KR20100098221A - Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof - Google Patents

Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof Download PDF

Info

Publication number
KR20100098221A
KR20100098221A KR1020090017278A KR20090017278A KR20100098221A KR 20100098221 A KR20100098221 A KR 20100098221A KR 1020090017278 A KR1020090017278 A KR 1020090017278A KR 20090017278 A KR20090017278 A KR 20090017278A KR 20100098221 A KR20100098221 A KR 20100098221A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
histidine
biosensor
lysine
metal
specific
Prior art date
Application number
KR1020090017278A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101115388B1 (en
Inventor
정종화
배두리
Original Assignee
경상대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020090017278A priority Critical patent/KR101115388B1/en
Publication of KR20100098221A publication Critical patent/KR20100098221A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101115388B1 publication Critical patent/KR101115388B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B82B3/0009—Forming specific nanostructures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553—Metal or metal coated
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

PURPOSE: A biosensor for detecting histidine and protein containing a large amount of histidine is provided to simply and conveniently detect histidine. CONSTITUTION: A histidine-specific biosensor comprises: a metal particle and organic ligand which is conjugated on the surface of metal particle. The organic ligand has a carboxylic group. The metal particle is silver, gold, or platinum. The diameter of the metal particle is 1nm-30nm. The organic ligand is a lysine with carboxylic group. A method for detecting histidine using the biosensor comprises: a step of dispersing the biosensor in a detection buffer; a step of mixing histidine-containing solution with the buffer; and a step of observing color change of the detection buffer. The biosensor is used for diagnosing liver cirrhosis, AIDS, asthma, lung disease, thrombotic disorder or malaria.

Description

히스티딘 특이적 바이오센서 및 이의 제조방법{HISTIDINE SPECIFIC BIOCENSOR AND THE MANUFACTURING METHOD THEREOF}HISTIDINE SPECIFIC BIOCENSOR AND THE MANUFACTURING METHOD THEREOF

본 발명은 바이오 센서를 이용한 생물학적 정량(bioassay) 기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 히스티딘 및 히스티딘 다량 함유 단백질을 검출하는데 이용할 수 있는 히스티딘 특이적 바이오 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 히스티딘의 검출 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a bioassay technique using a biosensor. More specifically, the present invention relates to histidine-specific biosensors that can be used to detect histidine and histidine-containing protein, a method for preparing the same, and a method for detecting histidine using the same.

최근 다양한 유기 및 무기 물질로 개질된 금속 나노 입자를 생물학 분야의 분석 도구, 즉 바이오 센서로 이용하기 위한 개발에 관심이 높아지고 있다. 특히, 나노입자 표면에 유기 리간드를 결합시키면 나노 입자에 소정의 기능을 부여할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 용매(solvent) 내에서 검출 대상 물질의 리셉터로 작용하는 유기 리간드를 물리적 화학적으로 안정화하는데 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 미르킨(Mirkin) 등에 따르면, DNA-금 나노입자를 이용하여 시스테인을 검출하는 비색 분석법(colorimetric assay)을 개발하였다고 보고한 바 있다. Recently, interest in development for using metal nanoparticles modified with various organic and inorganic materials as analytical tools, that is, biosensors in the biological field is increasing. In particular, binding the organic ligand to the surface of the nanoparticles may not only impart certain functions to the nanoparticles, but also help to physically and chemically stabilize the organic ligands acting as receptors for the detection target in various solvents. It is known. According to Mirkin et al. Have developed a colorimetric assay that detects cysteines using DNA-gold nanoparticles.

의학 분야에서도 상기와 같은 바이오 센서를 이용하면 질병의 유무를 판단하는데 도움이 될 것으로 기대된다. 일례로, 히스티딘 및 히스티딘을 다량 함유한 단백질은 인체내에서 매우 중요한 지표의 역할을 한다. 혈액이나 체액에 히스티딘을 다량 함유한 단백질의 수치가 비정상적으로 높다면 간경변증(advanced liver cirrhosis), 에이즈, 신장질환(renal disease), 천식, 폐질환 (pulmonary disorders), 혈전성 장애(thrombotic disorders) 및 말라리아와 같은 질병이 의심될 수 있다. 이러한 히스티딘 및 히스티딘 다량 함유 단백질의 검출용 분석 방법은 면역학적 검정(immunoassays), 형광 검출법(fluorimetric detection) 및 비색 검출법(colorimetric detection)과 관련되어 개발되고 있다. 그러나, 종래에 개발된 히스티딘의 검출 방법은 고가의 장비와 복잡한 실험 절차를 요할 뿐만 아니라 재료 처리량이 낮아 효과적으로 사용할 수 있는 범위가 매우 제한적인 문제가 있다. In the medical field, the use of such biosensors is expected to help determine the presence of diseases. In one example, histidine and proteins containing high amounts of histidine serve as very important indicators in the human body. Abnormally high levels of protein containing high amounts of histidine in the blood or body fluids include advanced liver cirrhosis, AIDS, renal disease, asthma, pulmonary disorders, thrombotic disorders, and Diseases such as malaria can be suspected. Analytical methods for the detection of such histidine and high amounts of histidine-containing proteins have been developed in connection with immunoassays, fluorimetric detection and colorimetric detection. However, the conventionally developed histidine detection method requires expensive equipment and complicated experimental procedures, and has a problem in that a range of materials that can be effectively used is low due to low material throughput.

본 발명은 상기의 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 나노 크기의 금속 입자를 포함하는 히스티딘 특이적 바이오 센서 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용하여, 고가의 장비나 복잡한 실험절차를 거치지 않고, 히스티딘 및 히스티딘 다량 함유 단백질을 검출하는 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 적은 재료량으로도 효과적으로 상기 히스티딘 및 히스티딘 다량 함유 단백질을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention has been made to solve the above problems, it is an object of the present invention to provide a histidine-specific biosensor comprising nano-sized metal particles and a method of manufacturing the same. Another object of the present invention is to provide a method capable of detecting histidine and histidine-containing proteins without expensive equipment or complicated experimental procedures using the histidine-specific biosensor. In addition, an object of the present invention is to provide a method capable of effectively detecting the histidine and the histidine-containing protein in a small amount of material.

본 발명의 상기와 같은 목적을 달성하기 위해 안출된 것으로서, 금속 입자 및 상기 금속 입자 표면에 결합된 유기 리간드를 포함하며, 상기 유기 리간드는 카르복시기를 가지는 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오 센서를 제공한다.In order to achieve the above object of the present invention, the present invention provides a histidine-specific biosensor comprising a metal particle and an organic ligand bonded to the surface of the metal particle, wherein the organic ligand has a carboxyl group. .

상기 바이오 센서는 상기 유기 리간드의 카르복시기는 3개인 것을 특징한다. 또한 상기 금속 입자에 결합하는 유기 리간드는 금속 입자 1몰에 대해 1몰 내지 100몰인 것을 특징으로 하는 것이다. The biosensor is characterized in that the carboxy group of the organic ligand is three. In addition, the organic ligand bound to the metal particles is characterized in that 1 to 100 moles per 1 mole of the metal particles.

본 발명의 바이오 센서에 있어서, 상기 금속 입자는 은, 금, 또는 백금에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 금속 입자의 입경은 1nm 내지 30nm, 더욱 바람직하게는 3nm 내지 10nm인 것이다. In the biosensor of the present invention, the metal particles are selected from silver, gold, or platinum. The particle diameter of the metal particles is 1 nm to 30 nm, more preferably 3 nm to 10 nm.

상기 유기 리간드는 카르복시기를 갖는 라이신인 것을 특징으로 한다. 상기 카르복시기를 갖는 라이신의 구체적인 예로는 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신(N,N-bis(carboxymethyl)-L-lysine)인 것이다. The organic ligand is characterized in that the lysine having a carboxyl group. Specific examples of lysine having the carboxyl group are N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine (N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine).

또한 본 발명은 상기의 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용한 히스티딘의 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 히스티딘 검출 방법은 상기 본 발명에 따른 바이오 센서를 검출 버퍼에 분산시키는 단계, 상기 바이오 센서가 분산된 검출 버퍼에 히스티딘이 함유된 수용액을 혼합하는 단계 및 상기 히스티딘 함유 수용액이 혼합된 검출 버퍼의 색상 변화를 관찰하는 단계를 포함한다.The present invention also provides a method for detecting histidine using the histidine specific biosensor. The histidine detection method according to the present invention comprises the steps of dispersing the biosensor according to the invention in a detection buffer, mixing the aqueous solution containing histidine in the detection buffer in which the biosensor is dispersed, and the detection of the mixed histidine-containing aqueous solution Observing the color change of the buffer.

