ㎐ H-5), 7.55 (1H, dd, J = 1.73 ㎐ and J = 3.54 ㎐ H-6), 7.57 (1H, d, J = 1.97 ㎐, H-2). 1 H-NMR (400 MHz, δ , CD 3 OD): 3.89 (3H, s , H-OCH 3 ), 6.84 (1H, d , J = 8.87 ㎐ H-5), 7.55 (1H, dd , J = 1.73 μs and J = 3.54 μs H-6), 7.57 (1H, d , J = 1.97 μs, H-2).
13C-NMR (100 ㎒, δ, CD3OD) : 56.79 (C-OCH3), 114.17 (C-2), 116.24 (C-5), 123.45 (C-1), 125.68 (C-6), 149.06 (C-3), 153.07 (C-4), 170.44 (C-7). 13 C-NMR (100 MHz, δ , CD 3 OD): 56.79 (C-OCH 3 ), 114.17 (C-2), 116.24 (C-5), 123.45 (C-1), 125.68 (C-6) , 149.06 (C-3), 153.07 (C-4), 170.44 (C-7).
구조식(3)의 화합물은 상기한 구조식(2)의 화합물인 protocatechuic acid의 C-3에 OH기 대신 메톡시(methoxyl)기가 결합된 형태의 화합물로서 1H-NMR 스펙트럼에서 보면 3.89ppm에서 methoxyl기의 전형적인 피크(peak)가 나타나는 차이를 보이고 있으며 나머지 수소 peak들은 protocatechuic acid와 동일하게 나타나고 있다. 13C-NMR 스펙트럼 역시 56.79ppm에서 methoxyl기의 peak가 보이고 있으며 C-3에 methoxyl기가 결합되어 인접한 C-4의 signal이 2ppm 정도 downfield되어 나타나는 차이를 보이고 있다. 나머지 탄소 peak들은 protocatechuic acid와 동일한 형태를 나타내고 있다. 이상의 데이터는 최 등(2004)이 함박꽃나무에서 분리한 화합물의 데이터(최인호, 이학주, 최돈하, 박재인, 최태호. 2004. 함박꽃나무(Magnolia sieboldii)의 추출성분. 목재공학 32(2): 33-39.)와 일치하였으며 EI-MS 스펙트럼에 의한 분자량 분석은 [M]+ m/z 168로서 이 화합물의 분자량 168과 일치하였다.The compound of formula (3) is a compound in which methoxy (methoxyl) group is bonded to C-3 of protocatechuic acid, which is the compound of formula (2), instead of OH group, and it is a methoxyl group at 3.89 ppm in 1 H-NMR spectrum. The typical peak of is shown and the remaining hydrogen peaks are the same as the protocatechuic acid. 13 C-NMR spectrum also shows a peak of methoxyl group at 56.79ppm, and the methoxyl group is bonded to C-3, resulting in a difference of 2ppm downfield signal of adjacent C-4. The remaining carbon peaks show the same shape as the protocatechuic acid. The above data is from Choi et al. (2004) data on the compounds isolated from the inflorescences (Choi In-Ho, Hak-Joo Lee, Don-Ha Choi, Jae-In Park, and Tae-Ho Choi. 2004. Extracts from Magnolia sieboldii . 39.) and molecular weight analysis by EI-MS spectrum is [M] + m / z 168, consistent with the molecular weight of 168 of this compound.
<실시예 2><Example 2>
황벽나무 수피 2kg을 7mm 크기로 분쇄 후 상온에서 9리터(ℓ)의 증류수에 첨가하고 25℃에서 72시간(3일) 동안 냉수추출을 한 다음 상기 냉수추출물이 1ℓ가 되도록 농축하였으며, 농축된 황벽나무 수피 추출물은 분획깔때기를 이용하여 헥산(hexane) 가용부, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 가용부 및 물 가용부로 각각 분획하였다.2 kg of yellow bark bark was crushed to 7 mm size and added to 9 liter (ℓ) of distilled water at room temperature, followed by cold water extraction at 25 ° C. for 72 hours (3 days), and the cold water extract was concentrated to 1 L. Tree bark extract was fractionated into hexane soluble part, ethyl acetate soluble part and water soluble part using a separatory funnel.
상기에서 얻은 황벽나무 수피의 물 가용부(95.8g)에 3% 농도의 묽은 염산을 물 가용부 200㎖에 대하여 10㎖를 첨가한 다음 40℃의 항온수조에서 2.5시간 동안 반응시킨 후 생성된 침전물을 재결정법으로 정제하여 하기 구조식(4)의 베르베린(berberin, 1.25g)을 얻었다. To the water soluble part (95.8 g) of the yellow bark bark obtained above, 10 ml of 3% dilute hydrochloric acid was added to 200 ml of the water soluble part, and then reacted for 2.5 hours in a 40 ° C. constant temperature water bath. Was purified by recrystallization to obtain berberin (1.25 g) of the following structural formula (4).
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(4)의 화합물의 확인은 Cellulose F(20×20cm, Merck) TLC plate를 사용하여 박층크로마토그래피를 실시하였다. 이때 전개용매는 t-butanol:acetic acid:H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% HOAc(solvent B)를 사용하였으며 UV램프(Beckman Du-70)로 254nm에서 관찰하였 다. The compound of Structural Formula (4) isolated from the bark of bark was identified by thin layer chromatography using Cellulose F (20 × 20 cm, Merck) TLC plate. The developing solvent used t -butanol: acetic acid: H 2 O (3: 1: 1, v / v, TBA (solvent A)) and 6% HOAc (solvent B) and UV lamp (Beckman Du-70) It was observed at 254nm.
