KR20100095281A - A pharmaceutical composition for the anti-cancer activity comprising salicornia herbacea l. extracts - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 항암 활성 함초 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항암 활성 증진 효과를 나타내는 함초 유래 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 활성 약학 조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anticancer active seaweed extract, and more particularly to an anticancer active extract and a health food composition containing the same as an active ingredient, a hamcho derived extract showing an anticancer activity enhancing effect.
현대화가 가속해짐에 따라 최근 우리나라의 식생활은 풍요로워지고 식사 패턴은 서구화로 변해가고 있으며 생활 방식이 또한 많이 변해가고 있다. 의식 수준이 높아지면서 삶의 기대치도 높아지고 더 나은 삶을 영위하기 위해 현대인들은 이전보다 더 많은 양의 업무량을 처리하고 있으며 다양한 경로로 스트레스를 받고 있다. 산업화 이전에는 자연을 가까이하는 삶을 살았지만 이제는 인위적으로 생활환경을 만들어 자연을 가까이 할 수가 없으며, 주변 환경 또한 오염되어 있어 예전과는 전혀 다른 생활 방식으로 살아가고 있다. 이에 따라 질병 발생 양식과 사망원인 등이 예전과는 다른 양상을 나타내는 등 많은 부작용이 생겨나고 있는 실정이다. 통계청이 발표한 사망원인 통계조사에 따르면 2007년 현재 암은 우리나라 인구의 10만명당 사망률 139.1%를 기록하면서 사망원인 1위를 기록하고 있으며 이는 계속 증가하고 있는 추세이다. 암의 종류별로는 폐암이 가장 많았고, 위암, 간암, 대장암, 췌장암 등이 그 뒤를 잇고 있다. As modernization accelerates, the diet of our country is becoming more abundant, the eating pattern is changing to westernization, and the lifestyle is also changing. Increasing consciousness raises expectations for life and leads a better life. Modern people are dealing with higher workloads than ever before and are stressed in various ways. Before the industrialization, I lived close to nature, but now I can't artificially create a living environment, and the surrounding environment is polluted, so I live a completely different way of life. As a result, many forms of side effects occur, such as disease occurrence patterns and causes of death. According to a statistical survey of causes of death published by Statistics Korea, as of 2007, cancer is the number one cause of death, with a death rate of 139.1% per 100,000 people in Korea. Lung cancer was the most common cancer type, followed by stomach cancer, liver cancer, colon cancer, and pancreatic cancer.
암에 대한 치료는 대부분 화학요법과 함께 외과적 수술, 방사선 요법 및 면역 요법이 함께 쓰이고 있으나. 현재 임상에서 쓰이고 있는 항암제의 대부분은 화학적으로 합성된 물질로서 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 작용하여 독성을 일으키고, 숙주의 방어력에 중요한 역할을 담당하는 림프구 및 골수세포도 파괴한다는 연구가 보고되고 있다. 최근에는 숙주에는 영향을 주지 않고 암세포에만 선택적으로 작용하여 암을 치료하는 물질을 개발하려고 여러 연구가 진행 중에 있으며, 그 중에서도 천연물에서 천연 항암제를 개발하려는 움직임이 활발하다. 현재까지 천마추출물, 복분자, 당귀, 녹차 등 여러 천연물에서 항암 활성이 확인되었다.Most cancer treatments include chemotherapy, surgical surgery, radiation therapy, and immunotherapy. Most of the anti-cancer agents used in the present clinical trials are chemically synthesized substances, which are toxic to cancer cells as well as normal cells, causing toxicity and destroying lymphocytes and bone marrow cells, which play an important role in host defense. Recently, various studies are underway to develop a substance that selectively treats cancer cells without affecting the host, and among them, the movement to develop natural anticancer agents from natural products is active. To date, anti-cancer activity has been confirmed in several natural products such as cheonma extract, bokbunja, tangui, green tea.
함초(Salicornia herbacea L.)는 우리나라 남해안과 서해안 간척지 바닷가의 염습 지대에서 자생하는 명아주과(Chenopdiaceae)에 속하는 일년초 식물로서 우리말로는 퉁퉁마디라고 부른다. 갯벌 식물인 함초는 다량의 염분을 체내에 축적할 뿐 아니라 90여 종의 천연 미네랄이 풍부하고 리놀렌산도 약 50%로 다량 함유하고 있으며, 필수 아미노산도 총 아미노산 함량 대비 약 40%를 함유한 것으로 알려져 있다.8) 또한, 함초에는 식이섬유소가 50~70% 정도 들어 있어 숙변과 변비를 예방하는 작용도 알려져 있으며, β-sitosterol, stigmasterol, uracil 및 isorhamnetin-3- O-β-D-glucopyranoside의 플라보노이드 성분이 분리되어 항산화 작용도 밝혀졌다. 함초에서 분리된 다당체에서 항당뇨 활성이 확인 된 바 있으며, 항암 활성 또한 연구되고 있으므로 항암 활성도 활발할 것으로 여겨진다. 하지만 아직까지도 함초의 숨겨진 성분과 효과가 다 밝혀진 것이 아니기 때문에 앞으로 활발한 연구가 이어진다면 천연 항암제 및 천연 약효 식물로서 우리 생활에 많이 쓰여질 것으로 기대되고 있다. Salicornia herbacea L. is an annual plant belonging to the Chenopdiaceae , which grows in the salty areas of the reclaimed coasts of the southern and western coasts of Korea. It is known that seaweed, a tidal-flat plant, not only accumulates a large amount of salt in the body, but is rich in 90 kinds of natural minerals and contains about 50% of linolenic acid and about 40% of essential amino acids. have. 8) In addition, 50 ~ 70% of dietary fiber is contained in seaweed to prevent stool and constipation, and flavonoids of β-sitosterol, stigmasterol, uracil, and isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside Separated, antioxidant activity was also revealed. Anti-diabetic activity has been identified in polysaccharides isolated from seaweed and anti-cancer activity is also being studied. However, since the hidden ingredients and effects of seaweed are not yet revealed, it is expected that if active research is conducted, it will be used in our lives as natural anticancer drugs and natural medicinal plants.
암의 발생 및 암에 의한 사망이 증가함에 따라 암을 예방하고 치료하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재까지 알려진 암의 치료법에는 수술요법, 방사선 요법, 화학요법, 면역요법 및 유전자 요법 등이 사용되고 있다. 그 중에서도 화학적으로 만들어진 항암제를 이용한 화학요법은 암세포뿐만 아니라 정상 세포에게도 독성을 나타낸다는 점에서 부작용을 가지고 있다. 따라서 항암제의 부작용을 줄이면서 항종양 효과를 증가할 수 있는 새로운 대체 물질의 개발이 시급하다고 할 수 있다. 최근 들어 천연물 유래의 항종양 효과를 가지는 새로운 생리활성물질에 대한 관심이 선진국을 중심으로 세계적으로 이루어지고 있으며, 특히 예로부터 식용되고 있는 천연물에 대한 새로운 항암제 개발이 이루어질 것으로 여겨진다. As the incidence of cancer and death by cancer increases, studies on how to prevent and treat cancer are actively conducted. Surgical therapy, radiation therapy, chemotherapy, immunotherapy and gene therapy are used to treat cancers known to date. Among them, chemotherapy using chemically produced anticancer agents has side effects in that it is toxic to normal cells as well as cancer cells. Therefore, it is urgent to develop new substitutes that can increase the antitumor effect while reducing side effects of anticancer drugs. Recently, interest in new bioactive substances having antitumor effects derived from natural products is being developed around developed countries around the world, and new anticancer drugs are expected to be developed for natural products that have been edible since ancient times.
지구의 70%를 차지하는 바다에는 지구상의 생물종의 약 80% 이상의 해양 생물이 서식하고 있다. 최근에는 육상 생물에서 생리활성 물질을 탐색하는 것에서 벗어나, 아직 알려지지 않은 해양 생물에서 생리학적으로 유용한 물질을 개발하는 움직임이 활발하게 이루어지고 있다. 함초도 예로부터 민간요법으로 많이 쓰이는 염 생식물로써 숙변, 변비예방, 항산화. 항당뇨, 항암 등 여러 효능이 입증되었지만 항암 활성에 관한 연구는 아직 이루어지지 않았다. About 70% of the world's oceans are home to more than 80% of marine life on Earth. In recent years, there has been an active move away from the search for bioactive substances in terrestrial organisms and the development of physiologically useful substances in marine organisms that are not yet known. Hamchoe is a salt plant commonly used as a folk remedy since ancient times. Although various effects such as antidiabetic and anticancer have been proven, studies on anticancer activity have not been made yet.
따라서 본 발명에서는 식용 및 약용으로서 가치가 무궁무진한 함초로부터 다당체 및 추출물을 얻어 항암 활성에 대해 알아보고, 이들 다당체 및 추출물이 세포주기에 미치는 영향과 세포주기에 부가되는 여러 단백질의 mRNA 발현 양상에 미치는 영향을 확인함으로써 완성되었다.Therefore, in the present invention, the polysaccharides and extracts from seaweeds, which are endlessly valuable as edible and medicinal products, are used to investigate anticancer activity, and the effects of these polysaccharides and extracts on the cell cycle and on the mRNA expression patterns of various proteins added to the cell cycle. It was completed by confirming.
