KR20100094119A - Producing method for yolk powder having a immuneantibody of duck disease and yolk powder using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 오리 질병에 대한 치료 및 예방 효과를 가지는 조성물에 대한 것으로, 특히 오리 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말의 생산방법과 상기한 면역항체를 포함하는 난황분말에 대한 것이다. 더욱 상세하게는, 오리 질병에 대한 항원을 면역제제로 제조하여 산란계에 접종하고, 그로부터 얻은 알(egg)의 난황을 이용하여 오리 질병에 유용한 난황분말을 제공하는 것이다. The present invention relates to a composition having a therapeutic and prophylactic effect on duck disease, and in particular, to a method for producing egg yolk powder containing an immune antibody against duck disease, and to an egg yolk powder containing the above-described immune antibody. More specifically, an antigen for duck disease is prepared as an immunologic agent and inoculated in a laying hen, and egg yolk obtained from the egg (egg) is used to provide egg yolk powder useful for duck disease.
일반적으로 동물들은 각종 질병으로부터 자기를 보호하기 위하여, 어떤 병원체에 감염된 후 회복되면서 면역기능을 발휘한다. 또한, 질병을 앓지 않고 면역기능을 갖도록 만들기 위해서, 특정 병원균으로 예방약을 제조하여 인위적으로 접종함으로써 면역을 얻게 할 수도 있고, 외부에서 이미 만들어진 면역물질을 체내에 주입시켜서 유사한 효력을 얻게 할 수도 있다.In general, animals are immune from being recovered after being infected by a pathogen in order to protect themselves from various diseases. In addition, in order to have an immune function without suffering from diseases, a prophylactic agent may be prepared by artificially inoculating a specific pathogen, and immunization may be obtained by artificially inoculating, or similar effects may be obtained by injecting an already-prepared immune substance into the body.
그 중에서 오리의 경우, 집단 사육으로 인해 어린 일령에서부터 다수의 병원체에 노출되어 있고, 질병에 대한 저항력도 떨어져 많은 질병이 복합적으로 감염되기 쉽다. 일부 어린 일령에서는 모체이행 항체의 결여로 질병에 대한 저항력이 약해 각종 질병에 대한 방어능력이 현격히 떨어져 폐사되는 경우도 발생한다. Among them, ducks are exposed to a large number of pathogens from young age due to breeding, and the resistance to disease is low, and many diseases are easily infected. In some younger ages, the lack of maternal transfer antibodies results in weaker resistance to disease, resulting in a marked loss of defense against various diseases.
오리에 대한 주요 질병원으로는 오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균증 및 살모넬라 감염증 등을 들 수 있으며, 현재 일반적으로는 상기 질병원에 대한 백신, 항생제, 설파제 등을 사용하여 오리 질병을 치료 및 예방하고 있다. The main disease sources for ducks include duck viral hepatitis, duck sepsis, E. coli and Salmonella infections. Currently, vaccines, antibiotics, sulfa drugs, etc. for the disease agents are used to treat and prevent duck disease. Doing.
그러나, 상기한 백신, 항생제, 설파제 등만으로는 오리의 질병을 조기에 효과적으로 치료 및 예방할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 백신이나 항생제를 과다하게 사용함으로써 수 많은 부작용이 나타나고 있다. 이에 따라, 오리의 질병을 치료하고 예방하기 위한 새로운 차원의 연구가 절실히 필요한 실정이다.However, there is a problem that the above vaccine, antibiotics, sulfa drugs and the like cannot effectively treat and prevent duck disease early. In addition, many side effects are caused by excessive use of vaccines and antibiotics. Accordingly, a new level of research is urgently needed to treat and prevent duck disease.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 오리의 주요 질병을 치료하고 예방할 수 있도록, 오리 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말의 생산방법과 상기한 면역항체를 포함하는 난황분말을 제공하는 것이 목적이다. The present invention for solving the above problems is to provide a method for producing an egg yolk powder containing an immune antibody against duck disease, and to provide an egg yolk powder containing the above-described immune antibody so as to treat and prevent a major disease of ducks. Purpose.
특히, 오리의 주요 질병인 오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균증 및 살모넬라 감염증에 대한 각각의 항원을 하나의 면역제제로 제조하여 산란계에 접종하고, 그로부터 얻은 알(egg)의 난황을 이용하여, 오리의 주요 질병을 한번에 예방 및 치료할 수 있는 효과를 가지는 난황분말을 제공하는 것이다. In particular, the respective antigens for duck's major diseases, duck viral hepatitis, duck sepsis, E. coli and Salmonella infection, are prepared with one immunologic agent and inoculated in laying hens, and egg (egg) obtained from the egg, It is to provide an egg yolk powder having the effect of preventing and treating major diseases at once.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 오리를 감염시킬 수 있는 다수의 서로 다른 전염성 질병에 대한 항원을 각각 준비하는 단계; 상기 준비된 항원들과 유성면역증강제(oil adjuvant)를 혼합하여 면역형성용 항원을 제조하는 단계; 상기 제조된 면역형성용 항원을 산란계에 접종하는 단계; 상기 산란계로부터 알(egg)을 수거하는 단계; 및, 상기 수거한 알로부터 난황을 채취하고, 상기 채취한 난황을 분말로 제조하는 단계;를 포함하는 오리 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말의 생산방법이다. The present invention for achieving the above object, comprising the steps of preparing an antigen for each of a number of different infectious diseases capable of infecting ducks; Preparing an antigen for immunization by mixing the prepared antigens with an oil adjuvant; Inoculating the prepared immune-forming antigen into a laying hen; Collecting eggs from the laying hens; And collecting the yolk from the collected eggs and preparing the yolk as a powder. The method of producing an yolk powder containing an immune antibody against duck disease, comprising: a.