.....구조식(4) ..... Structure (4)
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(4)인 단리 화합물의 구조 분석은 Bruker Advance DPX 400 ㎒ spectrometor (Germany)를 사용하여 1H--NMR(400㎒), 13C-NMR(100㎒)을 분석하였고, 2D-NMR인 DEPT, COSY, HMBC 등을 분석하였으며 분석용매는 CD3OD 및 DMSO를 사용하였다. 질량 분석은 TOF MS를 사용하여 분자량을 측정하였다. 하기에 구조식(4) 화합물의 측정결과를 나타내었다. Structural analysis of the isolated compound of Structural Formula (4) isolated from the bark of bark was carried out using 1 H--NMR (400 MHz) and 13 C-NMR (100 MHz) using Bruker Advance DPX 400 MHz spectrometor (Germany). 2D-NMR, DEPT, COZY, HMBC, etc. were analyzed, and CD 3 OD and DMSO were used as analytical solvent. Mass spectrometry measured molecular weight using TOF MS. The measurement results of Compound (4) are shown below.
구조식(4)의 Berberine (2.7g)Berberine of formula (4) (2.7 g)
TOF-MS m/z : [M]+ 336.TOF-MS m / z: [M] + 336.
1H-NMR (400 ㎒, δ, CD3OD) : δ 9.76 (1H, s, H-8), 8.67 (1H, s, H-13), 8.10 (1H, d, J = 9.2 ㎐, H-11), 7.99 (1H, d, J = 9.2 ㎐, H-12), 7.63 (1H, s, H-1), 6.95 (1H, s, H-4), 6.10 (2H, s, OCH2O), 4.93 (2H, t, J = 6.4 ㎐, H-6), 4.20 (3H, s, C-9-OCH3), 4.10 (3H, s, C-10-OCH3), 3.27 (2H, m, H-5). 1 H-NMR (400 MHz, δ , CD 3 OD): δ 9.76 (1H, s , H-8), 8.67 (1H, s , H-13), 8.10 (1H, d , J = 9.2 ㎐, H -11), 7.99 (1H, d , J = 9.2 ㎐, H-12), 7.63 (1H, s , H-1), 6.95 (1H, s , H-4), 6.10 (2H, s , OCH 2 O), 4.93 (2H, t , J = 6.4 ㎐, H-6), 4.20 (3H, s , C-9-OCH 3 ), 4.10 (3H, s , C-10-OCH 3 ), 3.27 (2H , m , H-5).
13C-NMR (100 ㎒, δ, CD3OD) : δ 152.2 (C-10), 152.1 (C-3), 150.0 (C-2), 146.5 (C-8), 145.8 (C-9), 139.7 (C-13a), 135.2 (C-12a), 132.0 (C-4a), 128.2 (C-11), 124.6 (C-12), 123.4 (C-1a), 121.9 (C-8a), 121.6 (C-13), 109.5 (C-4), 106.6 (C-1), 103.8 (C-OCH2O), 62.7 (C-9-OCH3), 57.8 (C-10-OCH3), 57.3 (C-6), 28.3 (C-5). 13 C-NMR (100 MHz, δ , CD 3 OD): δ 152.2 (C-10), 152.1 (C-3), 150.0 (C-2), 146.5 (C-8), 145.8 (C-9) , 139.7 (C-13a), 135.2 (C-12a), 132.0 (C-4a), 128.2 (C-11), 124.6 (C-12), 123.4 (C-1a), 121.9 (C-8a), 121.6 (C-13), 109.5 (C-4), 106.6 (C-1), 103.8 (C-OCH 2 O), 62.7 (C-9-OCH 3 ), 57.8 (C-10-OCH 3 ), 57.3 (C-6), 28.3 (C-5).
상기 구조식(4)의 화합물은 1H-NMR 스펙트럼에서 H-8의 signal로 귀속한 9.76ppm의 singlet peak는 인접한 질소의 영향으로 가장 저자장으로 downfield되어 나타나고 있고, 8.67ppm의 singlet peak는 같은 페놀환에 있는 H-13의 signal로 귀속하였다. H-11, 12의 signal로 귀속된 peak들이 8.10과 7.99ppm에서 J = 9.2Hz의 doublet으로 나타나고 있으며, 7.63과 6.95ppm의 signlet은 H-1, 4의 signal로 귀속하였다. 또한, 6.10ppm에서 methylene dioxy 수소의 특징적인 singlet signal이 나타났으며 4.20과 4.10ppm의 peak들은 C-9, 10에 결합된 두 개의 methoxyl기의 signal로 귀속하였다. 4.93ppm의 triplet signal은 H-6의 peak로서 질소의 영향을 받아 downfield되었고, 3.27ppm의 multiplet peak는 H-5의 signal로 귀속하였다. 이상은 주혜경 등(2000)이 쉬나무에서 단리한 berberine의 NMR 스펙트럼과 일치하였다(주혜경, 황방연, 안병태, 김미정, 최우회, 조봉진, 노재섭, 이경순. 2000. 수나무의 화학적 성분. 생약학회지 31(3): 300-305.).The compound of formula (4) showed 9.76 ppm singlet peak attributable to the signal of H-8 in the 1 H-NMR spectrum downfield to the low field due to the influence of adjacent nitrogen, and 8.67 ppm singlet peak showed the same phenol. It was attributed to the signal of H-13 in the ring. Peaks attributed to signals H-11 and 12 appear as doublets of J = 9.2 Hz at 8.10 and 7.99 ppm, and signlets at 7.63 and 6.95 ppm were attributed to signals H-1 and 4. In addition, a singlet signal characteristic of methylene dioxy hydrogen was observed at 6.10 ppm, and the peaks of 4.20 and 4.10 ppm were attributed to signals of two methoxyl groups bonded to C-9 and 10. The 4.93ppm triplet signal was downfielded under the influence of nitrogen as the H-6 peak, and the 3.27ppm multiplet peak was attributed to the H-5 signal. The above results were consistent with the NMR spectra of berberine isolated by Ju Hye-kyeong (2000) (Shu Hye-kyung, Hwang Bang-yeon, Ahn Byung-tae, Kim Mi-jung, Choi Woo-ho, Cho Bong-jin, Roh Jae-sub, Lee Kyoung-soon, 2000. ): 300-305.).
