KR20110006964A - 신규한 메탄산화세균 메틸로시스티스 속 미생물 및 이를 이용한 메탄 저감방법 - Google Patents
신규한 메탄산화세균 메틸로시스티스 속 미생물 및 이를 이용한 메탄 저감방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 메탄산화세균 메틸로시스티스 속 미생물 및 이를 이용한 메탄 저감방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 메탄 또는 휘발성유기화합물에 대한 분해능이 우수한 신규 메틸로시스티스 속 미생물은 충전제로 지렁이 분변토를 사용하는 메탄 저감용 바이오커버 또는 저감 시스템에서 보다 효과적으로 메탄을 분해할 수 있다.
메틸로시스티스 속, 메탄산화세균, 메탄, 휘발성유기화합물, 지렁이 분변토
Description
본 발명은 신규한 메탄산화세균 메틸로시스티스 속 미생물 및 이를 이용한 메탄 저감방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 메탄 또는 휘발성유기화합물에 대한 분해능이 우수한 신규 메틸로시스티스 속 미생물은 충전제로 지렁이 분변토를 사용하는 메탄 저감용 바이오커버 또는 저감 시스템에서 보다 효과적으로 메탄을 분해할 수 있다.
전 지구적 기후변화를 야기하는 대표적인 온실가스로 이산화탄소(CO2), 메탄(CH4), 아산화질소(N2O), F-가스(HFCs, PFCs, SF6) 등이 있다. 산업혁명 이후 인간 활동으로 인해 전 지구적 온실가스 배출량이 급속도로 증가되어 왔다. 이산화탄소에 이에 2번째로 기여도가 높은 온실가스인 메탄은 무색, 무취 온실가스로, 공기 중에 5~15% 함유되어 있으면 폭발성이 있으며, 0.5% 메탄에 장기 노출 시 호흡곤란을 야기하는 유해가스이다. 특히 메탄의 체류시간은 12±3년으로 타 온실가스에 비해 비교적 짧기 때문에, 20년 기준 GWP는 이산화탄소보다 70배 이상이다. 메탄은 농업 및 화석연료 사용 분야뿐 만 아니라, 다른 온실가스와는 다른 폐기물 처리분야가 주요 발생원인 특징이 있다. 매립지와 폐기물로부터 발생되는 메탄양은 연간 약 35∼73 Tg으로 추정된다. 메탄은 유기물의 혐기적 분해 과정에서 메탄생성세균에 의해 생성되며, 이러한 생물학적 작용에 의한 메탄 발생량은 총 발생량의 약 70~80% 정도 차지하는 것으로 추정되고 있다. 메탄 제거는 주로 대류권에서의 OH 라디칼과의 반응(CH4 + OH·→ CH3·+ H2O)과 성층권에서 염소와 반응(CH4 + Cl·→ CH3·+ HCl)에 의해 소멸된다. 또한, 호기적인 환경에서 메탄은 유일 탄소원과 에너지원으로 이용하는 메탄영양세균에 의해 이산화탄소로 최종 산화되는데, 이 메커니즘이 메탄의 주요 소멸 메커니즘이다.
한편, 주요한 메탄 발생원인 일부 매립지에서는 바이오가스를 포집할 수 있는 가스포집정이 설치되어 있는데, 일반적으로 생성된 바이오가스의 40~60% 정도 회수 가능하다. 매립지에 전면적으로 합성수지 커버를 설치할 경우, 90%까지 바이오가스를 회수 가능할 것으로 보고되고 있다. 매립지에서 배출되는 메탄을 함유한 바이오가스는 회수하여 에너지 등으로 자원화하거나 태워버리거나 복토의 토양미생물을 이용하여 산화·제거할 수 있다. 바이오가스를 연소시켜 연소열을 에너지원으로 자원화하는 방법은 온실가스 저감과 동시에 신재생에너지를 확보하는 차원에서 매우 이상적인 방법이나, 바이오가스 중 메탄 함량이 30% 이상이고 바이오가스 flux가 50 m3 h-1인 경우에만 적용 가능하다. 바이오가스 포집정이 설치된 매립지의 경우, 1톤의 CO2 환산톤에 해당되는 메탄가스를 에너지원으로 자원화하는데 소요되는 설치비와 운전비는 3.1$ US 정도 소요된다. 촉매를 이용하여 메탄가스를 충전탑에서 600∼800℃에서 산화시키는 화학적 산화방법은 메탄가스 농도가 0.1~1%로 저농도일 때 적용 가능한 방법이다. 또한, 메탄을 메탄올로 전환하여 자원화하고자 하는 방법도 연구되고 있다. 매립지에서 폭발위험을 방지하기 위해 바이오가스를 에너지 회수 없이 단순히 태워버리기도 한다. 이러한 단순 소각방법도 가스 포집정이 설치된 매립지에서 적용 가능하며, 바이오가스 중의 메탄농도가 20% 이상이어야 하고 바이오가스 flux가 10∼15 m3 h-1일 때 적용 가능하다. 또한, 바이오가스 소각시 dioxins과 같은 2차 오염물질이 발생하는 문제점이 있다. 우리나라뿐 만 아니라 선진국에서도 가스포집설비가 설치되지 않은 매립지가 여전히 많으며 시간이 많이 경과하거나 매립 규모가 작아 바이오가스 배출량이 적은 매립지가 많이 존재하다.
가스포집설비가 설치되지 않은 매립지, 시간이 많이 경과하거나 매립규모가 작아 바이오가스 배출량이 적은 매립지의 경우, 온실가스인 메탄 배출을 최소화하기 위해 바이오필터 혹은 바이오커버 등과 같은 생물학적 방법을 활용하고자 하는 연구가 최근 들어 매우 활발하게 진행되고 있다. 이러한 생물학적 방법은 호기적 조건하에서 메탄 산화하여 제거하는 메탄산화세균 활성을 이용하는 것으로, 토양, 퇴비, 토탄 등 다양한 물질을 충전제로 활용하는 바이오필터 혹은 바이오커버가 개 발되고 있다.
따라서, 현장 적용 평가한 바이오필터와 바이오커버의 성능은 매립지 특성, 충전제 종류 및 환경 조건 등에 따라 메탄 제거 효율이 매우 다양한 것으로 알려져 있어, 메탄 제거를 위해서는 효과적인 메탄산화세균과 충전제의 선택이 필수적이라 할 것이다.
본 발명의 목적은 메탄을 분해할 수 있는 신규의 메탄산화세균을 매립지에서 분리 및 동정하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 저감하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 제거할 수 있는 바이오커버(biocover) 및 이를 포함하는 메탄 저감 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 시스템을 이용하여 메탄을 저감하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 제공한다.
본 발명은 또한 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 포함하는 메탄 저감용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감용 조성물이 메탄을 분해시키는 단계를 포함하는 메탄 저감방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감용 조성물을 포함하는, 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄 저감용 바이오커버를 제공한다.
본 발명은 또한 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은
본 발명의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및
상기 바이오커버층을 둘러싸는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은
본 발명의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및
상기 바이오커버층 하부에 적층되는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감 시스템에 시료를 주입하여 메탄을 분해 시키는 단계를 포함하는 메탄 저감방법을 제공한다.
본 발명의 신규 메틸로시스티스 속 미생물은 메탄 또는 휘발성유기화합물에 대한 분해능이 우수하여 메탄을 생물학적으로 분해할 수 있는 매립지 복토층 또는 지표면에 설치되는 바이오커버에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 충전제로 지렁이 분변토를 사용함으로써 메탄 산화 효율을 더욱 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP에 관한 것이다.