따라서 본 발명의 목적은 항암 활성을 갖는 함초 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 및 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.Therefore, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition and health food composition containing the anti-cancer extract having an anticancer activity as an active ingredient.
상기와 같은 본 발명의 목적은 함초로부터 조 다당체 추출물을 제조한 후, 이로부터 함초 다당체를 제조하여 이들의 HT-29 세포의 성장에 미치는 영향을 실험을 통해 확인함으로써 달성되었다.The purpose of the present invention as described above was achieved by preparing a crude polysaccharide extract from the seaweed, and then by making a seaweed polysaccharide from it to confirm the effect on the growth of their HT-29 cells through experiments.
본 발명은 함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암 활성 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides an anticancer active pharmaceutical composition containing the extract of Hamcho as an active ingredient.
또한 본 발명은 함초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암 활성 건강식품 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides an anti-cancer active health food composition containing a seaweed extract as an active ingredient.
본 발명에 있어서, 상기 함초 추출물이 함초 다당체인 것이 바람직하다.In the present invention, the seaweed extract is preferably a seaweed polysaccharide.
본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "active ingredient" refers to a substance or a group of substances (a medicinal agent whose pharmacologically active ingredient is not known, etc.) which is expected to express the efficacy or effect of the drug directly or indirectly by inherent pharmacological action. It means containing a main component).
본 발명의 함초 추출물를 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the extract of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.As defined herein, "health functional food" means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to Act No. 6767 of the Health Functional Food Act, and "functional" means It means ingestion for the purpose of obtaining useful effects on health use such as nutrient control or physiological action on structure and function.
또한, 항암 활성을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.In addition, it is possible to manufacture and process as a health functional food in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like for the purpose of anticancer activity.
본 발명에서는 함초로부터 열수추출, 한외여과, 겔 투과 크로마토그래피 등을 통해 CSP, SPⅠ, SPⅡ의 수용성 물질을 추출하였으며, 각각을 동결건조를 통해 분말화 시킨 다음 정해진 농도로 희석시켜 연구를 진행하였다. 열수 추출 후 여과지로만 거른 것을 CSP라 정하였고, SPⅠ은 1kD 멤브레인을 사용하여 한외여과한 1kD 이상의 분자량을 가진 물질을 사용하였다. 겔 투과 크로마토그래피를 한 후 H2SO4-페놀법으로 분자량이 16~30kDa, 250~3300Da인 물질만 모아 SPⅡ로 사용하였다. In the present invention, water-soluble substances of CSP, SPI, SPII were extracted through hot water extraction, ultrafiltration, gel permeation chromatography, etc., each powder was lyophilized and then diluted to a predetermined concentration. After hot water extraction, only the filter paper was filtered, and CSP was used. For SPI, a material having a molecular weight of 1 kD or more was ultrafiltered using a 1 kD membrane. After gel permeation chromatography, H 2 SO 4 -phenol method was used to collect only materials having a molecular weight of 16 ~ 30kDa, 250 ~ 3300Da SPII.
본 발명에서는 상기 시료를 HT-29 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTS 방법을 통해 측정하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다. 대조군에 비하여 시료를 첨가한 실험군에서 농도가 높을수록 세포의 성장이 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 처리 시간이 길수록 성장률을 더 많이 감소하였다. 특히 CSP에 비해 SPⅠ과 SPⅡ를 처리한 실험군에서 이러한 농도 의존적인 세포 성장 억제효과를 나타내었다. In the present invention, the sample was measured by the MTS method to determine the effect on the growth of HT-29 cells and the results are shown in FIG. In the experimental group to which the sample was added compared to the control group, the higher the concentration, the more the cell growth was significantly reduced. The longer the treatment time, the more the growth rate was decreased. In particular, the experimental group treated with SPI and SPII showed a concentration-dependent cell growth inhibition effect compared to CSP.
아폽토시스는 생명체가 정상적인 기관의 발달과 조직의 항상성 유지를 하기 위한 필수적인 과정이며, 세포의 유전자에 내재되어 있는 예정된 죽음이다. 하지만 아폽토시스에 이상이 생길 경우 많은 종류의 질환이 일으키게 되며, 특히 암세포처럼 사멸되지 않고 무한히 증식하게 되는 변이가 생길 수 있다. 앞에서 확인한 CSP, SPⅠ과 SPⅡ의 암세포의 증식 억제 효과가 아폽토시스와 연관이 있는지 아넥신 V-FITC와 PI 염색을 통해 확인하였다. 아폽토시스가 일어나는 세포는 멤브레인 인지질 포스파티딜세린(phospholipid phosphatidylserine; PS)이 혈장 멤브레인의 안쪽에서 바깥쪽으로 이동하기 때문에 세포의 바깥 환경에 PS가 노출되게 된다. 아넥신 V는 Ca2+ 의존성 인지질-결합 단백질이며 PS에 높은 친화력을 가지고 있어 PS가 노출된 세포에 결합을 하게 된다. 아넥신 V 자체는 발색이 되지 않으므로 FITC와 같은 형광색소와 결합을 하여 눈에 보이도록 하여 사용한다. PS는 초기 아폽토시스의 단계에서 노출되기 때문에 후기 아폽토시스나 네크로시스와 구분하기 위해서 프로피듐 아이오다이드(propidium ioidide; PI)와 같은 DNA 염료와 함께 실험에 이용되었다.Apoptosis is an essential process for life to develop normal organs and maintain homeostasis of tissues, and is a predetermined death inherent in the genes of cells. However, if apoptosis is abnormal, many kinds of diseases are caused, and in particular, cancer cells may have mutations that proliferate indefinitely without being killed. Annex V-FITC and PI staining confirmed whether the inhibitory effects of CSP, SPI and SPII on the proliferation of cancer cells were related to apoptosis. Cells in which apoptosis occurs are exposed to the outer environment of the cell because membrane phospholipid phosphatidylserine (PS) moves from inside to outside of the plasma membrane. Annexin V is a Ca 2+ dependent phospholipid-binding protein and has a high affinity for PS, which binds to cells exposed to PS. Annexin V itself does not develop color, so it is used in combination with fluorescent dyes such as FITC to make it visible. Since PS is exposed at the stage of early apoptosis, it was used in experiments with DNA dyes such as propidium ioidide (PI) to distinguish it from late apoptosis or necrosis.
표 2와 3에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 시료를 첨가한 실험군에서 암세포 성장 억제를 확인한 MTS 실험과 마찬가지로 아넥신 V-FITC나 PI에 염색되지 않아 LL (lower left) 영역에 위치한 생존 세포(viable cell)가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 아폽토시스 세포는 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 특히 SPⅠ을 4㎎/mL의 농도로 처리한 실험군은 24시간 배양하였을 때 전체 아폽토시스 사멸이 91.59%, 48시간 배양하였을 때 92.71%로 가장 높은 아폽토시스의 비율을 나타내었다. 그 중에서도 후기 아폽토시스에 비해 초기 아폽토시스가 24시간 배양하였을 때는 85.67%, 48시간 배양하였을 때는 74.45%를 나타내어, 함초 추출물 및 다당체로 인한 항암 활성은 아폽토시스와 연관이 있으며, 특히 초기 아폽토시스의 비율을 높인다는 점을 알 수 있었다. 이 결과는 종래의 연구와 마찬가지로 생존 세포는 감소하고 초기 아폽토시스 세포은 증가한다는 연구결과와 일치한다. 이것은 현재 많은 항암제가 암세포의 아폽토시스를 유도함으로써 항암 기전을 펼치는 원리처럼 HT-29 세포의 아폽토시스를 유도한 함초 다당체 역시 항암제로써의 개발 가능성을 나타낸다.As shown in Tables 2 and 3, viable cells located in the lower left region of the LL (lower left) area were not stained with Annexin V-FITC or PI as in the MTS experiment confirming cancer cell growth inhibition in the experimental group to which the sample was added compared to the control group. ) Decreased in a concentration-dependent manner, apoptosis cells increased significantly compared to the control. In particular, the experimental group treated with SP I at a concentration of 4 mg / mL showed the highest apoptosis rate of 91.59% of total apoptosis when cultured for 24 hours and 92.71% when cultured for 48 hours. Among them, early apoptosis was 85.67% when cultured for 24 hours and 74.45% when cultured for 48 hours, compared with late apoptosis, and anticancer activity due to seaweed extract and polysaccharides was associated with apoptosis, and especially increased the rate of early apoptosis. I could see the point. This result is consistent with the findings that, as in previous studies, viable cells decrease and early apoptotic cells increase. This suggests that the Korean herbaceous polysaccharides that induce apoptosis of HT-29 cells may also be developed as anticancer agents, as many anticancer agents induce anticancer mechanisms by inducing apoptosis of cancer cells.
