KR20100119491A - 올리고카르보네이트 분자 수송체 - Google Patents

올리고카르보네이트 분자 수송체 Download PDF

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KR20100119491A
KR20100119491A KR1020100024178A KR20100024178A KR20100119491A KR 20100119491 A KR20100119491 A KR 20100119491A KR 1020100024178 A KR1020100024178 A KR 1020100024178A KR 20100024178 A KR20100024178 A KR 20100024178A KR 20100119491 A KR20100119491 A KR 20100119491A
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제임스 럽튼 헤드릭
매튜 키제웨터
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브라이언 트랜토
로버트 웨이마우스
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인터내셔널 비지네스 머신즈 코포레이션
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Abstract

본 발명은 하기 화합식을 포함하는 시클릭 카르보네이트 단량체에 관한 것이다:
Figure pat00023

상기 식에서,
R1, R2 및 R3은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고;
R10은 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 연결 기이고;
R4는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 임의의 가교 기이고;
Z는 O, NH, NR 및 S로 이루어진 군 중에서 선택되고;
G는 구아니딘 기이고;
P는 보호 기이다.
시클릭 카르보네이트 단량체는 약물, 약물 후보자, 프로브 또는 다른 관심 분자를 포함하는 개시제와 반응시켜 카르보네이트 골격 및 이 카르보네이트 골격에 결합된 구아니딘 기의 한 말단에 결합한 관심 분자를 갖는 올리고머를 형성할 수 있다.

Description

올리고카르보네이트 분자 수송체{OLIGOCARBONATE MOLECULAR TRANSPORTERS}
본 발명은 카르보네이트 조성물, 이의 제조 방법, 및 생물학적 차단벽을 횡단하는, 치료제, 치료제 후보자, 프로브 또는 다른 관심 분자를 수송 및/또는 전달하는데 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
예를 들면 약물, 진단제, 프로브 등과 같은 관심 분자의 세포 또는 조직 흡수는 구아니디늄 작용 기를 보유하는 분자 수송체 화합물에 관심 분자를 가역적으로 결합시킴으로써 가능할 수 있거나 향상시킬 수 있다. 관심 분자의 세포 흡수는 분자 수송체 화합물 상의 구아니디늄 기의 수 및/또는 배열의 작용일 수 있다. 다양한 구아니디늄-농후(GR) 분자 수송체 화합물은 세포 투과 활성을 나타내고, 분지형 (덴드리머형) GR 분자 수송체 화합물은 각종 생물학적 유용한 카고(cargo)를 세포로 그리고 조직으로 운반할 수 있다. 예를 들어, GR 펩티드는 인간의 피부 및 이의 세포로 약물을 운반하는데 사용되어왔다. 또다른 예로서, GR 덴드리머형 분자 수송체 화합물은 표적 치료 및 화상진찰(imaging) 용도에 사용되어왔다.
하지만, GR 펩티드 및 GR 덴드리머형 분자 수송체 화합물은 합성하기에 어렵고, 시간 낭비적이며 그리고 고비용이 들 수 있다. 이는 결국 기본 조사, 화상진찰 및 치료에 있어 상기 화합물의 응용성을 제한한다. GR 분자 수송체 화합물을 제조하는 단순화된 합성 방법은 화학요법, 화상진찰, 진단 및 메카니즘 화학 생물학에 있어서 약물, 약물 후보자, 프로브 및 관심 분자의 전달시 수송체의 적용 범위를 확장시킬 수 있다.
본 발명은 GR 펩티드 및 GR 덴드리머형 분자 수송체 화합물의 합성을 보다 용이하게 하는 것을 목적으로 한다.
시클릭 카르보네이트의 유기촉매 개환 올리고머화는, 예를 들어 알콜, 아민 또는 티올과 같은 다양한 친핵체를 개시할 수 있으며, 명확한 분자량 및 좁은 다분산도의 올리고머의 1단계 합성을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 구아니딘 기로 작용기화된 올리고머화가능한(oligomerizable) 시클릭 카르보네이트 단량체에 관한 것이다. 이 시클릭 카르보네이트 단량체는, 예를 들면 약물, 약물 후보자, 유전자, 프로브 또는 이들의 등가물과 같은 개시제 화합물과 반응할 수 있으며, 이는 추가 단량체 또는 다른 단량체와 추가로 반응하여 카르보네이트 호모올리고머(homooligomer) 또는 코올리고머(cooligomer)를 제공할 수 있는 중간체를 생성한다. 그 결과 생성된 올리고머는 올리고카르보네이트 골격에 결합된 펜던트(pendant) 구아니딘 기와 함께 개시제를 혼입한다. 코올리고머 골격 상의 보호된 구아니딘 기는 경우에 따라 산과의 반응에 의해 탈보호되어 분자 수송체 화합물과 개시제의 구아니디늄 농후(GR) 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. GR 분자 수송체 컨쥬게이트는 선택된 생물학적 차단벽을 횡단하는 가역적으로 결합된 카고 화합물의 수송 및/또는 전달을 향상시킬 수 있는 펜던트 구아니디늄 기를 포함한다.
작용성 시클릭 카르보네이트 화합물 및 구아니딘 부분을 갖는 작용기화된 화합물은 반응하여 좁은 범위의 다분산도를 보유하는 시클릭 카르보네이트 단량체 생성물을 재현가능하게 합성할 수 있다. 시클릭 카르보네이트 단량체가 개시제 화합물과 반응하는 경우, 카르보네이트 코올리고머 반응 생성물에서 카르보네이트-함유 골격의 길이, 즉 공정에서 혼입된 단량체 수는 개시제-단량체 비의 조정을 통해 쉽게 조절할 수 있다. 코올리고머 반응 생성물은 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비(Mw/Mn = PDI)로서 정의되는 좁은 다분산도를 보유한다. 바람직하게는, PDI는 1.5 미만, 가장 바람직하게는 1.2 미만이다. 카르보네이트 코올리고머로부터 유도된 GR 분자 수송체 화합물은 저장시 안정하며 수용성이고, 생물학적 검정에서 보다 단시간 동안 또는 치료 농도에서 장기간 동안 사용시 세포에 대한 급성 독성을 나타내지 않는다. 본원에 기술된 분자 수송체 화합물에 의해 나타난 용이한 세포 흡수, 및 단쇄 내지 장쇄 올리고머 및 혼합 올리고머를 제조할 수 있는 방법의 용이성은 약물/프로브 전달, 특히 생물학적 카고에 대해 유리하다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식을 포함하는 시클릭 카르보네이트 단량체에 관한 것이다:
Figure pat00001
상기 식에서,
R1, R2 및 R3은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고;
R10은 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 연결 기이고;
R4는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 임의의 가교 기이고;
Z는 O, NH, NR 및 S로 이루어진 군 중에서 선택되고;
G는 구아니딘 기이고;
P는 보호 기이다.
