KR20100136739A - Composition for antioxidation and preventing or treating immune disease comprising laminaria japonica extract as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A coposition containing organic solvent extract of Laminaria japonica for preventing or treating immune diseases is provided to ensure antioxidation and anti-inflammation and to prevent and treat cancer. CONSTITUTION: A composition for prevneting or treating oxidation and immune diseases contains an organic solvent extract of Laminaria japonica as an active ingredient. A method for preparing the organic solvent extract comprises: a step of collecting Laminaria japonica; a step of pulverizing and extracitn using methylene chloride and acetone in a ratio of 1:1 for 24 hours two times; and a step of concentrating with rotary vacuum evaporator in the water of 40°C. A food composition for preventing oxidation and immune disease contains the organic solvent extract of Laminaria japonica.

Description

Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for antioxidation and preventing or treating immune disease comprising Laminaria japonica extract as an active ingredient}Composition for antioxidation and preventing or treating immune disease comprising Laminaria japonica extract as an active ingredient containing organic solvent extract of Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ as an active ingredient

본 발명은 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 헴옥시게나제-1 (heme oxygenase-1, HO-1)의 발현을 증가시키고, 과산화수소에 의한 세포 독성을 감소시키고, 세포내 활성산소(ROS) 생성을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 염증 반응 매개 물질인 iNOS와 일산화질소 (NO)의 생성을 억제하는 항염증 효과를 나타내는 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. Laminaria invention It relates to a composition for the prevention or treatment of antioxidant and immune diseases containing an organic solvent extract of japonica as an active ingredient, more specifically to increase the expression of heme oxygenase-1 (HO-1), In addition to reducing cytotoxicity caused by hydrogen peroxide and reducing the production of free radicals (ROS) in the cell, it not only exhibits antioxidant effects, but also inhibits the activity of NF-kB, mediating the inflammatory response induced by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS). Laminaria exhibits anti-inflammatory effects that inhibit the production of the substances iNOS and nitric oxide (NO) It relates to a composition for the prevention or treatment of immune diseases, containing as an active ingredient an organic solvent extract of japonica .

다시마(Laminaria)는 갈조식물 다시마목 다시마과의 한 속으로, 전통적인 해 조식품이다. 한국, 일본, 캄차카반도, 사할린섬 등의 태평양 연안에 분포하며, 크기는 1.5 내지 3.5m 이고, 나비는 25 내지 40cm이다. 다시마속 식물은 태평양 연안에 20여 종이 자라고 있으며, 10 m 이상의 큰 종류도 있는데, 주요 종으로는 참다시마(L. japonica), 오호츠크다시마(L. ochotensis), 애기다시마(L. religiosa)등이 있다. 다시마에는 카로틴류, 크산토필류, 엽록소 등의 여러 가지 색소 외에 탄소동화작용으로 만들어지는 마니트, 라미나린 등의 탄수화물과 세포벽의 성분인 알긴산이 많이 들어 있고, 요오드, 비타민 B2, 글루탐산 등의 아미노산이 들어 있다.Kelp ( Laminaria ) is a genus of brown seaweed kelp, a traditional seaweed food. It is distributed in the Pacific coast of Korea, Japan, Kamchatka Peninsula, Sakhalin Island, etc., and the size is 1.5-3.5m, and the butterfly is 25-40cm. Kelp plants grow over 20 species on the Pacific coast, and there are also large varieties of more than 10 m. Major species are L. japonica, L. ochotensis, and L. religiosa. have. In addition to various pigments such as carotene, xanthophylls, and chlorophyll, kelp contains a lot of carbohydrates, such as manit and laminarin, which are made by carbon assimilation, and alginic acid, which is a component of cell walls, and amino acids such as iodine, vitamin B2, and glutamic acid. This contains.

다시마 중 Laminaria japonica는 참다시마 또는 다시마라고도 알려진 식용 해조류이며, 날것으로 또는 요리해서 먹기도 하는 등 식용으로 쓰이고 있다. 그러나, Laminaria japonica의 효능이나 그 성분에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. Laminaria of kelp japonica is an edible seaweed, also known as cheddar or kelp, and is used for food purposes, either raw or cooked. However, few studies have been conducted on the efficacy and composition of Laminaria japonica .

모든 호기성 세포에서 생성되는 활성 산소는 노화 및 퇴행성 질병에서 중요한 역할을 한다. 세포내 산화체 생성 및 항산화 방어 기작에 있어서 극적인 변화는 유전자 발현의 변화와 매우 밀접한 관계가 있으며, 활성 산소 반응은 분화, 노화 및 형질 전화 과정에서 관찰되는 세포 변화의 주요인이 된다. 세포는 활성 산소를 효과적으로 제거하는 항산화 시스템을 보유하고 있어 산화제와 항산화제 사이의 균형을 이루며 항상성을 유지한다. 그러나, 산화-항산화의 균형이 깨져 활성산소가 축적되며, 세포는 생체 분자의 손상과 신호 경로 및 유전자 발현의 변화를 초래하는 산화적 스트레스(oxidative stress)에 노출된다. 산화적 스트레스는 도 1(J.Cell.Physiol.2002;192:1-15)에서 보는 바와 같이 mitogen-activated protein(MAP) kinase/AP-1 경로와 NF-kB 경로 등의 세포내 신호전달 체계를 거쳐 유전자 발현을 조절할 수 있다. 또한, 슈퍼옥사이드 (superoxide), 하이드록시 라디칼 (hydroxy radical), 과산화수소 (hydrogen peroxide) 등의 활성 산소 (reactive oxygen species, ROS) 와 산화질소 (nitric oxide, NO), 과산화질소 (peroxynitrite,ONOO-)와 같은 활성질소 (Reactive Nitrogen Species, RNS)는 대식세포 (macrophages)나 중성구(neutrophils)를 포함한 여러 다양한 세포에서 호기성 에너지 대사의 부산물로서 끊임없이 생성된다. 이들의 높은 반응성으로 인해 단백질, 세포막지질 등이 산화, 변성되면서 노화와 관련된 인체의 여러 질병들이 발생될 수 있는 것으로 보고되고 있다.Free radicals produced in all aerobic cells play an important role in aging and degenerative diseases. Dramatic changes in intracellular oxidant production and antioxidant defense mechanisms are closely related to changes in gene expression, and reactive oxygen reactions are key drivers of cellular changes observed during differentiation, aging and transduction. Cells have an antioxidant system that effectively removes free radicals, maintaining a homeostatic balance between oxidants and antioxidants. However, the balance of oxidation-antioxidation is broken and free radicals accumulate, and cells are exposed to oxidative stress, which causes damage to biological molecules and changes in signaling pathways and gene expression. Oxidative stress is expressed in intracellular signaling systems such as the mitogen-activated protein (MAP) kinase / AP-1 pathway and the NF-kB pathway, as shown in FIG. 1 (J. Cell. Physiol. 2002; 192: 1-15). Gene expression can be regulated via In addition, reactive oxygen species (ROS), nitric oxides (NO), and peroxides (peroxynitrite, ONOO-), such as superoxide, hydroxy radicals, and hydrogen peroxide, etc. Reactive Nitrogen Species (RNS) are constantly produced as a byproduct of aerobic energy metabolism in many different cells, including macrophages and neutrophils. Due to their high reactivity, it has been reported that various diseases of human body related to aging may occur as proteins and membrane lipids are oxidized and denatured.

헴옥시게나제 (heme oxygenase, HO)는 항산화반응과 관련하여 최근 그 역할이 중요하게 인식되고 있다. HO는 헴 (heme)을 빌리버딘 (biliverdin)으로 변환시키는 속도-제한 효소로서, 이때 일산화탄소 (CO)와 철 (Fe)이 부수적으로 생성된다. 빌리버딘은 이어서 빌리루빈 (bilirubin)으로 환원되어 여러가지 산화물들을 청소하는데 사용된다. HO는 현재까지 알려진 바로는 3가지의 이성체가 존재하는데 (McCoubrey et al ., 1997), 계속 발현되는 HO-2 및 HO-3와는 달리 HO-1은 여러 자극들에 의해 유도되는 효소로서 특히 산화성 스트레스에 의해서 유도되어지는 것으로 알려져 있고 (Tenhumen et al ., 1970; 및 Choi and Alam, 1996), 특히 항산화와 항염증과 관련된 보호기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Otterbein et al ., 2000; 및 Lee et al ., 2003). Heme oxygenase (HO) has recently been recognized for its role in antioxidant activity. HO is a rate-limiting enzyme that converts heme into biliverdin, where incidental production of carbon monoxide (CO) and iron (Fe) occurs. Biliburdine is then reduced to bilirubin and used to clean various oxides. HO is known to have three isomers (McCoubrey et. al . , 1997), unlike HO-2 and HO-3, which are still expressed, HO-1 is an enzyme induced by several stimuli and is known to be induced by oxidative stress (Tenhumen et. al . , 1970; And Choi and Alam, 1996), in particular they are known to perform protective functions related to antioxidant and anti-inflammatory properties (Otterbein et. al . , 2000; And Lee et al . , 2003).