세포의 증식은 복잡하고 다양한 생화학적 반응의 연속적인 흐름에 의해서 일어나는데 이들 일련의 반응 조합을 세포 주기라 한다. 세포 주기는 DNA를 합성하는 S 기, 세포를 분열하는 M 기, 준비기인 G1 기와 G2 기로 구성되며, G1 기, S 기, M 기 그리고 G2 기의 순서로 진행되고, 분열이 장시간 이루어지지 않은 G0 (sub G1)기가 있다. 세포주기에서 다음 단계로 진행을 하고자 할 때, 세포가 다음 단계로 진행할 수 있을 정도로 준비가 되어 있는지 세포의 전반적인 상태를 확인하는 3가지의 체크 포인트가 있다. 첫 번째는 G1 기에 일어나는 제한점(Restriction Point; 개시)로 세포의 크기를 확인하여 DNA 복제 여부를 결정한다. 두 번째는 G2-M 전이이며, 세포분열을 하기 전에 DNA 복제가 종결되었는지 확인한다. 세 번째는 M 기에 존재하는 메타페이스-아나페이스 전이(Metaphase-Anaphase Transition)로 세포질 분열을 시작한다. 이 3가지 체크 포인트에서 세포주기를 정지시킬 수 있는 분자적 장치가 있다. 함초 추출물과 다당체가 HT-29 세포의 세포 주기에 어떠한 영향을 미치는지 분석하기 위하여 PI 염색을 한 후 유세포 분석법으로 분석하였다. 분석한 결과는 표 4와 5와 같이 24시간 배양하였을 때 대조군의 경우 G1 기와 S 기에 속하는 세포가 63.16%, 16.82%이고, G2/M 기에 속하는 세포가 14.24%로 분류되는 것에 비해, CSP, SPⅠ나 SPⅡ를 처리한 실험군에서 농도의존적으로 G2/M 기에 해당되는 세포가 점점 유의적으로 증가하였다. 특히 SPⅠ을 4㎎/mL 농도 처리군에서 37.77%로 2.65배인 가장 높은 증가률를 나타내었다. G2/M 기가 증가함에 따라 상대적으로 G1 기에 해당되는 세포의 빈도는 처리한 농도가 높을수록 유의적으로 감소하였고, S 기는 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 G2/M 진행억제 현상은 48시간 배양하였을 때도 확인할 수 있어 대조군이 7.74%인 것에 비해, CSP군은 4㎎/mL 농도군에서 19.31%로 2.5배 증가하였고, 같은 농도에서 SPⅠ군 (21.36%)이 2.7배, SPⅡ군 (29.64%)이 3.8배로 증가하였다. 이러한 결과는 종래 연구의 결과와 같은 경향으로 G2/M 진행 억제와 아폽토시스 유발이 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다. 이것은 세포 주기의 세 가지 체크 포인트 중에서 G2-M 전이에 함초 추출물과 다당체가 작용을 하는 것으로 알 수 있다. The proliferation of cells is caused by a complex and continuous stream of various biochemical reactions. These series of reaction combinations are called cell cycles. The cell cycle consists of the S phase that synthesizes DNA, the M phase that divides the cells, and the G1 and G2 phases, which are the preparatory phases, and proceeds in the order of G1, S, M, and G2 phases, and G0 does not divide for a long time. There is a (sub G1) group. When going to the next step in the cell cycle, there are three checkpoints that check the overall state of the cell to make sure that the cell is ready for the next step. The first is the Restriction Point (initiation) that occurs in the G1 phase to determine the DNA replication by checking the size of the cell. The second is G2-M metastasis, confirming that DNA replication is terminated before cell division. Third is the metaphase-Anaphase Transition, which is present in the M phase, initiating cellular division. There are molecular devices that can stop the cell cycle at these three checkpoints. In order to analyze the effect of the extracts and polysaccharides on the cell cycle of HT-29 cells, PI staining and analysis were performed by flow cytometry. As a result of the analysis, when the cells were incubated for 24 hours as shown in Tables 4 and 5, 63.16% and 16.82% of the cells belonging to the G1 and S phases of the control group were classified into CSP and SPⅠ, compared to 14.24% of the cells belonging to the G2 / M phases. In the experimental group treated with SPII, the concentration of G2 / M phase cells increased significantly. In particular, SPI showed the highest increase rate of 2.65 times to 37.77% in the 4 mg / mL concentration treatment group. As the G2 / M phase increased, the frequency of cells corresponding to the G1 phase decreased significantly as the treated concentration increased, and the S phase showed no significant difference. This G2 / M progression inhibition can be confirmed even after 48 hours of incubation, compared with the control group of 7.74%, the CSP group increased by 2.5 times to 19.31% in the 4 mg / mL concentration group, and the SPI group (21.36%) at the same concentration. ) Was increased by 2.7 times and SPⅡ group (29.64%) by 3.8 times. These results are in the same trend as the results of previous studies, indicating that G2 / M progression inhibition and apoptosis induction are closely related. This can be seen that the persimmon extract and polysaccharide act on G2-M metastasis among three check points of the cell cycle.
암세포 주기 분석의 결과에서 도출된 G2/M 진행 억제가 암세포 증식 억제와 관련이 있는 것으로 확인되었으므로 G2/M 기 조절 관련 단백질인 cyclins 및 Cdks와 p53, p21의 mRNA 발현정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다. 세포 주기 조절계는 주요 단백질을 인산화시킴으로써 세포주기 기구를 통제한다. 인산화와 탈인산화는 세포의 단백질 활성을 변화시키는 대표적인 방법 중의 하나이며, 세포주기 관련 단백질을 통제하는 것에도 쓰인다. 세포 주기는 cyclin이라는 단백질에 의해서도 조절되는데, 이들 cyclin은 그 자체가 효소 활성이 없으나 Cyclin-의존성 단백질 키나아제 (cyclin dependent protein kinase; Cdk)에 결합을 하면 효소적 활성을 띄게 된다. 여러 종류의 Cyclin과 Cdk가 결합된 cyclin-Cdk 복합체는 각기 다른 세포주기 단계를 촉진하게 된다. cyclin D와 cyclin E는 G1 기 진행을 유도하는데 필수적이며, 초기 G1 기의 시작에는 cyclin D/Cdk 4(and or Cdk 6)의 복합체가 필요하며, G1 기의 후기에서 S 기의 시작 전에는 cyclin E/Cdk 2 복합체가 이루어져야 한다. Cyclin A는 Cdk2와 복합체를 이루며 S 기와 G2기에서 발현이 증가하며, cyclin B는 Cdc 2와 복합체를 이루어 G2 기와 M 기로의 세포 주기 진행에 요구된다.Inhibition of G2 / M progression derived from cancer cell cycle analysis was found to be related to inhibition of cancer cell proliferation. Therefore, the expression level of cyclins and Cdks, p53 and p21, which are related to G2 / M phase regulation, was determined by RT-PCR. saw. Cell cycle control systems regulate cell cycle machinery by phosphorylating key proteins. Phosphorylation and dephosphorylation are one of the most common ways of changing protein activity in cells, and they are also used to control cell cycle-related proteins. The cell cycle is also regulated by a protein called cyclin, which itself has no enzymatic activity but becomes enzymatic when it binds to a Cyclin-dependent protein kinase (Cdk). Cyclin and Cdk combined cyclin-Cdk complexes promote different cell cycle stages. cyclin D and cyclin E are essential for inducing G1 progression, the initiation of early G1 phase requires a complex of cyclin D / Cdk 4 (and or Cdk 6), and cyclin E before the onset of S phase in late G1 phase. The /
도 8과 같이 여러 종류의 Cylin와 Cdks의 mRNA 발현율을 확인하였다. Cyclin A와 B1은 대조군에 비해 CSP, SPⅠ이나 SPⅡ를 첨가한 실험군에서 mRNA의 발현율이 감소하였다. Cyclin D는 대조군과 현저한 차이를 보이지 않았으나, Cyclin E는 대조군에 비해 CSP는 발현을 증가시켰고, SPⅠ와 SPⅡ는 CSP보다는 약한 발현 증가율을 나타내었다. Cdc 2는 대조군에 비해 실험군에서 약한 활성을 보였다. Cdk 2는 대조군과 CSP를 처리한 군에서 비슷한 수준의 발현을 보였으나, SPⅠ과 SPⅡ를 처리한 실험군에서는 증가되었다. Cdk 6의 경우에도 대조군과 실험군에서 큰 차이를 보이지 않았다. As shown in FIG. 8, mRNA expression rates of various types of Cylin and Cdks were confirmed. Cyclin A and B1 decreased the mRNA expression rate in the experimental group to which CSP, SPI or SPII was added compared to the control group. Cyclin D did not show a significant difference from the control group, but Cyclin E increased the expression of CSP compared to the control, and SPI and SPII showed a weaker expression increase than CSP.
G2 기의 진행과 관련이 있는 cyclin A과 B 그리고 Cdc 2의 활성이 대조군에 비해 실험군이 감소되는 것은 PI 염색을 통해 세포 주기에서 확인한 바와 같이 세포 주기가 G2/M 진행 억제 된 것과 일치한다. Reduction of cyclin A, B, and
Cdk 저해제는 cyclin/Cdk 복합체와 결합하여 그들의 활성을 억제하는데, 그 중에서도 p21은 DNA의 손상이 생기면 농도와 활성이 증가하는 종양 억제유전자인 p53에 의해 활성이 조절된다. p21 단백질이 활성이 되면 S 기로 진행을 돕는 cyclin-Cdk 복합체에 결합하여 활성을 억제시켜 G1 기에 세포주기를 멈추게 함으로써 DNA를 복제하기 전에 세포가 복구한 시간을 갖도록 한다. Cdk inhibitors bind to the cyclin / Cdk complex and inhibit their activity. Among them, p21 is regulated by p53, a tumor suppressor gene that increases in concentration and activity when DNA damage occurs. When the p21 protein is activated, it binds to the cyclin-Cdk complex, which aids the progression of S group, and inhibits the activity to stop the cell cycle at G1 phase, allowing the cells to recover before replicating DNA.
