KR20100082161A - ＲＯＲα를 이용한 항암제 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 RORα를 이용한 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포내 RORα의 인산화(phosphorylation)가 대조구(상기 세포에 상기 잠재적인 물질을 접촉시키지 않은 시험구) 대비 증가하는 것을 확인하는 단계; 및 상기 RORα의 인산화를 증가시키는 상기 잠재성 물질을 항암제로 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
고아핵수용체, RORα, Wnt, 베타-카테닌, 대장암, 인산화, 보조억제인자, 보조활성인자

Description

ＲＯＲα를 이용한 항암제 스크리닝 방법{Screening methods for anticancer agents by using RORα}
Wnt 유전자들은 다양한 신호전달 과정을 매개하는 시스테인(cysteine)이 풍부한 분비 폴리펩티드들로 이루어진 하나의 큰 패밀리(family)를 암호화한다. Wnt 신호전달의 비정상적 활성은 발달 결함 및 종양 형성으로 연결되는 주된 원동력으로 작용한다(Klaus, Birchmeier, 2008; Korinek et al., 1997; Morin et al., 1997; Willert et al., 2003). Wnt 신호전달 경로는 두 개의 카테고리로 나뉘어져 왔다; 하나는 정규적 Wnt/β-카테닌(catenin) 신호전달 경로이고, 나머지 하나는 비정규적 Wnt/Ca2+ 신호전달 경로이다(Kuhl et al., 2000; Liang et al., 2007; Liu et al., 2005). Wnt 활성이 없는 경우, 세포질내 β-카테닌의 수준은, 카제인 키나제 I(casein kinase I, CKI) 및 글리코겐 신타제 키나제-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)를 통한 짝지워진 인산화 후 26S 프로테아솜(proteasome)에 의한 β-카테닌의 분해 때문에, 낮은 상태로 유지된다(Orford et al., 1997; Salic et al., 2000). 정규적 Wnt들은 프리즐드(Frz) 패밀리 단백질들 및 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질(LRP) 5 또는 6에 결합하며, 이 결합은 dishevelled (Dvl) 를 활성화시키고 GSK-3β의 활성을 억제한다; 이 억제는 β-카테닌을 안정화시키며, TCF/LEF (T-cell factor/lymphoid enhancer factor)와 함께 표적 유전자 발현 조절을 위해 뒤이어 일어나는 핵으로의 전좌(translocation)를 일으킨다(Behrens et al., 1996; Giles et al., 2003; Molenaar et al., 1996; Moon et al., 2002).
Wnt5a와 같은 Wnt 리간드들에 의해 영향 받는 비정규적(Noncanonical) Wnt 신호전달 경로는 다양하고 때때로 반대되는 역할들을 가진다(Slusarski et al., 1997; Torres et al., 1996). 비정규적 Wnt들은 그것들의 수용체에 따라 정규적 Wnt 신호전달 경로에 대해 길항적이거나 상승적(synergistic)이다. Wnt5a-결함 마우스들은 말단지(distal limb)에서 증가된 β-카테닌 신호전달을 보였으며, 이는 Wnt5a 가 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로의 음성적 조절(negative regulation)과 관련이 있다는 것을 나타낸다(Nemeth et al., 2007). 반대로, Frz4 및 LRP5의 존재하에서 Wnt5a 는 Wnt/β-카테닌 신호전달을 증가시키는 것으로 나타났다(Mikels and Nusse, 2006). 비정규적 Wnt 신호전달 경로의 활성은 세포 내 Ca2+ 방출 및 Ca2+/칼모듈린(calmodulin)-의존적 키나제(kinase) II (CaMKII) 와 같은 Ca2+ 민감(sensitive) 효소들 및 단백질 키나제 C (PKC)의 활성을 가져온다는 점을 고려하면, 비정규적 Wnt 경로들은 정규적 Wnt 경로와는 명백히 다르다는 것을 알 수 있다.
자연발생적 장내 종양형성의 마우스 모델인 APC min/+ 는 Wnt/β-카테닌 신호전달을 연구하는데 널리 이용된다(Fodde et al., 1994; Shibata et al., 1997; Su et al., 1992). FAP(familial associated polyposis) 의 유전적 기초가 APC(adenomatous polyposis coli) 유전자에 맵핑되었고, APC 내 생식계열(germline) 및 산발성(sporadic) 돌연변이가 대부분의 FAP에서 일어났다(Groden et al., 1991; Kinzler et al., 1991). APC min /+ 마우스는 Wnt/β-카테닌 신호의 과활성을 일으키는 APC 유전자에 돌연변이를 갖고, 심각한 장암(intestinal tumor)의 진전으로 6개월 안에 죽는다. Wnt/β-카테닌 신호전달은 세포 항상성 유지에 결정적인 역할을 하므로, 다양한 양성적 및 음성적 세포조절자(cellular regulator)들이 유전적, 프로테오믹(proteomic), 및 RNAi-기반 스크리닝 방법들을 통해 밝혀져왔다. Runx3는 TCF4/β-카테닌과 3원 복합체(ternary complex)를 형성하며, TCF4/β-카테닌의 DNA 결합 활성을 억제한다(Ito et al., 2008). 윌름즈 종양억제자 (Wilms tumor suppressor) WTX 는 β-카테닌의 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 분해를 촉진함으로써 Wnt/β-카테닌 신호전달에 대해 길항작용을 한다(Major et al., 2007). 최근에, 매개복합체(mediator complex)의 사이클린-의존적 키나제 멤버(cyclin-dependent kinase member)인, CDK8은 β-카테닌-유래 전사활성에 필수적인 것으로 나타났다(Firestein et al., 2008). β-카테닌의 잘못 조절된 전사 활성이 직장암의 발병 및 진전에 결정적인 역할을 한다는 점을 고려하면, 유전적 불안을 야기하 는 유전자들의 동정이 복잡한 오작동 과정을 연구하는데 중요하다고 할 수 있다.
고아핵수용체 패밀리 멤버들은 유전자 발현군을 양성적 및 음성적으로 조절함으로써, 신경생성, 항상성 및 병 발생 조절을 포함하여 신호통합에 다양한 역할들을 한다(Blumberg 및 Evans, 1998; Giguere, 1999; Mangelsdorf et al., 1995). 레티노산(retinoic acid)-관련 고아핵수용체(ROR) α 는 아직까지 인식 리간드가 밝혀지지 않은 고아핵수용체 패밀리 멤버이다(Giguere et al., 1994; Gold et al., 2003; Lau et al., 1994). 스태거러(Staggerer, sg)는 푸르키니에세포(Purkinje cell) 분화를 억제하여, 소뇌 저형성증(cerebellar hypoplasia) 및 선천적 운동실조(congenital ataxia)를 초래하는 RORα 유전자의 전형적인 돌연변이다(Hamilton et al., 1996). Sg 마우스는 지질 대사, 뼈 대사, 과염증반응(hyperinflammatory responses), 및 주로 소뇌발달과 관련된 형질들을 나타내며, 약 50% 의 마우스는 젖을 떼자마자 죽기 때문에, Sg 마우스로 RORα의 기능 연구를 하는 것은 매우 어렵다(Doulazmi et al., 2006). 고아핵수용체들이 일반적인 생리 뿐 아니라 암 등의 병리에 잠재적인 조절자로 기능한다는 점을 고려하면, 고아핵수용체들은, 예를 들면 Wnt 및 PKC 신호전달 경로와 같이, 잠재적인 암발생 시스템과 기능적으로 상호작용할 수 있다(Peifer 및 Polakis, 2000). 이러한 상호작용은 암발생과 세포부착에서의 변화들을 유발할 수 있다(Polakis, 2000; van de Wetering et al., 2002). 다른 클래스의 핵수용체들에 비해, 고아핵수용체 RORα 의 기능 및 관련된 신호전달 경로는 아직 광범위하게 연구되어 있지 않다.