13C-NMR 스펙트럼에서 berberine의 전형적인 methylene dioxy 탄소에 기인한 103.8 ppm의 signal과 methoxyl기 탄소에 의한 62.7과 57.8 ppm의 signal을 확인하였다. 152.2와 145.8 ppm의 signal은 methoxyl기가 결합된 C-10, 9의 signal이며 146.5, 139.7, 57.3 ppm의 signal들은 C-8, 13a, 6이 질소의 영향으로 downfield되어 나타난 것을 알 수 있었다. 또한, 152.1과 150.0 ppm의 signal은 methylene dioxy가 결합되어 downfield된 C-3, 2의 signal이며 106.6, 109.5, 121.6, 124.6, 128.2 ppm의 signal들은 methine 탄소인 C-1, 4, 13, 12, 11의 peak로서 귀속하였다. 또한, 28.3 ppm의 signal은 methylene 탄소인 C-5에 대한 peak이며 123.4, 132.0, 121.9, 135.2 ppm의 signal들은 phenol ring에서 기인하는 quaternary 탄소인 C-1a, 4a, 8a, 12a의 peak임을 확인하였다. 이상은 이 등(1997)이 매발톱나무로부터 단리하여 보고한 berberine과 일치하였다(이향이, 김종원. 1997. 매발톱나무(Berberis amurensis Ruprecht)의 성분에 관한 연구. 생약학회지 28(4): 257-263.). TOF-MS는 m/z [M]+ 336으로서 이 화합물의 분자량과 정확히 일치하였고, berberine으로 구조를 구명하였다. In the 13 C-NMR spectrum, the signal of 103.8 ppm due to methylene dioxy carbon, typical of berberine, and the signal of 62.7 and 57.8 ppm due to methoxyl carbon were identified. The signals of 152.2 and 145.8 ppm were the signals of C-10 and 9 combined with methoxyl groups, and the signals of 146.5, 139.7 and 57.3 ppm were downfielded by the effects of nitrogen. In addition, the signals of 152.1 and 150.0 ppm are signals of C-3 and 2 downfield combined with methylene dioxy, and signals of 106.6, 109.5, 121.6, 124.6 and 128.2 ppm are methine carbons of C-1, 4, 13, 12, It was attributed to the peak of 11. In addition, the 28.3 ppm signal was the peak for C-5, methylene carbon, and the signals of 123.4, 132.0, 121.9, and 135.2 ppm were the peaks of C-1a, 4a, 8a, and 12a, quaternary carbons originating from the phenol ring. . The results were consistent with berberine reported by Lee et al. (1997) isolated from barberry (Hyang Lee, Jong-Won Kim. 1997. Studies on the components of Berberis amurensis Ruprecht. Journal of Pharmacognosy 28 (4): 257-263 .). TOF-MS was m / z [M] + 336, which exactly matches the molecular weight of this compound, followed by berberine structure.
<실시예 3><Example 3>
황벽나무 수피 2kg을 7mm 크기로 분쇄 후 상온에서 9리터(ℓ)의 증류수에 첨가하고 25℃에서 72시간(3일) 동안 냉수추출을 한 다음 상기 냉수추출물이 1ℓ가 되도록 농축하였으며, 농축된 황벽나무 수피 추출물은 분획깔때기를 이용하여 헥 산(hexane) 가용부, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 가용부 및 물 가용부로 각각 분획하였다.2kg of yellow bark bark was crushed into 7mm size and added to 9 liters of distilled water at room temperature, followed by cold water extraction at 25 ° C. for 72 hours (3 days), and the cold water extract was concentrated to 1 L. Tree bark extract was fractionated into a hexane soluble part, an ethyl acetate soluble part and a water soluble part using a fraction funnel.
상기에서 얻은 에틸 아세테이트 가용부(5.6g)를 농축하는 과정에서 생성된 침전물을 재결정법으로 정제하여 하기 구조식(5)의 리모닌(limonin, 2.45g)을 얻었다.The precipitate produced in the process of concentrating the ethyl acetate soluble part (5.6 g) obtained above was purified by recrystallization to obtain limonin (limonin, 2.45 g) of the following structural formula (5).
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(5)의 화합물의 확인은 Cellulose F(20×20cm, Merck) TLC plate를 사용하여 박층크로마토그래피를 실시하였다. 이때 전개용매는 t-butanol:acetic acid:H2O(3:1:1, v/v, TBA(solvent A))와 6% HOAc(solvent B)를 사용하였으며 UV램프(Beckman Du-70)로 254nm에서 관찰하였다.The compound of formula (5) isolated from the bark of the yellow bark was identified by thin layer chromatography using Cellulose F (20 × 20 cm, Merck) TLC plate. The developing solvent used t -butanol: acetic acid: H 2 O (3: 1: 1, v / v, TBA (solvent A)) and 6% HOAc (solvent B) and UV lamp (Beckman Du-70) It was observed at 254nm.