도 10에서 나타난 바와 같이, p53과 p21의 mRNA의 발현량은 대조군에 비해 실험군에서 약간 증가하는 것으로 확인되었다. 이것은 CSP, SPⅠ, SPⅡ가 HT-29 세포의 증식 억제에 종양억제 유전자 p53 및 p21의 발현과 관련이 있다는 것으로 확인 할 수 있다. As shown in FIG. 10, the expression levels of p53 and p21 mRNAs were slightly increased in the experimental group compared to the control group. This suggests that CSP, SPI and SPII are related to the expression of tumor suppressor genes p53 and p21 in inhibiting the proliferation of HT-29 cells.
본 발명에서는 민간에서 식용으로 많이 쓰이고 있는 함초에서 추출물과 다당 체를 추출하여 인체 대장암세포인 HT-29 세포에 대한 항암활성에 대해 연구하였다. 함초 추출물과 다당체는 모두 암세포의 성장 억제하는 효과를 보였으며, 초기 아폽토시스의 유발을 통해 아폽토시스를 유도하는 것으로 확인되었다. 또한 G2/M 진행 억제로 인해 세포주기를 지연시키는 효과도 있었으며, 세포주기와 관련있는 단백질의 mRNA 발현양을 통해 세포주기의 변화 양상도 알 수 있었다. 특히 이런 효과들은 조추출보다는 다당체인 SPⅠ과 SPⅡ에서 변화폭이 컸으며, SPⅠ에서 뚜렷이 관찰할 수 있었다. 따라서 함초 다당체는 항암 활성을 가진 새로운 생리활성 물질로서의 개발가능성을 기대할 수 있다.In the present invention, the anticancer activity of human colon cancer cells HT-29 cells by extracting the extracts and polysaccharides from the seaweed used in folk food. Both extracts and polysaccharides inhibited the growth of cancer cells and were found to induce apoptosis through the induction of early apoptosis. In addition, G2 / M progression inhibited the cell cycle, and the change in cell cycle was also revealed through the mRNA expression of proteins related to the cell cycle. In particular, these effects were more pronounced in the polysaccharides SPI and SPII than in crude extraction, and were clearly observed in SPⅠ. Therefore, the seaweed polysaccharide can be expected to be developed as a new bioactive substance with anticancer activity.
본 발명에 따른 함초 추출물은 암세포의 성장을 유의적으로 억제하였으며, 암세포의 아폽토시스 비율을 상승시켰고, G2/M 기에서 농도의존적으로 세포주기의 진행이 멈추며, G2 기의 진행과 관련이 있는 단백질의 활성을 감소시키고, 종양 억제 유전자인 p53 및 p21의 발현은 증가시킴으로써 아폽토시스 유도와 세포 주기 지연에 의해 암세포의 증식억제 효과를 나타내어 제약학 및 건강식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.Hamcho extract according to the present invention significantly inhibited the growth of cancer cells, increased the apoptosis rate of cancer cells, the cell cycle progression stops in a concentration-dependent manner in the G2 / M phase, and the protein of the G2 phase It is a very useful invention in the pharmaceutical and health food industry by reducing the activity and increasing the expression of the tumor suppressor genes p53 and p21, thereby showing the effect of inhibiting the proliferation of cancer cells by inducing apoptosis and delaying cell cycle.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1 : 함초로부터 다당체 추출 Example 1 Polysaccharide Extraction from Seaweed
본 실시예에서 사용한 실험 재료는 (주)다사랑으로부터 건조된 함초(Salicornia herbacea)를 구입하여 분말화하여 사용하였다.The experimental material used in this example was used to purchase powdered dried seaweed ( Salicornia herbacea ) from DaSarang Co., Ltd.
도 1에서 나타나는 바와 같이, 건조된 함초를 잘게 분쇄하여 고온, 가압 조건 하에서 3시간 동안 열수 추출한 후에 여과지(Whatman No.1)로 여과하여 조추출물인 함초 다당체 조출물(crude S. herbacea polysaccharide extract; CSP)를 얻었다. 상기 CSP를 한외여과기(ProFlux M12, Millipore, USA)에서 1 kD 멤브레인 (Millipore, USA)을 사용하여 여과한 후에 다당체인 함초 다당체 I(S. herbacea polysaccharide Ⅰ; SPⅠ)을 얻었다. 함초 다당체 II(S. herbacea polysaccharide Ⅱ; SPⅡ)은 상기 CSP를 겔 투과 크로마토그래피 방법을 통해 얻었다. 세파덱스 G-50 (Sigma, USA)을 고온 가압 멸균시킨 2차 증류수로 칼럼(2.5cm × 50cm, Sigma Chemical Co.)에 충전시킨 후 CSP를 세파덱스 G-50으로 충전된 칼럼에 2mL 주입하여 분당 3mL 유속으로 2.5mL씩의 분획을 얻었으며, 각각의 분획은 페놀-황산법으로 총 당량을 측정하였다. 블루 덱스트란(Blue dextran; Sigma, USA)을 표준물질로 하여 CSP로부터 분리되어 나온 다당체의 분자량을 추정하였다. As shown in FIG. 1, the dried seaweed is finely pulverized, hot water extracted for 3 hours under high temperature and pressure conditions, and then filtered with a filter paper (Whatman No. 1) to obtain crude crude polysaccharide extract (crude S. herbacea polysaccharide extract; CSP). The CSP was filtered on an ultrafilter (ProFlux M12, Millipore, USA) using a 1 kD membrane (Millipore, USA) to obtain polysaccharide I ( S. herbacea polysaccharide I; SPI). S. herbacea polysaccharide II (SPII) was obtained by gel permeation chromatography of the CSP. Sepadex G-50 (Sigma, USA) was charged with a column (2.5 cm × 50 cm, Sigma Chemical Co.) with secondary distilled water, autoclaved at high temperature, and then 2 mL of CSP was injected into a column filled with Sephadex G-50. Fractions of 2.5 mL were obtained at a flow rate of 3 mL per minute, and each fraction was determined by total phenol-sulfuric acid method. The molecular weight of the polysaccharide separated from the CSP was estimated using Blue dextran (Sigma, USA) as a standard.
FⅠ인 16~30kDa과 FⅡ인 250~3300Da인 분획인 모아 SPⅡ로 사용하였다(도 2 참조). 분리된 CSP, SPⅠ과 SPⅡ는 동결건조로 분말로 만든 뒤에 실험에 사용된 농도에 맞춰 희석하여 사용하였다.The collected fractions, which are the FIs of 16-30 kDa and the FIIs of 250-3300 Da, were used as SPII (see FIG. 2). The isolated CSP, SPⅠ and SPII were lyophilized to powder and diluted to the concentration used in the experiment.
실험예Experimental Example
HT-29 인체 대장암 세포(human colon cancer cell)는 한국세포주은행으로부터 분양받았으며, 10% 우태아혈청(FBS, fetal bovine serum, Gibco, USA)와 1%의 5,000 units/mL 페니실린 - 5,000㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco, USA)를 희석한 RPIM 1640 배지(Gibco, USA)를 사용하여 배양하였다. 세포는 37℃ 배양기를 이용하여 온도를 일정하게 유지하였으며 5% CO2 환경이 이루어지도록 배양하였다. 2일 간격으로 배지를 교환하고, 세포의 증식에 따른 과밀화 현상을 방지하기 위해 0.25% trypsin - 1mM EDTA (Gibco, USA)를 처리하여 일주일에 1~2회 계대배양하였다.HT-29 human colon cancer cells were distributed from Korea Cell Line Bank, 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) and 1% of 5,000 units / mL penicillin-5,000 µg / Culture was performed using RPIM 1640 medium (Gibco, USA) diluted with mL streptomycin (Gibco, USA). Cells were maintained at a constant temperature using a 37 ℃ incubator and cultured to achieve a 5% CO 2 environment. Medium was exchanged every two days, and incubated once or twice a week with 0.25% trypsin-1 mM EDTA (Gibco, USA) to prevent overcrowding due to cell proliferation.
암세포의 성장 억제 효과는 MTS 분석 원리를 이용하여 측정하였으며 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA)를 사용하여 다음과 같이 진행하였다. 세포 배양용 96 웰 플레이트에 5×105 cells/mL의 농도로 HT-29 세포를 분주한 후 24시간 동안 안정화시켰다. 실험군은 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL가 되도록 조제된 추출물과 다당체물을 각 웰에 10μL 분주하고 대조군에는 D.W.만 10μL을 첨가한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24, 48시간 배양하였다. 배양 후 세포 배양액 100μL에 세포 적정 용액을 20μL씩 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 다음 형광 다중-검출 리더기(Fluorescence Multi-Detection Reader; Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490nm에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.Cancerous Growth inhibition effect was measured using the MTS analysis principle and proceeded as follows using Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, USA). After dispensing HT-29 cells at a concentration of 5 × 10 5 cells / mL in a 96 well plate for cell culture, the cells were stabilized for 24 hours. Group is a final concentration of from 0.5, 1, 2, 4 ㎎ / the extract and polysaccharide with water to prepare so that mL 10μL dispensed to each well and the control group after 37 ℃ by the addition of 10μL only DW, 5% CO 2 incubator 24, Incubated for 48 hours. After incubation, 20 μL of the cell titration solution was added to 100 μL of the cell culture, followed by reaction for 4 hours, and then the OD value was measured at 490 nm using a Fluorescence Multi-Detection Reader (Synergy HT, BIOTEK, USA). Measured.