또다른 측면에서, 본 발명은
(i) 시클릭 카르보네이트 골격 및 이 골격으로부터 펜던트된 하나 이상의 구아니딘 기를 포함하는 시클릭 카르보네이트 단량체; 및
(ii) 약물, 유전자 및 프로브 중 하나 이상으로부터 선택된 생물학적 카고를 포함하는 개시제
를 반응시켜 카르보네이트 골격 및 이 카르보네이트 골격에 결합된 구아니딘 기를 포함하는 올리고머를 형성시키는 단계를 포함하고, 생물학적 카고는 카르보네이트 골격의 하나 이상의 말단에 결합하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예의 상세한 사항은 하기 첨부된 도면 및 상세한 설명에서 제시된다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 명백하게 이해될 것이다.
본 발명은 GR 펩티드 및 GR 덴드리머형 분자 수송체 화합물의 단순화된 합성 방법을 제공함으로써 화학요법, 화상진찰, 진단 및 메카니즘 화학 생물학에 있어서 약물, 약물 후보자, 프로브 및 관심 분자의 전달시 수송체의 적용 범위를 보다 광범위하게 확장하는 효과를 제공한다.
도 1은 반응식 2에서 화합물 5b에 대한 RI 및 UV 검출기 스펙트럼의 GPC 오버레이(overlay)이다.
도 2는 반응식 2에서 화합물 5b의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3에는 MTC-에틸구아니딘-boc(반응식 2에서 화합물 3)(상단, CDCl3), PMTC-구아니딘-boc(반응식 2에서 화합물 5) (중간, CDCl3) 및 PMTC-구아니딘(반응식 2에서 화합물 6)(하단, DMSO-d6)의 적층된 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 r8 단실, D2O의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5a는 수 중의 단실 에탄올 보정 곡선이다.
도 5b는 옥탄올 중의 단실 에탄올 보정 곡선이다.
도 6은 r8 단실, 반응식 2에서의 화합물 6a 또는 6b 및 반응식 2에서의 화합물 4를 사용한 Jurkat 세포로의 세포 흡수의 농도 의존도의 플롯이다.
도 7은 r8 단실, 반응식 2에서의 화합물 6b 및 반응식 2에서의 화합물 4를 사용한, pH 7.2 PBS 또는 K+ PBS 중의 Jurkat 세포로의 세포 흡수의 농도 의존도의 플롯이다.
도 8은 반응식 2에서의 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 반응식 2에서의 화합물 4를 사용한, PBS 중의 Jurkat 세포로의 유세포분석(flow cytometry) 측정된 세포 흡수의 플롯이다.
도 9는 반응식 2에서의 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 반응식 2에서의 화합물 4의 경우 NaN3의 존재/부재 하에 PBS 중의 Jurkat 세포에서의 유세포분석 측정된 세포 흡수의 플롯이다.
도 10은 반응식 2에서의 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 반응식 2에서의 화합물 4를 사용한, PBS 또는 [K+] PBS 중의 Jurkat 세포로의 유세포분석 측정된 세포 흡수의 플롯이다.
도 11에는 2-광자 여기를 이용하여 형광 현미경에 의해 시각화된, 반응식 2에서의 화합물 6b의 Jurkat 세포로의 세포 흡수를 도시한 것이다. 패널 A-O는 세포(탑부터 버텀까지)를 통과한 다양한 Z-컷을 나타내고, 한편 패널 P는 동일한 세포의 명시야 이미지를 나타낸다.
일 측면에서, 본 발명은 구아니딘 기 또는 보호된 구아니디늄 기로 작용기화된 올리고머화가능한 시클릭 카르보네이트 단량체에 관한 것이다. 이 단량체는 작용성 시클릭 카르보네이트 화합물과 작용기화된 구아니디닐 화합물의 반응 생성물이다.
작용성 시클릭 카르보네이트 화합물은 5∼7개의 탄소 원자를 갖는 시클릭 카르보네이트 부분을 포함한다. 이러한 적용에 있어서, 용어 카르보네이트는 하기 화학식 1로 나타낸 카르보네이트 이온을 포함하는 화합물을 지칭하고, 용어 시클릭 카르보네이트 화합물은 카르보네이트 이온을 포함하는 시클릭 부분을 지칭한다:
Figure pat00002
하기 화학식 2에 제시된 바람직한 구체예에서, 작용성 시클릭 화합물은 6원 고리를 갖는 시클릭 카르보네이트 부분을 포함한다:
Figure pat00003
화학식 2에서, R1, R2 및 R3은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택될 수 있다. R1 및 R2는 바람직하게는 H이고, R3은 바람직하게는 CH3이다. 화학식 2를 다시 참조하면, Y는 시클릭 카르보네이트 화합물과 반응시키고자 하는 구아니디닐 화합물의 작용가(functionality)에 따라 광범위하게 달라질 수 있는 작용 기이다. 적당한 작용 기는 아실 기, 예컨대 카르복실산, 산 클로라이드, 무수물, 아미드, 에스테르 등을 포함한다. 예를 들어, 화학식 2의 시클릭 카르보네이트 화합물에 대한 바람직한 작용 기 Y는 하기 화학식 3에 제시된 카르복실산 유도체이다:
Figure pat00004
화학식 3에서, R4는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴일 수 있는 임의의 가교 기이고, 바람직하게는 R4는 선형 알킬 또는 시클로알킬이다. 화학식 3에서, X는, 예를 들어 카르복실산 유도체가 활성화된 에스테르가 되도록 하는, OH, OC(O)R, Cl, Br, I, OR 또는 일부 다른 작용 기일 수 있다.
작용기화된 구아니디닐 화합물은 하나 이상의 구아니딘 기 및 하나 이상의 작용 기를 포함한다. 이러한 적용에서 용어 구아니딘 또는 구아니디닐 기는 하기 화학식 4로 나타낸 구조를 보유하는 부분을 지칭하고, 용어 구아니디늄 기는 이의 양 하전된 컨쥬게이트 산 형태를 지칭한다:
Figure pat00005
화학식 4에서, R6 및 R7은 바람직하게는 H이고, 한편 R5 및 R8은 바람직하게는 예를 들어 Boc 우레탄(Boc = C(O)OtBu) 또는 벤질(CH2Ph)로부터 선택된 보호 기이다.