.....구조식(5) ..... Structure (5)
상기에서 황벽나무 수피로부터 단리된 구조식(5)인 단리 화합물의 구조 분석은 Bruker Advance DPX 400 ㎒ spectrometor (Germany)를 사용하여 1H--NMR(400㎒), 13C-NMR(100㎒)을 분석하였고, 2D-NMR인 DEPT, COSY, HMBC 등을 분석하였으며 분석용매는 CD3OD 및 DMSO를 사용하였다. 질량 분석은 TOF MS를 사용하여 분자량을 측정하였다. 하기에 구조식(5) 화합물의 측정결과를 나타내었다. Structural analysis of the isolated compound of formula (5) isolated from the bark of bark was carried out using 1 H--NMR (400 MHz) and 13 C-NMR (100 MHz) using Bruker Advance DPX 400 MHz spectrometor (Germany). 2D-NMR, DEPT, COZY, HMBC, etc. were analyzed, and CD 3 OD and DMSO were used as analytical solvent. Mass spectrometry measured molecular weight using TOF MS. The measurement results of Compound (5) are shown below.
구조식(5)의 Limonin (2.4g)Limonin of formula (5) (2.4g)
TOF-MS m/z : [M]+ 470.TOF-MS m / z: [M] + 470.
1H-NMR (400 ㎒, δ, DMSO-d 6 ) : δ 7.72 (1H, s, H-21), 7.66 (1H, s, H-23), 6.50 (1H, s, H-22), 5.47 (1H, s, H-17), 4.92 (1H, d, J = 13.00 ㎐, H-19e), 4.48 (1H, d, J = 13.50 ㎐, H-19a), 4.11 (1H, s, H-15), 4.10 (1H, s, H-1), 3.12 (1H, dd, J = 15.50 ㎐ and 4.0 ㎐, H-2e), 2.77 (1H, dd, J = 15.5 ㎐ and 3.3 ㎐, H-6e), 2.64 (1H, dd, J = 16.5 ㎐ and 4.0 ㎐, H-2a), 2.57 (1H, dd, J = 12.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-9), 2.46 (1H, dd, J = 15.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-6a), 2.27 (1H, dd, J = 14.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-5), 1.72 (2H, m, H-11), 1.25 (2H, m, H-12), 1.19 (3H, s, H-28), 1.11 (3H, s, H-29), 1.02 (3H, s, H-18), 1.00 (3H, s, H-30). 1 H-NMR (400 MHz, δ , DMSO- d 6 ): δ 7.72 (1H, s , H-21), 7.66 (1H, s , H-23), 6.50 (1H, s , H-22), 5.47 (1H, s , H-17), 4.92 (1H, d , J = 13.00 μs, H-19e), 4.48 (1H, d , J = 13.50 μs, H-19a), 4.11 (1H, s , H -15), 4.10 (1H, s , H-1), 3.12 (1H, dd , J = 15.50 μs and 4.0 μs, H-2e), 2.77 (1H, dd , J = 15.5 μs and 3.3 μs, H- 6e), 2.64 (1H, dd , J = 16.5 ㎐ and 4.0 ㎐, H-2a), 2.57 (1H, dd , J = 12.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-9), 2.46 (1H, dd , J = 15.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-6a), 2.27 (1H, dd , J = 14.5 ㎐ and 3.2 ㎐, H-5), 1.72 (2H, m , H-11), 1.25 (2H, m , H-12) , 1.19 (3H, s , H-28), 1.11 (3H, s , H-29), 1.02 (3H, s , H-18), 1.00 (3H, s , H-30).
13C-NMR (100 ㎒, δ, DMSO-d 6 ) : δ 208.0 (C-7), 170.2 (C-3), 167.3 (C-16), 143.3 (C-23), 141.7 (C-21), 120.2 (C-20), 110.2 (C-22), 79.5 (C-4), 78.4 (C-1), 77.4 (C-17), 66.7 (C-14), 64.7 (C-19), 57.9 (C-5), 53.7 (C-15), 50.2 (C-8), 46.4 (C-9), 45.2 (C-10), 37.6 (C-13), 36.1 (C-6), 35.6 (C-2), 29.7 (C-12), 29.1 (C-30), 21.4 (C-29), 19.6 (C-28), 17.5 (C-11), 17.0 (C-18). 13 C-NMR (100 MHz, δ , DMSO- d 6 ): δ 208.0 (C-7), 170.2 (C-3), 167.3 (C-16), 143.3 (C-23), 141.7 (C-21 ), 120.2 (C-20), 110.2 (C-22), 79.5 (C-4), 78.4 (C-1), 77.4 (C-17), 66.7 (C-14), 64.7 (C-19) , 57.9 (C-5), 53.7 (C-15), 50.2 (C-8), 46.4 (C-9), 45.2 (C-10), 37.6 (C-13), 36.1 (C-6), 35.6 (C-2), 29.7 (C-12), 29.1 (C-30), 21.4 (C-29), 19.6 (C-28), 17.5 (C-11), 17.0 (C-18).