또한, HO의 최종산화물인 빌리루빈과 일산화탄소는 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하며, HO가 결핍된 세포에서는 산화적 스트레스에 의한 세포손상을 더욱 증가시킨다고 하는 보고 (Akihiro et al ., 1999)에서 알 수 있듯이 HO는 산화적 스트레스에 대한 면역계의 보호에 특히 중요한 효소이다. 특히, 유도형인 HO-1은 세포 및 기관들이 다양한 자극으로 손상될 수 있는 염증반응, 저/고산소증, 심혈관계질환, 퇴행성질환, 노화 등 무수한 자극에 대한 방어효과로 유전자발현의 전사단계에서부터 유도된다(Ryter SW,Alam J. and Choi AM., Heme oxygenase-1/carbon monoxide : from basic science to therapeutic applications, Physiol. Rev., 86, 2, 583-650 (2006).In addition, bilirubin and carbon monoxide, the final oxides of HO, protect cells from oxidative stress, and in cells lacking HO, further increase cell damage by oxidative stress (Akihiro et. al . HO is a particularly important enzyme for the protection of the immune system against oxidative stress. In particular, HO-1, which is an inducible type, is induced from the transcriptional stage of gene expression as a protective effect against numerous stimuli such as inflammatory reaction, hypoxia, hypoxia, cardiovascular disease, degenerative disease, and aging, which can damage cells and organs with various stimuli. (Ryter SW, Alam J. and Choi AM., Heme oxygenase-1 / carbon monoxide: from basic science to therapeutic applications, Physiol. Rev., 86, 2, 583-650 (2006).

HO-1의 단백질 발현에는 이 중 Akt 신호전달경로와 그로 인한 전사 조절인자인 NF-E2-related factor-2(Nrf 2)의 핵내로의 이동이 관여한다는 사실이 알려져 있다. 단백질 키나아제 B (Protein kinase B, PKB)로도 불리는 이 효소의 활성은 성장인자 수용체 등과 연관된 세포 내의 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)에 의해 유도된다. Akt 는 평상시에는 불활성화 상태로 존재하다가 외부 자극에 의하여 활성화 된 PI3K의 작용에 의하여 인산화가 되어 활성화가 되며, 이 후 하위 신호전달체계에 관여한다는 것이 잘 알려져 있다 (Hanada et al ., Biochim . Biophys . Acta . 1697:3-16, 2004; Vera et al ., Cancer Treat . Rev . 30:193-204, 2004; Kang et al ., Free Radic . Biol . Med . 43:535-545, 2007). 포스파티딜이노시톨-3-키나제 (PI3K) 및 Akt (단백질 키나제 B) 시그날링 경로는 세포 생존, 세포 증식, 세포 성장, 및 세포 운동성을 포함하는 다양한 생물학적 과정을 조절한다. PI3K/Akt 시그날링 경로는 시그날 전달체계 (signal transduction cascade)에 참여하는 모든 구성원 또는 성분을 포함한다. 이들에는 예를 들어, PI3-키나제, Akt-키나제, FKBP12, mTOR (라파마이신의 포유동물성 표적; 또한 FRAP, RAFT1 또는 RAPT1), RAPTOR (mTOR인 경우의 조절 관련된 단백질), TSC (결절성 경화증 컴플렉스 (tuberous sclerosis complex)), PTEN (포스파타제 및 텐신 동족체), 및 그의 하류 효과기가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.Protein expression of HO-1 is known to be involved in the movement of the Akt signaling pathway and the resulting transcriptional regulator NF-E2-related factor-2 (Nrf 2) into the nucleus. The activity of this enzyme, also called protein kinase B (PKB), is induced by phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) in cells associated with growth factor receptors and the like. It is well known that Akt is normally inactivated and phosphorylated by the action of PI3K activated by external stimuli, and then involved in downstream signaling systems (Hanada et. al . , Biochim . Biophys . Acta . 1697: 3-16, 2004; Vera et al . , Cancer Treat . Rev. 30: 193-204, 2004; Kang et al . , Free Radic . Biol . Med . 43: 535-545, 2007). Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) and Akt (protein kinase B) signaling pathways regulate a variety of biological processes, including cell survival, cell proliferation, cell growth, and cell motility. The PI3K / Akt signaling pathway includes all members or components that participate in the signal transduction cascade. These include, for example, PI3-kinase, Akt-kinase, FKBP12, mTOR (mammalic target of rapamycin; also FRAP, RAFT1 or RAPT1), RAPTOR (regulatory related protein in case of mTOR), TSC (nodular sclerosis complex) tuberous sclerosis complex)), PTEN (phosphatase and tensine homologues), and downstream effectors thereof, but are not limited thereto.

PI3K/Akt 신호전달경로에 의하여 발현이 조절되는 것으로는 HO-1과 같은 항산화효소계 (Martin et al ., J. Biol . Chem .279:8919-8929, 2004; 및 Ryter et al ., Physiol . Rev . 86:583-650, 2006) 및 NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1)과 같은 제2상 약물대사효소계(Jaiswal et al ., Free Radic. Biol . Med . 29:254-262, 2000)가 잘 알려져 있다. PI3K-Akt 시그날링에서의 이상은 세포 증식성 장애 (예를 들어, 암), 염증 및 면역조절 장애를 포함하는 다수의 질환 및 상태 발병기전의 원인이 된다. The expression is regulated by PI3K / Akt signaling pathways such as antioxidant enzymes such as HO-1 (Martin et al . , J. Biol . Chem . 279: 8919-8929, 2004; And Ryter et al . , Physiol . Rev. 86: 583-650, 2006) and NAD (P) H: Phase II drug metabolic enzymes such as quinone oxidoreductase 1 (NQO1) (Jaiswal et. al . , Free Radic. Biol . Med . 29: 254-262, 2000). Abnormalities in PI3K-Akt signaling cause many pathologies of disease and conditions, including cell proliferative disorders (eg cancer), inflammatory and immunomodulatory disorders.

HO-1의 증가는 박테리아독소인 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)에 의해 과잉생성이 유도되는 NF-kB 의 활성을 억제하고, 결과적으로 NF-kB 에 의하여 발현이 조절되는 유도성 일산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)를 억제하며, 최근에는 이러한 기전을 활용하여 HO-1 증가를 통한 iNOS 억제를 유도하는 유용한 물질들의 개발이 이루어지고 있다 (Chen TH et al ., 2007; 및 Ryter et al ., 2006). 박테리아의 산물인 LPS(lipopolysaccharide)는 TLR4에 의해 인지되고 이는 NF-kB 신호 전달 체계를 활성화시켜 염증 및 면역에 관련된 유전자의 발현을 증가시킨다. 이와 관련된 유전자로서 IL-1 과 TNF가 있으며, 이들은 다시 NF-kB 의 활성을 유도할 수 있다. NF-kB 에 의해 조절되는 유전자로는 사이토카인, 케모카인, 세포부착 관련 단백질, COX2, iNOS(inducible nitric oxide synthase), 자가 사멸 제어 단백질 등이 있으며, NF-kB를 활성화시키는 분자(activator)로는 TNF 수용체, IL-1/TLR 수용체, NLR(Nod-like receptor), IL-17, B 세포 및 T 세포 수용체 등이 있다. Increasing HO-1 inhibits the activity of NF-kB overinduced by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS), and consequently induces nitric oxide synthase (NF-kB) Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is suppressed, and recently, the development of useful substances that induce iNOS inhibition by increasing HO-1 has been made (Chen TH et. al . , 2007; And Ryter et al . , 2006). The product of the bacterium, lipopolysaccharide (LPS), is recognized by TLR4, which activates the NF-kB signaling system and increases the expression of genes involved in inflammation and immunity. Related genes include IL-1 and TNF, which can induce NF-kB activity. Genes regulated by NF-kB include cytokines, chemokines, cell adhesion-related proteins, COX2, inducible nitric oxide synthase (iNOS), and self-killing control proteins.TNF is an activator that activates NF-kB. Receptors, IL-1 / TLR receptors, Nod-like receptors, IL-17, B cell and T cell receptors.

NO는 각종 세포에 의해 생산되어 이들 세포에 작용하고, 염증 및 자가면역이 중재된 조직의 파괴에 관여하는 다기능 중재자인 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 NO는 생체 내에서 일산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase, NOS)에 의하여 생성되며, NOS는 지속적으로 생성되는 것 (constitutive NOS, cNOS)과 자극에 의해서 생성이 유도되는 것 (inducible NOS, iNOS)이 존재한다. NO is known to be a multifunctional mediator produced by various cells and acting on these cells and involved in the destruction of tissues mediated by inflammation and autoimmunity. Such NO is produced by nitric oxide synthase (NOS) in vivo, and NOS is continuously produced (constitutive NOS, cNOS) and induced by stimulation (inducible NOS, iNOS) is present.

상기 NOS는 L-아르기닌 (L-arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소로 그 중에서 신경계에 존재하는 nNOS (neuronal NOS) 및 혈관계에 존재하는 eNOS (endothelial NOS)는 체내에서 항상 일정 수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 하지만, iNOS는 각종 사이토카인 (cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되어 과량의 NO를 급격히 발생시켜 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 특히, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다 (Miller M. J. et al ., Mediators of inflammation, 4:387-396, 1995; 및 Appleton L. et al., Adv . Pharmacol ., 35:27-28, 1996). The NOS is an enzyme for producing NO from L-arginine, among which nNOS (neuronal NOS) present in the nervous system and eNOS (endothelial NOS) present in the vascular system are always expressed at a constant level in the body. NO produced by them plays an important role in maintaining normal homeostasis, such as inducing neurotransmission and vasodilation. However, iNOS is induced by various cytokines or external stimulants, and it is known to rapidly produce excess NO, causing cytotoxicity and various inflammatory reactions. In particular, chronic inflammation is closely related to the increase of iNOS activity. (Miller MJ et al ., Mediators of inflammation , 4: 387-396, 1995; And Appleton L. et al., Adv . Pharmacol . , 35: 27-28, 1996).

이러한 NO가 세포내에서 과도하게 발현될 경우, 염증이나 자가면역 질환 등의 면역계 질환을 야기하게 되어 염증 및 자가면역 질환 등을 일으키게 된다. 따라서, NO 생성을 저해하는 활성을 갖는 성분은 NO의 과잉생산에 의해 유발되는 질환인 상기 염증이나 자가면역 질환의 예방 및 치료에 효과적일 것이다.When the NO is excessively expressed in the cell, it causes an immune system disease such as inflammation or autoimmune disease, resulting in inflammation and autoimmune disease. Therefore, a component having an activity that inhibits NO production will be effective in preventing and treating the inflammation or autoimmune disease which is a disease caused by the overproduction of NO.