또한 상기 히스티딘 검출 방법에 있어서, 검출 버퍼의 색상 변화는 자외선-가시광선 분광 광도계를 이용해 흡광도를 측정하여 히스티딘의 함유량을 정량분석 하는 단계를 더 포함할 수 있다.In addition, the histidine detection method, the color change of the detection buffer may further comprise the step of quantitative analysis of the content of histidine by measuring the absorbance using an ultraviolet-visible spectrophotometer.

또한 본 발명은 금속 산화물을 환원제의 존재 하에 환원시켜 나노 수준의 금속 콜로이드 입자를 제조하는 단계, 상기에서 제조된 금속 나노 콜로이드에 카르복시기를 갖는 과량의 라이신을 함유한 수용액을 혼합하여 상기 금속 입자와 상기 라이신을 결합시키는 단계; 및 상기에서 형성된 라이신이 라이신이 결합된 금속 입자를 수용액과 분리하는 단계를 포함하는 히스티딘 특이적 바이오 센서 제조 방법을 제공한다. 또한 상기 제조 방법은 상기에서 생성된 라이신과 결합된 금속 입자를 세척 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.In another aspect, the present invention is to reduce the metal oxide in the presence of a reducing agent to produce a nano-level metal colloidal particles, by mixing an aqueous solution containing an excess of lysine having a carboxyl group to the metal nano-colloids prepared above and the metal particles Binding lysine; And the lysine formed above provides a method for producing a histidine-specific biosensor comprising the step of separating the lysine-bound metal particles with an aqueous solution. In addition, the manufacturing method may further comprise the step of washing and separating the metal particles combined with the lysine produced above.

본 발명에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서의 제조에 있어서, 상기 금속 산화물은 질산은(AgNO3)일 수 있다. 또한 상기 카르복시기를 갖는 라이신은 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신(N,N-bis(carboxy methyl)-L-lysine)일 수 있다.In preparing a histidine specific biosensor according to the present invention, the metal oxide may be silver nitrate (AgNO 3 ). In addition, the lysine having a carboxyl group may be N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine (N, N-bis (carboxy methyl) -L-lysine).

상기에서 금속 입자에 결합하는 라이신은 금속 입자 1몰에 대해 1몰 내지 100몰인 것이 바람직하다. 상기에서 형성된 금속 입자의 입경은 1nm 내지 30nm, 더욱 바람직하게는 3nm 내지 10nm인 것이 바람직하다.Lysine bonded to the metal particles in the above is preferably 1 to 100 moles per 1 mole of the metal particles. The particle diameter of the metal particles formed above is preferably 1 nm to 30 nm, more preferably 3 nm to 10 nm.

마지막으로 본 발명은 본 발명에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용하여 간경변, 에이즈, 신장질환, 천식, 폐질환, 혈전성 장애 또는 말라리아를 진단하는 방법을 제공한다. Finally, the present invention provides a method for diagnosing liver cirrhosis, AIDS, kidney disease, asthma, lung disease, thrombotic disorder or malaria using the histidine specific biosensor according to the present invention.

본 발명의 히스티딘 특이적 바이오센서는 히스티딘과 결합하여 색상의 변화 를 일으키므로 검출결과를 간편하게 시각적으로 확인할 수 있다. 따라서, 기존에 사용되고 있는 고비용의 복잡한 실험절차에 비해 히스티딘 및 히스티딘 다량 함유 단백질을 선택적으로 검출할 수 있는 효과가 있다. 이와 같이 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서는 고가의 장비나 복잡한 실험 방법을 사용하지 않고 간단하고 편리한 방법으로 검출 대상 물질인 히스티딘을 검출해 내는데 효과적이다. 또한 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서는 히스티딘의 농도가 5 마이크로몰 이하로 매우 낮은 경우에도 이의 함유 여부를 판단할 수 있다. The histidine-specific biosensor of the present invention binds to histidine and causes a change in color, so that the detection result can be easily visually confirmed. Therefore, there is an effect that can selectively detect histidine and a large amount of histidine-containing protein compared to the expensive and complicated experimental procedures used in the past. As described above, the histidine-specific biosensor of the present invention is effective in detecting histidine, which is a substance to be detected, in a simple and convenient manner without using expensive equipment or complicated experimental methods. In addition, the histidine-specific biosensor of the present invention can determine whether the histidine is contained even when the concentration of histidine is very low, such as 5 micromolar or less.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 히스티딘과 선택적으로 반응하는 나노 크기의 금속 입자와 유기 리간드가 결합된 히스티딘 특이적 바이오센서 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한 상기 바이오 센서를 이용하여 히스티딘 및 히스티딘이 다량으로 함유된 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a histidine-specific biosensor in which a nano-sized metal particle and an organic ligand are selectively reacted with histidine and a method for preparing the same. It also provides a method for detecting a histidine and a protein containing a large amount of histidine using the biosensor.

본 발명의 제1측면인 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서에 있어서, 상기 입자는 유기 리간드에서 제공되는 비공유 전자쌍과 배위 결합할 수 있는 금속으로, 특히, 금, 은 또는 백금과 같은 귀금속제인 것이 바람직하다. In the histidine-specific biosensor according to the first aspect of the present invention, the particle is a metal capable of coordinating with a non-covalent pair of electrons provided by an organic ligand, and particularly preferably a precious metal such as gold, silver or platinum.

상기 입자는 입경이 1 내지 30nm, 바람직하게는 3 내지 10nm인 것이다. 입자의 크기가 1nm 미만인 경우에는 입자 자체의 표면적이 적고 입자간 응집이 쉽게 발생하여 유기 리간드와 배위결합이 어렵다. 만일 입자의 크기가 30nm를 초과하는 경우에는 비표면적이 감소되기 때문에 충분한 양의 유기 리간드가 결합되기 어려운 측면이 있다.The particles have a particle diameter of 1 to 30 nm, preferably 3 to 10 nm. When the particle size is less than 1 nm, the surface area of the particle itself is small and aggregation between particles easily occurs, so that coordination bonds with organic ligands are difficult. If the particle size exceeds 30 nm, the specific surface area is reduced, so that a sufficient amount of the organic ligand is difficult to bind.

상기 유기 리간드는 본 발명의 바이오 센서에서 히스티딘의 리셉터 역할을 하는 것으로서, 히스티딘의 암모늄의 양이온과 결합할 수 있도록 음전하로 하전된 부분을 갖는다. The organic ligand serves as a receptor of histidine in the biosensor of the present invention, and has a negatively charged portion to bind to the cation of ammonium of histidine.

상기 히스티딘 특이적 바이오 센서에 있어서, 상기 금속 입자 1몰 대해 상기 유기 리간드는 1몰 내지 100몰, 더욱 바람직하게는 5몰에서 100몰 인것이다. 만일 1몰 미만인 경우에는 생물학적 유체, 즉 체액이나 혈액 중 히스티딘의 농도가 낮을 경우 효과적으로 히스티딘을 검출할 수 없는 문제가 있다. In the histidine specific biosensor, the organic ligand is 1 mol to 100 mol, more preferably 5 mol to 100 mol with respect to 1 mol of the metal particles. If less than 1 mole, there is a problem in that histidine cannot be effectively detected when the concentration of histidine in the biological fluid, ie, body fluid or blood, is low.

본 발명의 제1 측면인 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서의 구체적인 일실시 태양은, 상기 금속 입자로서 나노 크기의 은 입자와 상기 유기 리간드로서 카르복시기를 갖는 라이신이 결합된 것이다. 상기 카르복시기를 갖는 라이신으로는 구체적으로 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신를 예로 들수 있다. 일반적으로 아미노산과 같이 생물학적인 활성을 갖는 분자는 외부의 온도나 주변의 산도 등 환경적인 요건에 매우 민감해서 환경적인 요건에 따라 그 활성에 있어 큰 차이를 보인다. 따라서, 상기와 같은 생물학적 분자를 상기 은 입자와 같은 고체 지지체에 고정화시켜 사용하면 열적 안정성이 증가되어 활성이 높은 상태로 장기간 유지될 수 있다.One specific embodiment of the histidine-specific biosensor, which is the first aspect of the present invention, is a nano-sized silver particle as the metal particle and a lysine having a carboxyl group as the organic ligand. Specific examples of the lysine having a carboxyl group include N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine. In general, biologically active molecules such as amino acids are very sensitive to environmental requirements such as external temperature or acidity of the surroundings, and thus have a large difference in activity depending on environmental requirements. Therefore, the use of such biological molecules immobilized on a solid support such as the silver particles increases the thermal stability can be maintained for a long time in a high activity state.