세포 배양용 12 웰 플레이트의 각 웰에 HT-29 세포를 4×105 cells/mL의 농도로 분주하여 24시간동안 안정화시켰다. 실험군은 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL가 되도록 조제된 추출물과 다당체물을 각 well에 50μL 분주하고 대조군에는 동량의 D.W.을 첨가한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24, 48시간 배양하였다. 아폽토시스 측정은 BD 파르민젠(Pharmingen)™ 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 1 (BD Biosciences, USA)를 이용하여 측정하였다. 배양이 끝난 플레이트의 각 웰에 0.25% 트립신 - 1mM EDTA를 처리하여 착생 세포인 HT-29 세포를 부유시킨 다음 배지를 가하여 현탁하여 튜브에 모은 후 원심분리를 하였다. 세척용 완충액으로 세척한 다음 세포 펠릿을 1× 결합 완충액 100μL를 첨가하여 재부유하였다. 부유된 세포에 아넥신 V-FITC와 PI를 각각 5μL씩 첨가한 뒤 암실, 실온(20~25℃)의 상태에서 15분간 배양하였다. 반응 후 1× 결합 완충액 400μL를 첨가하고 1시간 이내에 FACSCalibur™ (Becton Dickinson, USA)로 분석하였다. In each well of a 12 well plate for cell culture, HT-29 cells were dispensed at a concentration of 4 × 10 5 cells / mL and stabilized for 24 hours. Group is a final concentration of from 0.5, 1, 2, 4 ㎎ / the extract and polysaccharide with water to prepare so that mL 50μL dispensed to each well and the control group after 37 ℃ was added the same volume of DW, 5% CO 2 incubator 24, Incubated for 48 hours. Apoptosis measurements were determined using BD Pharmingen ™ Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 1 (BD Biosciences, USA). Each well of the incubated plate was treated with 0.25% trypsin-1 mM EDTA to suspend HT-29 cells, which are engraftment cells, and then suspended in medium, collected in a tube, and centrifuged. After washing with wash buffer, the cell pellet was resuspended by adding 100 μL of 1 × binding buffer. Annexin V-FITC and PI were added to the suspended cells, 5 μL each, followed by incubation for 15 minutes in the dark at room temperature (20-25 ° C.). After the reaction 400 μL of 1 × binding buffer was added and analyzed by FACSCalibur ™ (Becton Dickinson, USA) within 1 hour.
세포 주기의 분석은 세포 사이클 상 측정 키트(Cell Cycle Phase Determination Kit; Cayman Chemical, USA)를 이용하여 다음과 같이 진행하였다. 세포 배양용 12 웰 플레이트의 각 웰에 HT-29 세포를 1×106 cells/well의 농도로 분주하여 24시간동안 안정화시켰다. 실험군은 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL가 되도록 조제된 추출물과 다당체물을 각 웰에 50μL 분주하고 대조군에는 동량의 D.W.을 첨가한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 24, 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 플 레이트의 각 웰에 0.25% trysin - 1mM EDTA를 처리하여 착생 세포인 HT-29 세포를 부유시킨 다음 배지를 가하여 현탁하여 튜브에 모은 후 원심분리를 하였다. 분석용 완충액으로 두 번 세척한 다음 106cell/mL의 농도로 재부유하였다. 세포를 고정하고 염색이 잘 되도록 하기 위해서 각 튜브 당 1mL의 정착액을 넣고 적어도 2시간이상 -20℃에 보관하여 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 원심분리하여 정착액을 완전히 버린 후, 세포 펠릿을 DNAse-free RNAse와 프로피듐 아이오다이드(PI)가 혼합된 염색 용액에 부유시키고 암실, 실온의 상태에서 30분간 배양하였다. 반응 후 1시간 이내에 FACSCalibur™의 FL2 채널에서 350nm 여기 레이저로 분석하였다.Cell cycle analysis was performed using the Cell Cycle Phase Determination Kit (Cayman Chemical, USA) as follows. In each well of a 12 well plate for cell culture, HT-29 cells were dispensed at a concentration of 1 × 10 6 cells / well and stabilized for 24 hours. Group is a final concentration of from 0.5, 1, 2, 4 ㎎ / the extract and polysaccharide with water to prepare so that mL 50μL dispensed to each well and the control group after 37 ℃ was added the same volume of DW, 5% CO 2 incubator 24, Incubated for 48 hours. Each well of the incubated plate was treated with 0.25% trysin-1 mM EDTA to suspend HT-29 cells, which are engraftment cells, and then suspended in medium, collected in a tube, and centrifuged. Wash twice with assay buffer and resuspend at a concentration of 10 6 cells / mL. In order to fix the cells and stain well, 1mL of fixation solution was added to each tube, and the cells were fixed by keeping at -20 ° C for at least 2 hours. After the fixed cells were centrifuged to completely discard the fixer, the cell pellet was suspended in a dye solution mixed with DNAse-free RNAse and propidium iodide (PI), and incubated for 30 minutes at room temperature in the dark. Within 1 hour after the reaction, a 350 nm excitation laser was analyzed in the FL2 channel of FACSCalibur ™.
mRNA 발현율을 검사하기 위해 먼저 Easy-spin™ [DNA free] 총 RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 총 RNA을 분리하였다. 세포 배양용 페트리 접시에 총 1~10×106 세포의 HT-29 세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시켰다. 총 농도가 4㎎/mL이 되도록 실험군에는 추출물과 다당체물을 첨가하고 대조군에는 동량의 D.W.를 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 배양 후 0.25% 트립신 - 1mM EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 배지를 가하여 현탁하고 1.5mL 에펜도르프 튜브(eppendorf 튜브)에 옮긴 후 13,000rpm에 10초간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 1mL의 용리 완충액을 첨가하고 10초간 격렬하게 볼텍싱하여 세포를 용리시켰다. 200μL의 클로로포름을 첨가하여 볼텍싱하여 섞은 후 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상등액 400μL을 새로운 1.5mL 에펜도르프 튜브에 옮기고, 400μL의 결합 완충액를 첨가한 뒤 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 원심분리를 하지 않은 채 실온에서 1분간 방치하여 반응시키고 상층액을 컬럼으로 적재한 후 13,000rpm에서 30초간 원심분리하였다. 튜브에 흘러나온 액은 버리고 다시 튜브를 끼운 후 700μL의 세척용 완충액 A를 컬럼으로 적재한 후 13,000rpm에서 30초간 원심분리하였다. 다시 튜브에 흘러나온 액을 버리고 700μL의 세척용 완충액 B를 컬럼으로 적재한 후 13,000rpm에서 30초간 원심분리하였다. 컬럼을 말리기 위해 아무것도 넣지 않은 상태에서 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 컬럼을 새로운 1.5mL 에펜도르프 튜브에 꽂고 500μL의 에멀젼 완충액을 첨가한 뒤 실온에서 1분간 반응시켰다. Total RNA를 용리시키기 위해 1분간 13,000rpm에서 원심분리하였고 컬럼을 빠져나온 total RNA는 분광광도계를 이용하여 농도와 순도를 알아보았다. To test mRNA expression, total RNA was first isolated using Easy-spin ™ [DNA free] total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Korea). A total of 1 ~ 10 × 10 6 cells of HT-29 cells were dispensed in a petri dish for cell culture and stabilized for 24 hours. Extracts and polysaccharides were added to the experimental group and the same amount of DW was added to the control group so that the total concentration was 4 mg / mL and incubated for 24 hours. After incubation, the suspension was treated with 0.25% trypsin-1 mM EDTA, suspended in medium, transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube, and centrifuged at 13,000 rpm for 10 seconds. After removal of the supernatant, 1 mL of elution buffer was added and the cells were eluted by vigorous vortexing for 10 seconds. 200 μL of chloroform was added and vortexed to mix, followed by centrifugation at 13,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes. 400 μL of supernatant was transferred to a new 1.5 mL Eppendorf tube, mixed well by adding 400 μL of binding buffer and pipetting. The reaction was allowed to stand for 1 minute at room temperature without centrifugation, and the supernatant was loaded into a column, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 30 seconds. After discarding the liquid flowing out of the tube, the tube was again loaded with 700 μL of washing buffer A as a column and centrifuged at 13,000 rpm for 30 seconds. Discarded the liquid flowing out of the tube again was loaded with 700μL wash buffer B as a column and centrifuged for 30 seconds at 13,000rpm. The column was centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm with nothing added to dry the column. The column was plugged into a fresh 1.5 mL Eppendorf tube and 500 μL of emulsion buffer was added and allowed to react at room temperature for 1 minute. In order to elute the total RNA was centrifuged for 1 minute at 13,000rpm and the total RNA exiting the column was analyzed for concentration and purity by using a spectrophotometer.