본 발명의 미생물은 메탄 또는 휘발성유기화합물의 분해능이 우수한 신규 메탄산화세균으로, 매립지 토양과 농화배양배지, 예를 들어 NMS(nitrate mineral salts) 배지를 첨가한 배양병을 밀봉하고, 탄소원으로 메탄을 주입하되, 배양 동안 질소와 인을 계속적으로 공급한 후 농화배양액을 접종원으로 사용하여 메탄 분해능이 우수한 신규 메탄산화세균, 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6를 분리 동정하고, 2009년 6월 3일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11519BP를 받았다. 상기 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 균주는 메탄 외에도 휘발성유기화합물에 대한 분해능이 우수하다.
본 발명은 또한 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 포함하는 메탄 저감용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 메탄을 제거하기 위해 메탄산화세균으로 본 발명의 신규한 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 메탄 저감용 조성물은 세균 배양액의 배양 환경 조성을 위한 충전제로 토양, 또는 지렁이 분변토 등을 단독 또는 둘 다 사용할 수 있다.
상기 지렁이 분변토는 하수처리과정에서 발생한 하수오니를 지렁이 먹이로 공급하여 생산된 지렁이 분변토로, 6개월 이상 자연 발효/건조과정을 거친 후 불순물을 제거하고 입자 크기가 0.2 내지 2 mm인 것을 사용할 수 있다.
또한, 상기 토양은 논/밭 토양, 산림토양, 또는 습지 토양 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
상기 토양은 표면층에서 100 내지 200 cm 깊이에서 채취한 후, 3 mm 이하의 체로 쳐서 큰 입자는 제거하고 사용할 수 있다.
상기 토양과 지렁이 분변토의 pH는 5 내지 7, 함수량은 1 내지 40%, 유기물 함량은 1 내지 40%로 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.
또한, 상기 토양 및 지렁이 분변토는 중량 대비 50 : 50 내지 90 : 10의 비율로 혼합되는 것이 바람직하다. 상기 함량 범위 내일 경우, 메탄의 저감 효율이 높기 때문이다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감용 조성물이 메탄을 분해시키는 단계를 포함하는 메탄 저감방법에 관한 것이다.
본 발명의 메탄 저감용 조성물은 탄소원으로 메탄을 사용하여 이들을 효과적으로 분해할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감용 조성물을 포함하는, 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄 저감용 바이오커버에 관한 것이다.
본 발명의 메탄 저감용 조성물을 메탄 저감용 바이오커버에 넣어주고 상기 바이오커버와 메탄을 접촉시키면 메탄이 효과적으로 분해될 수 있다.
본 발명의 바이오커버는 본 발명의 메탄 저감용 조성물을 함유하는 바이오 메디아층을
포함할 수 있다.
상기 바이오 메디아층은 메탄을 생물학적으로 분해할 수 있는 메탄산화세균으로 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 포함할 수 있다.
또한, 상기 바이오 메디아층은 메탄의 분해 효율을 높이기 위해 통상의 메탄산화세균을 더 포함할 수 있다. 상기 메탄산화세균으로는 메틸로모나스속(Methylomonas), 메틸로마이크로비움속(Methylomicrobium), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로칼둠속(Methylocaldum), 메틸로파가속(Methylophaga), 메틸로사르시나속(Methylosarcina), 메틸로써머스속(Methylothermus), 메틸로할로비우스속(Methylohalobius), 메틸로스파에라속(Methylosphaera), 메틸로시스티스속(Methylocystis), 메틸로셀라속(Methylocella), 메틸로캅사속(Methylocapsa), 메틸로시너스속(Methylosinus), 또는 메틸로코커스속(Methylococcus) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
또한, 상기 바이오 메디아층은 충전제로 토양 또는 지렁이 분변토를 포함할 수 있다. 상기 토양의 종류, 지렁이 분변토의 제조방법은 전술한 바와 같다.
또한, 상기 바이오 메디아층은 메탄산화세균이 필요로 하는 산소를 공급하여 바이오커버의 두께를 얇게 하기 위하여 산소생성제를 더 포함할 수 있다.
상기 산소생성제는 과산화마그네슘, 과산화칼슘, 또는 과탄산나트륨 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은
본 발명의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및
상기 바이오커버층을 둘러싸는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템에 관한 것이다.
상기 바이오커버층은 메탄산화세균과 지렁이 분변토를 포함하고 있어 메탄을 생물학적으로 분해할 수 있다.
상기 메탄산화세균으로 본 발명의 신규 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 포함할 수 있다.
상기 메탄산화세균은 전술한 통상의 메탄산화세균을 더 포함할 수 있다.
또한, 바이오커버층은 메탄의 산화 효율을 높이기 위해 충전제로 토양 또는 지렁이 분변토를사용할 수 있다. 토양 또는 지렁이 분변토에 대한 구체적인 사항은 전술한 바와 같다.
또한, 상기 바이오커버층의 두께는 50 내지 500 mm 인 것이 바람직하다. 상기 두께가 50 mm 미만인 경우, 메탄산화세균과 메탄가스가 접촉할 수 있는 시간이 짧아 산화작용이 충분히 일어나지 않아 메탄가스가 이산화탄소로 전환되지 못한다. 상기 두께가 500 mm를 초과할 경우, 대기에서 확산되는 산소가 바이오커버층의 저면까지 확산하지 못하여 호기성 조건을 조성할 수 없다.
상기 바이오커버층은 산소를 공급하기 위한 통기층이 둘러싸고 있다. 상기 통기층을 구성하는 성분은 산소 공급이 가능한 입자 크기를 갖는 것이라면 특별히 제한하지는 않는다. 예를 들어, 모래, 또는 자갈로 구성될 수 있다. 또한, 상기 통기층에는 공기를 공급할 수 있는 통기관이 하나 이상 설치되어 있을 수 있다. 상기 통기관을 통해 송풍기로 공기를 주입할 수 있다.
본 발명은 또한 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은
본 발명의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및
상기 바이오커버층 하부에 적층되는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 메탄 저감 시스템은 복토층과 바이오커버층 사이의 산소를 공급할 수 있는 통기층이 적층될 수 있다.
상기 바이오커버층에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 통기층을 구성하는 성분은 산소 공급이 가능한 입자 크기를 갖는 것이라면 특별히 제한하지는 않는다. 예를 들어, 모래, 또는 자갈로 구성될 수 있다. 또한, 상기 통기층에는 공기를 공급할 수 있는 통기관이 하나 이상 설치되어 있을 수 있다. 상기 통기관을 통해 송풍기로 공기를 주입할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 메탄 저감 시스템에 시료를 주입하여 메탄을 분해시키는 단계를 포함하는 메탄 저감방법에 관한 것이다.
본 발명의 메탄 저감 시스템에 메탄가스를 주입할 경우 본 발명의 메탄산화세균과, 충전제로 지렁이 분변토를 사용하여 효과적으로 분해될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 지렁이 분변토의 메탄 저감 효과
본 실시예에서 사용한 토양은 경기도의 논 토양으로, 표면층에서 약 30cm 이상 파낸 뒤 채취하였으며, 채취한 토양을 2 mm 체로 쳐서 큰 입자를 제거하였다. 또한, 지렁이 분변토는 서울 소재 하수처리설비에서 채취하였다. 하수처리과정에서 발생한 하수오니를 지렁이 먹이로 공급하여 생산된 지렁이 분변토로, 6개월 이상 자연 발효/건조과정을 거친 후 불순물 제거 및 입자 크기 선별과정을 거친 평균입자 크기가 0.2-2 mm의 것을 사용하였다.
토양과 분변토의 pH는 각각 6.47±0.08, 5.23±0.13 이었고, 함수량은 2.27±0.11%, 38.09±1.39%, 유기물 함량은 1.71±0.24%, 37.41±1.21%이었다.