상기 은 입자와 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이 결합된 형태의 히스티딘 특이적 바이오 센서가 히스티딘을 선택적으로 검출하는 방법은 아래와 같다.Method for selectively detecting histidine by the histidine-specific biosensor in which the silver particles and the N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine are combined is as follows.

상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신은 하기 화학식 1로 표현된다. The N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine is represented by the following formula (1).

Figure 112009012524917-PAT00001
Figure 112009012524917-PAT00001

상기 화학식 1에서 확인할 수 있듯이 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신은 카르복실기를 가지고 있어서 수용액 내에서 쉽게 수소이온을 잃고 양전하를 띠게 된다. 또한 히스티딘은 3개의 N(질소)를 포함하는데, 이 N은 비공유 전자쌍으로 인해 음전하를 띤다. 따라서, 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신의 양전하 부분과 히스티딘의 음전하 부분이 이온적으로 결합함으로써 히스티딘을 선택적으로 검출하는 것이 가능하다. 도 1 및 도 9는 본 발명의 구체적인 일실시 태양인 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신과 은 입자가 결합한 히스티딘 특이적 바이오 센서가 히스티딘과 선택적으로 결합하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다. As can be seen in Formula 1, the N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine has a carboxyl group, and thus easily loses hydrogen ions in the aqueous solution and has a positive charge. Histidine also contains three N's (nitrogen), which are negatively charged due to unshared electron pairs. Therefore, it is possible to selectively detect histidine by ionically binding the positively charged portion of the N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine and the negatively charged portion of histidine. 1 and 9 are schematic diagrams illustrating a process of selectively binding histidine to a histidine-specific biosensor in which N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine and silver particles are combined as a specific embodiment of the present invention. .

N, N-비스(카르복시메틸)-L-라이신(pH 9)의 음전하는 반발력에 의해 입자가 뭉치는 것을 방지한다. 은 나노입자의 표면은 카르복실산을 함유해서 이것이 양이온 타입의 아미노산과 결합할 수 있도록 한다. The negative charge of N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine (pH 9) prevents the particles from agglomerating by the repulsive force. The surface of the silver nanoparticles contains carboxylic acids that allow them to bind to cationic types of amino acids.

상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신은 카르복실기 3개를 가지면서도 분자의 크기가 작아 나노 수준의 입자 표면에 다량 결합할 수 있다. 따라서 히스티딘을 선택적으로 결합할 수 있는 수용체의 수를 충분히 확보하는데 효과적이다.The N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine has three carboxyl groups, but the molecule is small in size, and thus may be bonded to a large amount of nanoparticles. Therefore, it is effective to secure a sufficient number of receptors capable of selectively binding histidine.

본 발명의 제2 측면인 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용한 히스티딘 검출 방법은 본 발명의 제1 측면에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서를 검출 버퍼 에 분산시키는 단계; 상기 바이오 센서가 분산된 검출 버퍼에 히스티딘이 함유된 수용액을 혼합하는 단계; 및 상기 히스티딘 함유 수용액이 혼합된 검출 버퍼의 색상 변화를 관찰하는 단계를 포함한다. 상기 색상 변화를 관찰하는 단계는 자외선-가시광선 분광 광도계를 이용하여 히스티딘 함유량의 정량적인 분석을 수행할 수 있다. A histidine detection method using the histidine-specific biosensor according to the second aspect of the present invention includes dispersing a histidine-specific biosensor according to the first aspect of the present invention in a detection buffer; Mixing an aqueous solution containing histidine in a detection buffer in which the biosensor is dispersed; And observing the color change of the detection buffer in which the histidine-containing aqueous solution is mixed. Observing the color change may be performed by quantitative analysis of histidine content using an ultraviolet-visible spectrophotometer.

본 발명의 제3 측면인 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서를 제조하는 방법은 금속 산화물을 환원제의 존재 하에 환원시켜 나노 수준의 금속 입자 콜로이드를 제조하는 단계; 상기에서 제조된 금속 입자 콜로이드에 카르복시기를 갖는 라이신을 함유한 수용액을 혼합하여 상기 금속 입자와 상기 카르복시기를 갖는 라이신을 결합시키는 단계; 상기 단계에서 형성된 카르복시기를 갖는 라이신이 결합된 금속 입자를 분리하는 단계를 포함한다.A method of manufacturing the histidine specific biosensor, which is a third aspect of the present invention, comprises: reducing a metal oxide in the presence of a reducing agent to produce a nano-level metal particle colloid; Combining the metal particles with lysine having the carboxyl group by mixing an aqueous solution containing lysine having a carboxyl group to the metal particle colloid prepared above; Separating the metal particles to which lysine having a carboxyl group formed in the step is bound.

본 발명의 제3 측면인 상기 히스티딘 특이적 바이오 센서의 구체적인 일실시 태양은 질산은(AgNO3)를 환원시켜 은 콜로이드 용액을 제조한 후 여기에 과량의 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신을 첨가하여 상기 은 콜로이드 용액의 은 나노 입자와 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신을 결합시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 상기에서 금속 입자에 결합하는 라이신은 금속 입자 1몰에 대해 1몰 내지 100몰인 것이 바람직하다. 상기에서 형성된 금속 입자의 입경은 1nm 내지 30nm, 더욱 바람직하게는 3nm 내지 10nm인 것이 바람직하다.One specific embodiment of the histidine-specific biosensor, which is a third aspect of the present invention, is prepared by reducing silver nitrate (AgNO 3 ) to prepare a silver colloidal solution, followed by excess N, N-bis (carboxymethyl) -L By adding lysine, the silver nanoparticles of the silver colloidal solution and N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine may be combined. Lysine bonded to the metal particles in the above is preferably 1 to 100 moles per 1 mole of the metal particles. The particle diameter of the metal particles formed above is preferably 1 nm to 30 nm, more preferably 3 nm to 10 nm.

이하 구체적인 실시예를 바탕으로 하여 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서를 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 더욱 명확하게 설명하기 위한 용도로서만 사용될 뿐 본 발명의 범위를 제한하거나 한정하는 것은 아니다. 또한 본 발명의 목적 범위 내에서 부수적인 부분을 치환 또는 변경하는 것은 당업자에게 자명한 것이다. Hereinafter, the histidine specific biosensor of the present invention will be described in detail with reference to specific examples. The following examples are only used for the purpose of illustrating the present invention more clearly, but do not limit or limit the scope of the present invention. In addition, it will be apparent to those skilled in the art to substitute or change the minor part within the scope of the present invention.

실시예: 히스티딘 특이적 바이오 센서의 제조Example Preparation of Histidine Specific Biosensors

질산은(AgNO3) 수용액(5.0mM, 1.0mL)을 상온에서 교반한 후 구연산 나트륨 액(sodium citrate solution, 30mM, 1.0mL), 보로수소화 나트륨(sodium borohydride)(50mM, 1.0mL), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)(5mg)을 재빨리 넣었다. 상기 용액의 색상이 옅은 황색으로 변화된 후 상기 용액을 30분간 환류(reflux)하면서 가열하고 상온에서 냉각시켜 은 콜로이드 용액을 준비하였다. 상기 콜로이드 용액을 상온에서 24시간 동안 교반시키면서, 과량의 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신을 함유한 수용액을 혼합하여 리간드 교환 반응을 시켰다. 반응이 종료된 후 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이 결합된 은 나노 입자의 용액을 30분 동안 원심분리시키고, 상청액을 제거한 후 수용액에 재분산시켰다. 상기 입자를 3회 이상 세척한 후 최종적으로 검출 버퍼에 다시 분산시켰다. 이후 상기 용액의 산도를 NaOH를 이용해서 pH 9로 하였다. 이하 실시예 1에서 제조된 본 발명에 따른 바이오 센서를 BCML-Ag이라고 약칭하였다.Aqueous solution of silver nitrate (AgNO 3 ) (5.0 mM, 1.0 mL) was stirred at room temperature, followed by sodium citrate solution (30 mM, 1.0 mL), sodium borohydride (50 mM, 1.0 mL), polyvinylpi Lollidon (polyvinylpyrrolidone) (5 mg) was added quickly. After the color of the solution was changed to pale yellow, the solution was heated under reflux for 30 minutes and cooled at room temperature to prepare a silver colloidal solution. While stirring the colloidal solution at room temperature for 24 hours, an aqueous solution containing excess N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine was mixed to perform a ligand exchange reaction. After the reaction was completed, the solution of silver nanoparticles to which the N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine was bound was centrifuged for 30 minutes, the supernatant was removed, and then redispersed in an aqueous solution. The particles were washed three more times and finally dispersed again in the detection buffer. The acidity of the solution was then adjusted to pH 9 using NaOH. Hereinafter, the biosensor according to the present invention prepared in Example 1 is abbreviated as BCML-Ag.