1cm 경로 길이에 대한 RNA 상수 : 1 개의 A260 유닛 RNA = 40 ㎍/mLRNA constant for 1 cm path length: 1 A 260 unit RNA = 40 μg / mL
총 A260 = (희석 시료의 A260) × (희석 인수)Total A 260 = (A 260 of diluted sample) × (dilution factor)
농도 (㎍/mL) = (총 A260) × (40 ㎍/mL)Concentration (μg / mL) = (Total A 260 ) × (40 μg / mL)
수율(㎍) = (총 시료 부피) × (농도) Yield (μg) = (total sample volume) x (concentration)
이 때 정제된 RNA의 경우에는 A260/A280 의 비율이 1.9~2.0의 비율로 나타내었다. Total RNA의 농도를 측정한 후 RT-PCR을 진행하기 위해서 total RNA의 농도가 500ng이 되도록 실험군과 대조군을 각각 준비하였다.At this time, in the case of purified RNA, the ratio of A260 / A280 was represented by the ratio of 1.9-2.0. In order to proceed with RT-PCR after measuring the total RNA concentration, the experimental group and the control group were prepared so that the total RNA concentration was 500ng.
분리된 RNA를 정량한 후 맥심 RT-PCR 프리믹스 키트(Maxime RT-PCR PreMix Kit; iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 RT-PCR 과정을 수행하였다. RT-PCR PreMix 튜브에 템플릿 RNA, 각각의 유전자 특이 프라이머와 RNase-프리 물을 넣어 총 부피가 20μL가 되도록 맞춘 후 마스터사이클러 구배(Mastercycler gradient; Astec, Japan)를 이용하여 증폭하였다. 첫 번째 단계는 역전사 반응으로 cDNA를 합성한 후 RTase를 inactivation하는 단계이며, 두 번째 단계부터 유전자 특이 프라이머를 이용하여 cDNA에서 특정 유전자를 증폭하였다. 각 PCR 산물의 양적 차이를 알아보기 위하여 0.5× TAE buffer로 1.5% 아가로스겔를 만들고 각 웰 당 특정 프라이머에 해당하는 PCR 산물을 적재한 후 100volt에서 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 에티듐 브로마이드(ethidium bromide; EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV상에서 PCR 산물의 존재를 확인하였다. RT-PCR을 이용하여 분석을 한 유전자의 종류는 표 1과 같으며, 이 때 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 내부 대조군으로 사용하였다. After quantifying the isolated RNA, RT-PCR was performed using Maxim RT-PCR PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Korea). Template RNA, each gene specific primer and RNase-free water were added to the RT-PCR PreMix tube so that the total volume was 20 μL and amplified using a Mastercycler gradient (Astec, Japan). In the first step, cDNA was synthesized by reverse transcription, followed by inactivation of RTase. From the second step, specific genes were amplified in cDNA using gene-specific primers. In order to determine the quantitative difference between each PCR product, 1.5% agarose gel was prepared with 0.5 × TAE buffer, and each PCR product was loaded with a PCR product corresponding to a specific primer, followed by electrophoresis at 100 volts. After the electrophoresis gel was stained using ethidium bromide (EtBr, Sigma), the presence of the PCR product on the UV was confirmed. The types of genes analyzed using RT-PCR are shown in Table 1, where the housekeeping gene, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Used as a control.
모든 실험 결과는 통계 프로그림인 SAS (Statistic Analysis System)를 이용하여 평균과 표준 편차를 구하였다. 통계 처리는 일방 분산 분석법(one-way analysis of variance; ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.05 수준에서 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test)에 의해 유의차를 검증하였다.All experimental results were averaged and standard deviation calculated using statistical analysis system (Statistic Analysis System). Statistical treatment was performed by one-way analysis of variance (ANOVA) and significant differences were verified by Student's t -test at p <0.05 level.
<표 1>TABLE 1
RT-PCR에 이용된 프라이머 서열Primer Sequences Used for RT-PCR
실험예 1 : 함초 다당체의 암세포 성장 억제 효과Experimental Example 1 Inhibitory Effect of Seaweed Polysaccharide on Cancer Cell Growth
함초 다당체가 HT-29 세포의 성장에 미치는 영향을 분석하기 위해 CSP, SPⅠ과 SPⅡ의 첨가 농도 및 처리 시간에 따른 암세포의 생장률을 MTS 방법을 이용하였다. 결과적으로 CSP, SPⅠ과 SPⅡ를 처리한 실험군이 시료를 넣지 않은 대조군에 비해 유의적으로 감소함을 알 수 있었다(Fig 3). 시료의 처리 시간이 24시간인 경우는 D.W,를 처리하고 24시간 배양한 대조군을 100% 생존군으로 보았고, 48시간 배 양인 경우는 대조군의 생존율을 100%로 보아, 배양시간에 따라 대조군의 생존률을 변화하여 효과적으로 결과를 분석하였다. D.W.를 처리하고 24시간 배양한 대조군을 100% 생존군으로 보았을 때, CSP을 처리한 실험군은 0.5㎎/mL과 1㎎/mL을 처리하였을 때 50%이상의 생존률을 보였으며, 4㎎/mL을 처리하였을 때는 5%대로 급격히 생존률이 떨어졌다. 48시간의 경우에도 0.5㎎/mL과 1㎎/mL을 처리하였을 때 50%이상의 생존률을 보이다가, 2㎎/mL과 4㎎/mL을 처리하였을 때는 29%와 16%의 생존률을 보였다.MTS method was used to determine the growth rate of cancer cells according to the concentration of CSP, SPI and SPII and the treatment time. As a result, the experimental group treated with CSP, SPⅠ and SPII was significantly decreased compared to the control group without the sample (Fig. 3). When the treatment time of the sample was 24 hours, the control group treated with DW, and cultured for 24 hours was regarded as 100% surviving group, and in the case of 48 hours culture, the survival rate of the control group was 100%. The results were analyzed effectively by changing the. When the control group treated with DW and cultured for 24 hours was 100% surviving group, the experimental group treated with CSP showed more than 50% survival rate when treated with 0.5 mg / mL and 1 mg / mL, and 4 mg / mL. When treated, the survival rate dropped sharply to 5%. In the case of 48 hours, the survival rate was over 50% when 0.5 mg / mL and 1 mg / mL were treated, and the survival rates were 29% and 16% when 2 mg / mL and 4 mg / mL were treated.
한편, CSP에 비해 SPⅠ과 SPⅡ를 처리한 실험군의 경우는 암세포의 성장이 더 억제되는 경향이 보였다. 낮은 농도인 0.5㎎/mL과 1㎎/mL을 처리하였을 때는 CSP와 큰 차이를 보이지 않았으나, 2㎎/mL과 4㎎/mL를 처리한 실험군에서는 24시간 배양하였을 때 SPⅠ군이 13%와 9%의 결과가 나왔고, SPⅡ군이 29%와 14%의 암세포의 성장이 억제되는 점을 알 수 있었다. On the other hand, in the experimental group treated with SP I and SP II compared with CSP, the growth of cancer cells tended to be more suppressed. The low concentrations of 0.5 mg / mL and 1 mg / mL were not significantly different from CSP. However, in the experimental group treated with 2 mg / mL and 4 mg / mL, the SPI group was 13% and 9 when incubated for 24 hours. The results of% were found, and it was found that the SPII group inhibited the growth of 29% and 14% of cancer cells.
시료의 처리 농도가 높을수록, 배양 시간이 길수록 암세포의 성장은 유의적으로 감소하였으며, CSP군을 처리한 실험군에 비해 SPⅠ군이나 SPⅡ군을 처리한 실험군이 효과적으로 암세포의 성장을 억제하는 경향을 나타내었다. The higher the treatment concentration of the sample, the longer the incubation time, significantly decreased the growth of cancer cells, and compared with the experimental group treated with the CSP group, the experimental group treated with the SPⅠ or SPⅡ group showed a tendency to effectively inhibit the growth of the cancer cells. It was.
실험예 2 : 함초 다당체 처리에 의한 아폽토시스 유발Experimental Example 2 Induction of Apoptosis by Treatment of Seaweed Polysaccharides
암세포의 증식 억제가 아폽토시스와 연관성이 있을 거라 생각되어 대조군과 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ를 처리한 실험군의 아폽토시스 여부를 아넥신 V-FITC와 PI로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. D.W.를 넣은 대조군과 SPⅠ 또는 SPⅡ를 0.5, 1, 2, 4 ㎎/mL의 농도로 첨가한 실험군을 24시간과 48시간 배양한 후 아폽토시스 여부를 분석하였다. 도 4와 5에서 보는 바와 같이 분석된 세포는 아넥신 V-FITC와 PI의 염색 여부에 따라 아폽토시스를 구분할 수 있다. 전체 아폽토시스는 아넥신 V와 결합하는 초기 아폽토시스와 PI와 결합하는 후기 아폽토시스 또는 네크로시스로 구분되어지며, 초기 아폽토시스는 도트 플롯을 4분면으로 나누었을 때 LR (lower right) 영역에 나타나고 후기 아폽토시스는 UR (upper right) 영역에 나타난다. LL (lower left) 영역에는 아넥신 V와 PI에 결합하지 않은 생존 세포가 나타난다. Inhibition of the proliferation of cancer cells may be related to apoptosis, and apoptosis of the control group and the experimental group treated with CSP, SPI or SPII was analyzed by flow cytometry after staining with Annexin V-FITC and PI. A control group containing D.W. and an experimental group to which SPI or SPII was added at concentrations of 0.5, 1, 2, and 4 mg / mL were incubated for 24 hours and 48 hours, and then analyzed for apoptosis. As shown in FIGS. 4 and 5, the analyzed cells can distinguish apoptosis according to staining of annexin V-FITC and PI. Total apoptosis is divided into early apoptosis that binds annexin V and late apoptosis or necrosis that binds PI, and early apoptosis appears in the lower right region when the dot plot is divided into quadrants, and late apoptosis is UR. appears in the (upper right) area. The LL (lower left) region shows viable cells that do not bind Annexin V and PI.