화학식 4에서, R9는 의도된 적용에 따라 광범위하게 달라질 수 있고, 작용기화된 구아니디닐 화합물에서, R9는 상기 화학식 2의 시클릭 카르보네이트 화합물 상의 작용 기 Y와 반응하도록 선택된 작용 기이다. 예를 들어, 산 클로라이드가 시클릭 카르보네이트 화합물(화학식 2) 상의 작용 기 Y로서 선택되는 경우, 구아니디닐 화합물에 적당한 작용 기 R9는 하나 이상의 히드록시, 티오 또는 아미노 기, 바람직하게는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 지방족 히드록시, 티오 또는 아미노 기를 포함한다. 예시적 구아니디닐 화합물은 하기 화학식 5에 제시된다:
Figure pat00006
화학식 5에서, R10은 선형의 치환 또는 비치환된 알킬이고, Z는 OH, NH2 또는 SH이다.
작용성 시클릭 카르보네이트 화합물 및 작용성 구아니디닐 화합물은 반응하여 구아니딘 기로 작용기화되는 올리고머화가능한 시클릭 카르보네이트 단량체를 생성할 수 있다. 시클릭 카르보네이트 단량체는 시클릭 카르보네이트 및 이 시클릭 카르보네이트로부터 펜던트된 하나 이상의 구아니딘 기를 포함한다. 예를 들어, 상기 화학식 3의 화합물이 상기 화학식 5의 화합물과 반응하는 경우, 그 결과 생성된 시클릭 카르보네이트 단량체는 하기 화학식 6에 제시된다:
Figure pat00007
화학식 6에서, R1, R2, R3 및 R10은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬 중에서 독립적으로 선택되고, R1 및 R2는 바람직하게는 H이고, R3은 바람직하게는 CH3이고, R10은 바람직하게는 알킬이다. 임의의 가교 기 R4는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴일 수 있고, R4는 바람직하게는 알킬이다. G는 구아니딘 기이고, P는 Boc 우레탄 또는 벤질 기 중에서 선택된 보호 기이고, Z는 O, NH 또는 S이고, Z는 바람직하게는 O이다.
구아니디닐 작용성 올리고머화가능한 시클릭 카르보네이트 단량체는 적당한 촉매 및 개시제 화합물의 존재 하에 올리고머화될 수 있다. 이 반응에서는, 시클릭 카르보네이트 단량체 골격 상의 시클릭 고리가 개환되고 제1 및 제2 단량체가 연결되어, 카르보네이트 골격, 이 골격에 결합되는 펜던트 구아니딘 기 및 올리고머의 한쪽 말단에서의 개시제를 지닌 호모올리고머 또는 코올리고머가 제공된다.
개시제 화합물은 친핵체이어야 하고 개환 올리고머화 단계를 개시하기 위해 임의의 아미노, 히드록시 또는 티올 작용 기를 포함할 수 있다. 적당한 예로는 아민, 알콜, 티올 및 비제한적 예로서 지방족 선형 아미노 알콜을 비롯한 아미노 알콜, 뿐만 아니라 다작용성 분지 시스템(예, 디에탄올 아민), 아미노, 히드록시 또는 티올 작용 기를 함유한 과분지된 수지상 시스템, 아미노페놀, 아민 작용성 펩티드 및 관련된 생체분자, 치환된 알콕시아민, 작용기화된 세미카르바지드, 작용기화된 히드라진, 아미노알콕시실란, 아미노 또는 히드록시 말단화된 올리고머, 예를 들면 (메타)아크릴레이트, 스티렌, 폴리에테르(예, PEG 등), THF 및 PPO-Jeffamine 등, 및 용이하게 합성할 수 있는 폴리부타디엔 등이 포함된다.
개시제 화합물은 골격의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 결합할 수 있는, 생물학적 카고, 예컨대 약물, 유전자, 프로브 또는 다른 생물학적 유용한 화합물 등을 경우에 따라 포함할 수 있다.
적당한 촉매는 N-헤테로시클릭 카르벤, 1,5,7-트리아자바이시클로[4.4.0]dec-5-엔(TBD), 티오우레아/아민, 포스파젠 또는 당업계에 공지된 금속 알콕시드 패밀리 중 어느 것이든, 예컨대 LiOR, 주석 옥토에이트, Al(OR)3, LZnOR 등을 포함하는 유기 촉매 패밀리 중 어느 것이든 포함하고, R은 선형 또는 분지형 치환 또는 비치환된 알킬 또는 아실 중에서 선택되고, L은 알콕시드 OR, 치환 또는 비치환된 아릴 중에서 선택된 Ar을 갖는 β-디케티미네이트[ArCHRCHCHRNAr] 또는 트리덴테이트 디아미노 아릴옥시드, 예컨대 '2,4,-디-tert부틸-6{[2'디메틸아미노에틸)메틸아미노]메틸 페놀레이트 중에서 선택된다.
바람직하게는, 올리고머화를 위한 촉매는 티오우레아 ArNHC(S)NHR'과 3차 아민 또는 디아민의 조합물이고, Ar은 임의의 치환 또는 비치환된 아릴일 수 있고 R'은 임의의 치환 또는 비치환된 아릴 또는 알킬일 수 있다. 가장 바람직하게는, 티오우레아는 아릴 화합물, 예컨대 3,5-트리플루오로메틸페닐, 3,5-디니트로페닐, 나프틸로부터 유도되고 R'은 2차 알킬, 예컨대 시클로헥실, 시클로펜틸 등이다.
호모올리고머 또는 코올리고머를 형성하기 위해, 구아니디닐 작용성 시클릭 카르보네이트 단량체는 또한 하나 이상의 제2 단량체와 임의로 반응할 수도 있다. 제2 단량체는 광범위하게 다양한 작용 기, 예컨대 보호된 티올, 아민, 히드록실 또는 산 작용 기들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 단량체는 약물, 유전자, 프로브 또는 다른 생물학적 유용한 화합물을 포함할 수 있다. 구아니디닐 작용성 시클릭 카르보네이트 단량체 또는 구아니디닐 시클릭 카르보네이트 단량체를 제2 단량체와 반응시킴으로써 형성된 코올리고머는 호모올리고머 또는 코올리고머의 특성을 변형 및/또는 향상시키는데 선택된 작용 기를 갖는 제3 단량체와 임의로 추가 반응할 수 있고, 제3 단량체는 생물학적 카고를 포함하는 것이 꼭 필요하지는 않다.