즉, 본 발명은 오리 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말의 생산방법 및 이에 따른 난황분말에 대한 것으로, 특히 오리 질병에 대한 항원을 면역제제로 제조하여 산란계에 접종하고, 그로부터 얻은 알(egg)의 난황을 이용하여 오리 질병에 유용한 난황분말을 제공하는 것이다. That is, the present invention relates to a method for producing egg yolk powder containing an immune antibody against duck disease and to egg yolk powder according to the present invention. In particular, an antigen for duck disease is prepared as an immunologic agent and inoculated into a laying hen, and the egg obtained from the egg (egg). Egg yolk is used to provide yolk powder useful for duck disease.
본 발명자들은 오리의 주요 질병인 오리 바이러스성 간염(Duck virus hepatitis: DVH), 오리 패혈증(Rimeriella anatipestifer), 대장균(Escherichia coli) 증 및 살모넬라(Salmonellosis) 감염증을 예방 및 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 연구한 결과, 상기 질병에 대한 다수의 항원들과 광물성 기름 첨가제인 Oil adjuvant를 혼합하여 면역제제를 제조하고, 이것을 산란계에 접종하여 얻은 난황의 분말이 상기 질병의 예방 및 치료에 효과적인 것을 알게되어 본 발명을 완성하였다. The inventors are the main diseases of duck viral hepatitis in ducks: research to develop (Duck virus hepatitis DVH), duck septicemia (Rimeriella anatipestifer), E. coli (Escherichia coli) increases and Salmonella (Salmonellosis) substances in the infection prevention and cure As a result, a mixture of a plurality of antigens for the disease and the oil adjuvant, a mineral oil additive, was prepared to prepare an immunologic agent, and it was found that the powder of egg yolk obtained by inoculating it in laying hens was effective for the prevention and treatment of the disease. Was completed.
본 발명은 오리 전염성 질병의 항원을 면역시킨 닭으로부터 얻어낸 계란의 난황(Ylok)을 주성분으로 하고, 이에 따라 오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균 및 살모넬라 감염증 등에 대한 면역항체를 함유하는 난황분말을 얻을 수 있으며, 이러한 면역 난황항체 분말은 기존 사료에 혼합(사료첨가제) 또는 보조 사료로 오리에 급여함으로써 오리의 전염성 질병을 예방 및 치료하는 효과를 가진다.The present invention is based on the egg yolk (Ylok) obtained from chickens immunized with the antigen of duck infectious disease, thereby obtaining egg yolk powder containing immune antibodies against duck viral hepatitis, duck sepsis, E. coli and Salmonella infection The immune yolk antibody powder may be mixed with an existing feed (feed additive) or fed to the duck as a supplementary feed to prevent and treat infectious diseases of the duck.
이러한 본 발명에 따른 난황분말의 생산방법에서, 상기 다수의 서로 다른 전염성 질병은, 오리 바이러스성 간염(Duck virus hepatitis: DVH), 오리 패혈 증(Rimeriella anatipestifer), 대장균(Escherichia coli)증 및 살모넬라(Salmonellosis) 감염증인 것을 실시예로 하였지만, 상기 질병은 오리의 주요 질병원을 예시한 것일뿐 본 발명이 여기에 제한되지 않고 오리에게 전염되거나 발병할 수 있는 모든 종류의 질병에 동일하게 적용될 수 있음은 이 기술분야의 당업자에게 명백하다.In the production method of egg yolk powder according to the present invention, the plurality of different infectious diseases are Duck virus hepatitis (DVH), Rimeriella anatipestifer , Escherichia coli and Salmonella ( Salmonellosis ) is an example of an infection, but the disease is merely an example of a major disease source of ducks, the present invention is not limited thereto and may be equally applicable to all kinds of diseases that can be transmitted or developed in ducks. It will be apparent to those skilled in the art.
그리고, 상기 면역형성용 항원을 제조하는 것은, 상기 오리 바이러스성 간염 항원 8중량%, 오리 패혈증 항원 6중량%, 대장균 항원 6중량%, 살모넬라 감염증 항원 10중량% 및 유성면역증강제(oil adjuvant) 70중량%를 혼합하여 제조된 것이 더욱 바람직한데, 이것이 오리 바이러스성 간염의 역가상 함량을 고려하여 다른 질병원에 대한 항원과 함께 하나의 면역제제를 만들때 최적으로 적합한 면역능력을 가지게 할 수 있는 비율임을 확인하였다.The antigen for antigen formation is 8% by weight of duck viral hepatitis antigen, 6% by weight of duck sepsis antigen, 6% by weight of E. coli antigen, 10% by weight of Salmonella infectious antigen and oil adjuvant 70 It is more preferable to prepare by mixing the weight percent, which is the ratio that can be optimally suited for making one immunologic with antigens against other disease agents considering the titer content of duck viral hepatitis It was confirmed that.
또한, 상기 오리 패혈증 항원, 대장균 항원 및 살모넬라 감염증 항원은, 각각의 배양된 균체에 대하여 Spectrophotometer로 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값이 1.2인 항원인 것이 가장 바람직한데, 본 발명자는 이것이 상기 3가지 질병에 대한 항원을 만들때 최적으로 적합한 세균수의 적정치임을 알 수 있었다. In addition, the duck sepsis antigen, E. coli antigen and Salmonella infectious antigen is most preferably an antigen having an OD (Optical density) value of 1.2 at a wavelength of 410 nm with a spectrophotometer for each cultured cells, the present inventors It was found that the optimal number of bacteria was optimal when making antigens for eggplant disease.
이어서, 상기한 난황분말의 생산방법에서, 상기 면역형성용 항원을 산란계에 접종하는 것은, 상기 면역형성용 항원을 3주 간격으로 3차례 접종하는 것이 가능하다. 즉, 1차로 접종하고, 그로부터 3주 후에 2차 접종, 그로부터 3주후에 3차 접종을 수행하는 것이며, 이렇게 일정한 시간간격을 두고 다수 접종하는 것이 산란계에서의 면역반응을 효과적으로 이루어지게 한다. Subsequently, in the production method of the egg yolk powder, inoculation of the antigen for immunization into a laying hen can be inoculated three times at three week intervals. That is, the first inoculation, the second inoculation three weeks after that, and the third inoculation three weeks after that, and the multiple inoculation at regular intervals in this way to effectively effect the immune response in laying hens.