<실험예 1> 메탄 산화속도에 미치는 토양 및 지렁이 분변토 혼합비 영향
토양과 분변토 혼합비 차이에 따른 메탄제거속도의 차이를 조사하기 위해, 논 토양과 분변토를 10:0(w/w), 1:9, 2:8, 3:7, 4:6 및 5:5 조건이 되도록 혼합한 뒤, 각각 혼합토양의 함수율이 25%가 되도록 증류수를 첨가하였다. 각각의 혼합토양을 600 mL-혈청병에 50 g씩 첨가한 후, 부틸 러버로 밀폐한 후 메탄가스를 최종농도가 5% (50,000 ppmv)가 되도록 주입하였다. 25℃ 항온조건에 정치배양하면서 주기적으로 혈청병 상부의 메탄 농도 분석하여, 메탄농도가 200 ppmv 이하로 저하 되면, 상기와 동일 농도의 메탄가스를 재주입하였다. 동일한 방법으로 메탄가스 재주입을 5-10회 수행하였고, 재주입에 따른 메탄산화속도를 구하였다.
각 혈청병의 headspace의 가스는 gas-tight syringe(Agilent)를 이용하여 0.5mL 채취한 후 FID(Flame Ionization detector)가 장착된 GC(Gas chromatography, Agilent 6890 plus, USA)를 이용하여 CH4 농도분석을 하였다. 분석 조건은 HP-1 column(30 m × 0.320 mm × 0.25 ㎛), carrier gas(H2 35 mL/min, air 300 mL/min), make-up gas(N2 30 mL/min), split ratio 12:1, 주입부 온도 250℃, 검출부 온도 250℃, 오븐 온도 100℃(2.5분 hold)에서 수행하였다. CH4을 포함하여 산소, 이산화탄소 농도 분석을 위해 TCD (Thermal conductivity detector)가 장착된 GC (Gas chromatography, Agilent 7890A, USA)를 이용하였다. 분석 조건은 Molesive 5A column (30 m×0.53 mm×25 ㎛), carrier gas (He 20 mL/min), make-up gas (He 3 mL/min) split ratio 2:1, 주입부 온도 200℃, 검출부 온도 250℃, 오븐 온도 50℃ (3분 hold), 30℃/min 에서 250℃(2 분 hold)에서 수행하였다.
토양과 분변토의 혼합비에 따른 메탄제거용량 (산화속도)을 도 1에 도시하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 분변토를 혼합하지 않은 토양만의 메탄산화속도는 초기 상태에서 1.5 ㎍·g-day soil-1·h-1이었으며, 농화배양 후에는 4.9 1.5 ㎍·g-day soil-1·h-1으로 향상되었다.
분변토를 토양에 10, 20, 30, 40, 50% (w/w)의 비율로 혼합한 경우 메탄 산화능이 8.6-25.1 ㎍·g-day soil-1·h-1 (6.1-17.9 g·m-3·h-1) 이었다. 이는 지렁이 분변토의 비율을 10%까지 낮추어도 만족할만한 메탄산화능을 얻을 수 있는 것을 보여준다.
Filter bed는 메탄산화세균을 포함한 biofilm이 배양되는 곳이므로 미생물의 생장에 충분한 공간이 필요하며, 높은 함수율을 요구하고, 물리/화학/생물학적인 속성에 잘 부합해야 하며, 저렴할수록 유리하다. 따라서 분변토는 filter bed로써의 요건을 충분히 갖추었으며, 적은 양의 혼합으로도 좋은 메탄 산화능을 얻으므로 바이오커버 및 바이오필터의 소재로 활용 가능함을 확인하였다.
<실험예 2> 메탄 산화능에 미치는 온도 및 수분함량의 영향
논 토양과 지렁이 분변토를 5:5로 혼합한 토양을 대상으로 메탄산화속도에 미치는 온도와 함수율의 영향을 조사하기 위해, 13개의 600 mL-혈청병에 혼합토양(논 토양:분변토=5:5, w/w)을 100 g 씩 주입한 후, 메탄가스를 5%가 되도록 첨가하였다. 25℃ 항온조건에 정치배양하면서 메탄 농도가 200 ppmv 이하로 저하되면 메탄을 재주입하는 과정을 5회 수행하였다. 이렇게 steady state 에 도달한 혼합토양을 각각의 혈청병에서 꺼내 균일하게 혼합한 후(총 1300g 정도), 혼합토양의 함수율이 15% 이하가 될 때까지 3일간 자연건조 시켰다. 자연건조 시킨 혼합토양을 600 mL-혈청병에 50 g씩 분주하였다.
메탄분해능에 미치는 함수율의 영향을 조사하기 위해 혼합토양을 50 g씩 넣은 혈청병의 혼합토양의 함수율이 15, 20, 25, 30, 35 및 40%가 되도록 증류수를 첨가한 후, 밀폐하였다. 메탄가스를 주입하고 (최종농도: 50,000 ppmv), 25℃에서 정치배양하면서 주기적으로 혈청병 상부의 메탄 농도 분석하여, 메탄농도가 200 ppmv 이하로 저하되면, 동일 농도가 되도록 메탄가스를 재주입하였다. 이러한 방법으로 재주입을 5회 수행하였으며, 시간에 따른 메탄농도감소를 계산하여 메탄산화속도를 계산하였다. 각 함수율 조건 별로 혈청병을 2 세트씩 준비하여 실험을 수행하였다.
한편, 메탄산화능에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해 혼합토양을 50 g씩 넣은 혈청병의 혼합토양의 함수율이 25%가 되도록 증류수를 첨가한 후, 밀폐 후 메탄가스를 주입하였다(최종농도: 50,000 ppmv). 각 혈청병을 15, 20, 25, 30, 35 및 40℃에서 정치배양하면서, 메탄분해속도를 측정하였다. 각 온도 조건 별로 혈청병을 2 세트 준비하여 실험을 수행하였다. 온도 영향 실험 역시 함수율 영향 실험과 동일하게 메탄을 5회 재주입하여 각 주입시의 메탄분해속도를 계산하여 평균값을 구하였다.
논 토양과 분변토 혼합토양의 메탄산화특성을 상세하게 조사하기 위해 혈청병 실험을 수행하였다. 우선, 혼합토양에서 물리적/화학적 반응에 의해 메탄이 제거되는지 조사하기 위해 혼합토양을 멸균하여 메탄 제거 여부를 조사한 결과 물리적 흡착이나 화학적 반응에 의한 메탄 제거는 관찰되지 않았다(미도시됨).
또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 혼합토양의 메탄 제거 특성을 조사한 결과, 혼합토양에서 첫 번째 메탄 주입 시 약 2일의 lag period 후에 메탄이 제거되었으나, 두 번째 메탄 재주입부터는 lag period 없이 메탄 제거가 관찰되었다(도 2a). 이 결과는 논 토양보다는 분변토에 메탄분해에 관여하는 미생물이 더 많은 것으로 사료된다. 따라서 분변토는 메탄제거 시스템에 있어 우수한 접종원 중의 하나로 사료된다.
또한, 메탄의 농도 감소와 더불어 산소 농도와 이산화탄소 농도 역시 증가하였으나, 메탄을 주입하지 않는 경우에는 이산화탄소 농도 증가가 관찰되지 않았다(도 2b). 이는 메탄이 메탄산화세균에 의해 분해되어 이산화탄소로 배출되었음을 의미한다. 메탄산화세균은 CH4을 CO2로 완전 산화시키는 에너지대사 경로를 따르거나 세포구성물질로 변화시키는 물질대사경로를 따르게 된다: CH4 + 2O2 Biomass + CO2 + 2H2O 즉, CH4 산화 생성물인 HCHO를 세포물질 합성을 위해서도 사용함으로써 이론적으로 CH4 한 분자당 CO2 생성량은 한 분자 이하가 된다. 따라서 메탄산화세균에 의해 CH4이 CO2로 산화되기는 하나, 일부는 물질대사를 거침으로써 온실효과 기체의 총량 자체를 줄일 수 있다는 것이다. 본 실험예에서 습도 25%, 온도 25℃의 조건에서 CH4 소모량에 대한 CO2 발생량의 비가 0.46이었으며, 함수율이 40%일 때는 0.97로 측정되었다. 따라서 모든 CH4이 같은 농도의 CO2로 산화되는 것은 아님을 확인하였으며, 이러한 사실은 지구온난화 방지 측면으로 볼 때, 지구온난화 가스의 총량을 저감할 수 있다는 점을 공학적으로 이용할 수 있는 가능성을 보여주고 있다.