상기 구조식(5)의 화합물은 1H-NMR 스펙트럼에서 7.72, 7.66, 6.50 ppm의 singlet들은 limonoid 화합물의 C-17과 퓨란환의 C-20이 결합되었을때 나타나는 전형적인 H-21, 23, 22의 signal들로서 Bennett 등(1994)이 보고한 linonoid 화합물의 furan ring과 유사하였다(Bennett, R. D., M. Miyake, Y. Ozaki and S. Hasegawa. 1991. Limonoid glucosides in Citrus aurantium. Phytochemistry 30(11): 3803-3805.). 그리고 H-19의 signal로 귀속한 4.92와 4.48 ppm의 doublet peak들은 J = 13 Hz로서 C-3과 C-19가 lactone linkage 형태를 하고 있는 limonoid 화합물임을 알 수 있었으며 또한, limonin의 특징 중 하나인 H-1과 H-15는 4.10과 4.11ppm에서 거의 겹쳐진 signal로 나타나는 것을 확인하였다. 그리고 1.00ppm, 1.02ppm, 1.11ppm, 1.19ppm의 4개의 signal은 각각 C-4, 8, 13에 결합되어 있는 methyl기의 수소 peak로 귀속하였고, 13C-NMR 스펙트럼에서도 29.1ppm, 17.0ppm, 21.4ppm, 19.6ppm의 4 개의 signal로 나타나고 있으며 Ozaki 등(1991)이 Tetradium rutaecarpa에서 단리한 limonin 17-β-D-glucopyranoside와 비교 분석하였다. The compound of formula (5) is a signal of the typical H-21, 23, 22 that appears when the singlet of 7.72, 7.66, 6.50 ppm in the 1 H-NMR spectrum is combined with C-17 of the limonoid compound and C-20 of the furan ring These were similar to the furan rings of linonoid compounds reported by Bennett et al. (1994) (Bennett, RD, M. Miyake, Y. Ozaki and S. Hasegawa. 1991. Limonoid glucosides in Citrus aurantium . Phytochemistry 30 (11): 3803- 3805.). The doublet peaks of 4.92 and 4.48 ppm attributable to the H-19 signal were J = 13 Hz, indicating that C-3 and C-19 are limonoid compounds in the form of lactone linkage. It was confirmed that H-1 and H-15 appeared as almost overlapping signals at 4.10 and 4.11 ppm. And 1.00ppm, 1.02ppm, 1.11ppm, 4 of the signal 1.19ppm was attributed to the hydrogen peak of methyl group bonded to C-4, 8, 13, respectively, 13 C-NMR spectrum at 29.1ppm, 17.0ppm, Four signals of 21.4ppm and 19.6ppm are shown, and Ozaki et al. (1991) compared with limonin 17- β- D-glucopyranoside isolated from Tetradium rutaecarpa .
13C-NMR 스펙트럼에서 208.0, 170.2, 167.3 ppm의 peak들은 C-7, 3, 16의 ketone기의 signal로 귀속하였으며 143.3, 141.7, 120.2, 110.2 ppm에서 나타나는 peak들은 퓨란환에서 기인하는 C-23, 21,20, 22의 signal로 귀속하였다. 한편, C-1과 4가 78.4, 79.5 ppm에서 나타나고 있는 것으로써 cyclic ether 형태임을 알 수 있었는데, 만약 C-4의 경우 72 ppm 부근에서 signal을 나타낸다면 C-1과 환을 이루지 않으므로 이 화합물은 C-1과 4가 환을 이루는 cyclic ether 형태로 귀속할 수 있었다(Bennett et al., 1991). 또한, 인접한 산소의 영향을 받는 C-17, 14, 19, 15의 signal들은 downfield되어 각각 77.4, 66.7, 64.7, 53.7 ppm에서 나타나고 있으며 35.6, 36.1, 17.5, 29.7 ppm의 peak들은 methylene 탄소인 C-2, 6, 11, 12의 signal로 귀속하였다. 이 외에 methine 탄소인 C-5, 9에 대한 signal은 57.9ppm, 46.4ppm에서 나타나고 있음을 확인하였으며 이것은 이종구 등(2007)이 단리한 화합물과도 일치하였다(이종구, 최지영, 오준석, 정희욱, 최은향, 이희상, 김정아, 장태수, 손종근, 이승호. 2007. 황백(黃柏)으로부터 멜라닌 생합성 억제 물질의 분리. 생약학회지 38(4): 387-393.). In the 13 C-NMR spectrum, peaks of 208.0, 170.2, and 167.3 ppm were attributed to signals of ketones of C-7, 3, and 16, and peaks occurring at 143.3, 141.7, 120.2, and 110.2 ppm were derived from the C-23 furan ring. , 21, 20, 22 were attributed to the signal. On the other hand, C-1 and 4 were shown at 78.4 and 79.5 ppm, indicating that they are in cyclic ether form. If C-4 shows a signal near 72 ppm, it does not form a ring with C-1. C-1 and tetracycline can be attributed to the cyclic ether (Bennett et al ., 1991). In addition, the signals of C-17, 14, 19, and 15 affected by adjacent oxygen are downfielded at 77.4, 66.7, 64.7, and 53.7 ppm, respectively, and the peaks of 35.6, 36.1, 17.5, and 29.7 ppm are m-carbon, C-. 2, 6, 11, 12 belonged to the signal. In addition, it was confirmed that the signal for methine carbon, C-5 and 9, was shown at 57.9ppm and 46.4ppm, which is consistent with the compounds isolated by Lee Jong-gu et al. (2007). , Hee-Sang Lee, Jung-A Kim, Tae-Soo Jang, Jong-Geun Son, Seung-Ho Lee 2007. Isolation of Melanin Biosynthesis Inhibitors from Hwangbaek.