또한, 상기 채취한 난황을 분말로 제조하는 것은, 분무건조기(Spray dryer)를 이용하여 디스크 및 노즐형태의 분무방법으로 상기 난황의 수분을 건조시키는 것일 수 있다. 나아가, 상기한 난황분말의 생산방법에서, 상기 채취한 난황을 분말로 제조하는 것은, 상기 난황을 영하의 제1온도로 급속 동결시키고, 상기 제1온도보다 더 낮은 제2온도에서 진공상태로 상기 난황의 수분을 건조시키는 것도 가능하다. In addition, manufacturing the collected egg yolk as a powder may be to dry the moisture of the yolk by a spray method in the form of a disk and a nozzle using a spray dryer. Further, in the method of producing the yolk powder, preparing the sampled yolk powder may rapidly freeze the yolk yolk to a sub-zero temperature, and in a vacuum at a second temperature lower than the first temperature. It is also possible to dry the moisture of egg yolk.
상술한 바에 따라, 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 난황분말의 생산방법에 의해 생산되어, 다수의 서로 다른 전염성 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말일 수 있다. 또한, 본 발명은 오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균 및 살모넬라 감염증에 대한 면역항체를 함유하는 난황분말도 가능하다. 이러한 본 발명에 따른 난황분말은 오리와 관련된 다수의 서로 다른 질병을 효과적으로 그리고 간단하게 치료하고 예방할 수 있도록 해준다. As described above, another embodiment of the present invention may be an egg yolk powder produced by the above-described method for producing yolk powder, containing an immune antibody against a plurality of different infectious diseases. In addition, the present invention is also capable of egg yolk powder containing immuno-antibodies against duck viral hepatitis, duck sepsis, Escherichia coli and Salmonella infection. The yolk powder according to the present invention enables to effectively and simply treat and prevent a number of different diseases associated with ducks.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다. Specific details of other embodiments are included in the detailed description and the drawings.
상기한 본 발명은 오리 질병에 대한 면역항체가 함유된 난황분말의 생산방법과 상기한 면역항체를 포함하는 난황분말을 제공하여, 오리의 주요 질병을 효과적으로 그리고 간단하게 치료하고 예방할 수 있도록 해준다. The present invention as described above provides a method for producing yolk powder containing an immune antibody against duck disease and an egg yolk powder comprising the above-described immuno-antibody, thereby effectively and simply treating and preventing the main diseases of ducks.
특히, 오리의 주요 질병인 오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균증 및 살모넬라 감염증에 대한 각각의 항원을 하나의 면역제제로 제조하여 산란계에 접종하고, 그로부터 얻은 알(egg)의 난황을 이용하여, 오리의 다양한 주요 질병을 예방 및 치료할 수 있는 효과를 가지는 난황분말을 제공할 수 있다. In particular, the respective antigens for duck's major diseases, duck viral hepatitis, duck sepsis, E. coli and Salmonella infection, are prepared with one immunologic agent and inoculated in laying hens, and egg (egg) obtained from the egg, It can provide yolk powder having the effect of preventing and treating a variety of major diseases.
나아가, 본 발명에 따른 난황분말은 오리의 일반사료에 간단하게 혼합하여 공급할 수 있고, 이에 따라 종래의 백신, 항생제 및 설파제의 사용을 대체할 수 있는 새로운 차원의 오리 질병 예방 및 치료제일 수 있다. Furthermore, the yolk powder according to the present invention can be simply mixed and supplied to the general feed of ducks, and thus can be a new level of duck disease prevention and treatment that can replace the use of conventional vaccines, antibiotics and sulfa agents.
이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, one preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The invention may be better understood by the following examples, which are intended for purposes of illustration of the invention and are not intended to limit the scope of protection defined by the appended claims.
실시예 1 : 오리 질병의 면역항체가 포함된 난황분말의 생산 Example 1 Production of Egg Yolk Powder Containing Immune Antibody for Duck Disease
실시예 1-1 : 오리 질병 원인체의 항원 제조Example 1-1 Antigen Preparation of Duck Disease Cause Agents
(1) 오리 바이러스성 간염(DVH) 항원 제조(1) Duck Viral Hepatitis (DVH) Antigen Preparation
가. 바이러스 증식end. Virus propagation
동결건조 후 -80℃에서 보관중인 오리 간염바이러스(DRL62)를 10일령 Specific pathogen free(SPF) 발육란의 장뇨막강에 0.2㎖씩 접종하여 37℃에서 3~4일 배양하였다.After lyophilization, duck hepatitis virus (DRL62) stored at −80 ° C. was inoculated with 0.2 ml of the intestinal ganglia of 10-day-old Specific pathogen free (SPF) embryonated eggs and incubated at 37 ° C. for 3-4 days.
나. 바이러스 채독I. Virus poisoning
상기와 같이 37℃에서 배양하면서 매일 검란하여 계태아가 죽을 무렵 계태아 머리를 제외한 몸통을 채취하였다.As above, while incubating at 37 ° C. every day, at the time of dying, the trunk was collected except the head of the chick.
다. 바이러스의 불활화All. Inactivation of the virus
상기와 같이 채취한 계태아의 몸통을 20% Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 유제하여 바이러스를 회수하였다. 회수한 바이러스에 포르말린을 0.1%가 되도록 가하여 실온에서 24시간 동안 불활화시킨 다음 5,000rpm에서 20분간 고속으로 원심분리하였고, 그 결과물을 감염된 바이러스로 사용하였다.The virus was recovered by emulsifying the trunk of the chick embryo collected as above with 20% Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS). Formalin was added to the recovered virus at 0.1%, inactivated at room temperature for 24 hours, and then centrifuged at 5,000 rpm for 20 minutes at high speed, and the resultant was used as an infected virus.