BCML-Ag에 대한 테스트Test for BCML-Ag

나노 입자 표면와 유기 리간드의 결합여부 확인Confirmation of binding of nanoparticle surface and organic ligand

상기 실시예 1에 따른 BCML-Ag에 있어서, 히스티딘의 선택적인 리셉터로 작용하는 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이 은 나노 입자에 결합되어 고정되어 있는지 확인하기 위해 TEM(transmission electron microscopy, 투과전자현미경), 퓨리에 변환 라만 분광 광도법(FT-Raman spectroscopy), TOF-SIMS(Time of flight secondary ion mass spectroscopy, 비행 시간형 2차 이온 질량 분석법), 자외선-가시광선 분광 광도법(UV-VIS spectroscopy)을 이용하여 확인하였다.In BCML-Ag according to Example 1, TEM (transmission electron) to confirm that N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine, which acts as a selective receptor for histidine, is bound to and fixed on the silver nanoparticles microscopy (transmission electron microscopy), Fourier transform Raman spectroscopy (FT-Raman spectroscopy), time of flight secondary ion mass spectroscopy (TOF-SIMS), UV-visible spectroscopy (UV-) VIS spectroscopy).

상기 BCML-Ag의 FT-Raman 스펙트럼은 3263㎝-1, 1684㎝-1 및 1284㎝-1에서 피크를 보였다. 이를 통해 히스티딘 특이적 리셉터인 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이 은 나노 입자의 표면에 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 도 2는 상기 FT-Raman 스펙트럼의 그래프를 나타낸 것이다. 상기 피크는 은 나노 입자 표면에 결합된 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신에서 기인된 것으로 판단된다. 도 3은 상기 본 발명의 바이오 센서의 TOF-SIMS 스펙트럼 결과를 그래프로 나타낸 것으로 상기 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신의 분자질량(molecular mess)이 (m/z=262.26)인 것을 나타내며, 은 입자 표면에 완전히 결합되어 고정되어 있는 상태를 의미하는 것으로 해석된다.The FT-Raman spectra of the BCML-Ag showed peaks at 3263 cm -1 , 1684 cm -1 and 1284 cm -1 . Through this, it was confirmed that N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine, which is a histidine specific receptor, is bound to the surface of the silver nanoparticles. 2 shows a graph of the FT-Raman spectrum. The peak is believed to be due to N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine bound to the silver nanoparticle surface. FIG. 3 is a graph of the TOF-SIMS spectrum of the biosensor of the present invention, wherein the molecular mass of N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine is (m / z = 262.26). Is interpreted to mean a state that is completely bonded and fixed to the particle surface.

도 4는 상기 실시예 1에 따른 BCML-Ag에 대한 자외선-가시광선 흡광도 측정 결과를 도시한 그래프이다. 자외선 흡수 피크는 400nm인 것으로 관찰되었으며, 이 것은 아미노산이 없는 상태에서의 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서 표면의 플라스몬(plasmon) 흡수로부터 기인된 것으로 판단된다. 본 흡광도 측정에 있어서, 실험 시작 5분 후에 기록된 스펙트럼은 가장 협소한 반치폭(full-width-at-half-maximum(fwtn))을 보였는데 이것은 합성된 은 나노 입자가 단순 분산되었고(monodispersed), 균일하다는 것을 의미한다.FIG. 4 is a graph showing ultraviolet-visible absorbance measurement results for BCML-Ag according to Example 1. FIG. The ultraviolet absorption peak was observed to be 400 nm, which is believed to be due to the plasmon absorption of the histidine specific biosensor surface of the present invention in the absence of amino acids. For this absorbance measurement, the spectra recorded five minutes after the start of the experiment showed the narrowest full-width-at-half-maximum (fwtn), in which the synthesized silver nanoparticles were simply dispersed (monodispersed), Means uniform.

히스티딘 검출 확인 실험Histidine detection confirmation experiment

본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서의 히스티딘 검출 능력을 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 BCML-Ag가 분산된 검출 버퍼에 히스티딘 수용액을 혼합하여 최종 부피가 1mL가 되도록 하였다. 상기 BCML-Ag의 최종 농도는 10.0 마이크로 몰이 되도록 하였다. 또한 상기 버퍼에 혼합되는 히스티딘 수용액은 히스티딘의 농도는 5.0 에서 30.0μM 의 범위에서 5μM의 간격으로 수개 준비하였다. 또한 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서가 히스티딘을 선택적으로 검출하는지 확인하기 위해 상기 바이오 센서가 분산된 검출 버퍼에 각각 다른 아미노산 수용액을 혼합하여 색상이 변화되는지 관찰하였다. In order to confirm the histidine detection capability of the histidine-specific biosensor of the present invention, the histidine aqueous solution was mixed with the detection buffer in which the BCML-Ag prepared in Example 1 was dispersed so that the final volume was 1 mL. The final concentration of BCML-Ag was 10.0 micromolar. In addition, several histidine aqueous solutions mixed in the buffer were prepared at intervals of 5 μM in the range of histidine concentration of 5.0 to 30.0 μM. In addition, in order to confirm whether the histidine-specific biosensor of the present invention selectively detects histidines, the biosensors were mixed with different aqueous amino acid solutions to observe whether the color was changed.

도 15는 상기 검출 버퍼에 히스티딘이 첨가되었을 때 색상변화를 나타낸 사진이다. 히스티딘이 첨가되지 않았을 때에는 검출버퍼의 색상이 옅은 황색을 나타내나 히스티딘이 첨가되면 상기 검출버퍼의 색상은 붉은 색으로 변화되었다.15 is a photograph showing a color change when histidine is added to the detection buffer. When histidine was not added, the color of the detection buffer was pale yellow, but when histidine was added, the color of the detection buffer changed to red.

도 10c는 다양한 아미노산 용액(1.0x 10-4)을 첨가한 후 상기 검출 버퍼의 색 변화 상태를 나타낸 것이며, 도 10b는 이의 R value(A 520 /A 400 )이다. 검출 버퍼와 아미노산 수용액을 혼합하고 10분 후, 히스티딘을 함유한 용액은 황색에서 붉은 색으로 색이 변하였으며, 흡광율은 A 520 /A 400 에서 가장 큰 값을 보였다. 반면에 다른 아미노산을 첨가했을 때는 검출 버퍼의 색상 변화나 흡광도 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 바이오 센서는 히스티딘에 선택적으로 반응한다는 것을 확인할 수 있었다. FIG. 10C shows the color change state of the detection buffer after addition of various amino acid solutions (1.0 × 10 −4 ), and FIG. 10B is its R value ( A 520 / A 400 ). Ten minutes after mixing the detection buffer and the aqueous amino acid solution, the histidine-containing solution changed color from yellow to red, and the absorbance was the highest at A 520 / A 400 . On the other hand, when other amino acids were added, no change in color or absorbance of the detection buffer was observed. Therefore, it was confirmed that the biosensor of the present invention selectively reacts with histidine.

본 발명의 바이오 센서가 히스티딘과 결합하여 색상변화를 일으키는 것은 히스티딘에 의해서 상기 바이오 센서의 입자가 서로 응집하기 때문인 것으로 해석된다. 도 11a는 히스티딘의 첨가 전 및 첨가 후인 검출 버퍼의 TEM 이미지이며 도 11 b는 히스티딘 첨가 전 및 첨가 후의 BCML-Ag의 입경 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 이다. 상기 TEM 이미지에 의하면 히스티딘 첨가 전에는 상기 BCML-Ag의 입자가 수용액에 넓고 균일하게 분산되어 있었으며, 입경은 약 3 내지 5nm인 것으로 관찰되었다. 반면에 히스티딘을 첨가한 후에는 BCML-Ag의 입자간 응집이 발생하여 입경이 16 내지 20nm로 증가하였다. 이러한 응집은 색상이 황색에서 적색으로 변화하는 요인이되며, 응집된 상태에서 쌍을 이룬 플라스몬 엑시톤의 상호작용이 반영된 것으로 해석된다. The reason why the biosensor of the present invention binds to histidine and causes color change is because the particles of the biosensor agglomerate with each other by histidine. FIG. 11A is a TEM image of the detection buffer before and after addition of histidine and FIG. 11B is a graph showing the change in particle size of BCML-Ag before and after addition of histidine. to be. According to the TEM image, the particles of BCML-Ag were widely and uniformly dispersed in the aqueous solution before the histidine addition, and the particle diameter was observed to be about 3 to 5 nm. On the other hand, after addition of histidine, particle aggregation of BCML-Ag occurred and the particle diameter increased to 16 to 20 nm. This aggregation causes the color to change from yellow to red and is interpreted to reflect the interaction of paired plasmon excitons in the aggregated state.