이에 본 발명자들은 NO의 과잉생산으로 인한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 치료제의 개발을 위하여 연구를 거듭하던 중, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 PI3K의 활성화, Akt, ERK1/2를 인산화하고 Nrf2의 핵내 이동을 유도하여 HO-1의 단백질 발현을 촉진시키고, 과산화수소에 의한 세포 손상, 세포내 활성 산소에 의한 세포 손상을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 염증 반응 매개 물질인 iNOS와 일산화질소 (NO)의 생성을 억제하는 항염증 효과가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have been studying for the development of a therapeutic agent for preventing or treating a disease caused by the overproduction of NO, Laminaria Japonica organic solvent extract phosphorylates PI3K, Akt and ERK1 / 2, induces nuclear migration of Nrf2, promotes protein expression of HO-1, and induces cellular damage by hydrogen peroxide and cellular damage by free radicals. In addition to reducing antioxidant activity, it inhibits NF-kB activity and inhibits the production of iNOS and nitric oxide (NO), which are inflammatory mediators induced by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS). The present invention has been completed by elucidating that there is.

본 발명은 HO-1 유전자의 발현을 유도하고, 과산화수소에 의한 세포 손상, 활성 산소에 의한 세포 손상을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 염증 반응 매개 물질인 iNOS와 일산화질소 (NO)의 생성을 억제하는 항염증 효과를 나타내는 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention induces the expression of HO-1 gene, reduces the cell damage caused by hydrogen peroxide and the cell damage caused by free radicals, and shows an antioxidant effect, and inhibits the activity of NF-kB, lipopolysaccharide (LPS) is a bacterial toxin. It is an object of the present invention to provide an organic solvent extract of Laminaria japonica , which exhibits an anti-inflammatory effect of inhibiting the production of iNOS and nitrogen monoxide (NO), which are mediated by inflammatory response mediators.

본 발명의 다른 목적은 항산화 및 면역질환을 효과적으로 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a food composition that can effectively prevent antioxidant and immune diseases.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention Laminaria It provides a composition for the prevention or treatment of antioxidant and immune diseases containing an organic solvent extract of japonica as an active ingredient.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 포함하는 항산화 및 면역질환의 예방용 식품 조성물을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention is Laminaria It provides a food composition for the prevention of antioxidant and immune diseases comprising an organic solvent extract of japonica .

Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 면역세포 내에서 PI3K 활성화, Akt, ERK1/2 의 인산화, Nrf2의 핵내 이동 증가를 통하여 HO-1의 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 과산화수소에 의한 세포 손상, 활성 산소에 의한 세포 손상을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 일산화질소 및 iNOS의 생성을 억제시켜 면역질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.The composition of the present invention comprising an organic solvent extract of Laminaria japonica can increase the protein expression of HO-1 through PI3K activation, phosphorylation of Akt, ERK1 / 2, and increased nuclear transfer of Nrf2 in immune cells, In addition to reducing cell damage caused by free radicals and cellular damage caused by free radicals, it not only exhibits antioxidant effects, but also inhibits NF-kB activity. It can be effectively used for the prevention or treatment of a disease.

뿐만 아니라 활성산소, 활성질소의 소거능과 세포에서 활성산소를 효과적으로 소거하는 항산화 활성이 우수하므로 활성산소의 산화적스트레스에 기인한 질환 및 암의 예방 및 개선, 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. In addition, it has excellent scavenging ability of active oxygen and active nitrogen and antioxidant activity that effectively eliminates free radicals in cells, thus preventing and improving diseases and cancers caused by oxidative stress of active oxygen, health functional food materials and pharmaceutical compositions It can be usefully used.

또한 우리 나라 근해에서 자라는 갈조류의 일종인 Laminaria japonica의 다양한 생리활성을 밝혀냄으로써 Laminaria japonica의 생약자원으로서의 가치 및 부가가치를 증진하는 효과가 있다. Laminaria , a kind of brown algae that grows near our country, Laminaria by revealing various biological activities of japonica It has the effect of increasing the value and added value of japonica as herbal resource.

본 발명에 따른 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 PI3K 활성화, Akt, ERK1/2를 인산화하고 Nrf2의 핵내 이동율 유도하여 HO-1의 발현을 증가시키고, 과산화수소에 의한 세포 손상, 활성 산소에 의한 세포 손상을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 염증 반응 매개 물질인 iNOS와 일산화질소 (NO)의 생성을 억제하는 항염증 효과가 있다. 또한 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 세포의 생존율에 영향을 주지 않아 부작용을 나타내지 않으며, 식용 식물에서 유래된 천연물질이므로 안전하다. Laminaria according to the invention The pharmaceutical composition containing the organic solvent extract of japonica as an active ingredient increases the expression of HO-1 by phosphorylating PI3K activation, Akt and ERK1 / 2 and inducing the nuclear migration rate of Nrf2, and on cell damage by hydrogen peroxide and free radicals. In addition to reducing the cell damage caused by the antioxidant effect, and inhibits the activity of NF-kB, it inhibits the production of iNOS and nitrogen monoxide (NO), which are inflammatory mediators induced by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS) It has an anti-inflammatory effect. Also said Laminaria The organic solvent extract of japonica does not affect the viability of cells and does not show side effects. It is safe because it is a natural substance derived from edible plants.

본 발명의 일실시예에서는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 HO-1의 발현을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포 (American Type Culture Collection, Mannassas, VA, USA)주에 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 처리하고 배양한 후, 세포로부터 단백질을 분리하고, HO-1 단백질에 대하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 HO-1의 단백질 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 2 참조). 본 발명의 또 다른 실시예에서는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 처리한 세포를 배양 후, 세포로부터 RNA를 분리하여 역전사-중합효소반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 실시하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 mRNA 수준에서 HO-1의 유전자 발현을 유도하는 것을 확인하였다 (도 3 참조).In one embodiment of the present invention Laminaria To determine whether the organic solvent extract of japonica induced the expression of HO-1, Laminaria in RAW 264.7 cells (American Type Culture Collection, Mannassas, VA, USA) After treating and cultivating the organic solvent extract of japonica, the protein was separated from the cells, and Western blot was performed on the HO-1 protein. As a result, Laminaria It was confirmed that the organic solvent extract of japonica increased the protein expression of HO-1 (see FIG. 2). In another embodiment of the present invention Laminaria After culturing the cells treated with the organic solvent extract of japonica , RNA was isolated from the cells and subjected to reverse transcription-polymerase chain reaction analysis. As a result, Laminaria It was confirmed that the organic solvent extract of japonica induces gene expression of HO-1 at the mRNA level (see FIG. 3).

본 발명의 일실시예에서는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 HO-1 생성 유도에 관여하는 신호 전달 효소를 검출하기 위하여 3개의 MAPK(mitogen activated kinase) 및 PI3K 효소 각각의 억제제에 대한 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 작용 여부를 웨스턴 블랏법을 이용하여 측정하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 ERK1/2 과 PI3K의 신호 전달에 관여한다 는 것을 알 수 있었다. (도 4 참조)In one embodiment of the present invention Laminaria Laminaria for each inhibitor three MAPK (mitogen activated kinase), and PI3K enzyme to the organic solvent extract of japonica detecting an enzyme involved in signaling induced HO-1 generates The action of the organic solvent extract of japonica was measured by Western blot method. As a result, it was found that the organic solvent extract of Laminaria japonica is involved in the signal transduction of ERK1 / 2 and PI3K. (See Figure 4)

본 발명의 일실시예에서는 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물이 ERK1/2, Akt 인산화를 유도하는지 확인하기 위하여, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포 를 사용하여 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 효과를 측정하였다. 그 결과 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 처리는 ERK1/2과 Akt의 인산화를 증가시켰으며, 이러한 Akt의 인산화는 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 ERK1/2의 상위 신호와, Akt의 상위 신호인 PI3K의 활성화, 즉 PI3K/Akt 경로의 활성화가 유도될 것임을 알 수 있었으며, 하위 신호인 HO-1의 발현 유도를 매개할 것임을 알 수 있었다.(도 5a, 도 5b 참조) In one embodiment of the present invention Laminaria To determine whether the organic solvent extract of japonica induces ERK1 / 2, Akt phosphorylation, Laminaria using RAW 264.7 cells, a mouse macrophage The effect of the organic solvent extract of japonica was measured. The result is Laminaria Treatment of the organic solvent extract of japonica increased the phosphorylation of ERK1 / 2 and Akt, and the phosphorylation of Akt was Laminaria It was found that the administration of the extract of the organic solvent of japonica induced the upstream signal of ERK1 / 2 and the activation of PI3K, the upper signal of Akt, that is, the activation of the PI3K / Akt pathway in the signaling system. It can be seen that mediating the induction of -1 expression (see Figure 5a, 5b).