TOF-MS는 m/z [M]+ 470으로서 이 화합물의 분자량 470과 정확히 일치하였으며 이상의 결과로 화합물 5는 limonin으로 구조를 구명하였다.TOF-MS was m / z [M] + 470, which was exactly the same as the molecular weight of 470. As a result, compound 5 was identified as limonin.
<시험예 1> 항산화 활성 시험(DPPH radical 소거법)Test Example 1 Antioxidant Activity Test (DPPH radical scavenging method)
상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻은 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물에 대해 DPPH radical 소거능을 이용한 항산화 활성을 시험하였다. Antioxidant activity using DPPH radical scavenging ability of the compounds of the structural formulas (1) to (5) obtained in Examples 1 to 3 was tested.
DPPH radical 소거능을 이용한 항산화 활성 시험은 96 well microplate에 시 료로서 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻은 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 농도를 각각 500ppm으로 희석하여 100㎕씩 넣은 후 0.2mM DPPH 용액을 100㎕ 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 microplate reader로 517nm에서 흡광도를 측정하였다. Antioxidant activity test using DPPH radical scavenging activity was put into 100 well by diluting the concentration of the compounds of the structural formulas (1) to (5) obtained in Examples 1 to 3 to 500 ppm each as a sample in a 96
무첨가 대조군(control)은 시료 대신 EtOH을 가하여 같은 방법으로 측정하였으며 시료의 색을 보정하기 위하여 0.2mM DPPH 용액대신 EtOH을 넣어 실험 하였다.The control group (no additive) was measured in the same manner by adding EtOH instead of the sample, and experimented with EtOH instead of 0.2mM DPPH solution to correct the color of the sample.
도 1에서 상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 경우 protocatechuic acid, ferulic aicd, vanillic aicd가 대조구에 비하여 90% 이상의 높은 활성을 나타내었으며, berberine은 75% 정도를 나타내었고 limonin은 활성을 보이지 않았다. 이때 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 농도는 100ppm으로 다소 높게 측정하였으나 일반적으로 화장품에 사용되는 소재들의 기준 농도가 1000∼50000ppm임을 고려했을 때 화장품 첨가 소재로 충분히 이용 가능하다는 결과를 얻을 수 있었다.In Figures 1 to 3 of the compounds of the formula (1) to the formula (5) isolated from the bark of the bark in the protocatechuic acid, ferulic aicd, vanillic aicd more than 90% higher activity than the control Berberine showed about 75% and limonin showed no activity. At this time, the concentrations of the compounds of the structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of the yellow bark in Examples 1 to 3 were measured to be somewhat high as 100 ppm, but the standard concentrations of the materials used in cosmetics were 1000 to 50000 ppm. Considering that it was possible to obtain a result that can be sufficiently used as a cosmetic additive material.
<시험예 2> 미백 활성시험(tyrosinase 활성억제 시험)Test Example 2 Whitening Activity Test (Tyrosinase Activity Inhibition Test)
상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻은 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물을 각각 1㎎/㎖의 농도로 희석한 것을 0.1M PBS(pH 6.5) 용액과 tyrosine(1.5nM in 0.1M PBS)을 혼합한 것에 첨가하여 혼합액을 만들고 mushroom tyrosinase(1000 units in 0.05M PBS)를 가하여 최종적으로 반응액이 200㎕가 되도 록 96 well plate에 넣었다. 반응액을 37℃에서 10분간 배양 후 ELISA를 사용하여 490nm의 파장으로 도파크롬(dopachrome) 생성량을 측정하였다.Diluting the compounds of the formulas (1) to (5) obtained in Examples 1 to 3 to a concentration of 1 mg / ㎖ each 0.1M PBS (pH 6.5) solution and tyrosine (1.5nM in 0.1M PBS) was added to the mixture to make a mixture, mushroom tyrosinase (1000 units in 0.05M PBS) was added, and the reaction solution was finally put into a 96 well plate to 200µl. After incubating the reaction solution at 37 ° C. for 10 minutes, the amount of dopachrome produced was measured at 490 nm using an ELISA.
도 2에서 보는바와 같이 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 경우 대조군인 알부틴(Albutin)에 비해 미백활성이 다소 약하였으나, limonin을 제외하고 모든 화합물들이 50% 전·후의 저해능을 나타내었다. 따라서 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물들의 경우 미백관련 화장품 첨가 소재로서 이용 가능성이 있음을 확인 할 수 있었다.As shown in FIG. 2, the compounds of the above structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Examples 1 to 3 were slightly weaker in whitening activity than the arbutin, which is a control group, but limonin. Except for all the compounds showed the inhibitory ability before and after 50%. Therefore, in Examples 1 to 3, the compounds of the structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of the yellow bark could be confirmed that it can be used as a whitening-related cosmetic additive material.
<시험예 3> MTT assay에 의한 세포독성 시험Test Example 3 Cytotoxicity Test by MTT Assay
(1)공시세포(1) disclosure cells
세포독성 시험을 위하여 대식세포인 Raw 264.7 cell(Murine macrophage cell line), 섬유아세포인 L929 cell(Mouse Fibroblast)를 한국세포주은행(Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하여 사용하였다. For cytotoxicity test, macrophage Raw 264.7 cell (Murine macrophage cell line) and fibroblast L929 cell (Mouse Fibroblast) were purchased from Korean Cell Line Research Foundation.