라. 바이러스 역가검사la. Virus titer test
불활화전 감염된 계태아의 몸통을 유제한 바이러스의 역가를 검사하기 위하여, 상기 바이러스를 101.0~108.0까지 10진법으로 희석하고 10일령의 SPF 발육계란의 장뇨막강 내에 0.1㎖씩 접종하였으며, 37℃에서 5일간 배양하면서 폐사수를 측정하였다. 그리고, 생존한 계태아의 경우 오리 바이러스성 간염 특이 병변인 계태아 부종 및 위축, 간에 괴사소형성 등의 병변을 고려하여 바이러스 감염 유무를 확인하였고, Reed & Munch 방법에 따라 감염가를 EID50(50% Egg infective dose)로 계산한 결과, 바이러스 역가는 ㎖당 107.5EID50이었다.In order to test the titer of virus contaminating the torso of infected embryos before inactivation, the virus was diluted by 10 to 10 1.0 to 8.0 and inoculated 0.1 ml in the urinary membrane cavity of 10-day-old SPF embryonated eggs at 37 ° C. The mortality was measured while culturing for 5 days at. In the case of surviving chick embryos, the presence of viral infection was checked by considering viral edema and atrophy of duck viral hepatitis-specific lesions, and necrotic liver formation. Liver embryos were infected with EID 50 (50). The virus titer was 10 7.5 EID 50 per ml as calculated by% Egg infective dose.
(2) 오리 패혈증 항원 제조(2) Duck Sepsis Antigen Preparation
가. 종균배양end. Spawn culture
동결건조 후 -80℃에서 보관중인 오리 패혈증인 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)균주를 Sheep blood agar 배지에 이식하여 37℃에서 24시간 배양했다. After freeze drying, Rimerella anatifestifer, a duck sepsis, stored at -80 ° C (Rimeriella anatipestiferThe strain was transplanted into Sheep blood agar medium and incubated at 37 ° C for 24 hours.
나. 본 배양I. Present culture
상기 배양한 배지에서 오리 패혈증의 전형적인 단독집락을 선택하였고, 이것을 Brain heart infusion broth 배지에 Sodium bicarbonate 첨가하여 제조한 배지에 이식한 후 37℃에서 30시간 진탕배양 했다.A typical single colony of duck sepsis was selected from the culture medium, which was transplanted into a medium prepared by adding Sodium bicarbonate to Brain heart infusion broth medium, followed by shaking culture at 37 ° C. for 30 hours.
다. 채균 및 처리All. Sterilization and Processing
37℃에서 30시간 진탕배양한 감염 배양액에 0.3% 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 농축된 배양균체를 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였으며, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 냉실(5℃)에서 보존하였다.0.3% formalin was added to the infected culture medium shaken at 37 ° C for 30 hours, inactivated, and concentrated. Then, the concentrated culture cells were centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes, and cells were collected by Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS). After the collected cells were washed twice, the OD (Optical density) value was measured at a wavelength of 410 nm using a spectrophotometer and then stored in a cold room (5 ° C.).
(3) 대장균((3) Escherichia coli ( E. coliE. coli ) 항원 제조A) antigen production
가. 종균배양end. Spawn culture
동결건조 후 -80℃에서 보관중인 078균주를 Sheep blood agar 배지에 이식하여 37℃에서 20시간을 배양했다.After lyophilization, strain 078 stored at −80 ° C. was transplanted into Sheep blood agar medium, and cultured at 37 ° C. for 20 hours.
나. 본 배양I. Present culture
상기 배양한 배지에서 대장균의 전형적인 단독 집락을 선택하여 Brain heart infusion broth 배지에 이식하고 37℃에서 18시간 진탕 배양했다.A typical single colony of Escherichia coli was selected from the cultured medium, transplanted into Brain heart infusion broth medium, and cultured with shaking at 37 ° C for 18 hours.
다. 채균 및 처리All. Sterilization and Processing
37℃에서 18시간 진탕 배양 감염 배양액에 0.3% 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 농축된 배양균체를 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고, Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 측정한 후 냉실(5℃)에서 보존하였다.Incubated with 0.3% formalin for 18 hours at 37 ℃ shake culture infected culture was inactivated and concentrated, and the cells were collected by centrifugation of the concentrated culture cells at 5,000 rpm for 30 minutes, collected by Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS) After washing the cells twice, the OD (Optical density) value was measured at a wavelength of 410nm by using a spectrophotometer and stored in a cold room (5 ℃).
(4) 살모넬라((4) Salmonella ( SalmonellaSalmonella )항원 제조Antigen production
가. 종균배양end. Spawn culture
동결건조 후 -80℃에서 보관중인 S. pullorum, S. gallinarium, S. enteritidis 균주를 각각 Sheep blood agar 배지에 이식하여 37℃에서 20시간 각각 배양했다.After lyophilization , S. pullorum, S. gallinarium, and S. enteritidis strains stored at −80 ° C. were transplanted into Sheep blood agar medium and incubated at 37 ° C. for 20 hours.
나. 본 배양I. Present culture
상기 배양한 배지에서 S. pullorum, S. gallinarium, S. enteritidis 균의 전형적인 단독 집락을 선택하여 Brain heart infusion broth 배지에 각각 이식하고 37℃에서 20시간 진탕 배양했다.In the culture medium, typical single colonies of S. pullorum, S. gallinarium and S. enteritidis were selected and transplanted into Brain heart infusion broth medium, respectively, and cultured at 37 ° C. for 20 hours.
다. 채균 및 처리All. Sterilization and Processing
37℃에서 18시간 진탕배양한 각각의 감염 배양액에 0.3% 포르말린을 가하여 불활화 시킨 후 농축한 다음, 각각 농축된 배양균체는 5,000rpm에서 30분 원심 분리하여 균체를 수집하고 Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 2회 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 각각 측정한 후 냉실(5℃)에서 보존했다.Inactivated by adding 0.3% formalin to each of the infected culture medium shaken at 37 ℃ for 18 hours, concentrated, and then the concentrated culture cells were centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes to collect the cells and Dulbecco's Phosphate buffered solution ) Were collected twice and then stored in a cold room (5 ° C) after each measurement of OD (Optical density) at a wavelength of 410 nm using a spectrophotometer.