본 발명의 일실시예에서는 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물이 Nrf 2의 핵 내로의 이동에 영향을 주는지 여부를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 처리는 핵내에서의 Nrf2의 발현을 증가시켰으며, 이러한 Nrf2의 발현은 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 Nrf2의 상위 신호인 Akt의 인산화에 의한 것으로 하위 신호인 HO-1의 발현 유도를 매개할 것임을 알 수 있었다.(도 6 참조) In one embodiment of the present invention Laminaria It was confirmed by Western blot whether the organic solvent extract of japonica affected the migration of Nrf 2 into the nucleus. Treatment of the organic solvent extract of Laminaria japonica has the Nrf2 was increased expression in the nucleus, expression of this Nrf2 is Laminaria It can be seen that the administration of the organic solvent extract of japonica may mediate the induction of HO-1, which is a lower signal, by phosphorylation of Akt, the upper signal of Nrf2, in the signaling system (see FIG. 6).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 세포손상을 유도하는 산화 스트레스로서 과산화수소를 처리하였을 때 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 세포 보호 효 과를 확인하기 위하여 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물 및 과산화수소를 처리하고 배양한 후, 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 과산화수소에 의한 세포 생존율의 감소가 Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의하여 회복되는 것을 확인하였다 (도 7 참조), 또한, 세포손상을 유도하는 산화 스트레스인 활성산소의 생성 억제 효과를 확인하기 위하여, LPS 로 세포내 활성산소를 유도하고 Laminaria japonica의 유기용매 추출물로 처리한 후 세포내 활성산소의 양을 측정하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물로 처리한 후 활성산소의 생성이 억제되었으며, 활성산소와 같은 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 막아준다는 것을 알 수 있었다.(도 8 참조)In another embodiment of the present invention when treated with hydrogen peroxide as oxidative stress to induce cell damage Laminaria To determine the cellular protective effect of japonica , organic solvent extracts Laminaria After treatment with the organic solvent extract of japonica and hydrogen peroxide and incubated, the viability of the cells was measured. As a result, the decrease in cell viability caused by hydrogen peroxide was observed in Laminaria. It was confirmed that the organic solvent extract of japonica was recovered (see FIG. 7). Also, in order to confirm the inhibitory effect of the production of free radicals, which are oxidative stresses that induce cell damage, LPS induced intracellular free radicals and Laminaria japonica. After treatment with the organic solvent extract of the amount of free radicals in the cell was measured. As a result, Laminaria After treatment with the organic solvent extract of japonica , the production of free radicals was inhibited, and it was found that it prevents cell damage caused by oxidative stress such as free radicals (see FIG. 8).

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 HO-1 발현 유도에 의한 iNOS 생성 억제 여부를 확인하기 위하여 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 및 LPS를 처리한 세포를 배양한 후, 세포로부터 단백질을 분리하고, iNOS 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿을 각각 실시하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 LPS에 의해 유도되는 iNOS의 단백질 생성을 억제하는 것을 확인하였다 (도 9a 참조). 따라서, Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 HO-1의 발현 유도는 iNOS 유전자 발현 억제 효과와 관련이 있음을 알 수 있다. In addition, in another embodiment of the present invention Laminaria to determine whether the inhibition of iNOS production by HO-1 expression induction After culturing the cells treated with the organic solvent extract of japonica and LPS, proteins were separated from the cells, and Western blot using antibodies against iNOS protein was performed. As a result, Laminaria It was confirmed that the organic solvent extract of japonica inhibited the protein production of iNOS induced by LPS (see FIG. 9A). Thus, Laminaria Induction of HO-1 expression by the organic solvent extract of japonica may be related to the iNOS gene expression inhibitory effect.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 NO의 생성을 억제하는지 확인하기 위하여, 비활성화시에는 NO 생 성 수준이 매우 낮으나, LPS로 활성화시킬 때 NO 생성이 유도된다고 알려져 있는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 사용하여 Laminaria japonica의 유기용매 추출물로 처리한 후 그리에스 반응과, MTT 분석법에 따라 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, Laminaria japonica의 유기용매 추출물로 처리한 경우 그 농도가 증가할 수록 NO의 생성은 억제되나, 세포생존율에는 전혀 변화가 없음을 확인하였다(도 9b 참조). 따라서, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 면역세포가 활성화되었을 때 세포생존율에는 변화를 일으키지 않으면서 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다. Further, in another embodiment of the present invention, Laminaria of the present invention. To determine if the organic solvent extract of japonica inhibits NO production, Laminaria was used in RAW 264.7 cells, a mouse macrophage line known to induce NO production when inactivated but very low when activated with LPS. After treatment with the organic solvent extract of japonica , the cell survival rate was measured according to the Gries reaction and MTT assay. As a result, Laminaria When treated with an organic solvent extract of japonica it was confirmed that the production of NO as the concentration is increased, but there is no change in cell viability (see Figure 9b). Thus, Laminaria of the present invention The organic solvent extract of japonica was found to inhibit NO production in a concentration-dependent manner without changing the cell viability when activated.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 iNOS 단백질 양의 감소와 NF-kB 활성과의 관계를 확인하기 위하여, NF-kB에 의해 리포터 (reporter) 유전자가 발현되도록 제조된 플라스미드를 세포에 형질전환시킨 후 전사활성 (transactivation)을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 NF-kB의 전사 활성을 억제시켰으며, 이러한 NF-kB 전사 활성의 억제는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 하위 신호인 iNOS의 발현을 억제할 것임을 알 수 있었다.Further, in another embodiment of the present invention, Laminaria of the present invention. In order to confirm the relationship between the reduction of iNOS protein amount and the NF-kB activity by the organic solvent extract of japonica , the plasmid prepared to express the reporter gene by NF-kB was transformed into cells and then transferred. transactivation was measured. As a result, Laminaria of the present invention The organic solvent extract of japonica inhibited the transcriptional activity of NF-kB. Laminaria It was found that administration of the extract of the organic solvent of japonica would inhibit the expression of iNOS, a downstream signal in the signaling system.

따라서, 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 PI3K 활성화, Akt, ERK1/2 의 인산화, Nrf2의 핵내 이동 증 가를 통하여 HO-1의 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 과산화수소에 의한 세포 손상, 활성 산소에 의한 세포 손상을 감소시켜 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여, 박테리아 독소인 lipopolysaccharide(LPS) 에 의해 유도되는 일산화질소 및 iNOS의 생성을 억제시켜 면역질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.Thus, the Laminaria The composition of the present invention comprising an organic solvent extract of japonica as an active ingredient can increase the protein expression of HO-1 through PI3K activation, phosphorylation of Akt, ERK1 / 2, and increased nuclear transfer of Nrf2, and cells by hydrogen peroxide In addition to reducing cellular damage caused by damage and free radicals, it not only exhibits antioxidant effects, but also inhibits NF-kB activity and inhibits the production of nitric oxide and iNOS induced by the bacterial toxin lipopolysaccharide (LPS). It can be effectively used for prevention or treatment.

상기 면역질환의 대표적인 예로 염증성 질환을 들 수 있는데, 염증은 열, 홍조, 팽윤, 통증 및 기능 상실로 나타난다. 염증의 원인은 미생물 감염 (세균 및 진균 감염), 물리적 인자 (화상, 조사 및 외상), 화학적 제제 (독소 및 유발 물질), 조직 괴사 및 각종 유형의 면역학적 반응과 같은 인자들을 포함하며, 특히 NO를 발생시키는 효소인 NOS와 프로스타글란딘의 생합성과 관련된 효소들이 염증반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있고, 면역 반응 및 염증 반응에서 생산된 다수의 반응성 생성물 중 하나인 NO는 특히 만성 염증에 있어서 비특이적인 조직 파괴를 유발하는 것으로 알려져 있다.Representative examples of the immune diseases include inflammatory diseases, which are manifested by fever, flushing, swelling, pain and loss of function. Causes of inflammation include factors such as microbial infections (bacterial and fungal infections), physical factors (burns, irradiation and trauma), chemical agents (toxins and triggers), tissue necrosis and various types of immunological reactions, especially NO Enzymes related to the biosynthesis of NOS and prostaglandins, which are enzymes that produce N, are known to play an important role in mediating the inflammatory response, and NO, one of the many reactive products produced in immune and inflammatory responses, is particularly responsible for chronic inflammation It is known to cause nonspecific tissue destruction.

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 적용될 수 있는 NO의 과잉생산에 의한 질환은, 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 급성 및 만성 감염, 급성 및 만성 기관지염, 골관절염, 류마티스 관절염, 정맥동염, 위장염, 대장염, 방광염, 요도염, 피부염, 결막염, 심막염, 복막염, 활막염, 흉막염, 건염, 담낭염, 질염 및 포도막염 등을 포함한다. Laminaria of the present invention Diseases caused by overproduction of NO, to which the organic solvent extract of japonica can be applied, include, but are not limited to, acute and chronic infections, acute and chronic bronchitis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, sinusitis, gastroenteritis, colitis, Cystitis, urethritis, dermatitis, conjunctivitis, pericarditis, peritonitis, synovitis, pleurisy, tendonitis, cholecystitis, vaginitis and uveitis.

본 발명에서 사용가능한 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 자연으로 부터 얻을 수 있다. 상기 추출물은 공지된 방법을 사용하여 추출할 수 있으며, 이를 감압여과한 후 동결건조하여 사용하는 것이 바람직하다. Laminaria usable in the present invention Organic solvent extracts of japonica can be obtained from nature. The extract can be extracted using a known method, it is preferable to use after filtration and freeze-dried under reduced pressure.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 단독으로 사용되거나 또는 선택된 투여 경로에 따라 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 배합하여 제형화될 수 있다. Laminaria of the invention in a pharmaceutical composition of the invention The organic solvent extract of japonica can be used alone or formulated in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, depending on the route of administration chosen.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 경구 투여 또는 비경구 투여가 모두 가능하며, 비경구적인 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나, 피하 내, 정맥 내, 근육 내, 또는 복강 내 투여될 수 있다.The route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and the parenteral route of administration is not limited thereto, but may be administered subcutaneously, intravenously, intramuscularly, or intraperitoneally. .