대식세포는 이물질을 포식하여 가수분해 시키는 식세포 작용을 하므로 면역작용에 관여할 뿐만 아니라 항원을 인식하여 결합하고 림프구에 전달하여 줌으로써 특이적 면역반응의 중개자 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Macrophages are known to act as mediators of specific immune responses by phagocytosis by phagocytosis by phagocytosis and phagocytosis of foreign bodies, as well as being involved in immunity.
(2)세포배양(2) Cell culture
모든 공시세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 Gibco사의 fetal bovine serum(FBS)를 10%, 100U/㎖ penicillin 및 100㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 72시간 배양하였다. 셀(Cell) 배양 플라스크(flask)에 cell의 밀도가 2∼3×106/㎖ 정도가 되도록 계대배양하여 5% CO2 조건으로 cell 상태를 유지하였다.All test cells were treated with a 37 ° C., 5% CO 2 incubator using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) mixed with Gibco's fetal bovine serum (FBS) with 10%, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. incubator for 72 hours. The cell culture flasks were passaged so that the cell density was about 2 to 3 × 10 6 / ml, and the cells were maintained under 5% CO 2 conditions.
(3)세포독성 시험(3) Cytotoxicity test
세포 생존율을 측정하기 위하여 70% 이상의 밀도가 되도록 배양된 쥐 유래 정상세포인 대식세포(Raw 264.7 cell)와 섬유아세포(L929 cell)를 무혈청배지로 교체한 후 시험하고자 하는 시료를 농도별로 각각 well에 투여하여, 이를 48시간 추가 배양하였다. 살아있는 미토콘드리아 탈수소 효소들의 반응에 의하여 푸른색의 formazan product로 변화시키는 MTT(2㎎/㎖ in PBS)시약을 각 well에 20㎕씩 투여하고 4시간 추가 배양한 후, 상층액을 제거하였다. PBS로 세척한 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 가하여 formazan product를 완전히 용해시킨 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.In order to measure the cell viability, the cells to be tested were replaced with serum-free medium in which macrophages (Raw 264.7 cells) and fibroblasts (L929 cells), which were cultured to a density of 70% or more, were tested for each concentration. Was incubated for 48 hours. MTT (2 mg / ml in PBS) reagent was changed to a blue formazan product by the reaction of live mitochondrial dehydrogenases, and 20 μl of each well was incubated for 4 hours, and then the supernatant was removed. After washing with PBS and DMSO (dimethyl sulfoxide) was added to completely dissolve the formazan product, the absorbance was measured at 540nm with a microplate reader.
도 3에서와 같이 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 시료에서 80% 이상의 대식세포(Raw 264.7 cell)의 세포 생존율을 보여 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 세포독성이 없는 것으로 나타났다.As shown in Figure 3 to Example 1 to Example 3 showed a cell viability of more than 80% of the macrophage (Raw 264.7 cells) in a sample of the compounds of the formula (1) to the formula (5) isolated from the bark of bark In Examples 1 to 3, the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of bark were found to be cytotoxic.
도 3에서 대조군(control)은 세포독성 시험 과정 중 측정하고자 하는 샘플을 첨가하지 않은 무첨가군으로 이것을 100%로 놓고 그에 대한 퍼센티지(%)를 활성 으로 나타내는 것이다. In FIG. 3, the control is a control group without adding the sample to be measured during the cytotoxicity test, and the percentage is set as 100% as the activity.
<시험예 4> 피부암세포(B16F10)에 대한 세포독성 실험Test Example 4 Cytotoxicity Test on Skin Cancer Cell (B16F10)
실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물에 대해 피부암세포(B16F10)에 대한 세포독성 실험을 실시하였다. Cytotoxicity experiments on skin cancer cells (B16F10) were carried out on the compounds of the structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Examples 1 to 3.
이때 피부암세포(B16F10)에 대한 세포독성 실험은 유지선 등(2004)의 실험방법을 응용하여 실시하고(유지선, 김안근. 2004. B16F10 세포에서 Flavonoid인 Myricetin과 Vitamine C, Vitamine E의 병용 투여가 항산화 효소계에 미치는 영향. 생약학회지 35(4): 357-363.) 그 결과를 도 4에 나타내었다. At this time, the cytotoxicity test for skin cancer cells (B16F10) was carried out by applying the experimental method of Yoo Seon-sun et al. (2004) (Yoo Ji-sun, Kim An-geun. 2004. Combination administration of Flavonoid Myricetin with Vitamine C and Vitamine E in B16F10 cells Korean Journal of Pharmacognosy 35 (4): 357-363.) The results are shown in FIG.
도 4에서 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물에 대해 피부암세포(B16F10)의 세포 생존율을 나타낸 것으로서, 본 발명의 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 피부암세포(B16F10) 독성을 나타내고 있으며, 특히 berberine과 limonin이 60% 이하의 세포독성을 나타내었다. 따라서, 피부암세포에 독성을 나타낸 본 발명의 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 검버섯 및/또는 노인성 색소침착에 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어 최근 세계적인 추세에 있는 노인성 화장품 등의 기능성 첨가제로서 이용 할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다.4 shows the cell viability of skin cancer cells (B16F10) with respect to the compounds of the structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of bark in Examples 1 to 3, and from the yellow bark of the present invention The isolated compounds of the formulas (1) to (5) showed skin cancer cell (B16F10) toxicity, and especially berberine and limonin showed less than 60% cytotoxicity. Therefore, the compounds of the above formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark of the present invention, which are toxic to skin cancer cells, may be effective in blotting and / or senile pigmentation. Results that can be used as a functional additive, such as aging cosmetics.