<표 2>TABLE 2
24 시간 동안 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리된 HT-29 세포의 아폽토시스 사멸Apoptosis killing of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII for 24 hours
상기 결과는 총 처리 세포의 %로 나타냄.The results are expressed in% of total treated cells.
데이터는 평균 ± SD (n=6)로 나타냄.Data represented as mean ± SD (n = 6).
* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이가 있음. * significantly different from control at p <0.05.
<표 3>TABLE 3
48 시간 동안 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리된 HT-29 세포의 아폽토시스 사멸Apoptosis killing of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII for 48 hours
상기 결과는 총 처리 세포의 %로 나타냄.The results are expressed in% of total treated cells.
데이터는 평균 ± SD (n=6)로 나타냄.Data represented as mean ± SD (n = 6).
* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이가 있음. * significantly different from control at p <0.05.
표 2와 3에서 보는 바와 같이, CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ를 24시간 동안 처리한 실험군은 MTS 실험을 통해 확인한 바와 같이 4㎎/mL의 농도로 처리하였을 때 전체 세포수에서 생존 세포 집단이 차지하는 비중이 대조군 85.00%에 비해 각각 74.47, 6.72, 78.16%으로 나타나 유의적으로 감소하였고, 48시간 동안 처리한 실험군에서도 대조군 (79.36%)에 비해 CSP, SPⅠ와 SPⅡ 실험군이 53.00, 6.87, 58.82%로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이로써 CSP, SPⅠ와 SPⅡ의 암세포 성장 억제 효과를 한번 더 확인할 수 있었다.As shown in Tables 2 and 3, the experimental group treated with CSP, SPI or SPII for 24 hours showed the proportion of the viable cell population in the total cell number when treated at the concentration of 4 mg / mL as confirmed by the MTS experiment. 74.47, 6.72, and 78.16%, respectively, were significantly decreased compared to 85.00% of the control group. In the experimental group treated for 48 hours, the CSP, SPⅠ, and SPII groups were 53.00, 6.87, 58.82%, compared to the control group (79.36%). It was confirmed that the decrease. As a result, the cancer cell growth inhibitory effect of CSP, SPⅠ and SPII was confirmed once more.
또한 전체 아폽토시스 사멸은 24시간 동안 배양하였을 때 대조군이 13.51%인 것에 비해 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ를 4 ㎎/mL의 농도로 처리한 실험군이 각각 24.99, 91.59, 16.6%로 아폽토시스가 많이 일어난 점을 확인하였다. 또한 같은 농도에서 48시간 배양하였을 때 대조군이 29.08%인 것에 비해 각각 45.46, 92.71, 39.33%로 전체 아폽토시스를 확인하였다. 실험군 중에서도 특히 SPⅠ이 CSP나 SPⅡ에 비해 3~4배 정도 더 많은 아폽토시스를 유발하였다. In addition, total apoptosis killing was 24.99, 91.59, and 16.6% of CSP, SPI, or SPII treated at 4 mg / mL, respectively, compared to 13.51% of control group when cultured for 24 hours. It was. In addition, the total apoptosis was confirmed as 45.46, 92.71 and 39.33%, respectively, compared to 29.08% of the control group when incubated for 48 hours at the same concentration. Among the experimental groups, SPI induced 3 ~ 4 times more apoptosis than CSP or SPII.
초기 아폽토시스 사멸만 살펴보면, 실험군이 저농도일 경우에는 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 24시간 동안 4㎎/mL의 농도로 처리하였을 경우, 대조군 (7.27%)에 비해 CSP군 (16.67%), SPⅠ군 (85.67%)이 각각 2배과 12배 정도로 초기 아폽토시스 사멸이 증가하였으며, SPⅡ군은 유의적 차이를 보이지 않고 대조군과 비슷한 양상을 보였다. 같은 농도로 48시간 동안 처리하였을 경우에도 대조군 (16.27%)에 비해 SPⅠ군이 74.45%로 4배 이상 증가하였으며, CSP군과 SPⅡ은 큰 차이를 보이지 않았다. 후기 아폽토시스 사멸은 실험군이 대조군과 유의적으로 큰 차이를 보이지 않았다. Looking at the initial apoptosis killing, there was no significant difference in the experimental group at low concentrations, but when treated at a concentration of 4 mg / mL for 24 hours, the CSP group (16.67%) and the SPI group (7.27%) were compared with the control group (7.27%). 85.67%) showed an increase in early apoptosis killing by 2 and 12 fold, respectively, and the SP II group showed no significant difference and was similar to the control group. Even when treated for 48 hours at the same concentration, the SPI group increased more than four times to 74.45% compared to the control group (16.27%), and there was no significant difference between the CSP group and SPII. Late apoptosis killing was not significantly different from the control group.
CSP와 SPⅡ에 비해 SPⅠ은 아폽토시스를 많이 유발하여 하였으며, 특히 초기 아폽토시스 사멸이 많이 증가한 것을 확인할 수 있었다.Compared with CSP and SPII, SPI induced apoptosis, and in particular, early apoptosis killing was increased.
실험예 3 : 함초 다당체 처리에 따른 암세포 주기 분석Experimental Example 3: Cancer cell cycle analysis according to the treatment of seaweed polysaccharide
대조군과 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ를 0.5, 1, 2, 4㎎/mL의 농도로 24시간과 48시간 처리한 실험군을 대상으로 PI 염색을 이용하여 유세포 분석법으로 세포주기를 분석하였다. 세포주기는 G0 (sub G1), G1, S, G2/M 기로 구성되어 있으며, G0 기는 세포주기에서 벗어난 분열을 중지한 세포나 아폽토시스가 유발된 세포들이 있는 단계이고, G1 기와 G2 기는 휴지기 (gap period), S 기는 DNA를 두 배로 합성하는 단계, M 기는 세포 분열이 일어나는 분열기 (mitosis)이다. The cell cycle was analyzed by flow cytometry using PI staining in the control group and the experimental group treated with CSP, SPI or SPII at concentrations of 0.5, 1, 2, and 4 mg / mL for 24 hours and 48 hours. The cell cycle is composed of G0 (sub G1), G1, S, and G2 / M phases. G0 phase is a phase where cells that stop dividing out of the cell cycle or apoptosis-induced cells are present. period, the S group doubles the synthesis of DNA, and the M group is the mitosis in which cell division occurs.
도 6에는 각 시료를 24시간 처리한 후 세포주기를 분석한 히스토그램이고, 도 7은 48시간 처리한 후 분석한 히스토그램이다. 히스토그램에는 세포성 DNA에 염색되는 PI의 염색 강도 차이로 인해 두 개의 피크를 볼 수 있으며, 피크로 세포 주기 4부분을 나눌 수 있다. 첫 피크가 나타나기 전까지를 G0 기, 첫 피크 부분은 G1 기, 피크와 피크 사이를 S 기 그리고 두 번째 피크 부분을 G2/M 기로 구분한다. 6 shows a histogram of a cell cycle after 24 hours of treatment of each sample, and FIG. 7 shows a histogram of a sample after 48 hours of treatment. The histogram shows two peaks due to the difference in staining intensity of the PI stained on cellular DNA, and the peak can be divided into four parts of the cell cycle. Until the first peak appears, the G0 phase, the first peak portion is divided into G1 phase, the peak and peak between the S phase and the second peak portion is divided into G2 / M phase.
시료를 24시간 처리한 뒤 분석한 세포 주기의 각각의 시기에 해당되는 세포의 빈도를 표 4에 정량화하여 나타내었다. After the sample was treated for 24 hours, the frequency of the cells corresponding to each period of the analyzed cell cycle is shown in Table 4.
<표 4>TABLE 4
24 시간 동안 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리한 HT-29 세포의 세포 주기 분포Cell cycle distribution of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII for 24 hours
상기 결과는 총 처리 세포의 %로 나타냄.The results are expressed in% of total treated cells.
데이터는 평균 ± SD (n=6)로 나타냄.Data represented as mean ± SD (n = 6).
* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이가 있음. * significantly different from control at p <0.05.