메탄의 농도 별로 토양과 지렁이 분변토의 혼합비율이 5:5인 혼합토양을 이용하여 함수율 변화에 따른 메탄산화능의 영향을 도 3a에 도시하였다. 수분함량이 25%일 때의 메탄산화속도는 559.5 ㎍·g-dry soil-1·h-1 이었으며, 25%보다 높거나 낮은 수분함량에서는 수분함량이 25%일 때의 57~78%의 상대값을 보였다. 그러나 지렁이 분변토와 논 토양의 혼합토양은 수분함량이 15~40%의 넓은 범위에서 메탄을 효과적으로 제거하였다. 일반적으로 매립지의 수분함량이 7~45%까지 폭넓게 분포함을 고려할 때, 지렁이 분변토 혼합토가 바이오커버(biocover) 소재로 적합함을 알 수 있다.
또한, 메탄 산화에 대한 수분함량의 영향을 조사한 결과, 지렁이 분변토 혼합토양의 수분함량이 15~40%일 때의 메탄제거용량은 landfill soil의 4.4~7.8배 이상이므로 다른 보고에 비하여 월등히 높은 성능을 보인다.
메탄산화속도에 미치는 온도의 영향은 도 3b에 도시하였다. 메탄 산화를 위한 최적 온도는 25℃로 농화배양 후 메탄산화속도가 504.8 ㎍·g-dry soil-1·h-1 이었다. 25℃ 이하로 온도가 감소함에 따라 메탄산화능이 급격하게 저하되었으며 15℃에서는 25℃의 약 26%로 감소하였다. 하지만 25℃ 제외한 20~40℃의 범위에서 메탄산화속도는 129 내지 380 ㎍·g-dry soil-1·h-1으로 비교적 넓은 온도범위에서 우 수한 메탄산화능을 얻을 수 있었다.
이 결과로 볼 때 메탄산화세균은 중온성 미생물로 볼 수 있다. 매립지 내부는 계절별 온도 변화에 큰 차이가 없지만, 메탄산화세균의 서식이 가장 왕성할 것으로 예상되는 깊이 10~30 cm의 복토층은 대기 중의 공기와 직접적으로 맞닿는 부분이 있기 때문에 온도변화가 나타난다. 동절기의 복토층의 최상단 온도가 평균적으로 약 15℃를 유지하므로, 바이오커버의 매립지 적용이 가능하다고 할 수 있다.
본 실험에서, 메탄산화능이 유효하게 나타난 범위인 15~40℃에서 높은 산화능을 나타냈다.
<실험예 3> 미생물 군집 분석
(총 DNA 추출)
분변토(RES), 논 토양(RPS), 혼합토양(EEPS, earthworm cast:paddy=5:5)으로부터 Fast DNA SPIN for Soil Kit (MP Biomedical)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 PCR 재료로 사용되기까지 -20℃에 보관되었다.
(PCR 증폭)
RPS, RES, EEPS에서 추출된 DNA는 16S rRNA 유전자와 pmoA 유전자를 증폭하기 위해 각각 사용되었다. 약 200 bp의 16S rRNA 유전자 단편은 40-bp GC clamp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G)가 붙은 primer 341f (CCT ACG GGA GGC AGC AG)와 518r (ATT ACC GCG GCT GCT GG)을 이용한 PCRdmf 통하여 증폭하였다. pmoA 유전자에 의해 코딩된 불가용성 메탄산화효소 (particulate methane monooxigenase, pMMO 약 510 bp)의 단편은 6-FAM (6-carboxyfluorescein)로 염색된 프라이머 A189f (GGN GAC TGG GAC TTC TGG)와 mb661r (CCG GMG CAA CGT CYT TAC C)을 이용한 PCR을 통하여 증폭하였다. PCR은 50-㎕의 반응액에서 수행되었으며 그 성분은 다음과 같다: 100 ng DNA, 0.2 mg BSA, 0.4 mM 각 primer, 1×Ex Taq 버퍼, 0.75 U Takara Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa Bio Inc.), 200 mM dNTP. PCR은 GeneAmp®PCR system Model 2700 (PE Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였고 그 조건은 다음과 같았다: 초기 변성 95℃, 5분; 35 사이클- 변성 95℃, 30초, 풀림 55℃ 또는 60℃, 30초, 증폭 72℃, 30초; 마지막 단계에서 72℃, 10분. 각 PCR 산물은 1% 아가로우즈 겔에서 확인하였고, QIAquick PCR purification kit (Qiagen)을 이용하여 정제하였다. DGGE와 염기서열 분석을 통한 각 토양의 우점 메탄산화세균을 확인하기 위해, 1차 pmoA-PCR 산물을 재료로 하여, 2차 pmoA-PCR를 위의 조건과 동일하게 수행하고 그 산물을 정제하였다.
(DGGE 분석)
RES, RPS, EEPS 각 토양의 일반 미생물을 분석하기 위해, 정제된 16S rRNA 유전자 단편들(약 200 bp)을 8% 폴리아크릴아마이드 젤(40∼60% 농도구배의 우레아와 탈이온화된 포름아마이드)에 전기영동 하였다. 약 6 mg의 16S rRNA 유전자 단편들을 사용하였고, DCodeTM system (BioRed)을 이용하여 60℃로 데워진 1× TAE 버퍼 (10 mM Tris base, 20 mM sodium acetate, 1 mM EDTA) 속에서 50 V로 15 시간 동안 전기영동 하였다. 젤 상에서 분리된 유전자 단편들은 SYBR GOLD 용액 (Invitrogen) (1/10000 in 0.5×TAE 버퍼)으로 염색한 후, UV-illuminator를 이용하여 확인하였다. 각 토양 샘플의 DGGE 밴드 양상 간의 유사성을 GelCompa II software version 3.0 (Applied Maths, Inc.)를 이용하여 분석하고, 각 밴드의 상대적 출현빈도를 수치적으로 얻었다. 그 수치를 이용하여 DGGE 밴드 분석에서의 미생물 다양성 지수로, Shannon diversity Index (H) 를 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
H = - ∑ P i log P i
P i, 전체 밴드 강도 총합에 대한 각 밴드의 상대강도를 나타낸다.
정제된 2차 pmoA-PCR 산물을 6% 폴리아크릴아마이드 젤(40∼80% 농도구배의 우레아와 탈이온화된 포름아마이드)에 전기영동 하였다. 조건은 60℃ 1×TAE 버퍼 속에서 100V로 15 시간 동안 전기 영동 하였다. 밴드강도로써 우점 밴드들에서만 동결-해동 방법으로 DNA 단편을 추출하고, 추출된 pmoA 유전자 단편은 primer A189f-GC 와 mb661r를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 pmoA 유전자 단편은 QIAquick PCR purification kit을 이용하여 정제하고 primer mb661r로 BigDye v3.1 와 ABI auto sequencer 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystem)로 염기서열을 결정 하였다.