히스티딘의 검출에 있어서, 본 발명의 바이오센서의 히스티딘 특이적 특성(specificity)이 다른 아미노산의 복합적인 혼합물에 의해 저해되는지 알아보기 위해 검출 버퍼에 히스티딘과 다른 아미노산이 혼합된 수용액을 첨가하여 검출 버 퍼의 색상변화를 관찰하였다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 다른 아미노산이 혼합된 경우에도 본 발명의 바이오 센서를 첨가하였을때 적색으로 색상이 변화되는 것을 관찰할 수 있었다. In the detection of histidine, in order to determine whether the histidine specificity of the biosensor of the present invention is inhibited by a complex mixture of different amino acids, an aqueous solution of a mixture of histidine and other amino acids is added to the detection buffer to detect the detection buffer. The color change of was observed. As can be seen in FIG. 6, even when other amino acids were mixed, the color was changed to red when the biosensor of the present invention was added.

상기 도 6에서 실시예 1에 따른 BCML-Ag가 포함된 검출버퍼에 (1)히스티딘 (2)알라닌+히스티딘, (3)시스티딘+히스티딘, (4)류신+히스티딘, (5)프롤린+히스티딘, (6)발린+히스티딘, (7)세린+히스티딘, (8)티로신+히스티딘, (9)메티오닌+히스티딘, (10)페닐알라닌+히스티딘, (11)트레오닌+히스티딘, (12)아스파르산+히스티딘을 혼합한 것이다. 실험조 (2) 내지 (12)도 히스티딘만 포함된 실험조 (1)과 마찬가지로 색상이 붉게 변화된 것을 확인할 수 있다.6, (1) histidine (2) alanine + histidine, (3) cytidine + histidine, (4) leucine + histidine, (5) proline + histidine in the detection buffer containing BCML-Ag according to Example 1 in FIG. , (6) valine + histidine, (7) serine + histidine, (8) tyrosine + histidine, (9) methionine + histidine, (10) phenylalanine + histidine, (11) threonine + histidine, (12) aspartic acid + Histidine is mixed. Experimental tanks (2) to (12) can also be seen that the color changed to red as in experimental tank (1) containing only histidine.

또한 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 히스티딘이 다른 아미노산과 혼합되어 있는 경우에도 히스티딘이 단독으로 포함된 수용액의 흡광도와 차이가 없었다. 도 5는 히스티딘이 단독으로 포함된 수용액 및 히스티딘과 다른 아미노산이 혼합된 수용액의 R(A 520 /A 400 )수치를 나타낸 것이다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 히스티딘이 다른 아미노산과 혼합되어 있는 경우에도 R(A 520 /A 400) 수치는 일률적이며, 히스티딘이 단독으로 혼합된 수용액과 유사한 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 4, even when histidine was mixed with other amino acids, there was no difference in absorbance of the aqueous solution containing histidine alone. 5 shows R ( A 520 / A 400 ) values of an aqueous solution containing histidine alone and an aqueous solution mixed with histidine and other amino acids. As shown in FIG. 5, even when histidine was mixed with other amino acids, the R ( A 520 / A 400) value was uniform, and it was confirmed that the histidine had a value similar to that of the mixed solution alone.

이를 통해 본 발명의 바이오 센서는 히스티딘을 선택적으로 검출할 수 있으며 다른 아미노산이 혼합되어 있어도 히스티딘의 검출능은 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.Through this, the biosensor of the present invention can selectively detect histidine, and it is confirmed that the detection ability of histidine is not affected even if other amino acids are mixed.

히스티딘 함유 단백질의 선택적 검출능의 확인Confirmation of Selective Detection of Histidine-Containing Proteins

N-말단의 히스티딘 태그(tag)가 결여된 유비퀴틴 단백질 및 N 말단에 6개의 히스티딘 잔기가 있는 Cdc20 단백질을 이용하여 상기 BCML-Ag의 선택적인 색상 변화를 조사하였다. 상기 BCML-Ag 입자(5.0 mM)를 상온에서 10분 동안 상기 단백질(1.5 마이크로그램)과 함께 배양한 후 BCML-Ag의 색상변화에 대한 흡광도를 관찰하였다. 도 12는 이의 결과를 도시한 그래프이다. 상기 그래프에서 (a)는 아무것도 넣지 않은 검출 버퍼의 흡광도, (b)는 상기 히스티딘 태그가 결여된 유비퀴틴 단백질이 포함된 검출버퍼의 흡광도 및 (c)는 상기 Cdc20 단백질이 포함된 검출버퍼의 흡광도 결과이다. 이에 따르면 (a)와 (c)는 흡광도의 차이가 거의 없으나 (c)는 흡광도에 변화가 있는 것을 확인할 수 있었다. Selective color changes of the BCML-Ag were investigated using the ubiquitin protein lacking the N-terminal histidine tag and the Cdc20 protein with six histidine residues at the N terminus. The BCML-Ag particles (5.0 mM) were incubated with the protein (1.5 micrograms) for 10 minutes at room temperature, and then the absorbance of the color change of BCML-Ag was observed. 12 is a graph showing the results. In the graph, (a) is the absorbance of the detection buffer without anything, (b) is the absorbance of the detection buffer containing the ubiquitin protein lacking the histidine tag, and (c) is the absorbance result of the detection buffer containing the Cdc20 protein to be. According to this, (a) and (c) was almost no difference in absorbance, but (c) was confirmed that the change in absorbance.

검출버퍼의 색상 변화에 대해서도 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 히스티딘으로 표지된 단백질인 상기 Cdc20을 상기 BCML-Ag가 포함된 검출 버퍼와 혼합하면 A 520 /A 400 에서의 흡수율이 증가하면서 황색에서 적색으로 색상이 변화되는 것이 관찰되었다(도 12b의 c). 이것은 상기 히스티딘 표지 단백질이 상기 BCML-Ag와 상호작용을 했기 때문이다. 반면에 비 히스티딘 표지 단백질(non-histidine-tagged protein)을 거의 동일한 조건에서 BCML-Ag로 처리하였을 때, 색상변화는 관찰되지 않았다(도 12b의 b). 상기 BCML-Ag를 히스티딘 표지 단백질과 비히스티딘 표지 단백질의 혼합물과 함께 배양하였을 때, 상기 BCML-Ag이 포함된 검출 버퍼의 색상이 황색에서 붉은색으로 변화되었는데, 이것은 히스티딘 표지 단백질이 선택적으로 BCML-Ag의 표면에 결합한 것을 의미하는 것이다. The same result was obtained for the color change of the detection buffer. When the Cdc20, a histidine-labeled protein, was mixed with the detection buffer containing BCML-Ag, it was observed that the color was changed from yellow to red while increasing the absorption at A 520 / A 400 (c in FIG. 12B). This is because the histidine-labeled protein interacted with the BCML-Ag. On the other hand, when non-histidine-tagged protein was treated with BCML-Ag under almost the same conditions, no color change was observed (b of FIG. 12B). When the BCML-Ag was incubated with a mixture of histidine-labeled and non-histidine-labeled proteins, the color of the detection buffer containing the BCML-Ag changed from yellow to red, indicating that the histidine-labeled protein was selectively It means to bind to the surface of Ag.

또한 히스티딘 선택적 결합능력을 확인하기 위해, 히스티딘 잔기가 있는 단백질 및 히스티딘 잔기가 없는 단백질을 이용하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용한 분석을 실시하였다. In addition, in order to confirm histidine selective binding ability, analysis using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a protein having a histidine residue and a protein without a histidine residue was performed.