상기 항원을 제조할 때 사용된 Dulbecco's PBS(Phosphate buffered solution)는 1,000㎖ 의 증류수에 NaCl 8.00g, KCl 0.20g, Na2HPO4 1.15g, KH2PO4 0.20g 을 포함시켜 조제하였고, 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 사용하였다.Dulbecco's Phosphate buffered solution (PBS) used to prepare the antigen was prepared by including 8.00 g of NaCl, 0.20 g of KCl, 1.15 g of Na 2 HPO 4 , and 0.20 g of KH 2 PO 4 in 1,000 ml of distilled water, and 121 ° C. Autoclaved for 15 minutes at
실시예 1-2 : 면역형성용 항원 생산Example 1-2 Antigen Production for Immunogenesis
상기 실시예 1-1에 따라 제조한 질병 원인체 각각의 항원을 이용하여, 면역형성용 항원을 생산하였다. 즉, 오리 바이러스성 간염의 역가가 107.5ELD50/인 항원 8%, 오리 패혈증, 대장균 및 살모넬라균은 Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값을 각각 측정하여 O.D값 1.2로 조정한 오리패혈증 항원 6%, 대장균 항원 6%와 살모넬라 항원 10%를 각각 혼합하고, Oil adjuvant (Montnide ISA70) 70%를 가하여 잘 혼합한 다음, 15,000rpm에서 5분간 Homogenizer를 이용하여 면역형성용 항원을 생산하였다.Antigens for immunization were produced using the antigens of the disease agent prepared according to Example 1-1. In other words, 8% antigen of duck viral hepatitis 10 7.5 ELD 50 /, duck sepsis, Escherichia coli and Salmonella were adjusted to the OD value 1.2 by measuring the OD (Optical density) value at a wavelength of 410 nm using a spectrophotometer. Mix 6% of the duck sepsis antigen, 6% of the E. coli antigen, and 10% of the Salmonella antigen, add 70% of the oil adjuvant (Montnide ISA70), mix well, and then use the Homogenizer for 5 minutes at 15,000 rpm. Produced.
실시예 1-3 : 면역형성용 항원을 산란계에 접종Example 1-3: Inoculation of Immunogenic Antigens into Laying Hens
상기 실시예 1-2에 따라 생산한 면역형성용 항원을 19주령의 산란계(닭)에 마리당 0.8㎖씩 앞가슴 근육에 1차로 접종하고, 2차 접종은 1차 접종 3주후, 3차 접종은 2차 접종 3주후에 근육에 각각 접종하였으며, 그 이후 항원접종은 3개월 단위로 추가 접종하였다.Immunogenic antigens produced according to Example 1-2 were firstly inoculated into the breast muscle at 0.8 ml per horse in 19-week-old laying hens (chicken), the second inoculation was 3 weeks after the first inoculation, and the third inoculation was 2 Three weeks after the primary inoculation, the muscles were inoculated respectively, and then the vaccinations were further inoculated every three months.
실시예 1-4 : 계란 수거 및 난황분말의 제조Example 1-4: Egg Collection and Preparation of Egg Yolk Powder
상기 실시예 1-3에 따라 면역형성용 항원을 3차 접종 2주후부터 면역 항체가 형성된 계란을 위생적으로 수거한 후, 150ppm의 차아염소산나트륨을 계란에 분사하 여 깨끗하게 세척한 다음, 건조실에서 계란의 표면을 수분을 완전히 건조시켰다. After 2 weeks after the third inoculation of the immunogenic antigen according to Example 1-3, the eggs with the immune antibody were hygienically collected, and then 150 ppm of sodium hypochlorite was sprayed onto the eggs to clean the eggs, and then in the drying room. The surface of the was completely dried with moisture.
상기와 같이 건조시킨 계란을 할란하여 면역항체가 형성된 계란의 난황 채취한 다음, 분무건조 또는 동결건조 과정을 거쳐서 채취한 난황을 분말로 제조하였다. 즉, 분무건조공정은 분무건조기(Spray dryer)를 이용하는 디스크 및 노즐형태의 분무방법에 따라 면역이 형성된 난황의 수분을 건조시키는 방법으로서, 수분함량이 10%미만의 분말로 건조하여 가공하였다. 또한, 동결건조공정은 채취한 난황을 -40℃로 급속 동결시킨 후 동결건조기(Freeze dryer)의 냉동기 온도가 -80℃가 되었을 때 진공상태 하에서 면역이 형성된 난황의 수분을 건조시키는 방법으로서, 수분함량이 10%미만의 분말로 건조하여 가공하였다. Eggs were dried to obtain egg yolks, and the yolks were collected by spray drying or freeze drying. That is, the spray drying process is a method of drying the moisture of the yolk sac, which is immunized according to the spray method in the form of a disk and a nozzle using a spray dryer, which is dried and processed into a powder having a moisture content of less than 10%. In addition, the freeze-drying process is a method of drying the moisture of the egg yolk immunized under vacuum when the frozen egg yolk is rapidly frozen to -40 ° C and the freezer dryer temperature is -80 ° C. The powder was dried to less than 10% and processed.
실시예 1-5 : 난황 내 면역항체 추출Example 1-5: Immune Antibody Extraction in Egg Yolk
한편, 본 발명자들은 상기 실시예 1-4에 따라 수거한 계란의 난황 내 항체를 추출하였다. 즉, 계란을 수거하여 150ppm의 차아염소산나트륨 용액으로 세척 소독한 후, 이러한 계란의 난황유제액 : pH 4.0의 이온수와의 비율을 5 : 1로 혼합하여 4℃의 냉실에서 24시간 동안 보존한 다음, 8,000rpm에서 20분간 원심 분리 정제하여 난황에 함유된 항체를 추출하였다.On the other hand, the present inventors extracted the antibody in egg yolk of the eggs collected according to Example 1-4. That is, eggs are collected and washed and disinfected with 150 ppm sodium hypochlorite solution, and then the egg yolk emulsion: pH 4.0 is mixed with 5: 1 water and stored in a cold room at 4 ° C. for 24 hours. The antibody contained in egg yolk was extracted by centrifugation and purification at 8,000 rpm for 20 minutes.