바람직한 구체예에서, 제2 또는 제3 단량체는 5-7원 작용기화 또는 비작용기화된 시클릭 카르보네이트이다. 예시적 단량체는 하기 화학식 7에 제시된 구조를 보유한다:
Figure pat00008
화학식 7에서, R11, R12 및 R13은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬 또는 아릴 중에서 독립적으로 선택될 수 있고, R1 및 R2는 바람직하게는 H이고, R13은 바람직하게는 CH3이다. 임의의 가교 기 R14는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴일 수 있고, R4는 바람직하게는 알킬이다. F는 광범위하게 다양하여 펩티드, 단백질 또는 다른 생물학적 제제와 커플링할 수 있거나 GR 올리고카르보네이트 수송체의 용해도를 제어할 수 있는 작용 기이다. 적당한 작용 기는 아실 기, 예컨대 카르복실산, 아미드, 에스테르 등 및 보호된 티올, 아민 또는 히드록실 기를 포함한다. 대안적으로, F는 약물, 유전자, 프로브 또는 다른 생물학적 유용한 화합물을 포함할 수 있다.
상기 기술된 올리고머화 반응은 바람직하게는 4∼350 범위의 올리고머화도(DP; degree of oligomerization)를 제공하고, 특히 바람직한 DP는 6∼25 범위이다.
바람직한 구체예에서, 구아니딘 작용성 시클릭 카르보네이트 단량체는 개시제 화합물과 반응한다. 개시제 화합물은 아미노, 히드록시 또는 티올 작용 기를 포함하고, 경우에 따라 생물학적 카고, 예컨대 약물, 유전자, 프로브 또는 다른 생물학적 유용한 화합물 또는 이들의 등가물 등을 추가로 포함한다.
예를 들어, 하기 반응식 1에 제시된 바와 같이, 화학식 6의 단량체가 생물학적 유용한 화합물(B)을 포함하는 개시제와 반응하는 경우, 이렇게 생성된 카르보네이트 코올리고머 반응 생성물은 카르보네이트-함유 골격 스캐폴드(scaffold)로부터 펜던트된 다중 보호된 구아니디닐 기 뿐만 아니라 골격의 하나 이상의 말단 상에서의 생물학적 유용한 카고 화합물을 포함한다.
[반응식 1]
Figure pat00009
반응식 1에서, R1, R2, R3 및 R10은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬 중에서 독립적으로 선택되고, R1 및 R2는 바람직하게는 H이고 R3은 바람직하게는 CH3이고, R4는 임의의 가교 기이고, G는 구아니디닐 기이고, P는, 예를 들어 Boc 우레탄(Boc = C(O)OtBu) 또는 벤질(CH2Ph) 중에서 선택된 보호 기이고, E는 O, S 또는 NH, 바람직하게는 O이고, B는 생물학적 유용한 기이다.
선택된 반응물 및 이용된 반응 조건에 따라, 카르보네이트 코올리고머는 몇몇의 단량체 단위(또한 본원에서 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 올리고머로도 지칭됨), 복수의 단량체 단위(또한 본원에서 올리고머로도 지칭됨), 및/또는 다중 분지를 자체로 보유하는 화합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 반응식 1의 카르보네이트 코올리고머에서 n은 약 4∼약 350으로 광범위하게 다양할 수 있고, 전형적으로 n은 약 1∼약 50, 더욱 바람직하게는 약 5∼약 25, 가장 바람직하게는 약 8∼약 22의 범위일 수 있다.
더욱 상세한 예로서, 하기 실시예에 상세하게 논의되는 구체예에서, 화학식 8의 구아니디닐 작용성 올리고머화가능한 시클릭 카르보네이트 단량체, MTC-에틸구아니딘-BOC는 화학식 9의 아미노 작용성 개시제 화합물, 5-(디메틸아미노)-N-(2-히드록시에틸)나프탈렌-1-설폰아미드와 반응하여 화학식 10의 올리고카르보네이트 화합물, PMTC-구아니딘-boc를 생성할 수 있다:
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
카르보네이트 코올리고머는 경우에 따라 산과 반응하여 구아니딘 기(화학식 6 및 반응식 1) 상의 보호 기 P를 제거할 수 있고, 이는 반응 생성물로서 구아니디늄 농후(GR) 분자 수송체 컨쥬게이트 화합물을 생성한다. 예를 들어, 하기 화학식 11에 제시된 바와 같이, 산 트리플루오로아세트산(TFA)와 반응시킨 후, 화학식 10의 카르보네이트 올리고머로부터 유도된 GR 분자 수송체 컨쥬게이트 화합물은 선택된 생물학적 차단벽을 횡단하는 가역적으로 결합된 카고 화합물의 수송 및/또는 전달을 향상시킬 수 있는 펜던트 구아니디늄 기를 포함한다.
Figure pat00013
상기 화학식 11에 제시된 분자 수송체 컨쥬게이트 화합물에는 세포 흡수 연구에서 종래에 미이용된 골격 스캐폴드(카르보네이트) 및 측쇄 스페이싱(1,7)이 혼입되어 있다. 이러한 화합물은 이의 투여에 필요한 37℃에서 수시간 동안 Hepes 완충 용액(pH 7.4) 중에서 안정하고, 생물학적 검정 조건(≤ 25 μM, 5분 항온처리, 80% 이상의 생존력) 하에서 또는 장시간 노출 동안 치료 농도에서 사용하는 경우 Jurkat 세포주에서 급성 독성을 나타내지 않는다. 이의 올리고아르기닌 대응부(couterpart)와 같이, 그러한 수송체는 고 수용성이지만, 나트륨 라우레이트, 모델 막 성분으로 처리하는 경우 옥탄올(막 극성 서로게이트(surrogate)) 내로 용이하게 분배된다.
반응식 2는 본 발명의 일 측면에 따른 일 단계 올리고머화 공정의 바람직한 구체예를 예시한다. 이 공정은 동일한 합성 조작에서 프로브 및 유사하게 약물 부분의 직접 도입을 가능하게 한다.
[반응식 2]
Figure pat00014
예를 들어, 상기 기술된 단량체(예, 상기 반응식 2에서 화합물 3)는 수송체-컨쥬게이트 합성을 위한 키트 시약으로서 사용할 수 있고, 카르보네이트 분자 수송체 컨쥬게이트 화합물(상기 반응식 2에서 화합물 6)은 모체 아르기닌의 것과 유사하거나 더 우수한 흡수를 나타낸다. 본원에 기술된 화합물에 의해 제시된 용이한 세포 흡수 및 단쇄 내지 장쇄 올리고머 (및 코-올리고머)를 제조할 수 있는 용이성은 약물/프로브 전달, 특히 생물학적 카고에 대해 다수의 이점을 제공한다.