본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여를 위해서는 캡슐, 정제, 환제, 과립제 및 산제와 같은 고체 형태 또는 엘릭시스 시럽 및 현탁제와 같은 액체 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위해 고체 형태로 제형화하는 경우에는 적합한 담체로서 당분야에 공지된 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물을 캡슐로 제형화하기 위해서는 유당, 전분, 셀룰로오즈 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산과 같은 담체를 사용할 수 있다. 또한, 희석제를 사용하여 압착된 정제의 형태로 제조할 수 있으며 상기 정제와 캡슐은 모두 당분야에 공지된 방법에 따라 서방성으로 제조하여 수시간에 걸쳐 약제가 연속 방출되도록 할 수 있다. 또한, 압착된 정제는 당 피복 또는 필름 피복을 시킬 수 있다. 경구 투여를 위해 액체 형태로 제형화하는 경우에는 적합한 담체로서 당분야에 공지된 현탁제, 유제, 시럽제, 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있다.For oral administration of the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in solid forms such as capsules, tablets, pills, granules and powders or in liquid form such as elixis syrups and suspensions. When formulated in solid form for oral administration, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants and the like known in the art can be used as suitable carriers. For example, to formulate the pharmaceutical composition of the present invention in capsules, carriers such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid can be used. In addition, it can be prepared in the form of compressed tablets using a diluent and both the tablets and capsules can be prepared in a sustained release according to methods known in the art to allow the continuous release of the drug over several hours. In addition, the compressed tablets may have a sugar coating or a film coating. When formulated in liquid form for oral administration, suspending agents, emulsions, syrups, diluents, wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives and the like known in the art can be used as suitable carriers.

본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여를 위해서는 앰플 또는 바이알 단위의 주사제 형태가 바람직하다. 주사제로 제형화하는 경우의 적합한 담체로는 당분야에 공지된 안정제, 완충물질 및 보존제 등을 사용할 수 있고, 적합한 안정제로는 나트륨 비설파이트, 나트륨 설파이트 및 아스코르브산 등이 있으며, 보존제로는 염화벤즈알코늄, 메틸 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올 등이 있다.For parenteral administration of the pharmaceutical compositions of the invention, the form of injectables in ampoules or vials is preferred. Suitable carriers when formulated as injectables include stabilizers, buffers and preservatives known in the art, and suitable stabilizers include sodium bisulfite, sodium sulfite and ascorbic acid, and the like. Benzalkonium, methyl or propyl-paraben and chlorobutanol.

본 발명의 약학적 조성물의 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 0.000001 내지 1 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001 내지 500 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 300 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 의사의 의학적 판단 하에 환자의 연령, 건강정도, 체중, 배설율, 식이, 질병 중증도, 사용된 화합물의 활성, 성별, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간 및 치료 횟수 등에 따라 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.Typical daily dosages of the active compounds of the pharmaceutical compositions of the invention may range from 0.000001 to 1 mg / kg body weight, preferably from 0.001 to 500 mg / kg body weight, preferably from 10 to 300 mg / kg body weight. It can be administered once or divided into several times. However, the actual dosage of the active ingredient is determined by the medical judgment of the patient, including age, health, weight, excretion, diet, severity, activity of the compound used, sex, time of administration, route of administration, duration of treatment and frequency of treatment. It is to be understood that such determinations should be made in accordance with the foregoing, and therefore the above dosages do not limit the scope of the invention in any way.

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 천연물질로서 이미 Laminaria japonica가 식용으로 사용되고 있다는 점에서 안전성이 확보되어 있다. Laminaria of the present invention Organic solvent extract of japonica is a natural substance, and Laminaria japonica is already used for food safety.

또한, 본 발명의 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 항산화 및 각종 면역질환의 예방 등의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.In addition, the Laminaria of the present invention The organic solvent extract of japonica can be added to food or beverage for the purpose of antioxidant and prevention of various immune diseases.

본 발명의 건강음료는 필수성분으로서 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 향미제로서는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알콜이다. Health drink of the present invention is the Laminaria as an essential ingredient There is no particular limitation on the liquid components except for containing the organic solvent extract of japonica , and various flavors or natural carbohydrates may be included as additional ingredients, like ordinary drinks. As the flavoring agent, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. Examples of the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol.

상기 외에 본 발명의 식품 또는 음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. In addition to the above, the food or beverage composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, and preservatives. , Glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.

건강 보조식품 개발을 위하여 본 발명의 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종, 식품류, 음료류, 껌류, 미타민 복합제 등이 있다. Laminaria of the present invention for the development of dietary supplements Examples of the food to which the organic solvent extract of japonica can be added include various foods, beverages, gums, mitamine complexes and the like.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 한정하지는 않는다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples. However, the following examples are not intended to limit the invention only.

하기 실시예에서 도면상에 표시된 * 및 **는 통계분석결과를 나타내는 것으로서, Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 처리하지 않은 군 (도면에서 처리 농도가 0 또는 vehicle인 군)에 대하여 *는 p<0.05를 나타내며, **는 p<0.01을 나 타낸다 (통계분석은 Dunnett's two-tailed t-test를 수행한 것이다). In the following examples, * and ** represented on the drawings indicate statistical analysis results, Laminaria. * indicates p <0.05 and ** indicates p <0.01 for the non- japanica organic solvent extract (groups with treatment concentration 0 or vehicle in the figure) (statistical analysis is Dunnett's two-tailed). t-test).

제조예 1: Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 제조 Preparation Example 1 Laminaria Preparation of organic solvent extract of japonica

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 제조하기 위하여, 남해에서 5월에 채취한 학명이 확인된 시료와 강원도 안인영진에서 채취한 학명이 확인된 시료를 사용하였으며, 추출 단계 전까지 동결건조 후 냉장 보관하였고, 추출 직전 분쇄하여 메틸렌클로라이드와 아세톤 1:1 혼합 용매를 사용하여 24시간 동안 2회에 걸쳐서 추출하였다. 각각 얻어진 추출액은 40 ℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (EYELA JAPAN, N-N series)로 농축하여 사용하였다. 이후 일명 다시마로 불리는 남해의 시료로부터 얻은 추출물을 Laminaria japonica extract-1 (LJE-1)으로 명명하였고, 일명 참다시마로 불리는 강원도의 시료로부터 얻은 추출물을 Laminaria japonica extract-2 (LJE-2)로 명명하여 각각을 구분하여 실험하였다. 제조된 추출물은 다이메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹여서 실험에 사용하였다. 용매로 사용된 DMSO의 농도는 효과가 없다고 알려진 0.1%를 유지하였으며, 또한 용매에 의한 효과가 없음을 보여주기 위하여 용매 단독처리군을 대조군으로 사용하면서 이후의 과정을 진행하였다. Laminaria of the present invention In order to prepare organic solvent extracts of japonica , samples of scientific name obtained in May from Namhae and scientific names obtained from Ahn In-jin, Gangwon-do were used. The mixture was triturated and extracted two times for 24 hours using methylene chloride and acetone 1: 1 mixed solvent. Each extract was concentrated using a rotary vacuum evaporator (EYELA JAPAN, NN series) on a 40 ℃ water bath. Laminaria extract from a sample of the South Sea called a kelp It was named japonica extract-1 (LJE-1), and the extracts obtained from Gangwon-do samples, also called Chada Shimashima, were named Laminaria japonica extract-2 (LJE-2). The prepared extract was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and used for the experiment. The concentration of DMSO used as a solvent was maintained at 0.1%, which is known to have no effect, and the subsequent process was performed using a solvent-treated group as a control group to show that there was no effect by the solvent.

실시예 1: Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 HO-1 발현 유도 측정 Example 1 Measurement of Induction of HO-1 Expression by Organic Solvent Extract of Laminaria japonica

<1-1> 웨스턴 블럿을 이용한 HO-1 발현 유도 측정 <1-1> Induction measurement of HO-1 expression using Western blot

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 HO-1의 발현을 유도하는지 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. Laminaria of the present invention Whether the organic solvent extract of japonica induces the expression of HO-1 was confirmed by Western blot.

구체적으로, 마우스 대식 세포인 RAW264.7 세포를 페니실린 100 유닛/㎖, 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ 및 우태아혈청 (fetal bovine serum) 5%를 포함하는 RPMI 1640 배지 (이하, 편의상 'RPMI 배지'라 함)에서 1× 106 세포/㎖의 농도로 현탁하여 배양접시에 깐 다음, 5% CO2 배양기에서 37℃의 조건으로 배양하면서 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 10, 50 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 회수하여 항-마우스 HO-1 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, 시료 내의 다른 단백질에는 변화가 없음을 보여주기 위한 대조군으로서 항-마우스 베타-액틴 항체 (Cell Signaling Technology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하였다.Specifically, RAW264.7 cells, which are mouse macrophages, are RPMI 1640 medium (hereinafter referred to as 'RPMI medium' for convenience) containing 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 5% fetal bovine serum. hereinafter) 1 × 10 6 cells / suspended in a concentration of ㎖ then laid on a petri dish, and cultured in a 5% CO 2 incubator under conditions of 37 ℃ from Laminaria LJE-1 and LJE-2 organic solvent extracts of japonica were treated at concentrations of 10, 50 and 100 ㎍ / ml, respectively, and cultured for 18 hours. The cells were then harvested and subjected to Western blot using an anti-mouse HO-1 antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA; Dilution Ratio 1: 1,000), as a control to show no change in other proteins in the sample. Anti-mouse beta-actin antibody (Cell Signaling Technology, USA; dilution ratio 1: 1,000) was used.

도 2에 나타난 바와 같이, Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리는 HO-1 단백질 합성을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Figure 2, Laminaria Treatment of the organic solvent extract of japonica was confirmed to increase HO-1 protein synthesis.

<1-2> <1-2> 역전사Reverse transcription -중합효소반응 (-Polymerase reaction ( RTRT -- PCRPCR )을 이용한 ) HOHO -1 합성 증가 측정-1 synthesis increase measurement

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 HO-1의 합성 증가 를 mRNA 수준에서 확인하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다. Laminaria of the present invention RT-PCR was performed to confirm the increase in HO-1 synthesis by the organic solvent extract of japonica at the mRNA level.