실험예 1 : 항원에 대한 항체가 실험Experimental Example 1 Antibodies to Antigen Experiment
산란계에 접종과정을 거친 후 난황에 형성된 병원체에 대한 항체가를 측정하기 위하여, 상기 실시예 1-4에 따라 수거한 계란(오리 바이러스성 간염, 오리 패혈증, 대장균 및 살모넬라 감염증의 항원을 산란계에 3차 접종한 다음, 2주후 면역된 산란계의 계란)을 수득하였고, 난황 내에 형성된 항체의 병원체에 대한 항체가를 중화시험법 및 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA)으로 검사하였다.In order to determine the antibody value against the pathogens formed in egg yolk after inoculating the laying hens, the eggs (duck viral hepatitis, duck sepsis, Escherichia coli and Salmonella infection antigens collected in accordance with Example 1-4 were added to the laying hens). After two weeks of inoculation, the eggs of immunized laying hens were obtained two weeks later, and the antibody titers of the pathogens of the antibodies formed in egg yolk were examined by neutralization assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
실험예 1-1 : 중화시험법Experimental Example 1-1: neutralization test method
중화시험법은 계태아를 이용하여 난황에 바이러스의 양을 변화시켜 바이러스에 대한 항체가 얼마나 있는지 알아보는 방법이다. 실험구로서 바이러스를 1:10배 부터 1:2,048배까지 희석한 희석액 0.4㎖에 본 발명에 따른 상기 난황에서 추출한 추출액을 0.4㎖씩 넣은 후, 37℃에서 1시간 중화한 다음, 10일령의 발육계란에 희석배수별로 5개의 발육계란의 장뇨막강내에 0.1㎖을 각각 접종하였다. 대조구로서는 5개의 발육계란과 같이 37℃에서 7일간 배양하면서 폐사수를 측정하였으며, 생존한 발육계란의 태아가 오리 바이러스성 간염 특이 병변인 계태아 부종 및 위축, 간에 괴사소형성 등의 병변을 고려하여 바이러스 감염 유무를 확인하고 중화지수(meutralization index)로 측정하였다. Neutralization test is to determine how many antibodies to the virus by changing the amount of virus in egg yolk using a fetus. 0.4 ml of the extract extracted from the egg yolk according to the present invention was added to 0.4 ml of the diluted solution diluted from 1:10 to 1: 2,048 times as a test group, and then neutralized for 1 hour at 37 ° C, followed by development of 10 days of age. Eggs were inoculated with 0.1 ml into the urinary membrane of each of the five developing eggs by dilution factor. For control, the mortality was measured by incubating at 37 ° C for 7 days with five embryonated eggs.The embryos of surviving embryonated eggs considered lesions such as chick edema and atrophy, and liver necrosis, which are specific to duck viral hepatitis. The presence of virus infection was confirmed and measured by neutralization index (meutralization index).
그 결과, 면역된 계란의 난황속에 함유된 오리 바이러스성 간염에 대한 중화항체가는 1,280배이었으며 대조구에서는 10배 이하의 항체가를 나타내었다(표 1).As a result, the neutralizing antibody titer for duck viral hepatitis contained in the yolk sac of immunized eggs was 1,280 fold, and the control antibody showed 10-fold or less antibody titer (Table 1).
[표 1 : 오리 바이러스성 간염에 대한 중화항체가] Table 1: Neutralizing Antibodies for Duck Viral Hepatitis
실험예 1-2 : 효소면역측정법(ELISA)Experimental Example 1-2: enzyme immunoassay (ELISA)
효소면역측정법의 기본 원리는 세포와 조직에 존재하는 항원과 그 항원에 특이적인 1차 항체의 결합 상태를 확인하기 위해 효소의 분해작용을 이용하는 방법으로 효소가 발색물질(chromogen)을 분해하여 색깔을 나타나게 함으로써 항체의 결합을 증명하는 방법이다. 즉, microplate내에 흡착된 항원이나 항체 각각의 항원, 항체나 표지물질 등이 결합되도록 반응시킨 후 microplate well내의 발색 정도를 ELISA reder기를 이용하여 읽음으로서 항원, 항체 등의 존재를 확인하는 방법이다. The basic principle of enzyme immunoassay is to use enzyme digestion to check the binding state of antigens in cells and tissues and specific antibodies specific for the antigens. It is a method of demonstrating binding of an antibody by making it appear. In other words, it is a method of confirming the presence of antigen, antibody, etc. by reacting the antigen adsorbed in the microplate or the antigen, antibody or labeling substance of each antibody to be combined, and reading the color development in the microplate well using an ELISA reder.
먼저, 오리 패혈증, 대장균 및 살모넬라균을 배양한 균액을 20,000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하여 각각의 균체를 수거하였고, 상기 균체를 멸균 PBS로 3회 세척한 후 균체 pellet의 최종 단백질 농도가 5㎎/㎖되도록 분주하여 -70℃에 보관했다.First, each cell was harvested by centrifugation of the cells cultured with duck sepsis, E. coli and Salmonella at 20,000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes, and the cells were washed three times with sterile PBS. Aliquoted to 5 mg / mL and stored at -70 ° C.