본 발명의 구체예는 하기 비제한적 실시예를 참조하여 기술될 것이다.
실시예
일반적인 실험 정보
모든 화학물질은 Aldrich로부터 구입하였으며 이는 달리 언급하지 않는 한 입수한 그대로 사용하였다.
1-(3,5-비스-트리플루오로메틸-페닐)-3-시클로헥실-티오우레아(TU)는 문헌[Pratt, et al., Macromolecules, 2006, 39, 7863-7871]에 개설된 절차에 따라 제조하였고, 옥토아르기닌(r8)은 문헌[Wender, et al., Org. Lett., 2001, 3, 3229-3232]에 개설된 문헌 절차에 따라 제조하였다.
단실 아미노카프로산 NHS 에스테르는 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Invitrogen으로부터 입수하였다.
메틸렌 클로라이드는 밤새 CaH2 하에서 교반하고, 3회 동결-펌프-해동 사이클에 의해 탈기화시키고 화염-건조된 봄베(bomb)로 진공 전이시켰다.
겔 투과 크로마토그래피(GPC)는 직렬로 연결된 4개의 5 μm Waters 컬럼(300 mm x 7.7 mm)이 구비된 Waters 크로마토그래피 상에서 1.0 mL/분의 유속으로 테트라히드로퓨란(THF) 중에서 수행하였다.
Viscotek(Houston, TX) S3580 굴절률 검출기 및 Viscotek GPCmax 오토샘플러를 사용하였다. 이 시스템은 단분산 폴리스티렌 표준물(Polymer Laboratories 및 Varian, Inc., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용하여 보정하였다.
스펙트럼은 Varian INOVA 500 MHz 및 Varian Mercury 400 MHz 자기 공명 분광계 상에서 NMR 기록하였다.
합성 절차
1. 5-(디메틸아미노)-N-(2- 히드록시에틸 )나프탈렌-1- 설폰아미드 (반응식 2에서 화합물 4)
Figure pat00015
질소 하에, 교반 막대가 구비된 건조 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내에 단실 클로라이드(5.05 g, 18.72 mmol)를 배치하였다. 시린지를 통해 건조 메틸렌 클로라이드(50 mL)를 첨가하고, 플라스크에 첨가 깔대기를 부착시키고 이 시스템을 0℃로 냉각시켰다. 에탄올아민(1.25 g, 1.24 mL, 20.59 mmol), 트리에틸아민(2.27 g, 3.13 mL, 22.46 mmol), 및 75 mL의 건조 메틸렌 클로라이드를 첨가 깔대기에 적재하고, 용액을 30분에 걸쳐 교반하면서 적가하였다. 이 용액을 추가 30분 동안 교반한 후 얼음조를 제거하여 용액을 상온에 도달하도록 하고 추가 14시간 동안 교반하였다.
플래쉬 크로마토그래피를 사용하여 이 생성물을 단리시키고 메틸렌 클로라이드로 초기에 용출한 후 메틸렌 클로라이드 중에서 극성을 5% 메탄올로 점차 증가시켰다. 이어서 용매를 제거하고, 정치시 고체화되는 황색 오일을 얻었다. 수율 5.0 g(83%). 1H-NMR(CDCl3) δ: 8.6-7.2 (m, 6H, ArH-), 5.45 (t, 1H, -NH), 3.62 (m, 2H, -CH2OH), 3.07 (m, 2H, -NHCH2-), 2.90 (s, 6H, (-CH3)2), 2.25 (bs, 1H, -OH).
2. MTC - 에틸구아니딘 - BOC (반응식 2에서 화합물 3)
Figure pat00016
문헌[Pratt, et al., Chem . Commun ., 2008, 114-116]에 개설된 옥살릴클로라이드를 사용한 표준 절차를 이용하여 5-메틸-2-옥소-[1,3]디옥산-5-카르복실산(MTC-OOH)(1.26 g, 7.9 mmol)을 초기에 MTC-Cl로 전환시켰다. 교반 막대가 구비된 건조 250 mL 둥근 바닥 플라스크에서, 형성된 중간체를 75 mL의 건조 메틸렌 클로라이드 중에 용해시켰다. 질소 유동 하에, 1,3-디-boc-2-(2-히드록시에틸)구아니딘(2.0 g, 5.59 mmol), 피리딘(0.55 g, 0.56 mL, 6.92 mmol) 및 30 mL의 건조 메틸렌 클로라이드가 채워진 첨가 깔대기를 부착시켰다. 플라스크를 0℃로 냉각시켰고, 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 형성된 용액을 추가 30분 동안 교반한 후 빙조를 제거하고, 그 용액을 질소 하에 추가 4시간 동안 교반하였다. 미정제 생성물을 실리카겔 컬럼 상에 직접 배치하고, 100% 에틸 아세테이트로 용출시킴으로써 생성물을 분리하였다. 생성물 분획을 제거하고 용매를 증발시켜 백색 결정으로서의 생성물을 형성하였다. 수율 2.70 g (92%). 1H-NMR (CDCl3) δ: 11.5 (s, 1H, NH), 8.65 (t, 1H, NH), 4.70 (d, 2H, CH2), 4.35 (t, 2H, CH2), 4.23 (d, 2H, CH2), 3.75 (q, 2H, CH2), 1.55 (s, 18H, CH3), 1.45 (s, 3H, CH3). HR-MS-ESI: C19H31N3O9+Na에 대한 m/z, 계산치: 468.45; 실험치: 468.1952.
3. ( PMTC -구아니딘- boc )(반응식 2에서 화합물 5)의 합성:
Figure pat00017
대표예 5b
화염 건조된 유리류 TU(21 mg, 56 μmol)를 사용하는 N2 분위기를 갖는 글로브 박스에서, 교반 막대가 구비된 20 mL 유리 바이알 내에 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU)(8.5 mg, 56 μmol) 및 화합물 4(33 mg, 112 μmol)를 투입하였다. 소량 부피의 메틸렌 클로라이드를 첨가하고, 형성된 용액을 10분 동안 교반시켰다. 1 M 단량체의 최종 농도에 충분한 추가 DCM 중에 용해된 MTC-구아니딘-boc(0.5 g, 1.12 mmol)(화합물 3)를 촉매/개시제 용액에 첨가하고, 이렇게 생성된 용액을 3시간 동안 계속 교반하였다(1H NMR 분석에 의해 연구된 전환). 벤조산(15 mg, 120 μmol)을 첨가하여 촉매를 켄칭하였다. 미정제 반응 용액을 투석 백(1,000 g/몰 컷 오프)으로 옮기고, 48시간 동안 메탄올에 대해 투석하고, 24시간 후 메탄올 용액을 교환하였다. 잔여 용매를 증발시켜 회백색 고체로서 반응식 2에서 화합물 5b를 형성하였다(0.425 g, 5b).