대조군의 경우 G1 기와 S 기에 속하는 세포가 63.16%, 16.82%로 나타났고, G2/M 기에 속하는 세포가 14.24%로 확인되었다. 하지만 CSP, SPⅠ나 SPⅡ를 처리한 실험군에서는 농도의존적으로 G2/M 기에 해당되는 세포가 유의적으로 증가하였다. CSP군에서는 0.5㎎/mL 농도군 (20.40%)에서 4㎎/mL의 농도군(23.05%)으로 그 비율이 점차 증가하였고, SPⅠ군에서도 18.32%부터 37.77%로 유의적으로 증가하였다. SPⅡ군도 21.33%에서 34.61%로 농도의존적으로 증가하였다. 특히 SPⅠ을 4㎎/mL 농도 처리군에서 최고 2.65배로 증가하였다. G2/M 기가 증가함에 따라 상대적으로 G1 기에 해당되는 세포의 빈도는 처리한 농도가 높을수록 유의적으로 감소하 였고, S 기는 큰 차이를 보이지 않았다. In the control group, 63.16% and 16.82% of the cells belonged to the G1 and S phases, and 14.24% of the cells belonging to the G2 / M phase. However, in the experimental group treated with CSP, SPI or SPII, the cells corresponding to the G2 / M phase increased significantly in a concentration-dependent manner. In the CSP group, the proportion gradually increased from 0.5 mg / mL concentration group (20.40%) to 4 mg / mL concentration group (23.05%) and significantly increased from 18.32% to 37.77% in SPⅠ group. The SP II group also increased concentration-dependently from 21.33% to 34.61%. In particular, SPI increased up to 2.65-fold in the 4 mg / mL concentration treatment group. As the G2 / M phase increased, the frequency of cells corresponding to the G1 phase decreased significantly as the treated concentration increased, and the S phase showed no significant difference.
이러한 G2/M 기 진행 억제 현상은 시료를 48시간 처리한 후 세포 주기를 분석한 표 5에서도 확인할 수 있었다. 도 7에서와 같이 히스토그램에서도 농도가 높아질수록 G2/M 기에 해당하는 두 번째 피크가 더 굵어지는 것을 확인할 수 있으며, 대조군이 7.74%인 것에 비해, CSP군은 4㎎/mL 농도군에서 19.31%로 2.5배 증가하였고, 같은 농도에서 SPⅠ군 (21.36%)이 2.7배, SPⅡ군 (29.64%)이 3.8배로 증가하였다. Such G2 / M phase progression inhibition was also confirmed in Table 5 after analyzing the cell cycle after 48 hours of treatment. In the histogram, as shown in FIG. 7, as the concentration increases, the second peak corresponding to the G2 / M phase becomes thicker, and the CSP group is 19.31% in the 4 mg / mL concentration group, compared to 7.74% in the control group. At the same concentration, the SPI group (21.36%) was 2.7 times, and the SPII group (29.64%) was 3.8 times.
<표 5> TABLE 5
48 시간 동안 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리한 HT-29 세포의 세포 주기 분포Cell cycle distribution of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII for 48 hours
상기 결과는 총 처리 세포의 %로 나타냄.The results are expressed in% of total treated cells.
데이터는 평균 ± SD (n=6)로 나타냄.Data represented as mean ± SD (n = 6).
* p<0.05에서 대조군과 유의적으로 차이가 있음. * significantly different from control at p <0.05.
실험예 4 : 함초 다당체 처리에 의한 세포주기 관련 단백질의 mRNA 발현율 분석Experimental Example 4 Analysis of mRNA Expression of Cell Cycle-Related Proteins by Treatment of Seaweed Polysaccharides
실험예 4-1 : 함초 다당체가 Cyclin 및 Cdks의 발현에 미치는 영향Experimental Example 4-1: Effect of Seaweed Polysaccharide on the Expression of Cyclin and Cdks
암세포 주기 분석의 결과에서 도출된 G2/M 진행 억제가 암세포 증식 억제와 관련이 있으므로 G2/M 기 조절 관련 cyclins 및 Cdks의 mRNA 발현정도를 RT-PCR을 통해 알아보았다. 이 때 GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였으며, 이전 실험에서 가장 효과가 좋았던 4㎎/mL의 농도로 시료를 첨가한 후 24시간 배양한 뒤에 총 RNA를 추출하고 유전자 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.Inhibition of G2 / M progression from cancer cell cycle analysis was related to the inhibition of cancer cell proliferation, and the mRNA expression of cyclins and Cdks related to G2 / M phase regulation was examined by RT-PCR. At this time, GAPDH was used as an internal control, and the sample was added at a concentration of 4 mg / mL, which was the most effective in the previous experiment, and after 24 hours of incubation, total RNA was extracted and RT-PCR was performed using gene specific primers. It was.
도 8의 RT-PCR의 결과에서 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 CSP, SPⅠ와 SPⅡ를 첨가한 실험군에서 Cyclin A와 Cyclin B1의 전사수준에서 발현이 감소되었다. Cyclin D1에서의 발현율은 대조군과 실험군 사이에서 큰 차이를 보이지 않았지만, Cyclin E에서는 대조군에 비해 CSP를 첨가한 실험군에서는 증가하였고, SPⅠ와 SPⅡ를 첨가한 실험군에서는 대조군보다 약간 더 증가된 모습을 확인할 수 있었다. As shown in the results of RT-PCR of FIG. 8, the expression level of Cyclin A and Cyclin B1 was decreased in the experimental group to which CSP, SPI and SPII were added as compared to the control group. The expression rate of Cyclin D1 was not significantly different between the control group and the experimental group, but in the Cyclin E group, the CSP group was increased compared to the control group, and the experimental group with SPI and SPII was slightly increased than the control group. there was.
Cdks의 mRNA 발현 정도는 도 9에서 확인할 수 있는데, Cdc 2는 대조군에 비해 실험군에서 약한 활성을 보였고, Cdk 2는 대조군과 실험군에서 큰 차이를 보이지 않았다. Cdk 4는 대조군과 CSP군에서는 비슷한 정도의 전사 수준을 나타내었고, SPⅠ와 SPⅡ에서는 전사수준에서의 증가되는 모습을 나타내었다. Cdk 6은 대조군과 실험군에서 모두 약한 발현을 보였다. The mRNA expression level of Cdks can be confirmed in FIG. 9, where
실험예 4-2 : 함초 다당체가 p53 및 p21의 발현에 미치는 영향Experimental Example 4-2: Effect of Seaweed Polysaccharide on the Expression of p53 and p21
세포 증식 억제 인자에 해당되는 유전자 중 세포 주기와 밀접한 관계를 가지는 종양억제 유전자 p53과 Cdk 저해제 p21의 발현에 함초의 추출물 및 다당체가 미치는 영향을 알아보았다. 도 10에서 볼 수 있듯이 p53과 p21은 대조군에 비해 모두 발현이 증가되었으며, 특히 CSP에 비해 SPⅠ과 SPⅡ가 더 뚜렷하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다. Among the genes corresponding to cell proliferation inhibitors, the effects of extracts and polysaccharides of seaweed on the expression of tumor suppressor genes p53 and Cdk inhibitor p21, which are closely related to the cell cycle, were investigated. As can be seen in Figure 10 p53 and p21 was both increased expression compared to the control, in particular SP I and SPII it was confirmed that more distinctly increased.
도 1은 함초로부터 다당체를 정제하는 과정을 개략적으로 나타낸 공정도이다. 1 is a process diagram schematically showing a process for purifying polysaccharides from seaweed.
도 2는 함초 다당체 추출물의 겔투과 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the gel permeation chromatography results of seaweed polysaccharide extract.
도 3은 HT-29 세포에 대한 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ의 세포 생존력 효과를 나타낸 그래프이다.3 is a graph showing the cell viability effect of CSP, SPI or SPII on HT-29 cells.
도 4는 24 시간 동안 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리한 HT-29 세포의 아폽토시스 사멸에 대한 유세포분석 결과를 나타낸 도이다.Figure 4 shows the results of flow cytometry for apoptosis killing of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII for 24 hours.
도 5는 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리된 HT-29 세포의 아폽토시스 사멸에 대한 유세포분석 결과를 나타낸 도이다. Figure 5 shows the results of flow cytometry for apoptosis killing of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII.
도 6은 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리된 HT-29 세포의 세포 주기 분포에 대한 유세포분석 결과를 나타낸 도이다. Figure 6 is a diagram showing the results of flow cytometry for cell cycle distribution of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII.
도 7는 상이한 농도의 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리된 HT-29 세포의 세포 주기 분포에 대한 유세포분석 결과를 나타낸 도이다. Figure 7 shows the results of flow cytometry for cell cycle distribution of HT-29 cells treated with different concentrations of CSP, SPI or SPII.
도 8은 HT-29 세포에서 cyclins의 전사 수준에 대한 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ의 효과를 나타내는 도이다.Figure 8 shows the effect of CSP, SPI or SPII on the transcription level of cyclins in HT-29 cells.
도 9는 HT-29 세포에서 Cdks의 전사 수준에 대한 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ의 효과를 나타낸 도이다.9 is a diagram showing the effect of CSP, SPI or SPII on the transcription level of Cdks in HT-29 cells.
도 10은 CSP, SPⅠ 또는 SPⅡ로 처리한 HT-29 세포에서 Cdk 저해인자 p53 및 p21의 유도 결과를 나타낸 도이다.10 is a diagram showing the results of induction of Cdk inhibitors p53 and p21 in HT-29 cells treated with CSP, SPI or SPII.
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