그리고, 항원을 coting buffer로 희석한 다음 plate well당 100㎕씩 분주하여 제조 한 ELISA용 microplate을 이용하여, 상기 실험예 1-2의 실험구 난황분말과 대조구 난황분말에 대하여 발색 정도를 측정한 결과, 오리 패혈증은 1,280배 이상의 항체가를, 대장균은 2,560배, 살모넬라 감염증은 1,280~2,560배 이상의 항체가를 각각 나타내었으며, 감염을 시키지 않은 대조 계란의 난황에서는 10배 이하의 항체가를 나타내었다(표 2).Then, using the ELISA microplate prepared by diluting the antigen with a coting buffer and then dispensing 100 μl per plate well, the color development of the yolk powder and the yolk powder of Experimental Example 1-2 were measured. , Duck sepsis showed antibody titer of 1,280 times or more, Escherichia coli showed 2,560 times, and Salmonella infection showed 1,280 ~ 2,560 times or more, respectively. Table 2).
[표 2 : 패혈증, 대장균, 살모넬라에 대한 ELISA항체가]Table 2: ELISA Antibodies to Sepsis, Escherichia Coli, and Salmonella
실험예 2 : 난황분말의 질병원에 대한 효능 및 효과 실험Experimental Example 2 Test of efficacy and effect of egg yolk powder on disease agent
실험예 2-1 : 오리 바이러스성 감염에 대한 효능 실험Experimental Example 2-1: Efficacy test on duck viral infection
본 발명에 따른 난황분말이 오리 바이러스성 감염의 항원에 대한 감염 예방 및 치료 효과를 증대시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 실험군으로서 일반사료에 상기 실시예 1-4에 따라 준비된 난황항체분말을 0.5%첨가한 혼합사료를 준비하였고, 대조군으로는 일반사료를 준비하였다. 준비된 각각의 사료를 3일령 오리 100마리에 14일간 1일 2회 각각 급여하고, 임상관찰 하였다. In order to confirm whether the yolk powder according to the present invention can increase the infection prevention and treatment effect against the antigen of duck viral infection, 0.5% of the yolk antibody powder prepared according to Example 1-4 in the general feed as an experimental group Added mixed feed was prepared, and normal feed was prepared as a control. Each prepared feed was fed to 100 three-day-old ducks twice daily for 14 days and clinically observed.
그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 실험군 100마리 중에서 갑자기 침울하게 되고 한쪽으로 쓰러지며 머리와 목을 떨고 발버둥치는 등의 신경증상을 보인 오리는 28마리, 기침과 재채기증상은 22마리, 녹색 설사를 보인 19마리와 눈과 비강에서 분비물이 나온 26마리 등의 임상증상을 나타내었으며, 복합적인 질병 감염으로 17마리는 폐사하였다. 대조군에서도 갑자기 침울하게 되고 한쪽으로 쓰러지며 머리와 목을 떨고 발버둥치는 등의 신경증상을 보인 오리는 51마리, 기침과 재채기증상은 42마리, 녹색 설사를 보인 37마리와 눈과 비강에서 분비물이 나온 46마리 등 실험군에 비해 더욱 악화된 임상증상을 나타내었으며, 이 중 복합적인 질병 감염으로 32마리는 폐사하였다.As a result, as shown in Table 3, among the 100 experimental groups, 28 ducks that suddenly got down and collapsed to one side and showed neurological symptoms such as shaking head and neck, struggling, coughing and sneezing, 22, green Clinical symptoms including 19 diarrhea and 26 secretions from eyes and nasal passages were observed. Seventeen died due to multiple disease infections. In the control group, 51 ducks suddenly fell down and fell to one side, shaking head and neck, struggling, 42 coughs and sneezes, 37 green diarrhea, and secretions from the eyes and nasal passages. The clinical symptoms worsened compared to the experimental group including 46 animals, and 32 of them died due to multiple disease infections.
[표 3 : 오리 바이러스성 감염에 대한 효능 실험 결과] Table 3: Efficacy test results for duck viral infection
division
duck
Payday
Clinical observation
재치기cough,
Wit
(눈,비강)Discharge
(Eyes, nasal passages)
* 증상출현/시험수* Symptoms / Number of Tests
또한, 실험군에서 임상증상을 보이던 오리들은 빠른 회복상태를 보여 본 발명에 따른 난황분말의 효과를 확인할 수 있었고, 일부 폐사한 오리를 부검해서 육안적으로 관찰한 결과, 간과 심장에 섬유소성 삼출물이 출현 된 것을 확인할 수 있었다.In addition, the ducks that showed clinical symptoms in the experimental group showed a rapid recovery state, and confirmed the effect of the yolk powder according to the present invention. As a result of autopsy of some dead ducks, fibrogenic exudate appeared in the liver and heart. It could be confirmed.
실험예 2-2 : 오리 패혈증에 대한 효과 실험Experimental Example 2-2: Effect experiment on duck sepsis
상기 실시예 1-4에 따라 준비된 난황항체분말 0.5%를 일반사료에 첨가한 혼합사료를 3일령의 건강한 오리 300마리에 14일간 1일 2회씩 급여하여 실험군을 준비하였다. The experimental group was prepared by feeding the mixed feed obtained by adding the yolk antibody powder 0.5% prepared according to Example 1-4 to the general feed twice daily for 14 days to 300 healthy ducks of 3 days of age.
그리고, 오리 패혈증인 균주를 Sheep blood agar 배지에 이식하고 37℃에서 24시간 배양한 후, 오리 패혈증의 전형적인 단독집락을 선택하여 Brain heart infusion broth 배지에 Sodium bicarbonate을 첨가해서 제조한 배지에 이식하였고, 이것을 다시 37℃에서 24시간 배양하였다. 이렇게 만들어진 감염 배양액을 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고 PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값이 1.2로 조정된 균 1.0㎖씩을 준비하였다.Then, the duck sepsis strain was transplanted into Sheep blood agar medium and incubated at 37 ° C. for 24 hours, and then a single colony of duck sepsis was selected and transplanted into a medium prepared by adding Sodium bicarbonate to Brain heart infusion broth medium. This was incubated at 37 ° C. for 24 hours. The infected culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes to collect the cells, and the cells collected with PBS (Phosphate buffered solution) were washed, and then the optical density (OD) was adjusted to 1.2 at 410 nm using a spectrophotometer. 1.0 ml each of the prepared bacteria was prepared.