구체적으로, 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 10, 50 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하고 6시간 동안 배양하였다. 활성화된 세포에서의 영향 측정을 위해서는 LJE-1과 LJE-2 처리 1시간 후에 LPS 200 ng/㎖을 처리한 후 다시 6시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 회수하여 RNA를 분리한 다음, HO-1 유전자에 대한 RT-PCR을 수행하였고, 시료 내의 다른 유전자에는 변화가 없음을 보여주기 위한 대조군으로서 베타-액틴 유전자에 대한 RT-PCR도 수행하였다. RT-PCR의 반응산물로 1% 아가로즈겔 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.Specifically, after culturing the cells in the same manner as in <Example 1-1>, the organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of Laminaria japonica were treated at concentrations of 10, 50, and 100 μg / ml, respectively, 6 Incubated for hours. In order to measure the effect on the activated cells, after treatment with LPS 200 ng / ml 1 hour after LJE-1 and LJE-2 treatment, the cells were incubated for another 6 hours. Thereafter, cells were recovered to separate RNA, and then RT-PCR was performed on the HO-1 gene, and RT-PCR was also performed on the beta-actin gene as a control to show that there was no change in other genes in the sample. It was. 1% agarose gel electrophoresis was performed with the reaction product of RT-PCR, and the results are shown in FIG. 3.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 의하여 HO-1의 mRNA의 양이 증가함을 확인할 수 있으며, 이는 상기 실시예 1-1의 western blot 결과와 일치한다. As shown in Figure 3, Laminaria of the present invention It can be seen that the amount of mRNA of HO-1 is increased by treatment of the organic solvent extract of japonica , which is consistent with the western blot result of Example 1-1.

실시예 2: HO-1 생성 유도에 관여하는 신호 전달 효소의 활성에 대한 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 미치는 영향 측정 Example 2 Determination of the Effect of Organic Solvent Extract of Laminaria japonica on the Activity of Signal Transduction Enzyme Involved in Inducing HO-1 Production

실시예 2-1 : Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의하여 영향을 받는 신호 전달 효소의 검출Example 2-1: Laminaria Detection of Signal Transduction Enzymes Affected by Japonica , Organic Solvent Extract

Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 HO-1 생성 유도에 관여하는 신호 전달 효소를 검출하기 위하여 3가지 MAPK(mitogen activated kinase) 및 PI3K 효소 각각의 억제제에 대한 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 작용 여부를 western blot 법을 이용하여 측정하였다. Laminaria Laminaria for each inhibitor three kinds of MAPK (mitogen activated kinase), and PI3K enzyme to the organic solvent extract of japonica detecting an enzyme involved in signaling induced HO-1 generates The action of the organic solvent extract of japonica was measured by western blot method.

ERK1/2, p38, JNK, PI3K 각각의 억제제로서 PD98509, SB203580, SP600125, LY294002를 사용하였으며, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2로 처리하였을 경우 각각의 억제제에 의한 HO-1 생성의 조절은 도 3에서 보는 바와 같이 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 PD98509 및 LY294002는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2에 의하여 유도되는 HO-1의 생성을 모두 저해하므로, Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 ERK1/2 및 PI3K의 신호 전달에 관여한다는 것을 알 수 있었다.PD98509, SB203580, SP600125, and LY294002 were used as inhibitors of ERK1 / 2, p38, JNK, and PI3K, and HO-1 production by each inhibitor when treated with organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of Laminaria japonica . The control of is shown as shown in FIG. As shown in Figure 4 PD98509 and LY294002, so all inhibited the production of HO-1 is induced by the LJE-1 of Laminaria japonica organic solvent extract and the LJE-2, the organic solvent extract of the Laminaria japonica of ERK1 / 2 and PI3K It was found that it is involved in signal transmission.

실시예 2-2: Laminaria japonica 의 유기용매 추출물에 의한 ERK1/2와 Akt 인산화 유도 Example 2-2 Laminaria Induction of ERK1 / 2 and Akt Phosphorylation by Organic Solvent Extracts of japonica

본 발명의 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물이 ERK1/2, Akt 인산화를 유도하는지 확인하기 위하여, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 사용하여 Laminaria japonica 의 유기용매 추출물의 효과를 측정하였다. Laminaria of the present invention To determine whether the organic solvent extract of japonica induces ERK1 / 2, Akt phosphorylation, Laminaria using RAW 264.7 cells (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA), a mouse macrophage The effect of the organic solvent extract of japonica was measured.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 100 ㎍/ml씩 처리하고 5, 15, 30, 60분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 회수하여 항-마우스 phospho-ERK1/2 항체, 항-마우스 phospho-Akt 항체 (Cell Signaling Technology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, 시료 내의 ERK1/2 및 Akt 단백질 자체에는 변화가 없음을 보여주기 위한 대조군으로서 항-마우스 ERK1/2 항체, 항-마우스 Akt 항체 (Cell Signaling Technology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하였으며, 그 결과를 도 5a, 도 5b 에 나타내었다. Specifically, after culturing the cells in the same manner as in Example <1-1>Laminaria japonicaThe organic solvent extracts of LJE-1 and LJE-2 were respectively treated with 100 ㎍ / ml and incubated for 5, 15, 30 and 60 minutes. Cells were then harvested and subjected to Western blot using anti-mouse phospho-ERK1 / 2 antibody, anti-mouse phospho-Akt antibody (Cell Signaling Technology, USA; dilution ratio 1: 1,000), ERK1 / in the sample 2 and the anti-mouse ERK1 / 2 antibody and anti-mouse Akt antibody (Cell Signaling Technology, USA; dilution ratio 1: 1,000) were used as controls to show no change in the Akt protein itself. 5a and FIG. 5b.

도 5a, 도 5b에 나타난 바와 같이, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2의 처리는 ERK1/2과 Akt의 인산화를 증가시켰으며, 이러한 인산화는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 ERK1/2의 상위 신호와, Akt의 상위 신호인 PI3K의 활성화가 유도될 것임을 알 수 있었으며, 하위 신호인 HO-1의 발현 유도를 매개할 것임을 알 수 있었다.As shown in Figure 5a, 5b, Laminaria Treatment of LJE-1 and LJE-2 with organic solvent extracts from japonica increased the phosphorylation of ERK1 / 2 and Akt. Laminaria It was found that the administration of the extract of the organic solvent of japonica may induce the activation of the upper signal of ERK1 / 2 and PI3K, the higher signal of Akt, in the signaling system. It could be seen that.

실시예 2-3: Laminaria japonica 의 유기용매 추출물에 의한 전사조절인자 Nrf2 의 핵내 이동 변화 측정 Example 2-3 : Laminaria Measurement of Intranuclear Migration of Transcription Regulator Nrf2 by Japonica Organic Solvent Extract

전사조절인자인 Nrf2는 정상상태에서는 Keap1 단백질과 결합하여 싸이토플라즘에 격리되어 있으나, Akt 등에 의해 활성화되면 Keap1으로부터 떨어져 나와 핵으로 유입되어 HO-1 을 포함하는 다양한 타겟 유전자의 상호활성화(transactivation)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Laminaria japonica의 유기용매 추출 물이 Nrf2의 핵으로의 이동에 영향을 주는지 여부를 핵 단백질을 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였다. Nrf2, a transcriptional regulator, is isolated from the cytoplasm by binding to the Keap1 protein in the normal state, but when activated by Akt, it is separated from Keap1 and introduced into the nucleus, thereby transactivating various target genes including HO-1. It is known to play an important role in. Whether the organic solvent extract of Laminaria japonica affects the migration of Nrf2 to the nucleus was confirmed by Western blot using nuclear protein.

도 6에 나타난 바와 같이, Laminaria japonica의 유기용매 추출물LJE-1과 LJE-2의 처리는 모두 Nrf2의 핵으로의 이동을 증가시켰으며, 이러한 핵 내 Nrf2의 증가는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 Nrf2의 상위 신호인 Akt의 인산화에 의한 것으로 하위 신호인 HO-1의 발현 유도를 매개할 것임을 알 수 있었다.As shown in Figure 6, Laminaria Treatment of the organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of japonica increased the migration of Nrf2 to the nucleus. Laminaria It was found that the administration of the extract of the organic solvent of japonica may mediate the induction of HO-1, which is a lower signal, by phosphorylation of Akt, the upper signal of Nrf2, in the signaling system.

실시예 3: Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 산화적 스트레스에 의한 세포 손상 회복 측정 Example 3 : Laminaria Measurement of cell damage recovery by oxidative stress by organic solvent extract of japonica

실시예 3-1: Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 과산화수소에 의한 세포 손상 회복 효과 Example 3-1 : Laminaria Effect of organic solvent extract of japonica on cell damage recovery by hydrogen peroxide

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 회복시키는지 확인하기 위하여, 과산화수소를 처리하여 세포 독성을 유발하였으며, Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 의한 세포 독성 억제 정도를 세포 생존율로서 조사하였다. Laminaria of the present invention In order to verify that the organic solvent extract of japonica restore the cell damage caused by oxidative stress, hydrogen peroxide was treated to induce cytotoxicity, Laminaria The degree of inhibition of cytotoxicity by treatment of organic solvent extract of japonica was investigated as cell viability.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 1, 10 및 50 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 세포 손상을 유발시키기 위하여 과산화수소 500 μM을 처리한 후 다시 18시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 처리하지 않은 군 및 과산화수소를 처리하지 않은 군을 사용하였다. 이후, 세포를 회수하여 세포생존율 측정에 이용하였으며, 세포생존율은 MTT 분석법에 따라 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. Specifically, after culturing the cells in the same manner as in Example <1-1>Laminaria japonicaThe organic solvent extracts of LJE-1 and LJE-2 were treated at concentrations of 1, 10 and 50 μg / ml, respectively, and after 1 hour, 500 μM of hydrogen peroxide was treated and then incubated for 18 hours. As a controlLaminaria japonicaThe group not treated with the organic solvent extract and the group without treatment with hydrogen peroxide were used. Thereafter, cells were collected and used for measuring cell viability, and cell viability was measured according to the MTT assay, and the results are shown in FIG. 6.