화합물 5b의 1H-NMR 스펙트럼(CDCl3)은, 하기 선택된 공명 하에 표시된 적분으로 도 2에 도시하였다. 올리고머 골격 g 및 g'에 대한 말단 기 공명(즉, b 및 e)의 적분에 의해 올리고머화도를 측정하였다. δ: 11.49 (s, 11H, NH), 8.66 (t, 11H, NH), 8.32 (d, 1H, ArH), 8.26 (d, 1H, ArH), 7.58 (m, 2H, ArH), 7.34 (m, 1H, ArH), 7.23 (d, 1H, ArH), 4.30 (m, 65H, 폴리MTC-CH2), 4.14 (t, 2H, CH2), 3.75 (m, 22H, 폴리MTC-CH2), 3.22 (q, 2H, CH2), 2.92 (s, 6H, CH3), 1.51 (s, 200H, CH3-boc), 1.28 (s, 3H, 폴리MTC-CH3).
화합물 5a 및 5c의 합성(반응식 2)을 유사하게 수행하였다. 5a의 경우, 화합물 4의 양 = 41.5 mg(141 μmol)이었다. 5c의 경우, 단실 에탄올의 양 = 15.0 mg(51 μmol)이었다.
Figure pat00018
도 1은 화합물 5b의 RI 및 UV 검출기 스펙트럼의 GPC 오버레이를 도시한 것이다.
4. PMTC -구아니딘(반응식 2에서 화합물 6)의 합성
Figure pat00019
교반 막대가 구비된 100 mL 둥근 바닥 플라스크 내에 PMTC-구아니딘-boc(반응식 2에서 화합물 5b)(0.23 g, 46 μmol)를 투입하고 18 mL의 메틸렌 클로라이드 중에 용해시켰다. 트리플루오로아세트산(TFA)(2 mL)을 첨가하고 플라스크를 밀봉하고 18시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 30분 동안 용액을 통해 질소 기체를 기포 발생시키고 잔여 용매를 회전 증발에 의해 증발시켜 담황색 왁스상 고체로서의 화합물 6b를 생성하였다(0.20 g, 85%). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.40 (d, 1H, ArH), 8.20 (m, 2H, ArH), 7.90 (bs, 11H, 폴리MTC-NH), 7.55 (m, 2H, ArH), 7.25 (bs, 44H, 폴리MTC-NH), 7.18 (m, 44H, 폴리MTC-CH2), 4.02 (m, 22H, 폴리MTC-CH2), 3.92 (t, 2H, CH2), 3.37 (m, 22H, 폴리MTC-CH2), 2.99 (q, 2H, CH2), 2.79 (s, 6H, CH3), 1.10 (s, 33H, 폴리MTC-CH3).
도 3은 MTC-에틸구아니딘-boc(화합물 3)(상단, CDCl3), PMTC-구아니딘-boc(화합물 5)(중간, CDCl3) 및 PMTC-구아니딘(화합물 6)(하단, DMSO-d6)의 적층된 1H-NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
5. 단실 - r8 의 합성
Figure pat00020
교반 막대 및 탈이온수를 갖는 소형 원추형 바이알에 옥타아르기닌(25 mg, 0.01834 mmol)을 첨가한 후, 동결건조시켰다. 단실 아미노카프로산 NHS 에스테르(10 mg, 0.021668 mmol, Invitrogen)를 100 μL DMF 중에 용해시키고 원추형 바이알에 첨가하였다. 디이소프로필에틸아민(2.8 μL, 0.16251 mmol)을 첨가하고 DMF가 질소 스트림과 블로우 오프(blown off)되는 경우 반응물을 22.4시간 동안 실온에서 교반하였다. 아세토니트릴(0.5 mL) 및 탈이온수(1.5 mL)를 첨가한 후 트리플루오로아세트산(1.7 μL, 20 당량)을 첨가하고, 역상 HPLC(H2O:CH3CN, 5-60% 구배)에 의해 반응물을 정제하였다.
생성물 함유 분획을 수집하고 동결건조시켜 백색/황색 비정질 고체로서의 단실 r8을 형성하였다(25 mg, 90%); 분취 RP-HPLC(H2O:CH3CN) > 95% 순도. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ = 8.652 (d, J = 8.70 Hz, 2 H), 8,424 (d, J = 8.74, 1 H), 8.306 (d, J = 6.98, 2 H), 7.93 (d, J = 7.71, 1 H), 7.85-7.80 (m, 3 H), 4.33-4.18 (m, 8 H), 3.354 (s, 6 H), 3.18-3.11 (m, 14 H), 2.896 (t, J = 6.61, 2 H), 2.116 (t, J = 7.17, 3 H), 1.84-1.58 (m, 29 H), 1.38-1.29 (m, 4 H), 1.137 (d, J = 7.39, 3 H) ppm. MALDI MS: C66H129N35O11S(TFA 없음)에 대한 [M]+, 계산치: 1620.04; 실험치: 1615.365.
도 4는 r8 단실, D2O의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
6. 옥탄올 -물 분배
하기 기술된 분배 실험의 경우, 각각 물 및 옥탄올 중의 단실 에탄올의 보정 곡선을 초기에 만들었다(도 5a-5b 참조). λ=335 nm에서 Agilent 8453 분광광도계(Agilent, Inc., 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)를 사용하여 UV-vis 스펙트럼을 기록하였다. 보정 곡선으로부터, ∼0.1 mM의 초기 올리고머 농도(수중)에 상응하는 것으로, 흡광도가 1.0∼1.5 기구 흡광도 단위(AU; absorbance unit)이도록 한 이상적인 올리고머 농도를 만들었다. 올리고머를 수중(1 mL)에 용해시킨 후, 옥탄올(1 mL)을 첨가하고 물 및 옥탄올 층 둘다에서 UV-스펙트럼을 기록하였다. 나트륨 라우레이트(총 구아니딘 농도에 대해 1.2 당량)를 첨가하고, 바이알을 부드럽게 진탕하고, 물 및 옥탄올 층 둘다에서 UV 스펙트럼을 기록하였다. 분배 후, 물 및 옥탄올 층을 분리하고, 이후 수상을 동결건조시키고 이의 함량을 1H-NMR로 분석하였다.
화합물 6b(n = 11 단실 작용기화된 폴리(MTC-구아니딘))는 나트륨 라우레이트를 첨가하고 UV 여기시키면 옥탄올 층 내로 모두 분배되었다.
7. 유세포분석에 의한 세포 흡수 검정
단실-태깅된 올리고머 및 옥타아르기닌 대조군을 5 μM, 12.5 μM 및 25 μM 농도에서 pH 7.2 PBS 완충제 중에 제공하였다. RPMI 배지 1640(+ 글루타민) 중 10% FBS에서 성장시킨 Jurkat 세포를 세포 흡수 실험에 사용하였다. 3.0 x 106 세포/mL에서 200 μL/웰을 갖는 세포를 마이크로역가 평판 상에 평판배양하였다. 그 평판을 원심분리(3분 동안 1300 rpm)하고, 배지를 제거하고, 세포를 PBS 완충제에 2회 재현탁시켰다.
다양한 농도에서 화합물 6(a-c) 및 r8 대조군을 23℃에서 5분 동안 세포와 항온처리하였다. 마이크로역가 평판을 원심분리하고 세포를 단리시키고, PBS로 세척하고 프로피듐 요오다이드(3 μg/mL, 0.01%)를 함유한 PBS 중에 재현탁시켰다. 세포는 단실 형광단의 여기를 위한 UV 레이저가 구비된 형광 유세포분석기(Vantoo, 스탠포드 유니버시티)를 사용하여 분석하고, 프로피듐 요오다이드로 염색된 세포를 분석에서 제외하였다. 제시된 데이타는 분석된 20,000 세포에 대한 평균 형광 신호이다.
도 6은 23℃에서 r8 단실, 올리고머 화합물 6a 또는 6b, 또는 단실 알콜 개시제 화합물 4와 5분 동안 항온처리된 pH 7.2 PBS 중의 Jurkat 세포로의 세포 흡수의 농도 의존도를 도시한 것이다.
8. 4℃에서 또는 나트륨 아지드(NaN 3 )의 존재 하에 세포 흡수 검정
4℃에서의 흡수 검정은 4℃에서 용액을 미리 냉각시키고 세포를 얼음 상에서 항온처리하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 나트륨 아지드의 존재 하에서의 흡수 검정은 사용된 세포를 2% FBS/PBS 완충제 중 0.5% 나트륨 아지드와 30분 동안 예비 항온처리시킨 후 형광 표지화된 올리고머를 첨가하고 PBS 완충제 중 0.5% 나트륨 아지드로 세포를 세척하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
9. 고 칼륨 [K + ] 완충제의 존재 하에서의 세포 흡수 검정
136.9 mmol KCl, 1.5 mmol KH2PO4 및 8.3 mmol K2HPO4*7 H2O를 혼합하여 고 칼륨 PBS 완충제를 제조하고 pH = 7.2로 적정하였다. 모든 올리고머의 스톡 용액을 고 칼륨 PBS 완충제 중에서 제조하였다. 흡수 검정은 세포를 고 칼륨 완충제로 2회 세척하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 그리고나서 세포를 고 [K+] 완충제 중에서 올리고머에 노출시키고, 동일 완충제로 세척하고, 최종적으로 분석을 위해 그 완충제에 재현탁시켰다.
도 7은 2개 별도의 뱃치, 1 또는 2에서의 r8 단실, 올리고머 화합물 6b, 또는 23℃에서의 단실 알콜 개시제 화합물 4와 5분 동안 항온처리된 pH 7.2 PBS 또는 K+ PBS 중의 Jurkat 세포로의 세포 흡수의 농도 의존도 플롯이다.
도 8은 PBS 중의 올리고카르보네이트 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 단실 알콜 개시제 화합물 4의 유세포분석 측정된 세포 흡수의 플롯이다. Jurkat 세포를 23℃ 또는 4℃에서 5분 동안 각종 수송체와 항온처리하였다.
도 9는 PBS 중의 올리고카르보네이트 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 단실 알콜 개시제 화합물 4의 유세포분석 측정된 세포 흡수의 플롯이다. Jurkat 세포를 NaN3의 존재 및 부재 하에 23℃에서 5분 동안 각종 수송체와 항온처리하였다.
도 10은 PBS 또는 [K+] PBS 중의 올리고카르보네이트 화합물 6a, 6b, r8 단실 및 단실 알콜 화합물 4의 유세포분석 측정된 세포 흡수의 플롯이다. Jurkat 세포를 23℃에서 5분 동안 각종 수송체와 항온처리하였다.
10. 세포 흡수 검정의 결과
세포에 유입되지 않는 단독 단실 개시제 4와 대조적으로, 단실-올리고카르보네이트 컨쥬게이트 화합물 6a-6b는 단실화 r8 양성 대조군과 유사한 방식으로 연구된 농도 범위에 걸친 농도 의존 흡수를 나타내었다. 연장된 올리고머 화합물 6c는 흡수를 보여주지만 또한 경쟁적 세포-세포 유착 거동도 보여주는데 이는 추가 분석에서 제외하였다. 고 농도에서 화합물 6a와 비교한 화합물 6b에 대한 흡수에서의 유의적인 증가는 구아니딘 함량(최대 n=15)18이 증가하는 분자 수송체 화합물에 대해 관찰된 흡수에서의 증가와 일치하고 본 발명의 구체예에서 GR-올리고카르보네이트가 올리고아르기닌과 작용적으로 유사하다는 추가 증거를 제공한다.
다른 폴리구아니디닐화된 분자 수송체 화합물의 거동과 같이, 화합물 6a-6b의 흡수는 막 전위가 감소함에 따라 감소한다. 이러한 효과는 세포막을 횡단하는 전압 전위를 제거하는 것으로 공지된 프로토콜을 이용하여 모든 나트륨 이온이 칼륨 이온으로 대체된 변형 PBS와 항온처리된 세포에서의 화합물 6의 흡수를 검정하는 것에 의해 달성되었다.
추가적으로, ATP 의존 과정을 방해하는 것으로 공지된 조건을 이용하여 NaN3과 세포를 항온처리하는 것은 흡수에 있어 측정가능한 감소를 유도하였다.