이에 본 발명자들은 세포배양, 결장암조직 및 마우스 모델 연구들을 기반으 로, 대장암에서 인산화-의존적 방식으로 β-카테닌 전사활성을 약화시키는데 있어, 정규적 및 비정규적 Wnt 신호전달 경로 사이의 교차점에서 RORα가 수행하는 중요한 역할을 밝혔다. RORα-함유 복합체의 생화학적 정제는 β-카테닌이 하나의 구성요소라는 것을 나타내었고, 이는 RORα 및 Wnt 신호전달 경로 사이의 새로운 연결고리를 제공한다. RORα의 β-카테닌과의 상호작용 분석은 Wnt/β-카테닌 신호전달의 RORα-매개 억제는 RORα의 세린 잔기 35에 Wnt5a/PKCα-유발 인산화를 필요로 한다는 것을 보여주었으며, RORα의 β-카테닌에 대한 결합은 RORα의 인산화에 의해 유발 및 증가된다. 흥미롭게도, PKCα의 억제조절 (downregulation)과 함께 RORα 인산화의 감소는 Wnt 표적 유전자들의 활성 및 결장암 조직에서의 암 진전과 관련이 있다. 본 발명자들은 병태생리학적 모델에서 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로를 억제하고 그로 인해 세포증식 및 암 진전을 조절하는데 있어서, 그동안 밝혀지지 않았던 RORα의 역할을 밝히고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 효과적으로 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 암 진단에 유용한 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 RORα 를 이용하여 효과적으로 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 RORα 를 이용하여 암 진단에 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 RORα의 N-말단에 있는 세린을 인산화 시키는 물질을 탐색하는 방법은 암의 치료제를 찾는데 유용하다. 특히, Wit/β-카테닌 시그널에 의하여 발생되는 암의 치료제 탐색에 유용하다. 상기 암은 현재까지 알려지 Win/β-카테닌 시그널에 의해 발생되어지는 모든 암에 적용가능하며, 바람직하게는 상기 암은 대장암이다.
본 발명은 생체내 RORα의 양을 측정하여 암의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.
상기한 목적을 위하여 본 발명의 제 1 의 구현 형태는 RORα를 이용하여 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는 세포를 배양하는 단계; 상기 세포에 잠재적인 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포내 RORα의 인산화(phosphorylation)가 대조구(상기 세포에 상기 잠재적인 물질을 접촉시키지 않은 시험구) 대비 증가하는 것을 확인하는 단계; 및 상기 RORα의 인산화를 증가시키는 상기 잠재성 물질을 항암제로 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법를 제공한다.
상기 RORα의 인산화(phosphorylation) 수준을 측정하는 방법은 제한이 없으나 전기영동법, 형광분석법, 질량분석법, 면역분석법, PCR법 일 수 있다. 상기 면역분석법은 이뮤노블랏(immunoblot) 분석일 수 있다.
상기 RORα의 인산화(phosphorylation) 수준을 측정하는 방법은 Wnt 표적 유전자들의 발현 수준을 분석하는 방법일 수 있다. 상기 Wnt 표적 유전자는 사이클린 D1, c-myc, 및 c-jun 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 유전자일 수 있다. 상기 Wnt 표적 유전자들의 발현 수준을 분석하는 방법은 전기영동법, 형광분석법, 질량분석법, 면역분석법, PCR 법 일 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 분석일 수 있다. 상기 암 치료제 탐색 스크리닝 방법은 모든 암에서 적용이 가능하다.
상기 암치료제 탐색에서 사용되는 암세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 동일 기원의 세포가 바람직하다. 예를 들어 대장암 탐색을 위한 탐색 시스템에 사용되는 세포는 대장세포 기원의 세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 제 2 의 구현 형태는 생체내 RORα의 양을 측정하여 암의 진단하는 방법을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는 시험자로부터 세포를 채취하는 단계; 상기 시험자로부터 채취된 세포에서 세포내 RORα의 인산화(phosphorylation) 률을 측정하는 단계; 및 상기 RORα의 인산화 정도가 정상인의 수치와 비교하여 낮은 수준인 경우를 암발생 가능성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법을 제공한다.
상기 RORα의 인산화(phosphorylation) 수준을 측정하는 방법은 제한이 없으나 전기영동법, 형광분석법, 질량분석법, 면역분석법, PCR법 일 수 있다. 상기 면역분석법은 이뮤노블랏(immunoblot) 분석일 수 있다.
본 발명의 제 3 의 구현 형태는 RORα이 과발현된 APCmin/+ RORα 마우스를 제공한다. 상기 마우스는 항암제 연구에 유용하다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 자세히 설명한다. 그러나 본 발명의 실시예는 본 발명의 권리범위를 한정하는 것이 아니며, 본 발명의 권리범위는 청구범위에 의하여 정하여진다.
(실시예)
1. 재료 및 시약
항-β-카테닌, 사이클린 D1, 포스포(phospho)-PKCα 및 RORα 항체는 Santa Cruz Biotechnology 에서 구입하였다. 다음의 상용화된 항체들을 사용하였다: 항-아세틸-히스톤 H3, 아세틸-히스톤 H4, 디메틸-H3K9 및 디메틸-H3K4 항체(Upstate Biotechnology), 항-FLAG(Sigma), 항-RNA 중합효소 Ⅱ(Berkeley Antibody Company), 항-Xpress (Invitrogen), 및 항-포스포-Ser 항체(Alexis). 항-포스포-RORαS35 항체는 Abmart에서 생산되었다. PKCα 효소는 Cell Signaling 에서 구입하였다.
2. 마우스 종류 및 ROR α 유전자변형 마우스의 생산
한 쌍의 APC min/+ 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하였고, AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)에 따라 서울대학교의 동물 시설에서 키웠다. RORα 유전자변형 마우스를 만들기 위해, 치킨 베타-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter)에 연결된 사람 CMV immediate early enhancer의 조절 하에 Myc 표지(tag)가 융합된 사람 전장(full-length) RORα cDNA를 pCAGGS 발현벡터에 서브클로닝하였다. RORα 유전자변형 마우스를 유도하기 위하여, pCAGGS RORα SalI/HindIII 단편을 C57BL/6J 마우스로부터 유래한 수정란에 미세주입하였다. 형질전환 유전자의 자손 유전체로의 삽입은 PCR 분석으로 확인하였다. 상기 실험들은 동물실험 관련 윤리위원회(Institutional Animal Care and Ethics Committee)의 승인하에 이루어 졌다.
3. 사람 대장암 조직 표본들
사람 조직 샘플에서의 인산화된 RORα 및 PKCα 발현을 분석하기 위하여, 30쌍의 신선한 냉동 대장암 조직 및 매치되는 정상 점막 조직을 선별하였다. 냉동된 신선한 사람 조직 표본들은 과기부 산하 한국과학재단(Korea Science and Engineering Foundation)의 국가지정연구소재은행(National Research Resource Bank) 프로그램에서 지원받는 간암검체은행(Liver Cancer Specimen Bank)으로부터 공급받았다. 상기 조직 표본들을 연구용으로 사용한다는 전제하에 환자의 동의를 받았고, 연세대학교 의과대학의 임상시험 심의위원회로부터 본 발명에 사용되는 표본들의 이용에 대한 권한을 얻었다.
4. ROR α-함유 복합체의 정제
RORα-함유 복합체는 플래그-표지(Flag-tagged) RORα를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포들의 추출물로부터 정제하였다. 음성대조구로서, 빈 벡터를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포들의 막(mock) 정제를 수행하였다. RORα-함유 복합체는 비특이적 오염물질들을 제거하기 위해 세척된 추출물로부터 항-플래그(Flag) 항체-연결 아가로스 비드들을 이용하여 면역침강시켰고, 결합물질들은 플래그 펩티드(0.1 mg/ml)들과의 경쟁에 의해 용리(elution)된다. 결합단백질들은 SDS-PAGE 에 의해 분석되어 LCMS/MS 분석에 사용된다.
5. 시험관내 ( In vitro ) 키나제 ( kinase ) 분석
시험관내 키나제 분석은, HEK293 세포 용해물에서 면역침강된 PKCα 또는 정제된 PKCα 효소를 키나제로 사용하고, 정제된 GST-RORα 단백질을 기질로 사용하여, 40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM 디티오스레이톨 (dithiothreitol, DTT), 및 10 μCi [γ-32P]ATP 를 포함한 키나제 분석 버퍼에서 30℃로 30분간 수행하였다. 반응은 5X Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하고 10분간 끓임으로써 종료시켰다. 샘플들에 대해 12% SDS-PAGE를 수행하였고, 인산화된 RORα는 방사능 사진촬영(autoradiography)으로 탐지하였다.