(pmoA-based T-RFLP 분석)
RES, EPS, EEPS의 DNA로부터 유래된 6-FAM 염색 pmoA 유전자 단편들을 정제하고, 약 200 ng을 각각의 제한효소 Msp I 와 Hha I(BEAMS Biotechnology) 20 U로 37℃에서 하룻밤 처리하여 절단하였다. 말단 제한단편(T-RF)들이 크기 분포를 denaturing polyacrylamide 젤(6 M 우레아와 5% 폴리아크릴아마이드)에 ABI 377 DNA auto sequencer를 이용하여 전기영동 하였다. 50∼500 bp의 T-RFs 만 선택하여 GENESCAN analytical software(ABI)를 이용하여 분석하였다. 선택된 단편 사이즈들의 피크 넓이는 50 relative fluorescent units(RFU) 이상을 가진 피크들만 고려되었다. 전체 피크넓이 총합대비 각 단편 피크 넓이를 계산하였고, 그 수치를 이용하여 principal component analysis (PCA)를 소프트웨어 SPSS version 12.0K(SPSS Inc.)로 수행하였다.
(pmoA-based PCR 클로닝 및 시퀀싱)
EEPS DNA로부터 유래한 pmoA 유전자 단편을 정제하고, pGEM-T-Easy vector system(Promega)을 이용하여 클로닝 하였다. 클로닝 벡터로 cell-pulser electroporator (GIBCO BRL.)를 이용하여 E. coli DH5α를 형질전환 시키고, 선택배지 (LacZ/X-gal, ampicillin)에서 형질전환된 흰색 콜로니만을 선별 하였다. 선별된 콜로니를 50 ㎕의 증류수에 현탁한 후, 95℃에서 30분 동안 끓이고 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 클론-벡터가 포함된 상등액 1 ㎕를 이용하여 primer A189f and mb661r와 함께 PCR 을 수행하였고, 증폭된 pmoA 유전자 단편은 정제 후 염기서열을 primer A189f로 결정하였다.
(계통발생학적 분석)
EEPS-pmoA 유전자 염기서열들은 GenBank database에 있는 pmoA 유전자의 핵산과 아미노산 서열과 Blastn and Blastx 검색을 통하여 비교 동정 하였다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). 샘플의 pmoA 유전자 염기서열과 비교 동정된 pmoA 유전자 염기서열을 the software BioEdit version 7.0.9.0. (BioEdit Sequence Alignment Editor)을 이용하여 정렬시키고, 유사정렬된 부분의 염기서열 (>450 bp)들만 software MEGA version 4(Tamura et al., 2007)를 이용한 계통수 작성에 적용하였다. 그 계통수는 Neighbor-Joining method 와 Substitution model; amino acid position correction을 이용하여 bootstrap 1000 반복을 통해 계산 작성 하였다.
(뉴클레오티드 서열 인증번호)
본 실험을 통해 얻은 불용성 메탄산화효소(particulate methane monooxigenase, pmoA) 염기서열은 GenBank database에 다음과 같은 인증번호로 수록되었다: 인증번호: EEPS pmoA-DGGE 밴드 염기서열, FJ775131부터 FJ775133 EEPS pmoA-clone 염기서열, FJ775134부터 FJ77513164.
본 실험에서는 논 토양(RPS), 지렁이 분변토(RES), 혼합토양(EEPS)의 메탄 농화배양 후, 이들로부터 증폭한 16s rRNA gene amplicons을 이용하여 DGGE 방법으로 일반 미생물 군집의 다양성을 조사하였다(도 4). 이들 다양성 지수 (H')는 각각 RPS=3.32, RES=3.18, RESS=3.35 이었다. 그리고, 일반미생물의 DGGE band cluster 유사성은 각각 RPS와 EEPS가 71.43 %, RPS와 RES가 58.00%, RES와 EEPS가 64.59%이었다. DGGE band들의 상대적 다양성을 이용한 PCA 분석에서 EEPS의 일반 미생물군집은 RES보다는 RPS의 일반 미생물군집과 가까운 관계를 보였다 (도 4a). 이러한 결과는 EEPS의 일반 미생물군집이 RES 보다는 RPS의 일반 미생물군집에서 유래되었음을 암시한다.
실제 토양에서 메탄산화를 위한 메탄산화효소들의 활성은 pmoA 유전자에 의 해 코딩된 불가용성 메탄산화효소 (particulate methane monooxigenase, pMMO)가 mmoX 유전자에 의해 코딩된 가용성 메탄산화효소 (soluble methane monooxigenase, sMMO)보다 더 광범위하게 실제활성을 보일 것으로 생각되고 있다. 본 실험에서는 RPS, RES, EEPS에 존재하는 메탄산화세균의 다양성을, pmoA-유전자를 증폭하고 제한효소 Msp I와 Hha I 로 처리한 T-RFLP 방법으로부터 얻어진 T-RFs 를 PCA 방법으로 조사하였다. 그 결과 EEPS의 메탄 산화세균군집은 RPS보다는 RES의 메탄 산화세균군집에 가까웠다 (도 4b). 이는 흥미로운 발견으로, EEPS의 메탄 산화세균군집이 RPS보다는 RES의 메탄 산화세균군집으로부터 유래했음을 암시한다. 상기에서 언급했듯이, 이와는 상반되게, EEPS의 일반 미생물군집은 RES보다는 RPS의 일반 미생물군집에서 유래했음이 암시되었다. 이러한 결과는 지렁이 분변토가 메탄산화세균의 훌륭한 자원임을 증명한다.
또한, EEPS에서 추출된 DNA로부터 유래한 pmoA 유전자 클론 라이브러리에서 31 개의 pmoA 클론을 무작위로 선별하여 그 염기서열을 결정하고 비교 분석하였다. BLAST를 이용한 조사 결과, 31 개 모두 메틸로시스속(Methylocystis)(type II methanotrophs)에 속하였으며, 이들의 계통수는 도 5에 도시하였다. 이와 함께, RPS, RES, EEPS의 메탄 산화세균 우점종을 밝히기 위해, 2차 pmoA-PCR 산물의 DGGE에서 밴드 (밝기)강도로 3개의 우점 pmoA-DGGE 밴드 (EEPS pmoA-DGGE band EBL1-band EBL3)가 선별되었으며, 이들의 염기서열을 결정하고 비교분석 하였다.
BLAST를 이용한 조사 결과, EEPS pmoA-DGGE 밴드 EBL1 과 밴드 EBL2는 메틸로칼둠속 (Methylocaldum sp.)(type I methanotrophs)에 가장 밴드 강도가 높았던 EEPS pmoA-DGGE 밴드 EBL3은 메틸로시스티스속(Methylocystis) (type II)에 속하였다 (미도시됨). 반면, RES와 EEPS에서 출현한 EEPS pmoA-DGGE 밴드 EBL2는 RPS에서는 출현하지 않았다. 이러한 결과로 지렁이 분변토가 일반토양 (논 토양, RPS) 보다는 메탄 산화세균 농화에 더욱 직접적으로 기여하였음을 확인하였다.
계통수에서 보듯이(도 5), EEPS에서 농화배양된 우점 메탄 산화세균(pmoA-methanotrophs)들은 메틸로칼둠속(Methylocaldum sp.) (type I) 과 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) (type II)에 속하였다. 따라서, EEPS에서는 type I 및 type II 메탄산화세균이 메탄 산화에 관여하였음을 알 수 있다.
EEPS에서의 농화와 우점으로 볼 때, 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) (type II)이 이에 속하는 pmoA 클론의 수와 pmoA-DGGE 밴드의 강도를 기준으로 메틸로시스티스속(Methylocystis)이 메탄 산화세균의 우점으로 추정된다.
한편, 메틸로시스티스속(Methylocystis)이 메탄산화세균의 우점으로 추정된 결과는 흥미롭다. 왜냐하면, EEPS 메탄 산화세균 농화배양 환경은 type I 메탄산화세균에게 유리한, 산소풍족과 저농도 메탄 (5%), 영양풍족 (지렁이 분변토)의 환경이었기 때문이다. 하지만, 이 결과가 예상할 수 없는 것만은 아니다. 왜냐하면, 메탄산화세균의 다양성은 어느 한 가지의 환경요인보다는 다음과 같은 여러 가지 환경요인에 의해 복합적으로 결정되기 때문이다: 메탄 농도와 산소 이용성, 온도, 질소원, 토양재질과 함수량, 그리고, 지금까지 보고된 결과에 의하면 type I 과 type II 메탄산화세균이 메탄 농도가 높고 낮음에 따라 서로 독립적으로 우점할 수 있다는 증거가 없다.