최종적으로, 흡수에서의 감소(18∼37%)는 4℃에서 항온처리된 세포에서 관찰되었는데, 이는 엔도시토시스(endocytosis)가 역할을 할 수 있는 혼합된 메카니즘 경로를 시사한다.
11. 형광 현미경 연구
분석 전에 프로피듐 요오다이드로 세포를 염색하는 것을 제외하고는, 상기 기술된 바와 같이 세포를 세척하여 올리고머와 항온처리하고 분석을 위해 현탁시켰다. 단실 형광단을 여기시키기 위해 2-광자 여기에 대한 Ti:사파이어 레이저로 Zeiss LSM 510 상에서 분석을 수행하였다.
도 11은 2-광자 여기를 사용하여 형광 현미경에 의해 가시화되는 Jurkat 세포(5분 항온 처리, 25 μM, 23℃에서)로의 화합물 6b의 세포 흡수를 도시한 것이다. 패널 A-O는 0.9 μm 해상도 및 0.7 μm 컷들 간의 차를 갖는 세포(탑부터 버텀까지)를 통과한 다양한 Z-컷을 도시한 것이다. 패널 P는 동일 세포의 명시야 이미지를 도시한 것이다.
12. 컨쥬게이트의 가수분해 안정성을 측정하는 검정:
1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내에서 190 μL HEPES 완충 식염수(HBS) pH = 7.4(1 mM) 중에 컨쥬게이트 각각을 용해시키고 내부 표준물로서 작용하는 24 mL의 메탄올 중 10 mg 1-나프탈렌메탄올 용액 10 μL와 37℃에서 항온처리하였다. 적절한 시점에, 20 μL의 용액을 제거하고 RP-HPLC로 분석하였다. 컨쥬게이트, 내부 표준물 및 각종 분해 생성물의 적분 피크 면적으로부터 분해율을 계산하였다.
13. MTT 독성 검정:
RPMI 배지 1640 (+ 글루타민) 중 10% FBS 내에서 성장시킨 Jurkat 세포를, 동일 배지에서 96-웰 마이크로역가 평판 상에서 5∼10 x 104 세포/mL로 평판 배양하였다. 제2의 96-웰 평판에서, 화합물은 컬럼 2∼11 및 열 1∼3과 5∼7에서 20웰에 대해 삼중으로 일련적으로 희석하였고; 통상 희석물은 400 μM∼20 nM의 농도 범위로 차이가 났다. 컬럼 1 및 12는 각각 세포 및 화합물을 불포함하였다. 열 4 및 8은 내부 대조군으로서 콜히친의 연속 희석물을 포함하며; 콜히친 농도는 일반적으로 화합물 농도보다 더욱 낮아서 EC50(절반의 최대 효과적 농도)을 얻었다.
세포를 함유한 평판에 화합물을 첨가하고 그 세포를 24시간 동안 37℃에서 항온처리하며, 이 평판을 원심분리시킨 시점에 화합물을 제거하고, 새로운 배지에 세포를 재현탁시켰다. 24시간 동안 세포를 항온처리하고, 배지를 제거하고, 150 μL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 용액(5 mg/mL 배지)을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 3시간 동안 MTT와 항온처리하고, 150 μL 가용성 용액(10% triton X-100, 이소프로판올중 90% 0.1N HCl)을 각 웰에 첨가하고, 평판 판독기 상에서 비색법 데이타 데이타를 얻었다.
평판 판독기로부터의 수치상 데이타는 컬럼 1 및 12로부터의 값을 사용하여 표준화시키고 곡선 대입은 Graph Pad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하여 각 화합물에 대한 EC50을 얻었다.
화합물 4 및 6a-c에 대한 생성된 독성 및 안정성 데이타는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure pat00021
본 발명의 각종 구체예가 기술되었다. 이러한 구체예 및 다른 구체예는 하기 청구범위의 범위 내에 속한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식을 포함하는 시클릭 카르보네이트 단량체:
    Figure pat00022

    상기 식에서,
    R1, R2 및 R3은 H, 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고;
    R10은 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 연결 기이고;
    R4는 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환된 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릭, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 임의의 가교 기이고;
    Z는 O, NH, NR 및 S로 이루어진 군 중에서 선택되고;
    G는 구아니딘 기이고;
    P는 보호 기이다.
  2. 제1항에 있어서, R1 및 R2는 H이고, R3은 CH3이며, R4 및 R10은 선형 알킬이고, Z는 O인 것인 시클릭 카르보네이트 단량체.
  3. 제1항의 단량체와 개시제 화합물과의 반응으로부터 유도되는 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머로서, 개시제 화합물은 아미노, 히드록실 및 티올로 이루어진 군 중에서 선택된 작용 기를 포함하는 것인 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머.
  4. 제3항에 있어서, 개시제 화합물은 약물, 유전자 및 프로브 중 하나 이상으로부터 선택된 생물학적 카고(cargo)를 추가로 포함하는 것인 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머.
  5. 제3항에 있어서, 단량체 및 개시제 화합물은 N-헤테로시클릭 카르벤, TBD, 티오우레아 및 아민, 포스파젠, 및 금속 알콕시드로 이루어진 군 중에서 선택된 촉매의 존재 하에 반응시키는 것인 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머.
  6. 제5항에 있어서, 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머는 단량체, 개시제 및 하나 이상의 제2 단량체를 반응시키는 것으로부터 유도된 것인 지방족 카르보네이트 올리고머 또는 코올리고머.
  7. 제1항의 단량체와 개시제와의 반응으로부터 유도되는 지방족 폴리카르보네이트로서, 개시제는 아민 및 알콜로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 지방족 폴리카르보네이트.
  8. (i) 시클릭 카르보네이트 골격 및 이 골격으로부터 펜던트된 하나 이상의 구아니딘 기를 포함하는 시클릭 카르보네이트 단량체; 및
    (ii) 약물, 유전자 및 프로브 중 하나 이상으로부터 선택된 생물학적 카고를 포함하는 개시제
    를 반응시켜 카르보네이트 골격 및 이 카르보네이트 골격에 결합된 구아딘 기를 포함하는 올리고머를 형성시키는 단계를 포함하고, 생물학적 카고는 카르보네이트 골격 중 하나 이상의 말단에 결합하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 시클릭 카르보네이트 단량체 및 개시제를 제3 단량체와 반응시키는 단계로서, 제3 단량체는 약물, 유전자 및 프로브 중 하나 이상으로부터 선택된 생물학적 카고를 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 올리고머를 산과 반응시켜 카르보네이트 골격 상에 구아니디늄 기를 포함하는 올리고머 분자 수송체 화합물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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