이와 같이 준비된 균을 상기 실험군 오리 300마리 중 100마리의 근육에 접종한 뒤, 14일간 관찰한 결과 28마리가 전형적인 패혈증의 임상증상을 보였으며 나머지 72마리는 생존 내과하였다.Thus prepared bacteria were inoculated into the muscles of 100 of the 300 ducks in the experimental group, and 14 days of observation showed 28 clinical symptoms of typical sepsis and the remaining 72 survived.
실험예 2-3 : 대장균에 대한 효과 실험Experimental Example 2-3: Effect experiment on E. coli
상기 실시예 1-4에 따라 준비된 난황항체분말 0.5%를 일반사료에 첨가한 혼 합사료를 3일령의 건강한 오리 300마리에 14일간 1일 2회씩 급여하여 실험군을 준비하였다. The experimental group was prepared by feeding the mixed feed obtained by adding the yolk antibody powder 0.5% prepared according to Example 1-4 to the general feed twice daily for 14 days to 300 healthy ducks.
그리고, 대장균인 균주를 Sheep blood agar 배지에 이식하고 37℃에서 20시간 배양한 후, 대장균의 전형적인 단독 집락을 선택하여 Brain heart infusion broth 배지에 이식하였고, 이것을 다시 37℃에서 24시간 배양하였다. 이렇게 만들어진 감염 배양액을 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하여 균체를 수집하였고 PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값이 1.2로 조정된 균 1.0㎖씩을 준비하였다.Then, E. coli strains were transplanted into Sheep blood agar medium and incubated at 37 ° C. for 20 hours, and a single colony of E. coli was selected and transplanted into Brain heart infusion broth medium, which was incubated at 37 ° C. for 24 hours. The infected culture solution was centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes to collect the cells, and the cells collected with PBS (Phosphate buffered solution) were washed, and then the optical density (OD) was adjusted to 1.2 at 410 nm using a spectrophotometer. 1.0 ml each of the prepared bacteria was prepared.
이와 같이 준비된 균을 상기 실험군 오리 300마리 중 100마리의 근육에 접종한 뒤, 14일간 관찰한 결과 23마리가 전형적인 패혈증의 임상증상을 보였으며 나머지 77마리는 생존 내과하였다.The bacteria thus prepared were inoculated into the muscles of 100 of the 300 ducks of the experimental group, and after 14 days of observation, 23 showed clinical symptoms of typical sepsis and the remaining 77 survived.
실험예 2-4 : 살모넬라균에 대한 효과 실험Experimental Example 2-4: Effect test on Salmonella
상기 실시예 1-4에 따라 준비된 난황항체분말 0.5%를 일반사료에 첨가한 혼합사료를 3일령의 건강한 오리 300마리에 14일간 1일 2회씩 급여하여 실험군을 준비하였다. The experimental group was prepared by feeding the mixed feed obtained by adding the yolk antibody powder 0.5% prepared according to Example 1-4 to the general feed twice daily for 14 days to 300 healthy ducks of 3 days of age.
그리고, 살모넬라균인 Salmonella pullorum, Salmonella gallinarium, Salmonella enteritidis 균주를 각각 Sheep blood agar 배지에 이식하고 37℃에서 20시간 각각 배양한 후, 상기 균의 전형적인 단독 집락을 선택하여 Brain heart infusion broth 배지에 각각 이식하였고, 이것을 다시 37℃에서 18시간 각각 배양하였다. 이렇게 만들어진 감염배양액을 혼합하여 5,000rpm에서 30분간 원심 분리하고 PBS(Phosphate buffered solution)로 수집된 균체를 세척한 다음, Spectrophotometer를 이용하여 410nm의 파장에서 O.D(Optical density)값이 1.2로 조정된 균 1.0㎖씩을 준비하였다.And Salmonella strains Salmonella pullorum, Salmonella gallinarium, Salmonella enteritidis strains were respectively transplanted in Sheep blood agar medium and incubated at 37 ° C. for 20 hours, respectively, and the typical single colonies of the bacteria were selected and transplanted into Brain heart infusion broth medium, respectively. This was incubated at 37 ° C. for 18 hours each. The infected culture medium was mixed and centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes, and the cells collected with PBS (Phosphate buffered solution) were washed, and the OD (Optical density) was adjusted to 1.2 at 410 nm using a spectrophotometer. 1.0 ml each was prepared.
이와 같이 준비된 균을 상기 실험군 오리 300마리 중 100마리의 근육에 접종한 뒤, 14일간 관찰한 결과 25마리가 전형적인 패혈증의 임상증상을 보였으며 나머지 75마리는 생존 내과하였다.The bacteria thus prepared were inoculated into the muscles of 100 of the 300 ducks of the experimental group, and after 14 days of observation, 25 showed clinical symptoms of typical sepsis and the remaining 75 survived.
상기 실험예 2-2, 2-3, 2-4에 따른 결과, 본 발명에 따른 난황분말은 패혈증에 대하여 72.0%, 대장균에서는 77.0%, 살모넬라에서도 75.0%의 우수한 임상효과를 각각 나타내었다. 또한, 공격접종 7일후부터 병원체에 대한 임상증상을 보이다가 심한경우 폐사하였으며, 임상증상을 보이다 폐사한 오리를 부검하여 육안적으로 관찰한 결과 간과 심장에 섬유소성 삼출물이 출현 된 것을 확인할 수 있었다.As a result of Experimental Example 2-2, 2-3, 2-4, yolk powder according to the present invention showed excellent clinical effects of 72.0% against sepsis, 77.0% in E. coli, 75.0% in Salmonella, respectively. In addition, 7 days after challenge, the pathogen showed clinical symptoms and died in severe cases, and the clinical symptoms showed that fibrotic exudate appeared in the liver and heart.
한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다. On the other hand, while the present invention has been shown and described with respect to certain preferred embodiments, the invention is variously modified and modified without departing from the technical features or fields of the invention provided by the claims below It will be apparent to those skilled in the art that such changes can be made.
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