도 4에서 대조군(control)은 세포독성 시험 과정 중 측정하고자 하는 샘플을 첨가하지 않은 무첨가군으로 이것을 100%로 놓고 그에 대한 퍼센티지(%)를 활성으로 나타내는 것이다. In Figure 4, the control (control) is a group without addition of the sample to be measured during the cytotoxicity test to set this to 100% to indicate the percentage (%) for that activity.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. As described above, although described with reference to a preferred embodiment of the present invention, those skilled in the art will be variously modified and modified within the scope of the present invention without departing from the spirit and scope of the invention described in the claims below. It will be appreciated that it can be changed.
본 발명에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 항산화효과, 미백효과를 지니고 있어 화장품의 천연소재로서 사용할 수 있다. 특히 본 발명에 의해 황벽나무 수피로부터 분리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물은 항산화효과, 미백효과 이외에 피부암세포에 대한 독성을 지니고 있어 검버섯이나 노인성 색소침착에 대한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단되어 노인성 화장품 등의 기능성 첨가제의 소재로 사용할 수 있다.The compounds of the formulas (1) to (5) separated from the bark of the bark by the present invention have antioxidant and whitening effects and can be used as natural materials for cosmetics. In particular, the compounds of the structural formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark of the present invention have toxicity to skin cancer cells in addition to the antioxidant and whitening effects, and thus may have an effect on blotch or senile pigmentation. It is judged that it can be used as a material of functional additives such as aging cosmetics.
도 1은 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 황산화 활성 시험결과를 나타낸 그래프이다(도 1에서 com.1은 구조식(1)의 화합물을 의미하고, com.2은 구조식(2)의 화합물을 의미하고, com.3은 구조식(3)의 화합물을 의미하고, com.4은 구조식(4)의 화합물을 의미하고, com.5은 구조식(5)의 화합물을 의미한다).1 is a graph showing the results of the sulfate activity test of the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Examples 1 to 3 (com.1 in Figure 1 is a structural formula (1 ), Com. 2 means a compound of formula (2), com. 3 means a compound of formula (3), com. 4 means a compound of formula (4), com .5 means a compound of formula (5)).
도 2는 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 미백 활성 시험결과를 나타낸 그래프이다(도 2에서 com.1은 구조식(1)의 화합물을 의미하고, com.2은 구조식(2)의 화합물을 의미하고, com.3은 구조식(3)의 화합물을 의미하고, com.4은 구조식(4)의 화합물을 의미하고, com.5은 구조식(5)의 화합물을 의미한다).Figure 2 is a graph showing the test results of the whitening activity of the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Examples 1 to 3 (com.1 in Figure 2 is the formula (1) Com. 2 means the compound of formula (2), com. 3 means the compound of formula (3), com. 4 means the compound of formula (4), and com. 5 means a compound of formula (5)).
도 3은 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 대식세포(Raw 264.7 cell)에 대한 세포 생존 시험결과를 나타낸 그래프이다(도 3에서 com.1은 구조식(1)의 화합물을 의미하고, com.2은 구조식(2)의 화합물을 의미하고, com.3은 구조식(3)의 화합물을 의미하고, com.4은 구조식(4)의 화합물을 의미하고, com.5은 구조식(5)의 화합물을 의미한다).Figure 3 is a graph showing the cell survival test results for the macrophage (Raw 264.7 cells) of the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Example 1 to Example 3 (Fig. 3 Where com.1 means the compound of formula (1), com.2 means the compound of formula (2), com.3 means the compound of formula (3), and com.4 means formula (4) ) And com. 5 means the compound of formula (5).
도 4는 실시예 1 내지 실시예 3에서 황벽나무 수피로부터 단리한 상기 구조식(1) 내지 구조식(5)의 화합물의 피부암세포(B16F10)의 생존 시험결과를 시험결과를 나타낸 그래프이다(도 4에서 com.1은 구조식(1)의 화합물을 의미하고, com.2은 구조식(2)의 화합물을 의미하고, com.3은 구조식(3)의 화합물을 의미하고, com.4은 구조식(4)의 화합물을 의미하고, com.5은 구조식(5)의 화합물을 의미한다).Figure 4 is a graph showing the test results of the survival test results of the skin cancer cells (B16F10) of the compounds of the formulas (1) to (5) isolated from the bark of the bark in Example 1 to Example 3 (in Figure 4 com.1 means the compound of formula (1), com.2 means the compound of formula (2), com.3 means the compound of formula (3), com.4 means formula (4) Com.5 means a compound of formula (5)).
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103134895A (en) * | 2011-11-25 | 2013-06-05 | 张金荣 | Identification method for compound golden cypress agent |
CN104215708A (en) * | 2014-09-05 | 2014-12-17 | 广西万寿堂药业有限公司 | Content detection method of Chinese herbal compound granule for treating gynecological hemorrhage disease |
-
2009
- 2009-08-17 KR KR1020090075840A patent/KR20110018178A/en not_active Application Discontinuation
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN103134895A (en) * | 2011-11-25 | 2013-06-05 | 张金荣 | Identification method for compound golden cypress agent |
CN104215708A (en) * | 2014-09-05 | 2014-12-17 | 广西万寿堂药业有限公司 | Content detection method of Chinese herbal compound granule for treating gynecological hemorrhage disease |
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