6. 액체 크로마토그라피 -질량분석( Mass Spectrometry )
적은 양(100 μM)의 합성 펩티드들(RORα 또는 RORαS35A)을 PKCα 효소를 이용한 키나제 분석의 기질로 사용하였다; 반응은 4℃에서 10분간 10% TCA 침전반응에 의해 종료되었다. 원심분리에 의해 침전물을 제거한 후에, 상등액을 회수하고 상등액에서 인산화된 펩티드들을 한국기초과학연구원(Korea Basic Science Institute)에서 LC-MS 로 분석하였다.
7. 리포터 분석( Reporter assays )
루시퍼라제(luciferase) 시스템(Promega)을 이용하여, 루시퍼라제 활성을
트랜스펙션(transfection) 48시간 후에 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정하고, 베타-갈락토시다제 발현으로 표준화하였다. 수치들은 적어도 3번의 독립적 실험들에 대한 평균±표준편차로 나타내었다.
8. 칩( ChIP ), 2단계 칩, 및 shRNA -결합 칩 분석
칩, 2단계 칩, 및 shRNA-결합 칩 분석들은 앞서 기술한 방법으로 수행하였다(Baek et al., 2002; Kim et al., 2005).
9. 플라스미드 및 shRNA 의 제작
점 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 RORα DBD 돌연변이(C90A)를 만들었고, Cys90 의 시스테인이 알라닌으로 치환되었다. RORαΔAF2 는 다음과 같이 만들었다: RORα(아미노산 1 부터 505) 5’말단의 EcoRI 및 3’말단의 BamHI 부위를 PCR로 증폭하고 그 단편을 3X 플래그(Flag) 표지-CMV10 벡터의 EcoRI/BamHI 부위에 서브클론시켰다. 그 구축물들은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. RORα, β-카테닌(catenin), 및 비특이적 (NS) shRNA 에 대한 shRNA의 표적 서열들은 다음과 같다:
shRORα-1, 5’-CGGUGCGCAGACAGAGCUAUU-3’(서열번호 1);
shRORα-2, 5’-GAGGUAUCUCAGUAACGAAGA-3’(서열번호 2);
shβ-catenin, 5’-GUCCUGUAUGAGUGGGAAC-3’(서열번호 3)(Kim et al., 2005), 및 shNS, 5’-CUGGACUUCCAGAAGAACAUC-3’(서열번호 4).
siPKCα 올리고뉴클레오티드 중복서열은 다음과 같다:
5’-GAUCCGCGUCCUGUUGUAUGAAAUUUCAAGAGAA-3’(서열번호 5)(Hsieh et al., 2007).
10. 실시간 정량적 RT - PCR
mRNA의 양은 SYBR Green (분자 프로브) 으로 ABI prism 7300 시스템에 의해 측정되었다. 90-150 bp mRNA 특이적 단편들을 증폭하기 위하여 프라미어 쌍들을 설계하였고, 용융곡선(melting curve) 분석을 통해 유일한 산물인지 확인하였다. PCR 조건은 95℃ (5분) 및 95℃ (30초), 57℃ (30초), 및 72℃ (30초)의 40 사이클이었다. mRNA의 양은 ΔΔCt 법을 이용하여 계산하였고, β-액틴(actin) 또는 HPRT 를 검출하기 위한 프라이머들을 사용하여 표준화하였다. 모든 반응들은 3반복으로 수행하였다.
11. 간접적 면역형광 분석
HCT116 세포들을 커버슬립 위에서 키우고, 트랜스펙션 12시간 후에 PBS(phosphate buffered saline)로 3번 씻었다. 그 후 실온에서 30분간 PBS 에서 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포들을 고정시키고, PBS에서 씻은 뒤 PBS 0.5% 트리톤(Triton) X-100 (PBS-T)으로 30분간 실온에서 투과화시켰다. 블로킹(Blocking)은 PBS-T 에서 30분간 3% 말 혈청 및 10% 젤라틴으로 수행하였다. 염색을 위하여, 세포들을 친화-정제 항-플래그(affinity-purified anti-Flag) IgG 로 1시간 동안 배양하고 PBS-T 에서 3번 세척하였다. 염색된 세포들을 플루오레신 이 소티오시안산(fluorescein isothiocyanate)-연결 2차 항체들로 1시간 동안 키우고(Jackson Immuno Research Lab.), PBS-T에서 3번 씻었다.
12. 트랜스웰 세포이동 측정( Transwell cell migration assay )
RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D 를 안정적으로 발현하는 HCT116 세포들을 대조구와 함께 트랜스웰 세포이동 측정(Transwell cell migration assays)에 사용하였다. 트랜스웰 세포이동 측정은 이전에 개시된 것과 동일한 방법으로 수행하였다(Kim et al., 2006). 배양된 세포들은 Wnt5a(100ng/ml)로 2시간 동안 전처리하고, 2.5×104 HCT116 세포들을 24-웰 트랜스웰 챔버 어세이 플레이트(BD Biosciences) 위에 올려놓았다. 화학유인물질로 15% 소 태아 혈청을 포함하는 조절된 McCoy 5A 배지를 바닥 챔버에 첨가하였다.
22시간의 배양 후에, 필터의 아래쪽 챔버로 이동한 세포들을 100% 메탄올로 고정시키고, DAPI로 염색한 후, 4개의 다른 영역에서 세포들의 총 수를 셈으로써 정량화하였다. 모든 실험은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 측정치들은 적어도 3개의 독립적 실험들에 대한 평균 ± 표준편차로 표현하였다.
13. 비부착증식 측정( Anchorage - independent growth assay )
RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D 를 포함하는 HCT116 세포들의 비부착증식은 반고체 배지에서 세포 성장을 분석함으로써 결정하였다. 105개의 세포들을 10% FCS를 포함하는 0.4% 노블 아가(noble agar)를 함유한 McCoy 5A 배지에 옮겼다. 세포들을 5% 이산화탄소에서 3주간 키우고, 50개를 초과하는 세포들을 포함하는 콜로니들의 형성을 분석하였다.
14. 통계 분석
실험구와 대조구 샘플 사이의 통계적 차이는 Statview package (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA)를 이용한 student's t-test 로 결정하였다.
15. ROR α-함유 복합체의 정제 및 결합파트너인 β- 카테닌의 동정
아직 밝혀지지 않은 RORα의 기능을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 RORα-함유 복합체의 정제를 위해 플래그 에피토프(Flag epitope)-표지 전략을 사용하였다. 본 발명자들은 플래그-표지 RORα를 안정적으로 발현하는 세포주(cell line)를 생산하고, 그 추출물을 항-플래그 M2 친화 젤에서 항온반응시켰다.
500 mM 까지 염 농도를 증가시키며 버퍼로 세척한 후, 친화크로마토그라피 컬럼에 남아 있는 단백질들을 플래그 펩티드를 포함한 버퍼로 용출하였다. 플래그 M2 친화 컬럼으로부터 정제한 RORα-함유 복합체의 단백질들을 동정하기 위하여 액체 크로마토그라피 질량분석(mass spectrometry)/질량분석(LC-MS/MS)을 수행하였다. GRIP1 (glucocorticoid receptor-interacting protein 1) 및 베타-카테닌과 같은 전사 활성보조인자(coactivator)들이 플래그-RORα로 공동정제(copurify)되었다(도 1A 및 1B). 잘 알려진 RORα의 결합 파트너인 GRIP1 활성보조인자(Atkins et al., 1999)들의 존재는 이 분자들 사이의 기능적 연결을 확인시켜준다. 베타-카테닌의 RORα로의 결합은 용출물의 이뮤노블랏 분석 및 내생성 공동면역침전 측정(endogenous coimmunoprecipitation assay) 모두에 의해 확인되었다(도 1C 및 1D). RORα에 대한 베타-카테닌 상의 결합부위 맵핑(mapping)은 RORα가 N- 및 C-말단 도메인이 아니라 베타-카테닌의 아마딜로 반복 도메인(armadillo repeat domain)과 상호작용 한다는 것을 나타내며, 이는 작은 집단의 보조활성인자 결합부위와 중복된다(도 1E 및 1F). 이 데이터는 RORα가 Wnt/베타-카테닌 신호전달에 대한 공동조절인자(coregulator)로 기능할 가능성을 암시한다. 이들을 모두 고려하면, RORα-함유 복합체로부터의 베타-카테닌의 동정은 RORα와 Wnt/베타-카테닌 신호전달 경로 사이의 기능적 연결의 가능성을 암시한다.
16. ROR α에 의한 베타- 카테닌 전사 활성의 감소
본 발명자들은 Wnt 신호전달-의존적 대장암 세포들에서 RORα가 직접적으로 Wnt 표적 유전자들의 조절에 관여하는지 알아보기 위하여 Wnt/베타-카테닌 신호전달 경로가 연속적으로 활성화되는 HCT116 결장암 세포주를 사용하였다. TCF/LEF 결합부위를 갖는 TOPFLASH 리포터에 더하여, 사이클린(cyclin ) D1 또는 c- myc 유전자 전사체(transcript)들을 Wnt 신호전달 활성에 대한 리드아웃(readout)으로 사용하였다. shRNA에 의한 베타-카테닌의 녹다운(knockdown) 또는 우성의 네가티브 형태의 TCF 도입은 사이클린 D1 또는 c- myc 유전자 전사체의 유도를 감소시키며(도 2A), 이는 HCT116 대장암 세포들에서 증가된 사이클린 D1 또는 c- myc 전사체가 Wnt 신호전달 활성과 관련되어 있다는 것을 암시한다. RORα의 도입은 사이클린 D1 및 c-myc 전사체의 유도를 억제한다(도 2B). RORα의 과발현은 TOPFLASH 의 TCF/베타-카테닌-매개 활성 및 사이클린 D1 프로모터-루시퍼라제(luciferase) 리포터를 거의 완전히 억제한다(도 2C 및 2D). 본 발명자들은 shRNAs를 이용하여 내생성(endogenous) RORα의 발현을 억제하고, 두 개의 독립적인 shRNA들이 Wnt 표적 유전자에 미치는 기능적 영향을 이뮤노블랏팅 분석으로 검증하였다(도 7). RORα 과발현과 대조적으로, 특정한 shRNA들에 의한 내생성 RORα의 억제는 Wnt 표적 유전자 뿐 아니라(도 2E), TOPFLASH 및 사이클린 D1 프로모터-루시퍼라제 리포터의 증가된 활성을 야기한다(도 2F 및 2G). 이러한 결과는 RORα가 베타-카테닌-매개 전사 활성의 감소와 관련이 있으며 RORα의 과발현은 Wnt 표적 유전자들의 발현에 역효과를 가져온다는 것을 암시한다.
이러한 예상치 못한 결과들을 바탕으로 본 발명자들은 Wnt 표적 유전자의 RORα-매개 전사억제의 분자적 기작을 구체적으로 연구하게 되었다. RORα에 의한 베타-카테닌-매개 전사활성 억제는 두 가지 기작에 의한 것으로 가정할 수 있다. 첫번째로, RORα는 베타-카테닌과 직접적으로 상호작용하며, 베타-카테닌의 전사인자인 TCF로부터 DNA 결합-비의존적 방식(DNA binding-independent manner)으로 격리시킨다. 둘째로, RORα는 직접적으로 베타-카테닌에 결합하고 전사억제를 위해 다른 보조활성인자들의 Wnt 표적 프로모터로의 결합을 억제함으로써 베타-카테닌-매개 전사를 트란스억제(transrepress)한다. 격리 또는 트란스억제 과정이 RORα에 의한 베타-카테닌-매개 전사활성의 억제와 관련이 있는지 알아보기 위하여, 사이클 린 D1 프로모터에 대해 2단계 크로마틴 면역침전(ChIP) 측정을 수행하였다(도 2H). 용해성 크로마틴을 두 개로 분주하였다. 이 중 하나는 항-RORα 항체들로 면역침전시킨 후 면역복합체들이 방출되었고, 항-베타-카테닌 항체들로 다시 면역침전시켰다. 다른 하나는 항-베타-카테닌 항체들로 먼저 면역침전시키고, 항-RORα 항체들로 다시 면역침전시켰다. 2단계 ChIP 검정(assay)은 RORα 및 베타-카테닌 모두 프로모터 상에서 동시에 검출된다는 것을 보여주었다(도 2H). 이것은 RORα가 동일한 프로모터 상에서 베타-카테닌과 직접적으로 결합함으로써 베타-카테닌-매개 전사활성을 트란스억제한다는 가설을 뒷받침한다. RORα가 베타-카테닌으로부터 TCF를 완전히 대체하여, TOPFLASH 리포터의 억제를 유도할 가능성을 배제시키기 위하여, 베타-카테닌의 RORα 및 TCF 와의 직접적 동시 상호작용이 일어나는지 알아보기 위한 공동면역침전 검정(coimmunoprecipitation assay)을 수행하였다. RORα의 증가된 발현은 베타-카테닌과 TCF의 상호작용에 영향을 미치지 못하였고, 이는 베타-카테닌의 RORα 및 TCF 에의 동시적 결합 모델을 뒷받침한다(도 2I).
사이클린 D1 프로모터에 대한 추가적인 ChIP 측정은 RORα의 과발현이 RORα 결합의 증가 및 RNA 중합효소 II 결합의 감소와 함께 베타-카테닌-매개 전사활성을 상당히 억제한다는 것을 보여주었다(도 2J). 베타-카테닌 및 TCF의 도입은 RORα의 과발현에 의해 영향받지 않았다. 이와 함께, 본 발명자들은 RORα 또는 베타-카테닌에 대한 shRNA 를 사용함으로써 사이클린 D1 및 c- jun 프로모터에 대해 shRNA-결합(coupled) ChIP 검정을 수행하였다(도 2K). 베타-카테닌의 녹다운(Knockdown)은 히스톤 아세틸화의 실패를 초래하였고 RORα 도입의 감소를 나타내었으며, 이는 프 로모터에 대한 RORα 도입이 베타-카테닌을 통한다는 것을 암시한다. 이러한 결과들과 일치하여, RORα의 녹다운은 베타-카테닌의 도입을 변화시키지 않았다; 하지만, 그것은 히스톤 아세틸화 수준의 상당한 증가를 유도하였다(도 2K). 이러한 결과들은 RORα의 사이클린 D1 및 c- jun 프로모터에의 결합은 베타-카테닌에 의해 매개되며 RORα의 베타-카테닌에의 결합은 Wnt 표적유전자에 억제 효과를 가져온다는 것을 보여준다.
17. 세린 35에 프로테인 키나제 Cα에 의한 ROR α의 인산화
베타-카테닌과 직접적인 물리적 상호작용을 할 수 있는 RORα 도메인을 찾기 위하여, 다양한 RORα 결실(deletion) 돌연변이들을 준비하였다(도 3A). Ni+-NTA-아가로스 풀다운 검정(pulldown assay)은 RORα의 N-말단 도메인이 베타-카테닌 결합에 책임이 있다는 것을 나타내었다(도 3B). 추가로 본 발명자들은 베타-카테닌 결합의 분자적 결정자(determinant)들을 찾기 위해 RORα의 N-말단 도메인의 연속적인 결실 돌연변이들을 준비하였다(도 3C). 정교한 결실 맵핑은 아미노산 32 부터 41에 이르는 RORα의 N-말단 단편이 베타-카테닌 결합에 필수불가결하다는 것을 보여주었다(도 3D). 인산화는 동적인 과정이고, 포스페이트(phosphate)의 제거 및 추가는 단백질 결합 친화도를 변경할 수 있으므로, 본 발명자들은 잠재적인 인산화 부위를 찾았다. 아미노산 32 부터 41에 이르는 RORα 부위에서 PKC 일치 영역(S/TX0 -2R/K1 -3)의 동정으로부터 본 발명자들은 RORα가 특정한 PKC 이소폼(isoform)들에 붙는지 알아보기 위하여 다양한 PKC들을 가지고 공동면역침전 검정(coimmunoprecipitation assay)을 수행하였다. 생체 내(In vivo) 공동면역침전 검정은 RORα가 PKCα에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸 반면, PKCβ2, PKCχ, PKCδ, PKCε, PKCι, PKCη, 및 PKCζ를 포함한 PKC의 다른 이소폼들은 RORα에 결합하지 못하였다(도 3E).
RORα에 대한 PKCα의 선택적 결합으로부터 본 발명자들은 PKCα가 RORα 인산화에 직접적인 책임이 있는지를 연구하게 되었다. PKCα 키나제 검정에 이은 RORα 펩티드의 질량분석은 RORα가 PKCα에 의해 인산화된다는 것을 나타내었다(도 3F). RORα 펩티드의 계산된 분자량은 1620.8 Da 이며, 포스페이트 그룹의 첨가는 질량을 113 Da 로 증가시킨다. 인산화된 RORα 펩티드는 그것의 주요 피크를 1734.1 Da 에서 나타냈다. PKC 활성인자인 TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 의 처리는 내생성 RORα의 인산화를 증가시켰다(도 3G). 세린 잔기가 알라닌으로 치환된 RORαS35A 돌연변이는 TPA의 존재 하에 인산화되지 않은 반면, 야생형(WT) 또는 S39A 돌연변이는 TPA-유발 인산화를 나타내었다(도 3H). PKCα 키나제 검정 후의 질량분석은 RORαS35A 펩티드의 인산화된 형태에 대응하는 피크가 없다는 것을 확인시켜 주었다(도 8). 이러한 데이터는 PKCα에 의한 RORα의 S35 부위상의 부위-특이적 인산화를 설명한다.
추가로 PKCα가 직접적으로 S35에서 RORα를 인산화시키는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 항-플래그 항체를 가지고 세포 용해물에서 면역침전시킨 PKCα의 구성적(constitutive) 활성 형태(caPKCα) 또는 PKCα의 키나제 결손 돌연변이 형태(kdPKCα)를 이용하여 시험관내(in vitro) 키나제 검정을 수행하였다. caPKCα 또는 kdPKCα의 면역침전 물질은 박테리아에서 발현되고 정제된 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST)-RORα WT 또는 S35A 단백질들과 함께 항온반응시켰다. 실제로, caPKCα는 정제된 RORα 단백질들을 인산화시킨 반면, kdPKCα는 RORα 단백질들을 인산화시키지 못했다(도 3I). 예상한 바와 같이, RORαS35A 단백질들은 caPKCα에 의해 인산화되지 않았고, 이는 PKCα에 의한 RORα의 S35 부위특이적 인산화를 확인시켜준다. 면역조직화학적 (immunohistochemical) 연구들은 HCT116 세포들에서 RORα 및 RORαS35A 모두 거의 배타적인 핵 염색 패턴을 나타낸다는 것을 보여주었고, 이는 RORα의 인산화가 핵내 이동(nuclear localization)을 변경시키지 않는다는 것을 나타낸다(도 3J).
18. PKC α에 의한 ROR α의 인산화는 Wnt /베타- 카테닌 표적 유전자들의 하향조절( downregulation )에 결정적인 역할을 한다.
인산화된 RORαS35 펩티드에 대한 항체는 도트 블랏 분석(dot blot analysis)으로 평가한 인산화된 펩티드를 특이적으로 인식하였다(도 4A). 특이적이고, 정제된 항-포스포(phospho)-RORαS35 IgG 에 의한 면역침전분석은 RORα S35A와 달리 야생형은 TPA 처리에 의해 인산화되기 쉽다는 것을 보여주었다(도 4B). 이 데이터와 일치하여, 항-포스포-RORαS35 IgG 에 대한 이뮤노블랏팅에 의해 측정된 바와 같이, kdPKCα와 달리 caPKCα의 도입은 RORα의 인산화를 증가시키는 반면 특이적 PKCα 억제제인 Go6976의 처리는 RORα의 TPA-유발 인산화를 없앤다(도 4C 및 4D). 이러한 결과들은 PKCα의 TPA의존적 활성이 S35 부위에서 RORα의 인산화에 책임이 있다는 것을 보여준다.
단백질 인산화는 단백질들의 결합친화도를 변경시키므로, 본 발명자는 RORα의 인산화가 그것의 베타-카테닌에 대한 결합친화도에 영향을 미치는지 알아보았다. RORα의 구성인산화(constitutive phosphorylation)를 모방한, RORαS35D는 베타-카테닌에 대해 강한 결합을 보인 반면, RORαS35A는 베타-카테닌에 대해 매우 약한 결합을 나타내거나 결합하지 않았다(도 4E). 이러한 데이터에 일치하여, RORα의 베타-카테닌에 대한 결합은 TPA 처리에 의해 상당히 증가하였으며, TPA로 인해 증가된 결합은 Go6976 의 처리에 의해 거의 완전히 사라졌다(도 4F). RORαS35A 의 TPA-유발 인산화 실패는 RORα 의 베타-카테닌에 대한 결합을 폐기시켰고, 이는 RORα의 S35 부위의 인산화가 베타-카테닌에의 결합에 결정적임을 확인시켜준다. 이들 데이터는 RORα의 TPA/PKCα-의존적 인산화는 베타-카테닌에 대한 RORα의 결합 친화도를 변형시킨다는 것을 분명하게 나타낸다.
베타-카테닌에의 결합을 증가시키는 RORα 인산화에 의해 Wnt 표적유전자들의 RORα-매개 하향조절이 영향받는지 더 알아보기 위하여, 본 발명자들은 RORαS35A 또는 RORαS35D 중 어느 하나의 도입으로 사이클린(cyclin) D1 프로모터 상에서 ChIP 어세이(assay)를 수행하였다. 예상한 바와 같이, RORαS35A는 프로모터에의 도입(recruitment)의 감소를 보인 반면, RORαS35D는 프로모터에의 도입(recruitment)의 증가를 나타내었다(도 4G). 전사활성기능이 손상된 RORαΔAF2 돌연변이 및 DNA 결합 활성이 손상된 RORαC90A 돌연변이는 베타-카테닌에 대해 유사한 결합친화도(binding affinity)를 보였으며(도 9A), TCF/베타-카테닌-매개 활성에 대해 억제적 기능을 나타내었으며(도 9B), 이는 RORα의 전사활성 및 DNA 결합활성 모두 Wnt 표적 유전자들에 미치는 억제적 기능에 불필요하다는 것을 나타낸다. RNA 중합효소 II 결합의 동시적 감소와 함께 항-포스포(phospho)-RORαS35 IgG 에 의해 사이클린 D1 프로모터 상에서 측정된 바와 같이 TPA 처리는 인산화된 RORα의 결합을 증가시켰다. 반면에, 베타-카테닌의 프로모터 상에서의 도입(recruitment)은 TPA 처리에 의해 변하지 않았다(도 4H).
추가로, PKCα의 녹다운(knockdown)은 RORα의 사이클린 D1 프로모터상에서의 도입을 감소시키며, 프로모터 상에서 RORα의 증가된 도입은 RORα의 PKC 의존적 인산화 때문이라는 것을 확인시켜준다(도 4I). RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 분석은 TPA 처리가 HCT116 세포들에서 사이클린 D1 전사체의 하향조절을 초래한다는 것을 나타내었다 (도 4J). Wnt 표적 유전자들에 대한 RORα의 인산화유발 트란스억제 기작을 지지하여, PKCα 또는 RORα의 어느 하나의 녹다운은 Wnt 표적 유전자 발현의 TPA-매개 하향조절을 실패시켰다(도 4K). 이들 데이터는 RORα의 PKCα-의존적 인산화가 베타-카테닌을 통하여 RORα의 표적 프로모터들에 대한 증가된 결합을 유발한다는 것과 이 증가된 결합은 Wnt 표적 유전자들의 하향조절에 직접적으로 책임이 있다는 것을 강력하게 설명해준다.
19. Wnt5a 는 ROR α의 트란스억제 기능에 의해 정규적 Wnt 신호전달을 상쇄한다.
비정규적(noncanonical) Wnt 리간드 Wnt5a에 의해 유발된 비정규적 Wnt 신호전달 경로는 하위의(downstream) PKCs 및 CaMKII 를 활성화시키므로(Jonsson et al., 1998; Weeraratna et al., 2002), 본 발명자들은 Wnt5a가 대장암 세포에서 RORα 인산화 및 Wnt 표적 유전자들의 하향조절을 이끄는 PKCα 활성을 유도하는지 알아보았다. Wnt5a 처리는 PKCα의 활성형(active form)을 인식하는 항-포스포-PKCα 항체에 대한 이뮤노블랏팅에 의해 측정된 바와 같이 PKCα의 인산화를 증가시켰다(도 5A). 항-포스포-RORαS35 IgG에 대한 추가적인 이뮤노블랏팅 분석은 Wnt5a의 처리가 대장암 세포에서 사이클린 D1 발현의 하향조절(downregulation)과 함께 RORα의 인산화를 증가시킨다는 것을 나타내었다(도 5A). 이 결과들과 일치하여, Wnt5a 처리는 사이클린 D1 전사체의 발현을 감소시키고, 각각의 shRNA에 의한 PKCα 또는 RORα의 녹다운은 사이클린 D1 전사체의 Wnt5a-의존적 하향조절(downregulation)을 실패시킨다(도 5B). 이러한 결과들은 Wnt 표적유전자들의 Wnt5a에 의한 하위조절이 PKCα 활성에 의해 매개된다는 것을 확인시켜준다. 그 후에, 본 발명자들은 Wnt5a/PKCα-의존적 RORα 인산화가 Wnt 표적 유전자들의 베타-카테닌-매개 활성을 억제할 수 있는지 알아보았다. 정량적 RT-PCR 분석은 RORαS35A가 아니라 RORαS35D가 사이클린 D1 전사체의 하향조절을 유발할 수 있다는 것을 보여주었다(도 5C). 이러한 데이터는 RORα가 대장암 세포에서 인산화-의존적 방식으로 정규적 Wnt 신호전달 경로에 대한 Wnt5a-의존적 억제효과를 매개한다는 것을 암시한다.
RORα가 프로모터 상의 베타-카테닌에 직접적으로 결합함으로써 그것의 억제적 효과를 내며, 베타-카테닌 상의 RORα에 대한 결합부위가 소그룹의 보조활성인 자 결합부위와의 중복된다는 것이 보여진 베타-카테닌의 아마딜로(armadillo) 반복 도메인에 위치한다는 점을 고려하면(도 1E), 베타-카테닌 상의 RORα의 트란스억제 기작은 소그룹의 보조활성인자와 결합하는 베타-카테닌에 대한 경쟁으로 이루어질 수 있다. 사이클린 D1 프로모터에 대한 ChIP 어세이는 Wnt5a 또는 TPA의 처리가 인산화된 RORα의 프로모터에 대한 도입을 증가시키는 반면, CBP, p300, 및 pCAF 보조활성인자의 프로모터에 대한 도입은 상당히 감소한다는 것을 보여주었다(도 5D). 실제로, RORα의 TPA 또는 Wnt5a-의존적 인산화는 베타-카테닌-의존적 전사 활성을 감소시키고, 이는 히스톤 H3K9의 증가된 메틸화 (methylation) 및 감소된 RNA 중합효소 II 결합을 유도한다(도 5D). 이러한 결과들은 Wnt 표적 유전자들의 하향조절이 인산화에 의해 유발된 RORα 결합의 직접적 결과라는 것과 베타-카테닌에 대한 RORα의 트란스억제 기작은 적어도 부분적으로는 베타-카테닌 결합에 대한 소그룹의 보조활성인자와의 경쟁 및 아마도 전사 억제를 위한 히스톤 라이신(lysine) 메틸트란스퍼라제(methyltransferase)의 도입에 의해 이루어진다는 것을 나타낸다.
사이클린 D1, c-myc, 또는 c-jun 의 상위조절(upregulation)은 세포증식 및 이동과 관련이 있으므로, 본 발명자들은 RORα의 인산화가 세포이동을 억제할 수 있는지 알아보았다. RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D-발현 HCT116 대장암 세포들의 세포수의 증가를 측정하는 트란스웰 세포이동 어세이(transwell cell migration assay)는 Wnt5a 처리가, 비처리세포들과 비교하여, HCT116 대장암 세포의 이동을 감소시킨다는 것을 나타내었으며, RORαS35D-발현 세포들은 Wnt5a 존재 하에서 세포 이동의 상당한 감소를 보인다는 것을 보여주었다(도 5E). 이러한 결과들은 ROR α-매개 세포이동억제의 바탕이 되는 기작은 적어도 부분적으로는 인산화-의존적 방식의 Wnt 표적 유전자의 억제에 의한다는 것을 암시한다.
그 후 본 발명자들은 세포 및 종양 성장에 중요하다고 알려진 다른 성질들을 고려해 보았다. 앵커리지(anchorage)-독립적 성장은 종양 세포 성장의 중요한 특성이기 때문에, 본 발명자들은 RORαS35A가 아닌 RORαS35D 가 소프트 아가(soft agar)에서 HCT116 세포들의 콜로니-형성 능력을 억제할 수 있는지 알아보았다. RORαS35D 의 항-증식 성질과 일치하여, RORαS35D를 발현하는 HCT116 세포들은 대조구 세포들보다 상당히 천천히 자랐다(도 5F). 추가로, RORαS35D 발현 세포들에 의해 형성된 콜로니들의 크기는 대조구 세포들에 의해 형성된 것보다 상당히 작았다. 이러한 결과들은 RORα가 인산화-의존적 방식으로 세포성장을 조절하는데 상당한 역할을 한다는 것을 암시한다.
20. 사람 직장암에서 RORα 인산화의 빈번한 감소 확인
본 발명의 임상적 관련성을 찾기 위하여, 본 발명자들은 30개의 직장암 조직들에서 인산화된 RORα 및 PKCα의 발현을 조사하고 정상적인 점막 견본과 비교하였다. 항-포스포-RORαS35 IgG 에 대한 이뮤노블랏 분석은 30 케이스 중 22개의 경우(>73%)에서 RORα 인산화의 감소를 나타내었으며, 이 22개의 경우 중, 14 경우(>46%)는 PKCα 인산화의 감소를 보였다(표 1 및 도 6A). 추가로 본 발명자들은 상기 정상 및 종양 샘플들에서 Wnt 표적 유전자들의 발현을 정량적 RT-PCR로 조사하였다. RORα의 인산화 감소 및 PKCα 불활성화의 모든 케이스에서 증가된 Wnt 표적 유전자들의 발현을 보였다(표 1). Wnt5a 발현은 대장암, 유방암, 및 전립선암을 포함한 다양한 종양들에서는 하위조절되는 반면, 뇌, 위, 신장, 및 피부암들에서는 상위조절되는 것으로 보고되었다(Blanc et al., 2005; Iozzo et al., 1995; Kremenevskaja et al., 2005). 추가로 정량적 RT-PCR 분석은 대장암에서 Wnt5a의 하향조절이 PKCα 의 불활성화 및 RORα 인산화의 감소와 관련이 있다는 생각을 뒷받침하였다(표 1). 이 데이터들은 PKCα의 불활성화와 함께 RORα 인산화의 감소 및 Wnt5a 의 하향조절이 직장암에서 흔하다는 것을 암시한다.
[표 1]
Figure 112009001146050-PAT00001
21. APC min/+ 마우스에 비하여 APC min/+ RORα 트랜스제닉 마우스에서 용종 발달 감소
RORα의 종양 억제 기능이 마우스모델의 자연발생적 장 종양형성에 적용되는 지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 RORα 유전자변형 마우스와 교배한 APC min/+ 마우스를 만들고, 성- 및 연령-매치 마우스를 분석하였다. 본 발명자들은 사람 RORα cDNA를 발현하는 유전자변형 마우스를 만들었고, 대장 및 소장 조직에서 RORα의 발현 증가를 확인했다. APC min /+ 마우스는 24주 안에 죽는다. 반면, APC min /+ RORα 유전자 변형 마우스의 사망은 APC min /+ 와 한 배의 새끼인(littermate) 대조구에 비해 감소했다(도 6B). 본 발명자들은 입체 현미경으로 용종(polyp)의 수를 정량화하고, APC min/+ RORα 유전자 변형 마우스의 소장 또는 대장에서 APC min/+ 마우스의 것에서와 비교하여 가시적인 용종(직경 >1.0 mm)의 수가 감소했음을 발견했다(도 6C). 이러한 데이터들은 RORα가 Wnt 신호전달의 억제적 기능에 의해 Wnt 신호전달-매개 종양 형성 및 성장에 영향을 미친다는 점을 지지한다. 이들을 종합하면, RORα는 장 종양형성의 마우스 모델 APC min /+ 에서 세포 또는 종양 성장의 조절에 영향을 미친다.
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도 1은 RORα-함유 복합체의 정제 및 결합파트너인 β-카테닌의 동정을 나타낸다. (A) RORα-함유 복합체는 플래그-표지 RORα를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포들의 추출물로부터 정제하였다. 음성대조구로서, 빈 벡터를 안정적으로 발현하 는 HEK293 세포들의 막(mock) 정제를 수행하였다. 결합단백질들은 SDS-PAGE에 의해 분석되어 LC-MS/MS 분석에 사용되었다. (B) LC-MS/MS 분석으로부터 얻은 RORα-관련 폴리펩티드들의 펩티드 서열은 GRIP1 및 β-카테닌이 RORα-함유 복합체의 구성성분임을 보여준다. (C) β-카테닌 및 GRIP1은 이뮤노블랏 분석을 이용하여 용출물(elute)로부터 검출하였다. (D) HEK293 세포들에서 내생성(endogenous) RORα의 β-카테닌과의 공동면역침전 (coimmunoprecipitation). (E) GFP-표지 β-카테닌 결실 구축물 및 HisMax-RORα 각각을 발현하는 플라스미드를 이용하여 Ni+-NTA-아가로스 풀다운(pulldown) 분석을 수행하였다. (F) 다양한 베타-카테닌 결실 구축물들의 구조와 RORα에 대한 결합의 비교.
도2는 베타-카테닌 전사활성의 억제를 매개하는 RORα의 요건을 나타낸다. (A) 베타-카테닌 또는 지배적 음성(dominant negative) TCF에 대한 shRNA의 존재 하에 HCT116 세포 내의 사이클린 D1, c-myc 및 c-jun 전사체(transcripts)의 실시간 정량적 RT-PCR 분석. (B) HCT116 대장암 세포들에서 RORα의 트랜스펙션 후 사이클린 D1 및 c-myc 전사체의 측정. (C 및 D) RORα의 과발현은 TOPFLASH 리포터(C) 및 cyclin D1 프로모터 리포터(D)의 TCF/β-카테닌-매개 활성을 억제했다. (E) HCT116 대장암 세포들에서 두 개의 독립적인 shRNA들에 의한 RORα의 녹다운(knockdown) 후에 cyclin D1의 mRNA 양의 측정. (F 및 G) RORα에 대한 shRNAs의 도입은 TOPFLASH 리포터 (F) 또는 사이클린 D1 프로모터 리포터 (G)의 전사 활성을 증가시켰다. 데이타는 세개 독립적인 실험에 대하여 평균 ± 표준편차로 나타냈다. (H) RORα 및 β-카테닌이 같은 프로모터에 결합되는지를 확인하기 위하여 2-단계 ChIP를 수행한 것을 보인다. (I) 외래의 RORα의 발현이 있거나 없는 HCT116 세포가 항-TCF 항체와 공면역침전되었고 상기 면역침전된 물질은 항-β-카테닌 항체에 대해 이뮤노블랏팅 되었다. RORα의 과발현이 있거나 없거나 TCF와 β-카테닌의 상호작용은 변화가 없었다. (J) RORα의 과발현이 있거나 없는 상태에서 HCT116 세포에서 사이클린 D1 프로모터에 대한 ChIP 분석을 보인다. RORα, β-카테닌, TCF 및 RNA 중합효소 II에 의한 사이클린 D1 프로모터의 점유가 보였졌다. (K) HCT116 세포의 사이클린 D1 및 c- jun 프로모터에 대한 shRNA-연관 ChIP 분석이 행해졌다. β-카테닌의 녹다운은 히스톤 아세틸화의 감소 뿐만 아니라 프로모터에 RORα의 도입 감소를 가져왔다. 이것은 RORα이 β-카테닌 통해 결합한다는 것을 보인다.
도 3은 RORα은 세린 35에서 PKCα에 의해 인산화된다는 것을 보인다. (A) N-말단 도메인(NTD), DNA-결합 도메인(DBD), 힌지 지역, 리간드 결합 도메인(LBD) 및 AF-2 도메인의 위치를 나타내는 RORα의 모식도. (B) Ni+-NTA-아가로스 풀다운 어세이(pulldown assay)는 NTD에 대응되는 RORα의 아미노산 1-65 에 걸쳐있는 부분이 β-카테닌에 결합하는데 충분하다는 것을 보여준다. HEK293 세포들은 각각의 His-표지 RORα 결실 구축물(deletion construct) 및 β-카테닌을 발현하는 플라스미드들과 함께 트랜스펙션시켰다. 총 세포추출물(좌측 패널) 및 Ni+-NTA-아가로스 풀다운 물질들(우측 패널)을 항-β-카테닌 IgG 또는 항-Xpress IgG 에 대한 이뮤노블랏팅으로 분석하였다. (C) RORα 결실 단편들의 도시. (D) 각각의 RORα 결실 구 축물의 HisMax-β-카테닌과의 상호작용은 Ni+-NTA-아가로스 풀다운 어세이로 측정하였다. (E) RORα의 다양한 PKC 아이소폼(isoform)들과의 공동면역침전(coimmunoprecipitation). (F) RORα 합성 펩티드들 (NQESARKSE) 을 PKCα 효소와의 키나제 어세이의 기질로 사용하였다. 인산화된 펩티드 시료들을 LC-MS 분석으로 분석하였다. (G) 일정한 시간간격으로 HCT116 세포들에 TPA를 처리하였으며, 세포용출물을 항-RORα 항체로 면역침전시키고, 내생적(endogenous) 수준의 인산화된 RORα를 나타내는 항-포스포-Ser 항체에 대한 이뮤노블랏팅 분석을 하였다. (H) 플래그(Flag)-RORα WT, S35A, 또는 S39A 로 트랜스펙션시키고 하루 후에, HCT116 세포들에 TPA를 처리하였다. 항-플래그 항체로 면역침전 어세이를 수행하였고, 인산화된 RORα는 항-포스포-Ser 항체를 이용한 이뮤노블랏 분석으로 검출하였다. (I) 세포용출물에서 면역침전된 PKCα의 구성적(constitutive) 활성 형태(caPKCα) 또는 PKCα의 키나제 결손 돌연변이 형태(kdPKCα)의 어느 하나를 키나제로 사용하고 정제된 GST-RORα N-말단 야생형 (WT) 또는 S35A 단백질들을 기질로 사용하여 시험관내(In vitro) 키나제 어세이를 수행하였다. 반응시료들에 대해 12 % SDS-PAGE 를 수행하고, 인산화된 RORα를 방사능사진촬영(autoradiography)으로 검출하였다. (J) HCT116 세포들을 플래그-RORα WT 또는 S35A로 트랜스펙션시키고, 플래그 에피토프(epitope)에 대항적인 항체들로 염색하였다. 형광- 연결(conjugated) 2차 항체는 형광현미경을 이용하여 볼 수 있었고, DAPI로 염색된 핵을 볼 수 있었다.
도 4는 RORα의 PKCα-의존적 인산화가 Wnt/β-카테닌 표적 유전자들의 하향조절에 결정적 역할을 한다는 것을 보여준다. (A) 인산화된 RORαS35 펩티드에 대한 항체특이성은 닷 블랏(dot blot) 분석으로 측정하였다. (B) TPA 처리는 항-포스포-RORαS35 항체로 면역침전시켜 측정한 바에 따르면 S35 부위에서 인산화된 RORα를 증가시켰다. (C) 항-포스포-RORαS35 항체에 대한 이뮤노블랏은 caPKCα가 RORα의 인산화를 증가시키는 반면, kdPKCα는 RORα를 인산화시키지 못한다는 것을 나타낸다. (D) PKCα 억제제인 Go6976의 처리는 항-포스포-RORαS35 항체로 면역침전시켜 측정한 바에 따르면 RORα의 TPA 의존적 인산화를 막았다. (E) HCT116 세포들을 플래그-RORα WT, S35D, 또는 S35A로 트랜스펙션시키고, 세포추출물들을 항-플래그 항체로 면역침전시킨 후, 항-β-카테닌 항체에 대해 이뮤노블랏팅하였다. (F) HCT116 세포들에서 Go6976의 존재 또는 부존재 하에서 TPA를 처리한 후, RORα WT 또는 S35A의 어느 하나를 이용한 β-카테닌의 공동면역침전(coimmunoprecipitation) 어세이. (G) HCT116 세포들에서 플래그-RORα WT, S35A, 또는 S35D로 트랜스펙션시킨 후, 사이클린 D1 프로모터 상의 ChIP 분석. (H) HCT116 세포들에서 일정한 시간동안 TPA 처리를 한 후, 사이클린 D1 프로모터 상의 ChIP 분석. (I) ChIP 어세이는 PKCα에 대한 siRNA의 존재 또는 부존재 하에서 90분간 TPA를 처리하여, 사이클린 D1 프로모터 상에서 수행하였다. (J) 일정한 시간동안 TPA의 존재 하에 HCT116 세포들에서의 사이클린 D1 전사체(transcript)의 실시간 정량적(Real-time quantitative) RT-PCR 분석. (K) RORα 또는 PKCα에 대한 siRNA의 넉다운(knockdown) 효과는 HCT116 세포들에서 사이클린 D1 전사체의 발현 으로 측정하였다.
도 5는 Wnt5a가 RORα의 트란스억제 기능에 의해 정규적 Wnt 신호전달을 상쇄시킨다는 것을 보여준다. (A) 각각의 항체에 대한 이뮤노블랏 분석에 따르면, Wnt5a 처리는 인산화된 RORα 및 PKCα를 증가시키나 사이클린 D1 발현을 감소시킨다. (B) 사이클린 D1 전사체는 HCT116 세포들에서 Wnt5a의 존재 하에 RORα 또는 PKCα에 대한 siRNA들을 주입한 후에 측정하였다. (C) Wnt5a의 존재 하에 RORα, S35A, 또는 S35D를 주입한 후에 HCT116 세포들에서의 사이클린 D1 전사체의 실시간 정량적 RT-PCR 분석. (D) HCT116 세포들에서 TPA 또는 Wnt5a의 처리하에 사이클린 D1 프로모터 상에서의 ChIP 어세이. 인산화된 RORα, β-카테닌, RNA 중합효소 II, H3K9me2, H3K4me2, CBP, pCAF, p300, 또는 SMRT에 의한 사이클린 D1 프로모터의 점유를 표시하였다. (E) Wnt5a 처리하에 RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D-발현 HCT116 세포들에 대한 트란스웰(transwell) 세포 이동 어세이. 수치들은 3번의 독립된 실험들에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. (F) 소프트 아가(soft agar)에서 RORα, RORαS35A, 또는 RORαS35D를 발현하는 HCT116 세포들의 앵커리지(anchorage)-독립적 성장. 수치들은 6웰에서 2번의 독립된 실험들에 대한 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타내었다. 콜로니들은 10개의 다른 영역에서 세었고, '총 콜로니 수/웰'을 계산하였다. 각각의 그룹에 대한 대표도를 나타내었다.
도 6은 사람 결장 조직에서 RORα 인산화의 감소 및 RORα를 갖거나 갖지 않은 APC min/+ 마우스에서의 종양의 결정(characterization)을 보여준다. (A) 사람 직 장 조직 시료에서 매치되는 정상 조직 시료(N)와 함께 항-포스포-RORαS35, 및 항-포스포-PKCα 항체들에 대한 이뮤노블랏 분석(T). (B) APC min/+ 마우스에서 RORα가 생존에 미치는 영향. (C) 소장 내 가시적인 폴립(polyp)(>1.0 mm)들의 수는 연령(20-24주) 및 성별이 매치되는 APC min/+ 마우스 및 APC min/+ RORα 유전자변형 마우스에서 실체현미경(stereoscopic microscopy)으로 세었다. (D) 대장암에서 RORα의 Wnt5a/PKCα-의존적 인산화에 의해 정규적 Wnt 신호전달이 하향조절되는 모델. RORα는, RORα의 세린 35 잔기의 인산화를 통해 β-카테닌에 대한 결합을 증가시킴으로써, 또한 아마도 β-카테닌에 결합하기 위한 다른 공동활성인자들과 경쟁함으로써, 사이클린 D1, c-myc, 및 c-jun 과 같은 Wnt/β-카테닌 표적유전자들의 β-카테닌-매개 전사활성에 대한 트란스억제 기능을 갖는다. 이러한 혼선은 종양의 진전, 증식, 및 성장과 관련된 Wnt 표적 유전자들을 억제함으로써 종양 세포들의 침략적 활성을 조절한다.
도 7은 RORα에 대한 shRNA들의 확인이다. 두 가지 다른 유형의 shRNA들에 의한 RORα의 넉다운을 이뮤노블랏팅 분석으로 확인하였다.
도 8은 RORαS35A 펩티드의 질량분석 결과이다. RORαS35A의 합성펩티드(NQEAARKSE)들은 정제된 PKCα를 이용한 키나제 어세이의 기질로 사용하였다. 상기 인산화된 펩티드 시료를 질량분석법으로 분석하였다.
도 9는 RORα의 전사활성 기능 및 DNA 결합 활성이 Wnt 표적 유전자들에 대한 억제기능에 필요한 것이 아니라는 것을 보여준다. (A) HCT116 세포들을 플래그-RORα WT, DBD 돌연변이 (C90A), 또는 ΔAF2 돌연변이로 트랜스펙션시키고, 세포추출물들을 항-플래그 항체로 면역침전시킨 뒤, 항-β-카테닌 항체에 대해 이뮤노블랏팅하였다. (B) RORα WT, DBD 돌연변이 (C90A), 또는 ΔAF2 돌연변이의 도입은 사이클린 D1 프로모터 리포터의 TCF/β-카테닌-매개활성을 억제하였다. 데이터는 세 번의 독립적 실험들에 대한 평균±표준편차로 나타내었다.
<110> SNU Research and Development Business Foundation <120> Screening methods for anticancer agents by using ROR alpha. <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shROR alpha 1 <400> 1 cggugcgcag acagagcuau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shROR alpha 2 <400> 2 gagguaucuc aguaacgaag a 21 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh beta catenin <400> 3 guccuguaug agugggaac 19 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shNS <400> 4 cuggacuucc agaagaacau c 21 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siPKC alpha <400> 5 gauccgcguc cuguuguaug aaauuucaag agaa 34

Claims (8)

  1. 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포에 잠재적인 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 세포내 RORα의 인산화(phosphorylation)가 대조구(상기 세포에 상기 잠재적인 물질을 접촉시키지 않은 시험구) 대비 증가하는 것을 확인하는 단계; 및
    상기 RORα의 인산화를 증가시키는 상기 잠재성 물질을 항암제로 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 RORα의 인산화(phosphorylation) 수준을 측정하는 방법은 전기영동법, 형광분석법, 질량분석법, 면역분석법, 및 PCR법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 면역분석법은 항-포스포(phospho)-RORαS35 IgG에 대한 이뮤노블랏(immunoblot) 분석인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 RORα의 인산화(phosphorylation) 수준을 측정하는 방법은 Wnt 표적 유전자들의 발현 수준을 분석하는 것임을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 Wnt 표적 유전자들의 발현 수준을 분석하는 방법은 이뮤노블랏(immunoblot) 분석인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 Wnt 표적 유전자들의 발현 수준을 분석하는 방법은 RT-PCR 분석인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 대장암 세포인 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  8. 시험자로부터 세포를 채취하는 단계;
    상기 시험자로부터 채취된 세포에서 세포내 RORα의 인산화(phosphorylation) 률을 측정하는 단계; 및
    상기 RORα의 인산화 정도가 정상인의 수치와 비교하여 낮은 수준인 경우를 암발생 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 방법.
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