상기 SDS-PAGE 분석은 바이오 라드사(Bio-Rad)의 실험 메뉴얼에 따라 4%의 스태킹 젤(stacking gel) 및 16%의 리졸빙 젤(resolving gel)을 이용하여 수행되었다. 각 각의 단백질을 본 발명에 따른 바이오 센서(10.0μM, 1.0mL)와 혼합하여 2시간 동안 상온에서 로터리 믹싱의 방법으로 배양시킨 후 상기 혼합액을 40,000xg로 원심분리(20분)하여 상청액을 제거하였다. 상청액과 조기 혼합된(premixed) 단백질을 SDS-PAGE 젤에 용해시키고, CBB(coomassie brilliant Blue)로 염색하여 시각화하였다.The SDS-PAGE analysis was performed using 4% stacking gel and 16% resolving gel according to Bio-Rad's experimental manual. Each protein was mixed with a biosensor (10.0 μM, 1.0 mL) according to the present invention and incubated for 2 hours at room temperature by rotary mixing. The supernatant was removed by centrifugation (20 minutes) at 40,000 × g. It was. The supernatant and premixed proteins were dissolved in SDS-PAGE gels and visualized by staining with coomassie brilliant blue (CBB).

다른 아미노산 시퀀스 pI(isoelectric point), 단백질 구조, 특정한 사이드 체인의 존재의 영향을 최소화하기 위해서, N-말단에 히스티딘 표지가 없는 유비퀴틴(ubiquitin) 단백질과 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기로 표지된 Cdc20 단백질도 함께 사용하였다. 도 13은 BCML-Ag를 첨가하기 전 두개의 단백질 마커를 함유하는 젤의 이미지이다. BCML-Ag(도 13)를 첨가하고 분리한 후 비 히스티딘 표지 유비퀴틴 단백질이 젤 속에 여전히 관찰되었다. 반면에 히스티딘 표지 Cdc20 단백질은 사라졌는데, BCML-Ag와 Cdc20 간의 복합이 형성되어서 젤 매트릭스에 들어가기에는 크기가 너무 큰 구조가 되었기 때문이다. 6 개의 히스티딘 표지의 존재는 항 히스 티딘 항체를 이용한 면역탁본법(immunoblots)으로 확인하였다. 상기 결과는 히스티딘 표지 단백질이 효과적으로 BCML-Ag의 표면에 결합될 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서는 단백질 혼합물에서 히스티딘 단백질을 분리하는데 유용하게 사용될 수 있다.To minimize the effects of different amino acid sequence pI (isoelectric point), protein structure, and the presence of specific side chains, ubiquitin protein without the histidine label at the N-terminus and Cdc20 labeled with six histidine residues at the N-terminus Protein was also used. Figure 13 is an image of a gel containing two protein markers before adding BCML-Ag. After addition and separation of BCML-Ag (FIG. 13), non histidine labeled ubiquitin protein was still observed in the gel. On the other hand, the histidine-labeled Cdc20 protein disappeared because the complex formed between BCML-Ag and Cdc20 formed too large to enter the gel matrix. The presence of six histidine labels was confirmed by immunooblots using anti histidine antibodies. The results show that histidine labeled proteins can be effectively bound to the surface of BCML-Ag. Therefore, histidine specific biosensors according to the present invention can be usefully used to separate histidine proteins from protein mixtures.

히스티딘 검출을 위한 최소 농도Minimum Concentration for Histidine Detection

색상변화를 감지할 수 있는 히스티딘 이온 수용액의 최소 농도를 알아보기 위한 실험을 준비하였다. 실시예 1에 따른 BCML-Ag가 포함된 혼합물이 담긴 플라스크에 히스티딘을 5.0 부터 30.0 마이크로몰을 5 마이크로몰의 범위로 첨가하였다. 각 플라스크의 수용액은 모두 색상이 황색에서 적색으로 변화하였으며, 육안으로 확인하였을 때, 히스티딘의 농도가 높을수록 적색으로의 색상변화가 뚜렷하였다. 또한 히스티딘 농도가 5.0 마이크로몰인 경우에도 색상변화를 육안으로 확인하는 것이 가능했다. 도 7은 BCML-Ag가 포함된 수용액에서의 히스티딘 농도에 대한 520nm에서의 흡광도를 측정하여 그래프로 도시한 것이다. 상기 결과에 따르면 흡광도 결과는 히스티딘 농도에 따른 선형적인 상관관계가 있으며, 히스티딘의 농도가 증가할수록 흡광도가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 검출 대상 용액의 흡광도를 측정하여 상기 용액 내 히스티딘의 농도를 역으로 산출할 수 있다. 농도에 따른 선형적인 상관관계를 얻을 수 있었다.The experiment was prepared to find the minimum concentration of the histidine ion aqueous solution that can detect the color change. In a flask containing a mixture containing BCML-Ag according to Example 1, histidine was added in a range of 5.0 to 30.0 micromoles to 5 micromoles. The aqueous solution of each flask changed color from yellow to red. When visually confirmed, the higher the histidine concentration, the more pronounced the color change to red. In addition, it was possible to visually check the color change even when the histidine concentration was 5.0 micromolar. FIG. 7 is a graph showing the absorbance at 520 nm versus the histidine concentration in the aqueous solution containing BCML-Ag. According to the results, the absorbance results were linearly correlated with histidine concentration, and it was confirmed that the absorbance increased as the concentration of histidine increased. Therefore, by measuring the absorbance of the solution to be detected, the concentration of histidine in the solution can be calculated inversely. Linear correlation was obtained according to the concentration.

히스티딘 검출을 위한 용매의 산도 조건Acidity Condition of Solvent for Histidine Detection

히스티딘 검출 버퍼의 산도가 본 발명에 따른 바이오 센서의 히스티딘 검출 능력에 영향을 미치는지 확인하였다. 실시예 1에 따른 BCML-Ag가 분산된 검출버퍼에 히스티딘을 혼합하고(농도 1.0×10-4M) 상기 혼합 용액의 산도를 pH 4.0 에서 12.0로 조정하며 흡광도를 측정하였다. It was confirmed that the acidity of the histidine detection buffer affects the histidine detection ability of the biosensor according to the present invention. Histidine was mixed in a detection buffer in which BCML-Ag was dispersed according to Example 1 (concentration 1.0 × 10 −4 M), and the absorbance was measured by adjusting the acidity of the mixed solution from pH 4.0 to 12.0.

이 결과 산성 조건이나 중성 조건보다 염기성 조건에서 히스티딘의 검출능이 향상되는 것을 확인하였다. 도 8은 버퍼의 산도에 따른 흡광도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다. 이에 따르면 산성 조건에서보다 염기성 조건에서 흡광도가 높은 것을 확인할 수 있다. 도 14는 검출 버퍼의 산도에 따른 UV-VIS 스펙트럼 결과를 도시한 것이다. 상기 그래프에서 (a)는 검출버퍼에 히스티딘이 없는 경우, (b)는 염기성 조건에서 히스티딘을 첨가한 경우 및 (c)는 산성 조건에서 히스티딘을 첨가한 경우를 의미한다. 상기 실험결과를 통해 산성조건에서는 히스티딘이 없는 경우와 유사한 결과를 얻었음을 확인할 수 있었다. 이것은 염기성 조건하에서는 히스티딘의 암모니아의 양이온과 BCML-Ag의 카르복실산의 음이온 사이의 정전기적인 상호작용에 의해 히스티딘이 BCML-Ag과 강하게 응집하는 경향이 있기 때문이다. As a result, it was confirmed that the detection ability of histidine is improved under basic conditions than under acidic conditions or neutral conditions. 8 is a graph showing the results of measuring absorbance according to the acidity of the buffer. According to this, it can be seen that the absorbance is higher under basic conditions than under acidic conditions. 14 shows UV-VIS spectral results according to the acidity of the detection buffer. In the graph, (a) indicates that there is no histidine in the detection buffer, (b) indicates when histidine is added under basic conditions, and (c) indicates when histidine is added under acidic conditions. Through the experimental results, it was confirmed that similar results were obtained in the acidic condition without histidine. This is because under basic conditions, histidine tends to strongly aggregate with BCML-Ag by electrostatic interaction between the cation of ammonia of histidine and the anion of carboxylic acid of BCML-Ag.

또한 상기 BCML-Ag에 결합된 히스티딘 표지 단백질을 일정 농도의 염산(HCl)용액에서 배양하면, 단백질이 BCML-Ag에서 방출되어 UV-VIS 스펙트럼 강도의 95%가 회복되고, BCML-Ag 검출 버퍼는 적색에서 황색으로 역으로 색상이 변화하는 것을 확인할 수 있었다.In addition, when the histidine-labeled protein bound to BCML-Ag is incubated in a constant concentration of hydrochloric acid (HCl) solution, the protein is released from BCML-Ag to recover 95% of the UV-VIS spectral intensity, and the BCML-Ag detection buffer is It was confirmed that the color changes from red to yellow in reverse.