<실시예 2> 매립지 토양으로부터 메탄 산화 컨소시엄 배양
메탄 산화 컨소시움을 얻기 위해 매립지로부터 토양을 채취 하였다. 토양 채취 장소는 충청남도 공주로, 매립가스가 계속 배출되고 있는 활동적인 매립지로 표면으로부터 약 10 cm 깊이에서 흙을 채취하였다. 채취한 흙은 아이스박스에 넣어 운반하였고 4℃에서 보관하였다.
메탄 산화 컨소시움을 얻기 위해 다음과 같이 농화배양을 수행하였다. 600 mL-혈청병에 매립지 토양 (wet landfill soil) 8 g과 nitrate mineral salts (NMS) 배지 20 mL을 넣고 고무마개로 밀봉하였다. 밀봉된 혈청병에 유일 탄소원으로 메탄 5% (v/v)를 주입하였고 혈청병은 30℃, 180 rpm에서 배양하였다. 한번 주입한 메탄이 100% 제거되면 혈청병 고무마개를 열어 1시간 동안 공기포화를 시켜 주었고, 공기포화 후 고무마개를 닫고 메탄을 동일한 농도로 주입하였다. 질소와 인의 고갈에 따른 저해를 막기 위해 재배양 2번 수행 후 공기포화할 때 질소와 인 농축액을 각각 1 mL씩 넣어주었다.
NMS 배지 조성은 다음과 같다 (MgSO4·7H2O 1 g/L; CaCl2·2H2O 0.295 g/L; KNO3 1 g/L; KH2PO4 0.26 g/L; 0.41 g/L). 질소와 인 농축액은 NMS 배지조성을 참고하였고, 질소는 KNO3를 100 mL 증류수에 2 g을 인은 100 mL 증류수에 KH2PO4 0.52 g과 Na2HPO4·12H2O 1.65 g을 넣어 제조하였다.
농화배양을 진행하면서 메탄이 분해되는지 확인하고자 1 mL gas tight syringe를 이용하여 혈청병의 headspace에서 0.3 mL씩 채취하였다. 채취가스는 왁스컬럼 (Supelco, 30×0.32mm×0.25㎛)이 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent 6850N, USA)-불꽃 이온화 검출기를 이용하여 분석하였다. 분석 온도는 오븐 100℃, 주입부와 검출부는 230℃ 이었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 매립지 토양을 이용하여 농화배양한 메탄 산화(분해) 농화배양액은 5% 메탄을 65시간 이내에 100% 분해하였고, 농화배양액의 메탄 분해 속도는 4.95±0.26 μmole·g-dry soil-1·h-1 이었다. 실험 결과로부터 이 농화배양액이 메탄을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다.
메탄 산화 컨소시움의 미생물 군집을 알아보고자 초기 토양 및 컨소시움으로부터 DNA를 추출하였다. 초기 토양의 미생물 군집 분석을 위해 약 0.5 g 토양 (wet soil)을 BIO101 kit를 이용하여 추출하였다. 메탄 산화 컨소시움 시료는 메탄이 완전히 분해된 후 배양액 1 mL을 14,000×g에서 5분간 원심분리하여 침전물에서 DNA를 추출하였고 토양과 마찬가지로 BIO101 kit을 이용하였다. DNA 추출은 BIO101 kit 방법에 따라 수행하였고 모든 샘플은 2 반복씩 추출하였다.
메탄분해세균의 군집 구조를 알아보고자, PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) 기법을 이용하였다. 메탄분해세균을 증폭하는데 사용한 프라이머 쌍은 A189fGC (5’- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G GGN GAC TGG GAC TTC TGG-3’)와 mb661r (5’-CCG GMG CAA CGT CYT TAC C-3’) 이었다. 증폭 조건은 첫 번째 단계에서 초기변성이 96℃에서 5 분, 두 번째 단계에서 변성 96℃ 1 분, 풀림 58℃ 1 분, 증폭 72℃ 1 분을 40 회 수행하였고, 마지막 단계에서 72℃ 5 분으로 실험하였다. 증폭된 DNA 농도를 200-300 ng/㎕로 맞춘 후 6% 폴리아크릴아마이드 젤에 주입하였다. 우레아의 변화는 35-70%였고 60℃, 50 V에서 17시간 운전하였다. DGGE 실험 후 젤로부터 밴드를 잘랐고, 자른 젤에서 DNA를 추출하였다. 젤로부터 DNA를 추출하기 위해서 멸균수 30 ㎕를 첨가하고 -20℃에서 얼렸다. 그 후 70℃에서 3분간 녹이고 잘 섞어 주었다. 다음의 과정을 3번 반복한 후 상등액의 DNA를 증폭하였고, 증폭 시 사용 프라이머는 A189fGC primer에서 GC 부분을 제외한 프라이머를 사용하였다. 증폭 조건은 위와 동일하다. 증폭된 DNA의 염기서열을 분석하여 농화배양액의 메탄분해세균의 군집을 알아보았다.
메탄 산화 컨소시움을 PCR-DGGE로 분석한 후 얻은 클론의 염기서열을 분석하여 동정한 결과, 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.), 메틸로시너스속(Methylosinus sp.), 및 메틸로마이크로비움 알붐(Methylomicrobium album) 등과 같은 메탄산화세균이 우점종임을 확인하였다(도 7).
<실시예 3> 신규의 메탄산화세균 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 분리 및 동정
메탄 분해 순수균을 분리하기 위해 농화배양액을 접종원으로 사용하여 실험을 수행하였다. 9 mL 0.9% NaCl 용액에 농화배양액 1 mL을 넣고 연속 희석 방법을 이용하여 희석하였다. 희석된 용액을 NMS 한천 배지에 도말한 후 데시케이터에 넣고 20% 메탄을 첨가 후 30℃에 배양하면서 균주 성장을 관찰하였다. 성장된 콜로니를 4 mL의 NMS 배지가 포함된 혈청병에 접종하고 고무마개로 막은 후 메탄을 5% 주입하였다. 주입 후 headspace의 메탄 농도를 시간에 따라 분석하여 메탄 분해능을 확인하였다. 분석방법은 상기 실시예 2와 동일하다.
메탄 분해 순수균을 동정하기 위해 상기 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 27f (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)와 1492r (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC-3’)를 이용하여 증폭하였다. 증폭 조건은 상기 실시예 2와 같고 증폭된 시료를 염기서열 분석하여 동정하였다.
메탄 산화 컨소시엄으로부터 메탄을 분해할 수 있는 순수균을 얻고자 NMS 아가 배지에 컨소시엄을 접종하고 20% 메탄이 포함된 데시케이터에서 배양하였다. 배양된 배지에서 메탄을 분해할 수 있는 균주 M6을 분리하였고, 16S rDNA 부분 염기서열 분석결과 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.)에 속하였다. M6 균주의 염기서열 결과는 표 1과 같고 M6 균주와 유사한 계통발생학적 트리 결과는 도 8에 도시하였다. 분리 균주는 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.)으로 동정되었다. 이러한 결과로 볼 때, 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 균주가 농화배양액에서 우점하며 메탄을 분해하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6의 메탄 분해 특성을 알아본 결과 M6 균주는 5% 메탄을 3일안에 완전히 분해하였다. 이때 메탄의 분해속도는 9.98 mmole·L-1·h-1 이었다 (도 9).
따라서, 메탄에 대한 분해능이 우수한 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6을 2009년 6월 3일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11519BP를 받았다.
<실시예 4> 신규 균주를 이용한 바이오커버
매립지의 복토층을 실험실 규모로 모사하여 CH4 산화특성을 규명하기 위하여 실험실 규모의 바이오커버 (biocover)를 제작하여 실험하였다. 본 실험에서 사용된 컬럼은 총 3개의 층으로 구성되었으며, 지름 20 cm, 높이 50 cm의 충전부 2개와 지름 20 cm, 높이 30 cm의 환기부로 이루어져있다. 바이오커버는 PVC 재질로 제작되었으며 상세한 장치의 구성도를 도 10에 도시하였다.
각 충전부의 밑부분은 PVC 재질의 다공판과 20 cm 직경의 고무 필터를 50 cm 높이로 올려 CH4/CO2 혼합가스가 유입부분에서 최대한 균일하게 확산될 수 있도록 하였다. 산림토양과 지렁이 분변토를 75:25(w/w)로 혼합한 토양을 2단의 충전부에 충전하였다. 또한, 상기 실시예 3에서 개발한 미생물 컨소시움 배양액 300 mL(1.3×108 cells/mL)을 충전부에 첨가하였다. 지렁이 분변토 혼합 효과를 검증하기 위한 대조군으로 지렁이 분변토를 혼합하지 않은 산림토양만을 충전한 바이오커버를 준비하였다.
시료 주입 포트는 10 cm 마다 gas-tight valve를 설치하고 출구에 GC 분석용 셉툼(septum)을 끼워서 컬럼 내의 혼합가스 누출을 최대한 방지하였다. 컬럼 상부에는 공기를 200 mL/min의 유량으로 계속적으로 흘려주어 대기층의 묘사와 매립지의 자연적인 토양층 redox gradient를 모사하였다. 합성 매립가스의 농도는 40% CH4와 60% CO2를 사용하였으며 하단에서 상부 방향으로 10 및 20 mL/min로 공급하였다. 모든 실험은 20±5℃의 실험실에서 운전하였다.
실험실 규모의 바이오커버에 40% CH4와 60% CO2 (v/v)의 혼합가스를 10 mL/min의 속도로 공급한 경우, 시간 별로 바이오커버 표면 층에서 검출된 CH4 농도를 도 11에 도시하였다.
또한, 메탄 산화가 안정적으로 관찰되는 시점에서의 바이오커버 각 높이 별로 O2, N2, CH4 그리고 CO2의 농도변화를 도 12에 도시하였다.
바이오커버의 하단(-0.5∼-1 m)은 혐기성 상태로 상부의 환기부에서 유입되고 있는 공기가 하단까지는 충분히 확산되지 못하므로 CH4 역시 거의 대기로 희석되지 않았다. 또한, O2의 농도가 거의 없는 혐기성 환경이므로 메탄산화세균 (methanotrophs)의 활성 역시 미미한 것으로 판단된다. CH4의 농도가 1% (v/v) 이상이고, O2의 농도가 약 1% (v/v)정도로 낮을 때에는 type Ⅱ 메탄산화세균이 type Ⅰ 메탄산화세균 보다 생장률이 우세하므로 미생물에 의한 CH4 산화가 전무하다고는 할 수 없다.
두 개의 바이오커버 모두 공기가 확산되어 조성된 호기성 상태인 높이 0∼-0.3 m에서 대부분의 CH4가 산화되었다. 논 토양만 충전한 바이오커버 표면에서는 60,000 ppmv의 CH4가 분해되지 않고 배출되어 약 85%의 메탄산화율을 보였다. 그러나, 논 토양과 지렁이 분변토를 혼합한 바이오커버 (토양 75% + 지렁이 분변토 25%) 표면에서는 약 5,000 ppmv의 CH4가 배출되어 약 99%의 메탄산화율을 확인하였다. 그런데, 이 바이오커버에서 12일차 이후로 채널링 현상이 심화되어 메탄 배출량이 증가하였으나, 충전물을 모두 꺼내 재충전한 이후에는 메탄산화효율이 회복됨을 알 수 있었다.
토양 100% 및 토양과 분변토 혼합한 바이오커버의 밀도는 각각 0.83, 0.76이었고, 유기물 함량은 각각 13.6±1.23%, 23.09±0.60% 이었다. 이러한 결과로부터 지렁이 분변토를 혼합 시 필터 베드의 밀도가 낮아져 공기의 확산이 원활히 이루어졌음을 알 수 있었고, 산림 토양보다 유기물이 풍부하므로 메탄산화세균의 생장 및 활성을 높인다고 사료된다. 따라서 지렁이 분변토가 혼합된 복토재를 적용할 때 현재보다 더 얇은 최종복토층을 적용하면서도 높은 메탄산화율도 도출할 수 있음을 확인하였다.
실험실 규모의 바이오커버에 40% CH4와 60% CO2 (v/v)의 혼합가스를 20 mL/min의 속도로 공급한 경우, 시간 별로 바이오커버 표면 층에서 검출된 CH4 농도를 도 13에 도시하였다.
또한, 메탄 산화가 안정적으로 관찰되는 시점에서의 바이오커버 각 높이 별로 O2, N2, CH4 그리고 CO2의 농도변화를 도 14에 도시하였다.
<실시예 5> 신규의 메탄산화세균 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6의 오염물질 분해
메탄의 분해능이 우수한 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 의 다른 탄화수소화합물 이용가능성을 알아보기 위하여 총 14개의 물질을 선택하여 이 물질들에 대한 M6의 분해능 또는 성장능을 조사하였다.
기질 테스트에 사용될 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 균주는 R2A 배지에서 대량 배양되어 세척 후 NMS 배지에 옮겨 접종되었다. 이는 120 mL-혈청병에 4 mL씩 분주되었고, 고무마개로 막은 후 각 물질을 1 ㎕씩 주입하였다. 단 OD600 값의 측정하기 위한 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 디젤 분해 확인용 M6 균주는 600 mL-혈청병에 20 mL씩 분주되었고, 고무마개로 막은 후 각 물질은 10 ㎕씩 주입되었다. 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 디젤을 이용한 성장능은 OD600 값의 측정을 통해 분석이 이루어졌고, 나머지 10가지 물질의 분해능은 기질의 농도 측정을 통해 분석이 이루어졌는데 이 때 50 ㎕ gas tight syringe를 이용하여 혈청병의 headspace에서 30 ㎕씩 채취하여 왁스컬럼 (Supelco, 30×0.32 mm×0.25 ㎛)이 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent 6850N, USA)-불꽃 이온화 검출기를 이용하였다. 분석 온도는 오븐 100℃, 주입부와 검출부는 230℃ 이었다.
표 2에 나타난 바와 같이, 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 균주는 m-자일렌, p- 자일렌, 메탄올 및 에탄올을 분해할 수 있었다.
<실시예 6> 메탄 저감 시스템
본 발명에 의한 바이오커버를 이용한 메탄 저감 시스템은 다음과 같이 제조하였다.
바이오커버의 재료는 일반 토양과 지렁이분변토의 혼합비를 중량 대비 75:25의 비율로 사용하였고, 메탄산화세균으로 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6를 사용하였다.
또한, 메탄산화세균이 필요로 하는 산소를 공급하여 바이오커버층의 두께를 얇게 하기 위하여 산소생성제인 과산화마그네슘(MgO2), 과산화칼슘(CaO2)을 혼합하여 바이오커버 층을 제조할 수도 있다.
도 15a는 본 발명에 따라 매립지의 복토층이나 지표면 위에 설치되는 바이오커버의 설치 예를 보여주는 단면이다. 바이오커버를 이용한 메탄 저감시설은 매립층, 복토층, 바이오커버층, 및 식재층으로 구성되며, 바이오커버층에 산소를 공급하기 위한 방법으로 바이오커버층에 공기를 공급할 수 있도록 모래 및 자갈층으로 둘러싸인 통기관을 설치하고 송풍기로 공기를 공급할 수 있도록 구성하였다.
도 15b는 본 발명에 따라 매립지의 복토층이나 지표면 위에 설치되는 또 다른 바이오커버의 설치 예를 보여주는 단면이다. 바이오커버를 이용한 메탄 저감시설은 매립층, 복토층, 모래 및 자갈층, 바이오커버층, 및 식재층으로 구성되며, 바이오커버층에 산소를 공급하기 위해 복토층과 바이오커버층 사이의 모래 및 자갈층에 공기를 공급할 수 있는 통기관을 설치하고 송풍기로 공기를 공급할 수 있도록 구성하였다.
도 1은 지렁이 분변토 혼합비율에 따른 메탄 산화속도를 비교한 것으로, (a) 초기, (b) 활성을 나타낸다.
도 2는 토양 및 분변토 혼합토양의 메탄 산화 특성을 나타낸 것이다.
도 3은 메탄산화속도에 미치는 수분 함수량(a)과 온도의 영향(b)을 나타낸 것이다.
도 4는 논토양, 분변토 및 혼합토양의 세균 군집 특성을 비교한 것으로, (a) 일반세균, (b) 메탄산화세균을 나타낸다.
도 5는 분변토 시료의 pmoA-clone과 pmoA-DGGE band clone의 계통발생학적 연관성을 나타낸 것이다.
도 6은 매립지 농화배양액의 메탄 분해를 나타낸 것으로, 기호 ●, 실험군 ○, 대조군을 나타낸다.
도 7은 매립지 농화배양액으로부터 얻은 클론의 계통발생학적 트리를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6 균주의 계통발생학적 트리를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 메틸로시스티스속(Methylocystis sp.) M6의 메탄 분해 특성을 나타낸 것이다.
도 10은 실험실 규모의 바이오커버 및 실험실 규모의 바이오커버 설치 도면을 나타낸 것이다.
도 11은 바이오커버 표면에서 배출되는 메탄 농도를 비교한 것이다 (40% CH4+60% CO2(v/v) 혼합가스 유량: 10 mL/min).
도 12는 바이오커버 각 높이 별로 O2, N2, CH4 및 CO2 농도변화를 나타낸 것이다 (40% CH4+60% CO2(v/v) 혼합가스 유량: 10 mL/min).
도 13은 바이오커버 표면에서 배출되는 메탄 농도를 비교한 것이다 (40% CH4+60% CO2(v/v) 혼합가스 유량: 20 mL/min).
도 14는 바이오커버 각 높이 별로 O2, N2, CH4 및 CO2 농도변화를 나타낸 것이다 (40% CH4+60% CO2(v/v) 혼합가스 유량: 10 mL/min).
도 15는 매립지에 설치하기 위한 본 발명의 바이오커버를 포함하는 메탄 또는 휘발성유기화합물 저감 시스템을 나타낸 것이다.
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<211> 1357
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<213> Methylocystis sp.M6
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1357)
<223> 16S rDNA from Methylocystis sp. M6
<400> 1
tgcagtcgag cgatcacacc atgtcgtggc ccttcatagt tgagtgcgga cgggtaacac 60
gcccttcggc tcccaagtct cagggtaact tgacctcata ccggatacgc ccttttggga 120
aaagatttaa tgccgaatga tgggcccaag accgattagg tcgttggtgt gttaatggcg 180
cacccaggcg acgatgggta gctggtctga gaggatgatc acccacactg ggactgagac 240
ccggcccaga ctcctaccgg acgcaacggt ggggaatatt ggacaatgcg cccaagcctg 300
atccttgcat gccgcgtgac agattagggc actggcgttg tgaagctctt tccccccgta 360
agataatgac cctctttgga taacaacccc cggctagctt cgtgccagcc gcaacagtaa 420
tccgaaagct gctagccttg ttcggaatca ctgggtatga agcgcgcgta gtccgaactt 480
taagtcagta gtgagctccc gaggctcaag ctcggaactg cgtttgatac tgcagctctc 540
tagtccgctt gaagtgaaac gcactgcctt gtagaggtga gattcgtaga tattggcaag 600
accagcagtg gaggaggggg ctcactgtct ctgtcacgcc gaggagcggc agacgtctgg 660
agcggacaag aggatataac ccctggtact ccccgcaata agtgagcgat gttagtggtt 720
gtgggttcct cgtcatcagt ggcgcagcta acgcattaag catcccgcct gggggagtac 780
ggtcgcaagg ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 840
gtttaattcg aagcaacgcg cagaacctta ccagggtttg acattcccgg tatcatcccc 900
agagatggct ttcccccgtc aagggcccag aggacaggtg ttgcatggct gtcgtcagct 960
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc ttagttgcca 1020
tcatttagtt gggcactcta gggtgactgc cggtgataag ccgaagggag ggtggggatc 1080
acgtcaactc tccctgtccc ttccaggctg gacacctccc tcaatccaag gtcgatacca 1140
atgggaagcg acaaggcgga gggaatcaat tctcaaaagt ctctctcagt tcggattgca 1200
gtctgcaact cgcgtgcatg aagagggaat cgttagtaat cgcagatcag catgcggcga 1260
agaattgtcg gccctcgtac accccgccgg tcatctcacc aaagtagttg gctttccccg 1320
gaggcggtcg acgtcctcat tgagcagccg tccaaag 1357
Claims (12)
- 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP.
- 메틸로시스티스 속(Methylocystis sp.) M6 KCTC 11519BP를 포함하는 메탄 저감용 조성물.
- 제2항에 있어서,토양 및 지렁이 분변토로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 메탄 저감용 조성물.
- 제3항에 있어서,토양 및 지렁이 분변토는 중량 대비 50 : 50 내지 90 : 10의 비율로 혼합되는 메탄 저감용 조성물.
- 제2항의 메탄 저감용 조성물이 메탄을 분해시키는 단계를 포함하는 메탄 저 감방법.
- 제2항의 메탄 저감용 조성물을 포함하는, 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄 저감용 바이오커버.
- 제6항에 있어서,메틸로모나스속(Methylomonas), 메틸로마이크로비움속(Methylomicrobium), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로칼둠속(Methylocaldum), 메틸로파가속(Methylophaga), 메틸로사르시나속(Methylosarcina), 메틸로써머스속(Methylothermus), 메틸로할로비우스속(Methylohalobius), 메틸로스파에라속(Methylosphaera), 메틸로시스티스속(Methylocystis), 메틸로셀라속(Methylocella), 메틸로캅사속(Methylocapsa), 메틸로시너스속(Methylosinus) 및 메틸로코커스속(Methylococcus)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 메탄산화세균을 더 포함하는 메탄 저감용 바이오커버.
- 제6항에 있어서,산소생성제를 더 포함하는 메탄 저감용 바이오커버.
- 제8항에 있어서,산소생성제는 과산화마그네슘, 과산화칼슘 및 과탄산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 메탄 저감용 바이오커버.
- 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은제6항의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및상기 바이오커버층을 둘러싸는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템.
- 폐기물 매립지의 복토층 또는 지표면 위에 바이오 활성층을 설치하여 복토층 또는 지표면에서 발산되는 메탄을 생물학적으로 분해하는 메탄 저감 시스템에 있어서, 상기 바이오 활성층은제6항의 바이오커버가 하나 이상 적층된 바이오커버층; 및상기 바이오커버층 하부에 적층되는 통기층을 포함하는 것을 특징으로 하는 메탄 저감 시스템.
- 제10항 또는 제11항의 메탄 저감 시스템에 시료를 주입하여 메탄을 분해시키는 단계를 포함하는 메탄 저감방법.
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