도 7에 나타난 바와 같이, 과산화수소만 처리한 군에서는 세포 손상에 의한 세포 생존율 감소가 나타났으며, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1 및 LJE-2의 농도를 점차 증가하여 투여했을 경우에는 그 농도가 증가할수록 과산화수소에 의한 세포 생존율 감소가 더욱 회복됨을 확인하였다.As shown in Figure 7, in the group treated with hydrogen peroxide only showed a decrease in cell viability due to cell damage, Laminaria of the present invention When the concentrations of the organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of japonica were gradually increased, it was confirmed that as the concentration increased, the cell viability decreased by hydrogen peroxide.

따라서, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 산화적 스트레스에 의한 세포 손상을 방지하는 효과가 있음을 알 수 있었다.Therefore, the organic solvent extract of Laminaria japonica of the present invention was found to have an effect of preventing cell damage by oxidative stress.

실시예 3-2 : Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 LPS에 의한 세포내 활성 산소(ROS) 생성 억제Example 3-2 Laminaria Inhibition of Intracellular Activated Oxygen (ROS) Production by LPS by Organic Solvent Extract of japonica

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 산화적 스트레스에 의한 또다른 세포 손상을 회복시키는지 확인하기 위하여, LPS를 사용하여 세포내 활성 산소종(ROS) 생성을 유도했을 때 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 효과를 측정하였다. In order to make sure to recover the other cell damage caused by the organic solvent extract of the oxidative stress of the Laminaria japonica of the present invention, when using the LPS induced intracellular reactive oxygen species (ROS) produced an organic solvent extract of the Laminaria japonica The effect of was measured.

구체적으로, 상기 <1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 10 및 50 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 ROS 생성을 유발시키기 위하여 LPS 1 μg/ml을 처리한 후 다시 14시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 처리하지 않은 군 및 LPS를 처리하지 않은 군을 사용하였다. 이렇게 배양된 세포에서 ROS 생성 정도를 측정하기 위하여 DCFDA 20 μM를 1시간 동안 처리한 후 세포를 회수하여 Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS)를 이용한 유세포분석 (flow cytometry)을 수행하여 ROS 생성 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. Specifically, after culturing the cells in the same manner as in <1-1>Laminaria japonicaThe organic solvent extracts of LJE-1 and LJE-2 were treated at concentrations of 10 and 50 ㎍ / ml, respectively, and incubated for 14 hours after treatment with LPS 1 μg / ml to induce ROS generation after 1 hour. As a controlLaminaria japonicaThe group not treated with the organic solvent extract and the group not treated with LPS were used. In order to measure the degree of ROS generation in the cultured cells, DCFDA 20 μM was treated for 1 hour, and then the cells were recovered and flow cytometry was performed using a Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) to measure the level of ROS formation. The results are shown in FIG. 8.

도 7에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 군에서는 세포내 ROS 생성이 급격히 증가하였으며, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1 및 LJE-2를 처리하였을 경우에는 LPS에 의한 세포내 활성산소(ROS) 생성이 억제되는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 7, in the LPS-treated group, intracellular ROS production was rapidly increased, and when the organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of Laminaria japonica of the present invention were treated, intracellular active oxygen by LPS It was confirmed that (ROS) production was suppressed.

LPS에 의해 세포내 활성산소가 유도되었는데, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1 및 LJE-2로의 처리양이 증가할 수록 LPS에 의해 유도되어진 세포내 활성산소를 효과적으로 소거함으로써 정상구의 형광도보다 낮은 수치를 나타내었다. 따라서 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 세포내 활성산소 생성을 억제함으로써 우수한 항산화 활성을 나타내었다.Intracellular free radicals were induced by LPS, Laminaria. As the amounts of japonica treated with the organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 increased, they effectively lowered the intracellular free radicals induced by LPS. Thus Laminaria The organic solvent extract of japonica showed excellent antioxidant activity by inhibiting the generation of free radicals in cells.

실시예 4: Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 iNOS 억제 활성 측정 Example 4 Laminaria Determination of iNOS Inhibitory Activity by Organic Solvent Extract of Japonica

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 iNOS 단백질 발현을 저해하는 활성을 갖는지 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다. Laminaria of the present invention It was confirmed by Western blot whether the organic solvent extract of japonica has the activity of inhibiting iNOS protein expression.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 10, 50 및 100 ㎍/ml을 처리하고, 1시간 후에 세포를 활성화시키기 위하여 LPS 200 ng/㎖을 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 군 및 LPS만 처리한 군을 사용하였다. 이후, 세포를 회수하여 항-마우스 iNOS 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였고, 시료 내의 다른 단백질에는 변화가 없음을 보여주기 위한 대조군으로서 항-마우스 베타-액틴 항체 (Cell Signaling Technology 사, 미국; 희석비율 1:1,000)를 사용하였으며, 그 결과를 도 9a에 나타내었다. Specifically, after culturing the cells in the same manner as in Example <1-1>,Laminaria japonicaThe organic solvent extracts of LJE-1 and LJE-2 were treated with 10, 50 and 100 μg / ml, respectively, and after 1 hour, LPS 200 ng / ml was treated and then incubated for 24 hours. As a control group, a group not treated with LPS and a group treated with only LPS were used. Cells were then harvested and subjected to Western blot using an anti-mouse iNOS antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA; Dilution Ratio 1: 1,000), and as a control to show no change in other proteins in the sample. Mouse beta-actin antibody (Cell Signaling Technology, USA; dilution ratio 1: 1,000) was used and the results are shown in Figure 9a.

도 9a에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 군에서는 LPS를 처리하지 않은 군에 비해 iNOS 단백질 합성이 증가되었음을 확인할 수 있었고, Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 투여한 군에서는 iNOS 단백질 합성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 9a, in the LPS-only group was confirmed that the iNOS protein synthesis was increased compared to the group without the LPS treatment, Laminaria It was confirmed that iNOS protein synthesis was inhibited in the group administered with the organic solvent extract of japonica .

실시예Example 5:  5: LaminariaLaminaria japonicajaponica 의 유기용매 추출물에 의한 By organic solvent extract NONO 생성 억제 활성 및 세포생존율 측정 Production Inhibition Activity and Cell Viability Measurement

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 NO의 생성을 억제하는지 확인하기 위하여, 비활성화시에는 NO 생성 수준이 매우 낮으나, LPS로 활성화시킬 때 NO 생성이 유도된다고 알려져 있는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 사용하여 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 효과를 측정하였다. Laminaria of the present invention To determine if the organic solvent extract of japonica inhibits NO production, Laminaria was used in RAW 264.7 cells, a mouse macrophage line known to induce NO production when inactivated but very low when activated with LPS. The effect of the organic solvent extract of japonica was measured.

구체적으로, 상기 <1-1>과 동일한 방법으로 세포를 배양한 후 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 각각 10, 50 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 1시간 후에 세포를 활성화시키기 위하여 LPS 200 ng/㎖을 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 군 및 LPS만 처리한 군을 사용하였다. 이후, 세포 배양액을 회수하여 NO의 양을 그리에스 (Griess) 반응을 이용하여 측정하여 그 결과를 도 9b의 A에 나타내었다. 또한, 세포는 회수하여 세포생존율 측정에 이용하였으며, 세포생존율은 MTT 분석법에 따라 측정하여 그 결과를 도 9b의 B에 나타내었다. Specifically, after culturing the cells in the same manner as in <1-1>Laminaria japonicaThe organic solvent extracts of LJE-1 and LJE-2 were treated at concentrations of 10, 50 and 100 ㎍ / ml, respectively, and after 1 hour, LPS was treated with 200 ng / ml and then incubated for 24 hours. . As a control group, a group not treated with LPS and a group treated with only LPS were used. Thereafter, the cell culture was recovered and the amount of NO was measured using a Griess reaction, and the results are shown in A of FIG. 9B. In addition, cells were recovered and used for measuring cell viability, and cell viability was measured according to the MTT assay, and the results are shown in B of FIG. 9B.

도 9b의 A에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 군에서는 NO가 과량 생성되었으며, 상기 LPS와 함께 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 농도를 점차 증가하여 투여했을 경우에는 그 농도가 증가할수록 NO의 생성이 더욱 억제됨을 확인할 수 있었고, 도 9b의 B에 나타난 바와 같이, 이때의 세포생존율에는 전혀 변화가 없음을 확인하였다.As shown in A of FIG. 9B, in the LPS-only group, NO was excessively generated, and the Laminaria of the present invention together with the LPS. When the concentration of the organic solvent extract of japonica was gradually increased, it was confirmed that NO production was further inhibited as the concentration was increased. As shown in B of FIG. 9B, there was no change in cell viability at this time. Confirmed.

따라서, 본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물은 면역세포가 활성화되었을 때 세포생존율에는 변화를 일으키지 않으면서 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 알 수 있었다.Thus, Laminaria of the present invention The organic solvent extract of japonica was found to inhibit NO production in a concentration-dependent manner without changing the cell viability when activated.

실시예 8: Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 NF-kB 의 전사 활성 억제 Example 8 Laminaria Inhibition of NF-kB Transcriptional Activity by Organic Solvent Extract of japonica

본 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물에 의한 iNOS 단백질 양의 감소와 NF-kB 활성과의 관계를 확인하기 위하여, NF-kB에 의해 리포터 (reporter) 유전자가 발현되도록 제조된 플라스미드를 세포에 형질전환시킨 후 전사활성 (transactivation)을 측정하였다. 상기 플라스미드는 NF-kB 결합부위 활성에 의하여 발현이 조절되는 리포터 유전자로서 Firefly Luciferase가 클로닝 되어있는 플라스미드를 사용하였고, 형질전환 효율을 보정하기 위하여 Renilla Luciferase가 클로닝 되어있는 대조 플라스미드를 사용하였다 (문헌 [Choi C. Y., et al., Eur. J. Pharmacol., 576:151-159,2007] 참조). In order to confirm the relationship between the reduction of iNOS protein amount and NF-kB activity by the organic solvent extract of Laminaria japonica of the present invention, a plasmid prepared to express a reporter gene by NF-kB was transformed into cells. After transfection, the transactivation was measured. As the reporter gene whose expression is controlled by NF-kB binding site activity, the plasmid was cloned with Firefly Luciferase, and a control plasmid cloned with Renilla Luciferase was used to correct the transformation efficiency. Choi CY, et al., Eur. J. Pharmacol. , 576: 151-159,2007).

구체적으로, RAW 264.7 세포를 1× 106 세포/㎖의 농도로 맞추어 DEAE-덱스트란 방법을 사용하여 상기 두 종류의 플라스미드를 세포에 형질전환시킨 후 배양접시에 깐 다음, 5% CO2 배양기에서 37℃의 조건으로 배양하면서 상기 발명의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2를 처리하고, 1시간 후에 세포를 활성화시키기 위하여 LPS를 처리하고 18시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 군 및 LPS만 처리한 군을 사용하였다. 이후, 세포를 회수하여 세포 분리물을 추출한 다음, 활성측정에 사용한 단백질의 양에 대한 Luciferase의 활성 비율을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.Specifically, the RAW 264.7 cells were adjusted to a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and the two kinds of plasmids were transformed into cells using the DEAE-dextran method, placed in a culture dish, and then in a 5% CO 2 incubator. The organic solvent extracts LJE-1 and LJE-2 of Laminaria japonica of the present invention were incubated at 37 ° C., and treated with LPS to activate cells after 1 hour and incubated for 18 hours. As a control group, a group not treated with LPS and a group treated with only LPS were used. Thereafter, the cells were collected to extract the cell isolates, and then the activity ratio of Luciferase to the amount of protein used for activity measurement was measured. The results are shown in FIG. 10.

도 10에 나타난 바와 같이, Laminaria japonica의 유기용매 추출물 LJE-1과 LJE-2의 처리는 모두 NF-kB의 전사 활성을 억제시켰으며, 이러한 NF-kB 전사 활성의 억제는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 투여에 의해 신호전달체계에 있어서 하위 신호인 iNOS의 발현을 억제할 것임을 알 수 있었다.As shown in FIG. 10, Laminaria the japonica the organic solvent extract LJE-1 and treatment of the LJE-2 is a stylized both inhibit the transcription activity of NF-kB, the inhibition of these NF-kB transcriptional activity is passed signal by administration of an organic solvent extract of the Laminaria japonica system It was found that the expression of iNOS, which is a lower signal, would be suppressed.

제제예 1: Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제의 제조 Formulation Example 1 Laminaria Preparation of medicament containing organic solvent extract of japonica as active ingredient

<1-1> 정제의 제조<1-1> Preparation of Tablet

Laminaria japonica의 유기용매 추출물 25 ㎎을 부형제 직타용 락토오스 26 ㎎과 아비셀 (미세결정 셀룰로오스) 3.5 ㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이드 1.5 ㎎ 및 결합제인 직타용 L-HPC (low-hydrosyprophyl cellulose) 8 ㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활택제로서 마그네슘 스테아레이트 1 ㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.25 mg of organic solvent extract of Laminaria japonica was extracted with 26 mg of lactose for excipients and 3.5 mg of Avicel (microcrystalline cellulose), 1.5 mg of sodium starch glyconide as a disintegration aid and 8 mg of low-hydrosyprophyl cellulose (L-HPC) for binders. The mixture was put in a U-type mixer and mixed for 20 minutes. After mixing was completed, 1 mg of magnesium stearate was further added as a lubricant and mixed for 3 minutes. Tablets were prepared by tableting and film coating after a quantitative test and a humidity test.

<1-2> 시럽제의 제조<1-2> Preparation of Syrup

Laminaria japonica의 유기용매 추출물 2 g, 사카린 0.8 g 및 당 25.4 g을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후 글리세린 8.0 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르브산 0.4 g 및 적량의 증류수를 혼합한 다음, 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다. Laminaria 2 g of organic solvent extract of japonica , 0.8 g of saccharin and 25.4 g of sugar were dissolved in 80 g of warm water. After cooling the solution, 8.0 g of glycerin, 0.04 g of flavor, 4.0 g of ethanol, 0.4 g of sorbic acid, and an appropriate amount of distilled water were mixed, and then water was added to make 100 ml.

<1-3> 캡슐제의 제조<1-3> Preparation of Capsule

Laminaria japonica의 유기용매 추출물 50 ㎎, 유당 50 ㎎, 전분 46.5 ㎎, 탈크 1 ㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다. A capsule was prepared by mixing 50 mg of organic solvent extract of Laminaria japonica , 50 mg of lactose, 46.5 mg of starch, 1 mg of talc, and an appropriate amount of magnesium stearate and filling it into hard gelatin capsules.

<1-4> 주사제의 제조<1-4> Preparation of Injection

Laminaria japonica의 유기용매 추출물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 최종 부피가 100 ㎖가 되도록 하였다. 상기 용액을 앰플에 충진하고 가열 멸균하였다.1 g of organic solvent extract of Laminaria japonica , 0.6 g of sodium chloride and 0.1 g of ascorbic acid were dissolved in distilled water to a final volume of 100 ml. The solution was filled in ampoules and heat sterilized.

도 1은 산화적 스트레스와 관련된 신호전달 경로를 나타낸다.1 shows signaling pathways associated with oxidative stress.

도 2는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 HO-1 단백질 생성 유도를 나타낸 것이다.2 Laminaria Induction of HO-1 protein production by treatment with organic solvent extract of japonica .

도 3은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 HO-1의 mRNA 발현 유도를 나타낸 것이다.3 Laminaria Induction of mRNA expression of HO-1 by treatment with organic solvent extract of japonica .

도 4는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 HO-1 단백질 생성 유도에 대한 각종 신호전달효소의 특이적 억제제 처리 결과를 나타낸 것이다. 4 Laminaria The results of treatment with specific inhibitors of various signaling enzymes for induction of HO-1 protein production by treatment with organic solvent extracts of japonica .

도 5(a)는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 ERK1/2의 인산화 측정 결과, 도 5(b)는 Akt의 인산화 측정 결과를 나타낸 것이다.Figure 5 (a) is Laminaria Phosphorylation of ERK1 / 2 according to the treatment of the organic solvent extract of japonica , Figure 5 (b) shows the results of the measurement of phosphorylation of Akt.

도 6은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 전사조절인자 Nrf2의 핵내 이동 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.6 Laminaria Changes in the nuclear transfer of the transcriptional regulator Nrf2 following treatment with the organic solvent extract of japonica are shown.

도 7은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 과산화수소에 의한 세포 손상 회복을 나타낸 것이다.7 Laminaria It shows the recovery of cell damage by hydrogen peroxide following the treatment of organic solvent extract of japonica .

도 8은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 LPS에 의한 세포내 활성 산소(ROS) 생성 억제를 나타낸 것이다.8 is Laminaria Inhibition of intracellular reactive oxygen (ROS) production by LPS following treatment with organic solvent extract of japonica .

도 9(a)는 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 LPS에 의한 iNOS의 단백질 발현 유도의 억제를 측정한 결과, 도 9(b)는 NO 생성 유도의 억제를 나타낸 것이다.9 (a) is Laminaria As a result of measuring the inhibition of protein expression induction of iNOS by LPS according to the treatment of the organic solvent extract of japonica , Figure 9 (b) shows the inhibition of NO production induction.

도 10은 Laminaria japonica의 유기용매 추출물의 처리에 따른 LPS에 의한 NF-kB 의 전사 활성 억제를 나타낸 것이다.10 is Laminaria Inhibition of transcriptional activity of NF-kB by LPS following treatment of organic solvent extract of japonica .

Claims (4)

Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.A composition for preventing or treating antioxidant and immune diseases, comprising an organic solvent extract of Laminaria japonica as an active ingredient. 제 1 항에 있어서, The method of claim 1, 상기 Laminaria japonica의 유기용매 추출물이 헴옥시게나제-1 (heme oxygenase-1, HO-1)의 발현 유도, 과산화수소에 의한 세포 손상 감소, 세포내 활성산소 생성 억제, NF-kB 생성을 억제하여 과발현된 일산화질소 및 iNOS의 생성 억제하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물. Laminaria Nitrogen monoxide overexpressed by organic solvent extract of japonica induced expression of heme oxygenase-1 (HO-1), decreased cell damage by hydrogen peroxide, inhibited free radical production, and inhibited NF-kB production And a composition for preventing or treating antioxidant and immune diseases, characterized by inhibiting the production of iNOS. 제 2 항에 있어서, The method of claim 2, 상기 헴옥시게나제-1 (heme oxygenase-1, HO-1)의 발현 유도는 PI3K/Akt 신호전달 경로의 활성화, ERK1/2 인산화, Nrf2의 핵내 이동을 통해 핵내 수준 변화를 통해 유도되는 것을 특징으로 하는 항산화 및 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.The expression of heme oxygenase-1 (HO-1) is induced through activation of the PI3K / Akt signaling pathway, ERK1 / 2 phosphorylation, and intranuclear levels of Nrf2. Antioxidant and composition for the prevention or treatment of immune diseases. 제 1 항의 Laminaria japonica의 유기용매 추출물을 포함하는 항산화 및 면역질환의 예방용 식품 조성물.Claim 1 Laminaria Food composition for the prevention of antioxidant and immune diseases comprising an organic solvent extract of japonica .
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US20230091957A1 (en) * 2020-08-25 2023-03-23 Vita Motus AG Method for the Stimulation of Human Immune Cells

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