도 1은 N,N-비스(카르복시메틸)-L-라이신이 은 나노 입자에 결합한 바이오 센서와 상기 바이오 센서에 히스티딘이 특이적으로 결합한 상태를 도식화하여 표현한 것이다. 1 is a diagram illustrating a biosensor in which N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine is bound to silver nanoparticles and a state in which histidine is specifically bound to the biosensor.

도 2는 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서의 FT-Raman 스펙트럼의 피크를 도시한 그래프이다. 2 is a graph showing peaks of the FT-Raman spectrum of the histidine specific biosensor of the present invention.

도 3은 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서의 TOF-SIMS 스펙트럼 결과를 도시한 그래프이다. Figure 3 is a graph showing the TOF-SIMS spectral results of the histidine specific biosensor of the present invention.

도 4는 실시예 1의 바이오 센서 및 상기 바이오 센서와 히스티딘 및 기타 다른 아미노산이 결합한 상태의 UV-VIS 스펙트럼 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 4 is a graph showing the UV-VIS spectrum results of the biosensor of Example 1 and the biosensors combined with histidine and other amino acids.

도 5는 히스티딘과 선택적으로 결합한 본 발명의 바이오 센서의 R(A 520 /A 400 )을 나타낸 것이다. Figure 5 shows the R ( A 520 / A 400 ) of the biosensor of the present invention selectively combined with histidine.

도 6은 실시예 1의 바이오 센서가 포함된 검출 버퍼에 히스티딘을 단독으로, 및 히스티딘과 다른 아미노산을 혼합한 수용액을 첨가한 후 색상변화를 관찰한 것이다. 상기 도 6에서 (1)히스티딘 (2)알라닌+히스티딘, (3)시스티딘+히스티딘, (4)류신+히스티딘, (5)프롤린+히스티딘, (6)발린+히스티딘, (7)세린+히스티딘, (8)티로신+히스티딘, (9)메티오닌+히스티딘, (10)페닐알라닌+히스티딘, (11)트레오닌+히스티딘, (12)아스파르산+히스티딘을 검출버퍼와 혼합한 것이다. FIG. 6 is a color change observed after adding histidine alone and an aqueous solution mixed with histidine and other amino acids to the detection buffer including the biosensor of Example 1. FIG. 6, (1) histidine (2) alanine + histidine, (3) cystidine + histidine, (4) leucine + histidine, (5) proline + histidine, (6) valine + histidine, (7) serine + histidine , (8) tyrosine + histidine, (9) methionine + histidine, (10) phenylalanine + histidine, (11) threonine + histidine, and (12) aspartic acid + histidine.

도 7은 수용액내의 히스티딘의 농도에 따른 자외선 흡수강도의 보정곡 선(520nm)을 나타낸 그래프이다. 7 is a graph showing a correction curve (520 nm) of ultraviolet absorption intensity according to the concentration of histidine in an aqueous solution.

도 8은 산도에 따른 흡광도의 변화를 도시한 그래프이다. 이에 따르면 염기성 조건인 경우에 흡광도가 높은 것을 확인할 수 있다. 8 is a graph showing the change in absorbance according to acidity. This confirms that the absorbance is high in the case of basic conditions.

도 9는 본 발명의 히스티딘 특이적 바이오 센서에 포함된 카르복실기와 히스티딘의 암모니아 부분이 이온적으로 결합한 상태를 도시한 것이다.9 illustrates a state in which the carboxyl group included in the histidine-specific biosensor of the present invention is ionically bound to the ammonia portion of histidine.

도 10a, 도 10b 및 도 10c는 본 발명에 따른 바이오 센서가 히스티딘을 선택적으로 결합할 수 있음을 나타낸 것이다. 10A, 10B and 10C show that the biosensor according to the invention can selectively bind histidine.

도 11은 본 발명에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서의 TEM 이미지(A)와 상기 바이오 센서가 히스티딘과 결합한 후의 TEM 이미지를 도시한 것이다.11 shows a TEM image (A) of a histidine specific biosensor according to the present invention and a TEM image after the biosensor is combined with histidine.

도 12a 및 도 12b는 본 발명의 바이오 센서가 유비퀴틴 단백질 및 Cdc 20 단백질의 검출한 결과를 도시한 것이다. 12A and 12B show the detection results of the ubiquitin protein and the Cdc 20 protein by the biosensor of the present invention.

도 13은 유비퀴틴 단백질의 첨가 전 및 후와 Cdc 20 단백질이 첨가한 후의 젤 이미지를 나타낸 사진이다.Figure 13 is a photograph showing the gel image before and after the addition of the ubiquitin protein and after the addition of the Cdc 20 protein.

도 14는 검출 버퍼의 산도에 따른 UV-VIS 스펙트럼 결과를 도시한 것이다.14 shows UV-VIS spectral results according to the acidity of the detection buffer.

도 15는 실시예 1에 따른 히스티딘 특이적 바이오센서가 포함된 검출버퍼에 히스티딘 혼합 후 색상이 옅은 황색에서 붉은 색으로 변화된 모습을 나타낸 사진이다.15 is a photograph showing a color changed from pale yellow to red after mixing histidine in a detection buffer including a histidine-specific biosensor according to Example 1. FIG.

Claims (16)

히스티딘 특이적 바이오센서에 있어서, For histidine specific biosensors, 금속 입자; 및 Metal particles; And 상기 금속 입자 표면에 결합된 유기 리간드;An organic ligand bonded to the metal particle surface; 를 포함하며, 상기 유기 리간드는 카르복시기를 가지는 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오센서.And, wherein the organic ligand has a carboxyl group. 제1항에 있어서, The method of claim 1, 상기 유기 리간드의 카르복시기는 3개인 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오 센서Histidine-specific biosensor, characterized in that the three carboxyl groups of the organic ligand 제1항 또는 제2항에 있어서, The method according to claim 1 or 2, 상기 금속 입자에 결합하는 유기 리간드는 금속 입자 1몰에 대해 1몰 내지 100몰인 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오센서.The organic ligand that binds to the metal particles is a histidine specific biosensor, characterized in that 1 to 100 moles per mole of the metal particles. 제1항 또는 제2항에 있어서, The method according to claim 1 or 2, 상기 금속 입자는 은, 금, 또는 백금에서 선택되는 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오센서.The metal particles are histidine specific biosensor, characterized in that selected from silver, gold, or platinum. 제1항 또는 제2항에 있어서, The method according to claim 1 or 2, 상기 금속 입자의 입경은 1nm 내지 30nm, 더욱 바람직하게는 3nm 내지 10nm인 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오센서.The particle diameter of the metal particles is 1 nm to 30 nm, more preferably 3 nm to 10 nm histidine specific biosensor. 제1항 또는 제2항에 있어서, The method according to claim 1 or 2, 상기 유기 리간드는 카르복시기를 갖는 라이신인 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오 센서.The organic ligand is a histidine specific biosensor, characterized in that the lysine having a carboxyl group. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 상기 카르복시기를 갖는 라이신은 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신(N,N-bis (carboxymethyl)-L-lysine)인 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오 센서.Lysine having a carboxyl group is N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine (N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine) histidine specific biosensor. (a) 상기 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 바이오 센서를 검출 버퍼에 분산시키는 단계;(a) dispersing the biosensor according to any one of claims 1 to 7 in a detection buffer; (b) 상기 바이오 센서가 분산된 검출 버퍼에 히스티딘이 함유된 수용액을 혼합하는 단계; 및(b) mixing the aqueous solution containing histidine in the detection buffer in which the biosensor is dispersed; And (c) 상기 히스티딘 함유 수용액이 혼합된 검출 버퍼의 색상 변화를 관찰하는 단계;(c) observing the color change of the detection buffer in which the histidine-containing aqueous solution is mixed; 를 포함하는 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용한 히스티딘 검출 방법.Histidine detection method using a histidine-specific biosensor comprising a. 제8항에 있어서,The method of claim 8, 상기 히스티딘 검출 방법은 상기 (c) 단계에서 또는 (c) 단계 이후에 색상이 변화된 검출 버퍼의 자외선-가시광선 분광 광도계를 이용해 흡광도를 측정하여 히스티딘의 함유량을 정량분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용한 히스티딘 검출 방법.The histidine detection method further comprises the step of quantitatively analyzing the content of histidine by measuring the absorbance using an ultraviolet-visible spectrophotometer of the color change detection buffer in step (c) or after step (c). Histidine detection method using a histidine specific biosensor. (a) 금속 산화물을 환원제의 존재 하에 환원시켜 나노 수준의 금속 콜로이드 입자를 제조하는 단계;(a) reducing the metal oxide in the presence of a reducing agent to produce nano-level metal colloidal particles; (b) (a) 단계에서 제조된 금속 콜로이드 입자에 카르복실기를 갖는 과량의 라이신을 함유한 수용액을 혼합하여 상기 금속 입자와 상기 라이신을 결합시키는 단계; 및(b) combining the metal particles with the lysine by mixing an aqueous solution containing an excess of lysine having a carboxyl group to the metal colloidal particles prepared in step (a); And (c) 상기 (b) 단계의 완료 후 (b) 단계에서 형성된 라이신이 결합된 금속 콜로이드 입자를 수용액과 분리하는 단계; (c) after the completion of step (b), separating the lysine-bound metal colloidal particles formed in step (b) with an aqueous solution; 를 포함하는 히스티딘 특이적 바이오 센서 제조 방법.Histidine specific biosensor manufacturing method comprising a. 제10항에 있어서, The method of claim 10, (c) 단계에서 생성된, 라이신과 결합된 금속 콜로이드 입자를 세척 분리하는 단계를 더 포함하는 히스티딘 특이적 바이오 센서 제조 방법.Method for producing a histidine-specific biosensor further comprises the step of washing and separating the metal colloid particles bound to lysine, produced in step (c). 제10항 또는 제11항에 있어서, The method according to claim 10 or 11, wherein 상기 금속 산화물은 질산은(AgNO3)인 것을 특징으로 하는 바이오 센서 제조 방법.The metal oxide is silver nitrate (AgNO 3 ), characterized in that the biosensor manufacturing method. 제10항 또는 제11항에 있어서, The method according to claim 10 or 11, wherein 상기 카르복시기를 갖는 라이신은 N,N-비스(카르복실메틸)-L-라이신(N,N-bis (carboxymethyl)-L-lysine)인 것을 특징으로 하는 바이오 센서 제조 방법.The lysine having a carboxyl group is N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine (N, N-bis (carboxymethyl) -L-lysine) bio-sensor manufacturing method characterized in that. 제10항 또는 제11항에 있어서, The method according to claim 10 or 11, wherein 상기 (b) 단계에서 금속 입자에 결합하는 라이신은 금속 콜로이드 입자 1몰에 대해 1몰 내지 100몰인 것을 특징으로 하는 바이오센서 제조 방법.Lysine binding to the metal particles in the step (b) is a biosensor manufacturing method, characterized in that 1 to 100 moles per mole of metal colloidal particles. 제10항 또는 제11항에 있어서, The method according to claim 10 or 11, wherein 상기 (a) 단계에서 형성된 금속 콜로이드 입자의 입경은 1nm 내지 30nm, 더욱 바람직하게는 3nm 내지 10nm인 것을 특징으로 하는 바이오 센서 제조 방법.The particle size of the metal colloid particles formed in the step (a) is 1nm to 30nm, more preferably 3nm to 10nm characterized in that the biosensor manufacturing method. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 히스티딘 특이적 바이오 센서를 이용하여 간경변, 에이즈, 신장질환, 천식, 폐질환, 혈전성 장애 또는 말라리아를 진단하는 방법.A method for diagnosing cirrhosis, AIDS, kidney disease, asthma, lung disease, thrombotic disorder or malaria using the histidine specific biosensor according to any one of claims 1 to 7.
KR1020090017278A 2009-02-27 2009-02-27 Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof KR101115388B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090017278A KR101115388B1 (en) 2009-02-27 2009-02-27 Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090017278A KR101115388B1 (en) 2009-02-27 2009-02-27 Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100098221A true KR20100098221A (en) 2010-09-06
KR101115388B1 KR101115388B1 (en) 2012-02-16

Family

ID=43005230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090017278A KR101115388B1 (en) 2009-02-27 2009-02-27 Histidine specific biocensor and the manufacturing method thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101115388B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101448353B1 (en) * 2012-09-24 2014-10-10 한양대학교 산학협력단 Method for analyzing the protease activity and the application thereof
KR101594379B1 (en) * 2014-11-07 2016-02-16 재단법인 대구경북과학기술원 Method for Detection of Protein Comprising Histidine-Tag Using immunochromatography

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7265213B2 (en) 2005-07-28 2007-09-04 Kpl, Inc. Methodology of conjugating chelators to biomolecules

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101448353B1 (en) * 2012-09-24 2014-10-10 한양대학교 산학협력단 Method for analyzing the protease activity and the application thereof
KR101594379B1 (en) * 2014-11-07 2016-02-16 재단법인 대구경북과학기술원 Method for Detection of Protein Comprising Histidine-Tag Using immunochromatography
US10788489B2 (en) 2014-11-07 2020-09-29 Daegu Gyeongbuk Institute Of Science And Technology Method for detection of protein comprising histidine-tag using immunochromatography

Also Published As

Publication number Publication date
KR101115388B1 (en) 2012-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Karakuş et al. Colorimetric and electrochemical detection of SARS-CoV-2 spike antigen with a gold nanoparticle-based biosensor
Poo-Arporn et al. The development of disposable electrochemical sensor based on Fe3O4-doped reduced graphene oxide modified magnetic screen-printed electrode for ractopamine determination in pork sample
Jans et al. Dynamic light scattering as a powerful tool for gold nanoparticle bioconjugation and biomolecular binding studies
Li et al. Facile synthesis of red emitting 3-aminophenylboronic acid functionalized copper nanoclusters for rapid, selective and highly sensitive detection of glycoproteins
Liu et al. A novel sandwich-type electrochemical aptasensor based on GR-3D Au and aptamer-AuNPs-HRP for sensitive detection of oxytetracycline
Wu et al. A specific turn-on fluorescent sensing for ultrasensitive and selective detection of phosphate in environmental samples based on antenna effect-improved FRET by surfactant
Wangoo et al. Synthesis and capping of water-dispersed gold nanoparticles by an amino acid: bioconjugation and binding studies
Liu et al. Molecularly imprinted polymer decorated 3D-framework of functionalized multi-walled carbon nanotubes for ultrasensitive electrochemical sensing of Norfloxacin in pharmaceutical formulations and rat plasma
Chen et al. Sensitive and selective detection of glutathione based on resonance light scattering using sensitive gold nanoparticles as colorimetric probes
Tang et al. Multifunctional magnetic bead-based electrochemical immunoassay for the detection of aflatoxin B 1 in food
Liu et al. Electrochemical immunosensor for salbutamol detection based on CS-Fe3O4-PAMAM-GNPs nanocomposites and HRP-MWCNTs-Ab bioconjugates for signal amplification
JP2007506084A (en) Nanoparticle conjugate and method for producing the same
Wang et al. Aptamer-binding zirconium-based metal-organic framework composites prepared by two conjunction approaches with enhanced bio-sensing for detecting isocarbophos
JP2008518405A (en) Stable metal / conductive polymer composite colloids and methods for making and using the same
Marfà et al. Magnetic-molecularly imprinted polymers in electrochemical sensors and biosensors
Wang et al. Selective colorimetric analysis of spermine based on the cross-linking aggregation of gold nanoparticles chain assembly
Xu et al. Novel dual ligand co-functionalized fluorescent gold nanoclusters as a versatile probe for sensitive analysis of Hg 2+ and oxytetracycline
Zhou et al. Tetracycline generated red luminescence based on a novel lanthanide functionalized layered double hydroxide nanoplatform
Zhang et al. SiO 2-MIP core-shell nanoparticles containing gold nanoclusters for sensitive fluorescence detection of the antibiotic erythromycin
Gagic et al. Fully automated process for histamine detection based on magnetic separation and fluorescence detection
Wang et al. Determination of human urinary kanamycin in one step using urea-enhanced surface plasmon resonance light-scattering of gold nanoparticles
Lian et al. Copper nanoclusters as a turn-on fluorescent probe for sensitive and selective detection of quinolones
Ahmadi et al. Chiral magnetic nanospheres resonance light scattering properties studies for selective determination of naproxen and phenylglycine enantiomers
Yang et al. A novel platform for high sensitivity determination of PbP2a based on gold nanoparticles composited graphitized mesoporous carbon and doxorubicin loaded hollow gold nanospheres
Retout et al. Peptide‐Conjugated Silver Nanoparticles for the Colorimetric Detection of the Oncoprotein Mdm2 in Human Serum

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150202

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160201

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee