KR20100075478A - 눈물 샘플의 성분들의 농도를 측정하기 위한 장치 - Google Patents

Abstract

의학적 진단 방법은 감지 표면이 제공된 표면 플라스몬 공진 장치를 사용한다. 환자의 눈으로부터의 눈물 샘플이 상기 감지 표면과 접촉하도록 위치된다. 그 후에 상기 표면 플라스몬 공진 장치는 상기 눈물 샘플에서 염 및 항원 분석대상물들과 같은 용질의 농도들을 판단하도록 작동된다.

Description

눈물 샘플의 성분들의 농도를 측정하기 위한 장치{DEVICE FOR MEASURING CONCENTRATIONS OF CONSTITUENTS OF TEAR SAMPLE}

본 발명은 눈물의 선택된 성분들을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 다양한 눈 질병의 진단에 유용하다.

안구 건조증(dry eye syndrome), 또는 건성 각결막염(keratoconjunctivitis sicca, KCS)은 안과에서 가장 빈번하게 규명되는 진단중의 하나이다. 현재 추정으로는 미국에서 대략 4-6천만명이 안구건조증을 보인다고 간주한다. 안구건조증의 발병에 대한 정확한 통계 데이터가 부족한 것은 최신식 진단 장비가 부족한 것이 큰 이유이다. 그러나, 더 불안감을 주는 경향은, 증상 환자들이 항상 용이하게 확인되지 않기 때문에, 안구건조증의 오진 또는 초기 발견에서 완전히 벗어나는 것이다.

더 효과적인 진단을 추구하는 것은 이 나라에서 사용가능한 안과적 관리의 패러다임을 강화할 것이다. 제약업계는 이 점을 인지한다. 안구건조증을 치료하기 위한 제1 처방 약들이 현재 시장에 나오고 있고, 다음 24개월안에 더 많이 나올 것이나, 진단 및 치료를 모니터하기 위한 방법은 아직 문제로 남아있다.

안구건조증을 진단하고 이의 치료의 효과를 모니터하는 것 모두에 대한 '골드 스탠다드(gold standard)' 테스트가 없다. 인기있는 방법은 증상들의 주관적 관찰 및 객관적 테스트들(예, 쉬르머 테스팅(Schirmer testing), 염색 기술들(staining techniques) 및 눈물 파괴 시간(tear break-up time)) 매트릭스인데, 이 중 어떤 것도 안구건조증의 검출 또는 이의 심각성을 측정하는데 특정되지 않는다.

안구건조증을 겨냥한 최근 약제학적 발전들을 고려할 때, 진단 기술들의 적시의 및 병행한 발전이 필요하다.

눈물의 오스몰 농도(osmolarity)-거기에 용해된 고체들의 정도-는 안구건조증의 존재 및 심각성의 지시약(indicator)으로서 해당 분야의 전문가들에 의해 일반적으로 수용된다. 눈물 오스몰 농도의 측정과 연관되는 가장 흔한 기구는 삼투압계(osmometer)이나, 기술적 한계들이 1차적 연구 환경들에 대한 눈물 삼투압계의 사용을 제한한다.

삼투압계는 물에 용해된 용질들의 농도를 측정하는 장치이다. 이것이 다른 분야들에서 넓게 사용되지만, 삼투압계는 다른 것들중에서 독성학 및 정신적 외상 경우에 오스몰(osmol) 갭(gap)을 결정하는 것, 만니톨(mannitol) 치료 주입들을 모니터하는 것, 수술 절차들에서 세척액을 갖는 글리신 섭취에서 흡수를 모니터하는 것과 같은 적용에서 의학에서 사용된다.

눈물 오스몰 농도를 측정하기 위한 이 기술의 적절성에도 불구하고, 현재 장치들은 임상적 환경에서 그들의 광범위한 사용을 방지하는 특정 한계들을 보인다. 가장 일반적인 문제는 샘플 크기와 관련이 있다.

거의 모든 상업적으로 이용가능한 삼투압계들은 밀리미터-크기 샘플들을 측정하도록 설계된다 (그리고 아마도 기술적으로 제한된다). 환자들로부터 추출한 눈물 샘플들은 나노리터 부피이기 쉽고 더 복잡한 문제들은, 안구건조증 환자들은 일반적으로 눈물이 적고 눈물 샘플들을 훨씬 어렵게 만든다. 나노리터 샘플 크기들을 측정하도록 설계된 삼투압계는 더 이상 상업적으로 이용가능하지 않고 임상적 환경에서 실제로 사용하기에 복잡하다. 그 결과 시술하는 안과의사들이 이 일반적인 질환을 정확하게 검출하기 위한 무계획적인 방법 및 부적절한 도구들이 있다는 것이다.

안구건조증

안구건조증은 눈물막(tear film)의 3개 요소, 즉 점액층, 수성층 및 지방층 중 하나 이상의 감소된 생성이 특징인 질병들의 복합적인 그룹이다. 눈물막 요소들의 하나에서의 결핍(deficiency)이 눈물막 안정성의 손실로 이어질 수 있다. 보통의 시력은 촉촉한 안구 표면에 의존하고 전제조건으로서 충분한 질의 눈물들, 눈물막의 정상적 조성물, 규칙적인 깜박임 및 정상적 눈꺼풀 감김을 필요로 한다. 치료하지 않은 채 방치하면, 안구건조증은 결막 및 각막 상피에서의 진행하는 안과적 변화, 불편함, 각막 궤양화를 초래할 수 있고 심지어 궁극에는 시력상실로 이어질 수 있다.

표준 치료는 눈물 대체 요법이었는데, 이는 인간 눈물막 모방 또는 눈물막의 더 정교한 저삼투압 버전을 제공하는 것 중 어느 하나를 시도하는 것이다. 불행히도, 안구건조증이 가벼운 단계를 넘어 진행될 때, 이러한 통상의 요법은 효과가 덜 하게 된다. 또한, 이러한 치료들은 안구건조증의 병인에 대처하지 않는다.

안구건조증이 증가한 정확한 메커니즘들은 현재 알려지지 않고 수년간 많은 논쟁중이다. 여러 개의 상이한 메커니즘들이 최근 수년간 안구건조증의 가능한 병인으로서 제안되어 왔는 바, 일반적 생각은 안구 표면을 미끄럽게 하는 눈물막의 질의 문제에 의해 주로 발생한다는 것이다. 더 최근의 연구는 안구건조증은 노화와 동반되는 호르몬 상태에서의 감소의 결과일 수 있거나 (폐경후 여성에게 더 현저함) 안구 표면의 면역 기반 및 후천성 염증 질환을 가질 수 있다는 것들을 제안한다. 안구건조증의 기타 원인들은 특정 약물(즉, 항히스타민제, 베타-차단제), 특정 전신성 염증성 질환들(즉, 류마티스 관절염)과의 연관성, 기계적 원인들(즉, 불완전한 눈꺼풀의 감김), 전염성 원인들(즉, 바이러스성 전염들), 및 특정 신경성 원인들(즉, 라식 수술들 (LASIK procedures))로부터 발병할 수 있다. 안구건조증의 가능한 발병 인자들을 알게 된 최근의 수확에도 불구하고, 적절한 진단 기준, 객관적 진단 테스트의 특정 목적들, 진단에서 주관적 증상의 역할, 및 결과들의 해석에 대한 합의가 되지 않았다.

안구건조증의 증상들은 하나의 개별적인 증상에서 다른 증상까지 상당히 다르다. 대부분 환자들은 이물감, 따갑고 일반적인 안구 불편함을 호소한다. 불편함은 전형적으로 가렵고, 건조하고, 아프고, 모래가 든 것 같고, 예리하거나 따가운 느낌으로 묘사된다. 불편함은 안구건조증의 전형적 특징인데 그 이유는 각막에 감각의 신경 섬유들이 풍부하게 제공되기 때문이다.

높은 일반성에도 불구하고, 안구건조증은 항상 진단하기 용이한 것은 아니다. 증상을 보이는 아주 많은 환자들이 경증 내지 중간의 심각함을 갖는다. 이러한 환자들이 정말로 불편함을 겪을지라도, 안구건조증의 객관적 신호들을 놓칠 수 있고, 적절한 진단 없이, 환자들은 이 질환이 적절하게 만드는 주목 및 치료를 받지 못할 수 있다. 안구건조증의 신호들 및 증상들은 전염성, 알러지성 또는 자극성 결막염과 같은 기타 질환의 증거로서 오진될 수 있다. 진단에서 이러한 복잡성을 고려할 때, 안구건조증의 진단율은 20%로 추정된다.

여러 제약사와 연구 사이트들은 안구건조증에 대처하고 완화하는 약품들을 제형화하고 있고, 많은 것들이 그들의 치료 버전의 FDA 3차 시험 중이다. 이 명세서 작성하는 날에, 안구건조증에 대한 치료를 위한 제1 처방 제품이 시장에서 구입가능하고, 2004년 초로 출시가 계획된 다른 것들 및 2005년 및 2006년에 출시가 계획된 두 개의 출시가 뒤따른다. 안구건조증의 발병을 객관적으로 측정할 용이한 방법이 없이, 의사들은 늦거나 오진 중 하나로 약물의 주관적 조제를 하도록 남겨질 것이다.

현재의 객관적 진단 방법들

안구건조증의 진단은 전형적으로 임상적 검사로 시작한다. 쉬르머 테스트는 보통 표준화된 여과지 스트립들을 아래 눈꺼풀의 중간과 외측 1/3 사이 연결부에 놓음으로써 수행된다. 5분 후에 5 mm이하가 젖었다면, 수성 눈물-결핍이 존재한다고 믿어도 되는 이유가 된다. 이 테스트는 신속하고, 저렴하고 결과가 즉각적이지만, 대략의 추정만을 제공할 분이고 보통의 안구건조증에서 신뢰할 수 없다.

염색법은 플루오레세인 또는 로즈 뱅갈(Rose Bengal) 중 어느 하나로 안구건조증을 진단하는 다른 방법이고, 훈련된 의사는 건조를 가리키는 세극등 관찰하에 패턴들을 찾을 수 있다. 다른 테스트인 눈물 파괴 시간은 눈물막의 안정성의 측정이다. 보통 눈물막은 약 10초 후에 파괴가 시작되고 안구건조증 환자들에서 가속된다.

눈물 오스몰 농도를 측정하는데 일반적으로 사용되는 삼투압계는 1960년대에 개발된 클리프톤 다이렉트 리딩 나노리터 오스모미터(Clifton Direct Reading Nanoliter Osmometer)(뉴욕 하트포드의 클리프톤 테크니컬 피직스(Clifton Technical Physics))이다. 원래 눈물을 측정하는데 사용되도록 의도되지는 않았지만, 이는 용액의 나노리터 부피를 측정할 수 있는 몇 도구들중 하나이고 안과에 사용할 방법을 찾았다.

클리프톤 삼투압계는 수 년동안 한정된 양만 제조되었고, 연구소 외부에서 일상적으로 사용되지 않는다. 이는 어는점 내림(freezing point depression)이라는 공지된 측정 기술에 기반한다. 클리프톤 삼투압계는 눈물의 어는점 내림을 측정함으로써 오스몰 농도를 측정한다. 어느점 내림 측정에서, 보통 0℃에서 어는 물이, 용해된 용질의 존재 하에 어는점 내림이 일어나고, 이 어는점 내림의 수학적 관계식은 (Raoult's Law),에 의해 정의된다.

이 테스트가 정확할 수 있을지라도, 이는 측정을 하는데 매우 훈련된 조작자를 필요로 한다. 이 테스트는 현미경에서 눈물방울의 분획 부피(fractional volume)를 광학적으로 조사함으로써 '내림'을 모니터한다. 사용가능성의 제한 및 부족 때문에, 이 분야에서 몇 개의 유닛만 남은 것으로 보인다. 또한, 각 측정은 15분 동안 측정할 수 있는데, 이는 작은 샘플 부피와 결합하여 클리프톤 삼투압계의 사용이 매우 지루하고 불편한 공정으로 만든다. 필요한 시간의 양 및 요구되는 작동 기술은, 상기 유닛들이 사용가능하다고 하더라도, 바쁜 업무 또는 임상에 허용가능하지 않다.

일상적 조사를 수행하는 의사의 손에 바로 필요한 것은 확인, 추적, 및 초기 단계에서 처치 및 약물의 투여를 도울 수 있는 간단하고 정확한 장치이다.

이는 또한 기타 눈 질병의 조기 검출을 촉진하고, 증가된 눈물막 증발에 기반한 안구 건조 질병과 감소된 눈물 분비에 기반한 안구 건조 질병과 같은 상이한 유형의 안구 건조를 구별하는 것에 이로울 수 있다. 눈물샘 질병 때문인 안구 건조는 수성 눈물 생성에서 뿐만 아니라 눈물샘에 의한 단백질의 분비의 감소에 의한 감소를 야기한다. 이 질병 질환에서, 눈물 오스몰 농도는 증가되는 반면, 단백질의 농도는 감소된다. 대조적으로, 큰 안검열 폭 또는 마이봄선 기능 장애가 흔한 원인인 증발성 안구 건조 질병에서, 오스몰 농도는 증가하고 단백질 농도 역시 증가한다. 따라서, 이 두 질환을 구별하기 위하여, 임의의 주어진 눈물 샘플의 농도를 아는 것이 유용하다.

본 발명은 하나 이상의 눈 질병의 진단을 촉진하기 위한 장치 및/또는 관련 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명은 염 농도 및 단백질 농도와 같은, 눈물 샘물의 적어도 두 요소의 농도를 측정하는 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 장치는 안구건조증의 진단을 위하여 눈물의 오스몰 농도를 측정한다.

본 발명은 종래 삼투압계 및 특히, 나노리터 크기 샘플들의 오스몰 농도를 측정하는 것의 내재적 문제들의 적어도 일부를 방지하는 장치를 고려한다. 바람직하게, 상기 장치는 사용하기 간단하고, 의사 및 환자에게 비용 효율적이고, 정확하고, 이에 따라 기본적으로 연구 설정으로 국한되는 눈물 삼투압계에 연관된 문제들을 극복한다.

본 발명은 눈물 샘플에서 분석대상물 또는 특히 항원들을 포함한 화학적 마커들을 바람직하게 검출하기 위한 감지 플랫폼으로서 부분적으로 표면 플라스몬 공진(surface plasmon Resonance, SPR) 기술을 사용한다. 일반적 전략은 SPR 센서 표면상 특정 항체들을 고정시키는 것을 포함하는 바, 이는 그들의 각 화학적 마커들, 예를 들어 항원들에 특이적인 신호 발생을 야기할 것이다.

눈물 샘플에서 분석대상물들 또는 항원들과 같은 용질을 검출하기 위하여 SPR 감지 표면상 고정되는 항체들을 사용하는, 본 발명의 이 특징은 눈물 샘플에서 항원 분석대상물들의 알려지는 농도들은 눈 질병들 및 질환들의 진단을 촉진할 수 있다는 것을 인지한다. 예를 들어, 눈물샘 질병 때문인 안구 건조는 수성 눈물 생성의 감소 및 눈물막 오스몰 농도의 증가는 물론 눈물샘에 의한 단백질 분비에서의 감소를 야기한다. 이 질병 질환에서, 눈물 오스몰 농도는 증가되는 반면, 단백질의 농도는 감소된다. 대조적으로, 큰 안검열 폭 또는 마이봄선 기능 장애가 흔한 원인인 증발성 안구 건조 질병에서, 오스몰 농도는 증가하고 단백질 농도 역시 증가한다. 따라서, 이 두 질환을 구별하기 위하여, 임의의 주어진 눈물 샘플의 농도를 아는 것이 유용하다.

본 발명은 SPR이 총 단백질 농도를 측정할 수 있고 단백질 분석을 위한 많은 응용과 같은 데에서 사용될 수 있음을 인지한다. 본 발명은 나노리터 눈물 샘플에서 단백질의 농도를 측정하기 위하여 SPR 눈물 삼투압계의 사용을 고려한다.

본 발명은 부분적으로 특히 인간 눈물을 포함하는 용액의 나노리터 부피에서 하나 이상의 용질 또는 분석대상물의 농도를 측정하는 장치에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 장치는 인간 눈물 샘플에서 하나 이상의 항원 용질 또는 분석대상물의 농도를 측정한다. 장치는 표면 플라스몬 공진 분광기(spectroscope)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 장치는 전형적으로 레이저인 광원, 렌즈, 거울, 프리즘, 박막 감지 표면 및 광 검출기를 포함한다. 장치는 또한 미가공 데이터를 분석하고 테스트되는 용액의 용질 또는 분석대상물 농도값을 출력하도록 프로그램되는 컴퓨터를 포함한다.

표면 플라스몬 공진(SPR)은 소정 각도에서 금속 유전 인터페이스상에 빛이 입사될 때, 반사되는 빛이 소멸되도록, 발생하는 현상이다. 입사광의 소정 각도에서, 반사되는 빛의 강도는 수학적 방정식에 의해 잘 정의되는 감소하는 강도의 특징적 곡선을 보인다. 반사되지 않는 빛의 에너지는 금속 표면에 의해 흡수되고 금속에서 전자의 진동 모드(공진)를 야기한다. 표면 플라스몬 공진의 첫 직접 측정은 1959년에 관찰되었고, 이는 1970년데 전반에 과학적 연구 커뮤니티에서 폭넓게 연구되었다. 과학자들은 굴절율, 금속 박막의 특성을 측정하는 것과 같은 것에 기술을 이용하였고 1982년에 와서야 SPR이 화학적 센서로서 유용할 수 있다는 것이 제안되었다. 그 이후로, SPR은 다양한 어플리케이션에서 사용되는 다목적 기술로 성장하였다. 이들은 빛 흡수력(absorbance) 연구, 바이오-동태학 및 바이오-감지 측정, 벌크 액체 측정, 가스 검출, 굴절율 측정 및 박막 정의를 포함한다. 1992년에, SPR 시스템들이 분자 크기 연구용 새 측정 도구로서 시장에 상업적으로 나타나기 시작했다. SPR의 주요 매력중의 하나는 측정의 내재적 민감도였고 기타 형태의 분광기 측정에서 발견되는 결점들을 보충하는 것이었다.

SPR 측정 시스템의 필수 요소들은 상대적으로 간단하다. 주로 레이저 소스, 간단한 렌즈, 박막 감지 표면 및 검출기로 구성되어, 시스템은 적은 노력으로 소형으로 제조될 수 있다. 감지 표면의 하나의 버전은 증발된 박막 기술의 수단에 의해 유리상에 증착되는 50 나노미터 두께의 금 박막으로 구성된다. 얇은 금 코팅은 실시에 있어서 상당한 경험이 없거나 발생하는 현상에 필요한 정확한 두께를 달성하기 위하여 반복 수행에 의하지 않고는 어렵다. 그러나, 강한 SPR 신호를 생성하고, 오래가고 눈물 오스몰 농도 측정에 잘 어울리는 발생하는 권리의 막박 코팅의 제조를 위하여 본원에 공정이 개시된다.

본 발명에 따른 테스트 방법은 표면 프라스몬 공진 장치를 제공하는 단계, 감지 표면을 구비하는 표면 플라스몬 공진 장치를 제공하는 단계, 환자의 눈으로부터의 눈물 샘플을 감지 표면에 접촉하여 배치하는 단계, 및 눈물 샘플의 하나 이상의 용질 또는 분석대상물 농도를 결정하기 위하여 표면 플라스몬 공진 장치를 작동하는 단계를 표함한다. 전형적으로, 용질 또는 분석대상물은 항원이고 항원 용질 또는 분석대상물에 대한 항체와 제공되는 감지 표면으로 측정된다.

표면 플라스몬 공진 장치가 광 감지 장치 및 상기 광 감지 장치에 작동되도록 링크되는 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 포함하는 경우, 표면 플라스몬 공진 장치는 컴퓨터에 감지 표면에 의한 빛 흡수의 패턴을 인코딩하는 전기적 신호를 전송하기 위한 광 감지 장치를 작동하는 단계 및 광 감지 장치로부터의 이미지를 분석하기 위하여 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동하는 단계를 포함한다.

컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 것은 바람직하게 흡수선 위치를 (항원) 용질 또는 분석대사물 농도를 갖는 흡수선 위치에 연관되는 미리 기록된 데이터와 비교하기 위하여 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 표면 플라스몬 공진 장치를 작동하는 것은 컴퓨터에 초당 다중 전기적 신호들을 전송하기 위하여 광 감지 장치를 작동시키는 단계를 포함하는 바, 여기에서 전기적 신호들의 각각은 감지 표면에 의한 광 흡수의 패턴을 인코드하고, 전기적 신호들은 적어도 하나의 미리 설정된 시간 간격에 의해 서로 분리된다. 또한, 컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 전기적 신호들의 각각에서 인코드되는 광 흡수의 패턴을 분석하기 위하여 작동된다.

SPR 장치로 눈물 오스몰 농도를 측정할 때, 하나는 제1 몇 밀리세칸드 내에서 수득되는 SPR 신호의 부분을 분석한다. 염 용액 및 단백질 둘 다를 포함하는 눈물 용액의 주어진 샘플에 대하여, 염 용액은 감지 표면으로 신속히 이동하는 작은 분자 또는 이온을 포함한다. 더 부피가 큰 단백질은 감지 표면에 도달하고 결합되는데 더 많은 시간이 소요된다. 두 파트 시간에 기반한 측정을 함에 따라, 하나는 염의 농도(오스몰 농도)를 반영하는 제1 신호 및, 염 및 단백질이 감지 표면에 결합하는 단백질 농도 둘 다를 반영하는 제2의 큰 신호를 측정한다. 하나는 간단한 신호 추출 및 분석을 통하여 단백질의 농도(즉, 큰 신호보다 작은 신호가 단백질 농도에 비례적임)를 결정한다.

광 흡수의 패턴의 컴퓨터 분석은 예를 들어 흡수선 위치들 또는 감지 표면에 의한 최대 흡수의 각도들을 결정한다. 따라서, 표면 플라스몬 공진 장치를 작동하는 것은 더욱 특정하게 표면 공진 각도 또는 전기적 신호들의 각각으로부터 흡수선 위치들을 결정하기 위하여 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 포함한다.

이러한 공진 각도들 또는 흡수선 위치들은 제1 공진 각도 또는 전기적 신호들의 제1의 것 및 제2 공진 각도와 임시적으로 연관되는 흡수선 위치, 또는 전기적 신호들의 나중이 것과 연관되는 흡수선 위치를 포함한다. 그 후에 표면 플라스몬 공진 장치를 작동하는 것은 제1 공진 각도 또는 제1 용질 농도값을 결정하기 위하여 제1 공진 각도 또는 흡수선 위치를 제1 캘리브레이션 표(calibration table)에 있는 것과 비교하기 위하여, 생성된 공진 각도 또는 흡수선 위치를 결정하기 위하여 제1 공진 각도 또는 흡수선 위치 및 제2 공진 각도 또는 흡수선 위치를 서로 추출하기 위하여, 및 제2 용질 농도를 결정하기 위하여 생성된 공진 각도를 제2 캘리브레이션 표에 있는 것과 비교하기 위하여 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 것을 추가로 포함한다.

표면 플라스몬 공진 장치는 휴대용 프로브의 형태를 취할 수 있다. 이 경우에, 눈물 샘플을 배치하는 것은 감지 표면을 환자 눈의 눈물이 고인 부분에 접촉하도록 프로브를 조작하는 단계를 포함한다. 또한, 감지 표면을 구비하는 표면 플라스몬 공진 장치를 제공하는 것은 프로브의 작동하는 부분(tip)상에 미리 설정된 위치에서 시스(sheath)를 운반하는 금속 막을 배치하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 대안적 방법에 따라, 눈물 샘플을 배치하는 것은 환자의 눈에서 눈물 샘플을 추출하는 단계 및 상기 눈물 샘플을 감지 표면에 증착하는 단계를 포함한다. 눈물 샘플은 마이크로피펫(micropipette)을 사용하여 추출 및 증착될 수 있다. 대안적으로, 눈물 샘플은 압지(blotter paper)와 같은 흡수성 다공성(porous) 물질을 사용하여 추출 및 증착될 수 있다.

본 발명은 제1 용질 농도가 염 농도라는 것을 고려한다. 이는 염이 눈물 샘플의 기타 용질 요소들보다 감지 표면으로 더 신속하게 이동하기 때문이다. 수반되는, 눈물 샘플의 염 농도에만 상응하는 흡수선 위치 또는 감지 표면 공진 각도를 수득하기 위하여, 다른 용질들(예, 단백질, 박테리아)의 임의의 상당량이 감지 표면으로 이동할 충분한 기회를 갖기 이전에 측정을 수득하는 것이 필요하다. 그 상황에서, 흡수선 또는 기본 위치(용매, 물에 의하고 임의의 용질에 의하지 않게 결정되는 굴절 각도)에 상대적인 감지 표면 공진 각도는 눈물 샘플의 염 농도만에 의하고 임의의 기타 용질 농도에 의해서는 아니다. 바람직하게, 제1 측정은 눈물 샘플이 감지 표면에 접촉하자마다 수득된다. 그러나, 감지 표면상 눈물 샘플의 증착 시간으로부터 약 1/30초만의 지연은, 개시 비디오 신호가 기타 물질들의 농도 때문에 오차가 적거나 없게 염 농도를 포획하기에, 일반적으로 충분히 신속하다. 부수적으로, 측정 프로브가 눈물 샘플을 수득하기 위하여 눈 표면에 접촉하는 경우, 이 처음 신호는 물론 여러 개의 추후 측정들도 반드시 측정되어야 하는 반면, 프로브는 여전히 눈에 접촉하고 있다.

본 발명에 따른 의학적 진단 시스템은 환자의 눈으로부터 눈물 샘플을 접촉하기 위한 감지 표면을 구비하고, 광 감지 장치를 추가적으로 구비하는 표면 플라스몬 장치, 및 감지 표면에 의하여 광 흡수의 패턴을 인코딩하는 전기적 신호를 그로부터 접수하기 위한 광 감지 장치에 작동가능하게 연결되는 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 포함한다. 컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 감지 표면에 접촉하는 눈물 샘플의 용질 농도와 관련되는 파라미터를 결정하기 위하여 광 감지 장치로부터의 데이터를 분석하도록 프로그램된다.

광 감지 장치는 전하 결합 소자와 같은 카메라일 수 있다. 그 경우에, 전기적 신호는 비디오 신호이다. 대안적으로, 광 감지 장치는 다중 요소 포토다이오드 및 전기적 신호일 수 있다. 그 후에 전기적 신호는 아날로그 차동 신호이다.

컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 바람직하게 흡수선 위치를 용질 농도를 갖는 흡수선 위치에 연관되는 미리 기록된 데이터와 비교하기 위한 수단을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 플라스몬 표면 공진 장치는 작동하는 부분상의 감지 표면을 환자 눈의 눈물 맺힌 부분과의 접촉을 촉진하도록 적용되는 작동하는 부분을 갖는 핸드헬드 휴대용 케이싱을 포함한다.

본 발명에 따른 플라스몬 표면 공진 장치의 감지 표면은 크롬(chromium)과 같은 제2 금속의 제2 층상에 배치된 금과 같은 제1 금속의 제1 층을 포함할 수 있다. 물론, 금속의 배합들 또는 신호 층들이 유용하다고 증명될 수 있다.

염 이외의 용질의 농도가 측정되어야 하는 경우, 감지 표면은 또한 특정 용질 또는 모이어티(moiety)에 대한 항체를 구비하여 제공된다. 항체는 예를 들어 항체 선들의 티올 그룹들(thiol groups)에 의해 조정되는 화학흡착에 의해 감지 표면의 금속 층들에 부착될 수 있다. 그리고 관련된 항체를 부착하는 것에 의해, 눈물의 임의의 항원의 농도가 측정될 수 있다.

본 발명의 특징은 보통 및 안구 건조 환자와 연관되어 전형적 부피인, 눈물의 나노리터 부피를 측정하는 능력이다. 장치는, 눈물의 오스몰 농도 수준이 안구 건조의 삼각성과 연관성이 있다고 공지되었으므로, 안구건조증의 존재 및 정도를 결정하는데 유용하다. 오스몰 농도의 측정은 샘플이 감지 표면에 배치되는 거의 즉시 수득되고, 따라서 착오가 일어날 수 있는 증발의 문제를 접하지 않는다.

도 1은 본 발명에 따른 삼투압계의 기본 요소들을 도시하는 단면에서 광학적 개략도이다.
도 2a는 샘플이 감지 표면상에 없을 때 도 1의 삼투압계의 CCD 카메라에 의해 보여지는 이미지의 도면이다.
도 2b는 소정 염 농도를 갖는 샘플이 감지 표면상에 있을 때 도 1의 삼투압계의 CCD 카메라에 의해 보여지는 이미지의 도면이다.
도 2c는 증가된 염 농도를 갖는 샘플이 감지 표면상에 있을 때 도 1의 삼투압계의 CCD 카메라에 의해 보여지는 이미지의 도면이다.
도 3a는 샘플이 도 1의 삼투압계의 감지 표면상에 증착될 때 표면 플라스몬 공진이 발생하는 경우 특징적 강도 대 각도 만곡 위치를 도시하는 그래프이다.
도 3b는 도 1의 삼투압계의 감지 표면에 배치되는 두 개의 상이한 샘플로부터의 결과 및 특징적 만곡에서 생성된 이동을 도시하는 그래프이다.
도 4a는 본 발명에 따른 삼투압계의 더 상세한 광학적 개략도이다.
도 4b는 감지 표면, 반원통형 프리즘, 샘플 용액, 및 광선 경로를 더 상세히 도시하는 광학적 도면이다.
도 4c는 더 넓은 선을 생성하기 위하여 빔이 갈라지도록 허용될 때 CCD 카메라상의 이미지를 도시하는 도면이다.
도 5는 환자 눈 및 마이크로피펫으로 환자로부터 눈물을 추출하는 과정을 보여주는 마이크로피펫의 개략도이다.
도 6a는 전체 레이저선 이미지를 덮는 용액 한 방울을 갖는 도 4a의 삼투압계의 감지 표면의 개략적 평면도이다.
도 6b는 CCD 카메라에 의해 보여지는 상응하는 이미지의 표시이다.
도 6c는 레이저선 이미지의 절반만을 덮는 한 방울의 용액을 도시하는 도 6a와 유사한 도 4a의 삼투압계의 감지 표면의 개략적 평면도이다.
도 6d는 CCD 카메라에 의해 보여지는 상응하는 이미지의 표시이다.
도 7a는 레이저 선 이미지의 작은 부분을 덮는 나노리터 방울을 갖는 도 4a의 삼투압계의 감지 표면의 개략적 평면도이다.
도 7b는 CCD 카메라에 의해 보여지는 상응하는 이미지의 표시이다.
도 7c는 레이저 선 이미지를 따르는 여러 포인트를 덮는 4개의 나노리터 방울을 도시하는 도 7a와 유사한 도 4a의 삼투압계의 감지 표면의 개략적 평면도이다.
도 7d는 CCD 카메라에 의해 보여지는 상응하는 이미지의 표시이다.
도 8a는 감지 표면상 두 개의 상이한 샘플을 위치하는 결과를 도시하는 그래프이다. 이는 광의 강도가 축소되는 것과 그 후에 CCD상에 떨어지는 검은 선을 다시 나타내는 상승을 보인다. 두 곡선의 이동은 오스몰 농도에서의 변화를 나타내고 또한 원형 시스템에 존재하는 잡음 요소(noise component)를 도시한다.
도 8b는 두 개의 곡선 사이의 이동을 결정하는 방법에 맞는 직선을 도시하는 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 데이터 획득 단계를 도시하는 도 4a 의 삼투압계를 사용하여 발생되는 이미지들을 표시한다.
도 9c는 눈물의 오스몰 농도를 결정하기 위하여 SPR 신호의 컴퓨터 또는 마이크로프로세서에 의해 수행되는 분석 및 공정을 도시하는 그래프이다.
도 10a는 본 발명에 따른 삼투압계에서 사용가능한 사분면(quadrant) 포토다이오드 검출기의 개략적 전면도이다.
도 10b는 사분면의 각 절반상에 겹쳐놓은 두 개의 SPR 신호를 도 10a와 유사하나 더 크게 도시한다.
도 11은 축소되고 간결화된 도구인 핸드헬드 프로브의 형태의 핸드헬드 SPR 눈물 삼투압계의 개략적 사시도이다.
도 12는 도 11의 공막 부위에서 눈의 눈물막에 접촉하는, 핸드헬드 SPR 눈물 삼투압계 프로브의 개략적 부분 측면도이다.
도 13은 1회용 감지 표면 및 시스, 보호 쉘, 광학 코어 및 후면 쉘을 유지하는 요소를 도시하는 도 11 및 도 12의 SPR 눈물 삼투압계 프로브의 개략 분해도이다.
도 14는 광학 코어 SPR, 눈물 삼투압계 프로브의 출입하는 상세한 광학 개략 및 광선 경로를 도시한다.
도 15는 본 발명에 따른 삼투압계의 감지 표면위에 마이크로피펫을 정확하게 위치시키는 정밀 마이크로피펫 홀더의 개략적 사시도이다.
도 16은 본 발명에 따른 SPR 삼투압계의 금 감지 표면상에 항체를 고정시키는데 사용되는 화학 요소의 도면이다.
도 17은 도 16의 항체를 티올화하기 위한 수식(scheme)의 도면이다.

본 발명은 첨부된 도면에서 도시되는 실시예들을 참조하여 실시예의 방법으로 더 상세히 개시될 것이다. 다음의 개시되는 실시예들은 예로서만 제시되고 본 발명의 개념을 임의의 소정의 물리적 구성으로 제한하도록 이해되어서는 안된다는 것을 유념해야 한다.

본 발명의 바람직한 실시예가 도 1의 단면에서 도시된다. SPR 분광기에서, 감지 표면을 치는 입사광이 어느 각도에서 반사가 0으로 축소되는지에 흥미가 있다. 레이저로부터의 광은 원통형 렌즈(102)에 의해 각이 진 거울(104)로부터 금 코팅된 감지 표면(108)상의 선 이미지(106)로 반사된 후 초점이 모아진다. 레이저 빔이 한 점에 모이기(110) 때문에, 광의 다중 각도들이 동시에 감지 표면상에 입사한다. 그 후에 반사된 광(112)이 반대쪽으로 각이 진 거울(116)으로부터 먼저 것으로 반사된 후 제2 원통형 렌즈(114)에 의해 평행하다. 감지 표면상에 샘플이 없다면, 카메라에 의해 보여지는 생성된 이미지는 CCD 상의 모든 픽셀이 도 2a에서 도시된 바와 같이 광의 동일한 양을 보이는 단순한 명시야(202)이다.

본 발명의 주요 목적은 부피가 약 나노리터인 알려지지 않는 용액 샘플의 오스몰 농도를 결정하는 것이다. 오스몰 농도는 필수적으로 물에서 염의 농도이고 밀리오스모(milliosmos)(mOs)의 단위로 표시될 수 있다. 다음의 설명은 어떻게 장치가 뒤따르는 더 상세한 설명과 함께 오스몰 농도에서 변화를 감지하는지를 개략한다.

도 1에 도시된 특정 설정에서, 하나의 작은 물방울이 감지 표면(108)에 도입된다면, 표면 플라스몬 공진이 발생하고, 한 점에 모이는 빔(110)에서 각도들의 하나로부터 광이 감지 표면의 금 층으로 완전히 흡수된다. 카메라(118)에 위해 보여지는 생성된 이미지는 도 2b에 도시되는 바와 같이 이미지에서 검은 수평선(204)을 갖는 동일한 명시야(202)이다. 이제, 염 결정(즉, 식탁용 소금(table salt))이 감지 표면상의 물 방울에 들어간다면, 이미지(206)에서 검은 선은, 염 결정이 필수적으로 귤절율에서 변화를 가리키면서 용해되기(도 2c) 때문에, 명시야(202) 중에서 위로 이동할 것이다. 이는 표면 플라스몬 공진이 발생하는, 즉 한 점에 수렴하는 빔(110)에서 상이한 광선인 광의 각도(델타θ)에서 이동에 상응한다. 누군가 도 2b에서 도시되는 이미지를 가로질러 수직(y) 방향에서 강도를 표시하려 한다면, 특징적 SPR 커브(302)가 수득될 것인바, 이는 수학 방적식에 의해 잘 정의되고 도 3a에 도시된다. 추가적 염을 첨가함으로써 감지 표면상 물 방울의 염 농도를 증가하는 것은 검은 선을 더 수직적으로 움직이게 할 것이다. 누군가 도 2b 및 도 2c에서 검은 선의 강도를 표시하려 한다면, SPR 커브(304)에서 측면 이동이 도 3B에서 델타(θ)(306)으로 도시되는 바와 같이 현상이 발생하는 각도에서의 변화를 가리키는 것으로 보이고 오스몰 농도에서의 변화와 직접 관련된다. 따라서, 캘리브레이션으로, 우리는 알려지지 않은 용액의 정확한 염 농도 또는 오스몰 농도를 결정할 수 있다.

수행 시스템 고려사항

본 발명의 더 상세한 조사가 이제 개시될 것이다. 도 4a에 관련하여, SPR에 기반한 나노리터 눈물 삼투압계는 670nm과 동일한 파장을 갖는 광원으로서 레이저 다이오드 모듈(다이오드 레이저와 평행하고 원형화 광학의 합)을 사용하나, 임의의 다양한 유형의 레이저 소스, 즉 가스, 고형, 반도체 등이 사용될 수 있다. SPR이 발생하게 하기 위하여, 레이저 광은 감지 표면에 평행한 평면에서 편광되어야만 하고, 따라서 편광 필터(404)가 한 평면의 편광을 확실하게 하면서 레이저 빔 사이에 삽입된다. SPR은 사실상 광의 임의의 파장에서 관찰될 수 있으나, 원형이 그 파장에서 기능하도록 설계되었기 때문에 여기에서 670nm('적색')을 사용하여 개시될 것이다.

편광 필터에 이어서, (단초점거리 렌즈 및 핀홀로 구성된) 공간 필터(406)가 임의 잡음의 레이저 빔을 제거하는데 사용된다. 여과되지 않은 레이저 빔들은 공기중의 입자들, 렌즈상의 먼지 등으로부터의 공간 잡음을 포함할 것이고, 결과는 원치않는 회절 패턴들을 갖는 빔일 것인 바, 이는 데이터 분석 동안 이미지 프로세싱에 복잡성을 추가할 수 있다. 공간 필터에서 렌즈 및 핀홀은 필터링을 최적화하기 위하여 소정 레이저 파장을 위하여 선택된다 (즉, 6mm 초점길이 렌즈 및 10 마이크론 지름 핀홀).

공간 필터를 나온 빛은 갈라지고 구형 렌즈(408)에 평행해진다. 평행해진 후에, 빛은 원통형 렌즈(410)에 진입하고 빔은 선 이미지(412)에 집중된다. 눈물 샘플이 배치될 감지 표면(414)은 (가장 간단한 경우에) 수평일 필요가 있는 바, 만일 수직이라면, 눈물 샘플은 떨어질 수 있다. 따라서, 각이 진 거울(416)이 초점에 도달하기 전에 빔을 가로막고 선 이미지를 감지 표면(414)에 수평적으로 배치되도록 방향을 돌린다. (구형 렌즈 대신에) 원통형 렌즈가 사용되는 이유는 포커싱된 선 이미지를 생성하기 위해서이다. 이 선 이미지를 고려하여, 눈물의 샘플은 선상 아무데나 배치될 수 있고 SPR 신호를 볼 수 있을 것인 바, 추가적으로 선 이미지의 길이를 따라 다중 샘플을 배치함으로써 다중 샘플이 한번에 분석될 수 있다.

원통형 렌즈는 한 점에 모이는 원통형 파면 및 감지 표면에 집중된 선 이미지를 생성한다. SPR이 발생하도록, 레이저 광은 유전체 매질(즉, 유리)에 있어야 하고 그 후에 금속 금 감지 표면을 가격한다. 이는 대체로 프리즘의 기저부에 증착된 금을 갖는 등변 프리즘의 수단으로서 완성된다. 그러나, 프리즘의 평평한 페이스들이 매 광선 입자의 굴절을 생성할 것이고, 계산을 간단하게 하기 위하여, 원통형 '프리즘'(417)이 사용된다. 이 프리즘은 광학 유리로 제조된 원통의 절반이다. 이는 소정 유리의 로드(rod)를 센터리스 연삭(centerless grinding)하고 그 후에 외부 지름을 연마(polishing)함으로써 편리하게 제조될 것이다. 그 후에 로드는 원통형의 축을 따라 절반이 연삭(ground)될 수 있고 원통 페이스의 플랫이 연마되어 '반-원통'을 생성한다. 원통형 프리즘을 사용함으로써, 프리즘에 진입하는 모든 광선이 표면에 대해 직각이기 때문에 표면들은 굴절을 도입하지 않는다. 감지 표면은 간단히 원통형 프리즘의 연마된 페이스일 수 있고 금의 박막이 이 표면상에 직접 증착될 수 있다. 그러나, 실행에서, 원통형 프리즘은 전체 반-원통보다 1mm 작게 제조되었고 원통의 평평한 페이스와 동일한 치수를 갖는 동일한 물질의 평평한 유리 플레이트들은 1mm 더 두껍게 제조되었다. 이는 금이 증착되어 감지 표면을 구성하는 이러한 유리 플레이트 중 하나인 바, 프리즘들보다 많은 이러한 플레이트들을 제조하는 것이 더 간단하기 때문이다. 원통형 프리즘 및 증착된 금을 구비하는 유리 플레이트는 굴절율 정합액(index matching fluid)로 함께 모아져서(assemble), 들어오는(incoming) 빛에 대하여 어셈블리(assembly)는 하나의 유닛으로 보인다 (즉, 매질(media)에서 변화가 없고 이런 이유로 원통형 프리즘과 유리 플레이트들 사이의 굴절이 없다). 도 4b는 원통형 프리즘(430) 및 감지 표면상의 샘플 방울(433)과 굴절율 정합액으로 모아진 금 층착된 감지 표면(432)을 도시한다. 추가적으로 434에서 프리즘으로 진입하고 436에서 프리즘을 나가는 다중 각 광선을 도시하는 바, 각 경우에 굴절은 없다.

유리 플레이트들 상으로의 금의 증착은, 금의 정확한 두께가 강한 SPR 신호에 필요하기 때문에, 어려운 공정이다. 상기 복잡성에 더하여, 진공 층착되었을 때, 금은 유리에 매우 잘 부착되지 않고, 표면의 간단한 세정이 증착된 금을 쓸어버릴 것이다. 금을 더 견고하게 하기 위하여, 제1 증착 크롬의 공지 기술이 사용된다. 우리 시스템에서, 2-5 나노미터 크롬이 증착되고 50 나노미터 금이 따라서 증착된다. 실행에서 정확하게 50 나노미터 금을 수득하는 것은 다소 어렵고, 여러번의 시운전이 금의 50과 55 나노미터 사이의 어느 크기의 사용가능한 두께를 얻기 위하여 증발 코팅 챔버들을 캘리브레이션하기 위하여 수행되었다. 이는 사용된 크롬의 양이 또한 중요할 수 있다고 밝혀졌다. 너무 적은 크롬이 사용된다면, 금은 매우 내구성이 있지 않고 핸들링 또는 사용 동안 들려나가게 되기 쉽다. 너무 많은 크롬이 사용된다면, 낮은 SPR 신호가 보이거나 심지어 전혀 보이지 않는다.

프리즘에 진입하는 파면이 한 점에 모이기 때문에, 이는 각도들의 범위가 감지 표면상으로 입사될 것이라는 것을 뜻한다. SPR 최소는 주어진 용액에 대하여 단 하나의 소정 각도에서만 발생한다. 예를 들어, 감지 표면을 둘러싸는 매질이 공기라면, SPR이 발생할 각도 (반사된 강도 최소)는 ~33도일 것이다. 만일 물이 도 4b에서 도시된 바와 같이 방울(433)의 형태로 감지 표면상의 매질로서 도입된다면, SPR은 ~54도에서 발생할 것이다. 본 발명의 목적이 물에 용해된 염의 다양한 농도를 측정하는 것이고, 안구 건조의 존재 및 정도를 결정하는 인간 눈물 오스몰 농도의 범위가 있기 때문에, 장치는 이러한 용액들에 대한 SPR 발생의 범위내에 있는 각도의 범위('동적 범위')를 갖는다. 예를 들어, 우리 시스템은 +/- 5도의 한 점에 모이는 빔을 갖는다. 인간 눈물의 오스몰 농도의 범위는 약 300mOs 내지 400mOs 이다. 이상적 시스템에서, 누군가 1mOs라고 할 정도의 굴절을 할당하고 아주 정확하게 오스몰 농도를 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 실행에서, 오스몰 농도 변화로서 각도에서의 변화는 300-400mOs의 범위에서 약 0.1도로 매우 적고, 이는 신호 검출에서 도전이 된다.

다시 도 4a와 관련하여, 광이 선 이미지에 집중하도록 한 후에, 이는 금 감지 표면으로부터 반사되고 갈라진다. 만일 샘플이 제자리에 있다면, 일반적으로 도 3a 또는 도 3b에 도시된 바와 같이 반사되는 이미지는 검은 선을 보인다. 이 나가는 광은 처음과 반대 각도에 유사하게 배치된 거울(418)에 의해 반사되고 광을 구부려 레이저의 원래 광학 축으로 돌려보낸다. 그 후에 제2 원통형 렌즈(420)이 이 갈라지는 광에 평행하게 된다. 전하 연결된 소자(CCD) 카메러(424)는 광 빔에 대해 수직으로 배칠될 수 있고 검은 선을 갖는 명시야가 추후 프로세싱을 위한 비디오 신호로서 수득된다. 그러나, 각도에서 우리 변화가 약 0.1도로 적기 때문에, 이는 오스몰 농도의 극단치에서, 대략 CCD 카메라에서 픽셀의 크기인 단지 10 마이크론 정도로 검은선의 수직적 이동으로 해석한다. 이미지 프로세싱 기술로 1 픽셀 이하로 선의 이동을 감지하는 것이 가능하지만, 선의 이동은 광학적으로 증가될 수 있다. 대신에, 단초점거리 렌즈(422)가, 원통형 렌즈(420)가 빔을 작은 점으로 집중하고 그 후에 갈라지도록 하는 평행하게 된 빔으로 간 후에, 삽입될 수 있다. 그 후에 만일 CCD 카메라(424)가, 빔이 갈라지도록 된 후에, 배치된다면, 빔은 신속히 커지고, 결과는 도 4c에 도시된 바와 같이 명시야(440)에 둘러싸인 검은 (CCD(442)의 활성 영역의 거의 3/4을 덮는) 큰 검은 선(438)이다. 이 경우에, 검은 선은 이의 이동이 그런 것처럼 많은 픽셀을 덮고 작은 이동이 더 용이하게 검출될 수 있다. CCD상의 이미지는 개인용 컴퓨터(426)에 장착되는 프레임 그래버(frame grabber)(428)로 포착된다.

SPR 분광기를 이용한 눈물 오스몰 농도 측정

시스템 복잡한 사항이 적절하게 개시되었기 때문에, 다음은 이의 나노리터 눈물 삼투압계로서의 사용을 개시할 것이다.

샘플의 나노리터 부피를 취급하는 내재적 어려움이 있는 바, 최대량의 눈물액이 대체로 환자로부터 수집될 수 있다. 환자로부터의 샘플의 추출은 상대적으로 간단하나, 이 샘플을 기구에 삽입하는 것은 어려울 수 있다. 어는 점 내림 기술을 사용한 삼투압계에서, 샘플이 해동될 수 있도록 결빙되어야 하고, 완전한 해동의 지점이 오스몰 농도에 관련된다. 증발의 문제는, 샘플이 작을 때 활동하기 시작하는데, 만일 증발이 발생한다면, 오스몰 농도의 부정확한 판독이 수득될 것이다. 추가적으로, 나노리터 눈물 샘플이 소정 종류의 결빙 메커니즘 (즉, 열전기 냉각 플레이트)으로 놓여져야 하고, 이는 현미경적으로 관찰된다. 간단히, 이는 어는점 내림 삼투압계에 대하여 신뢰할만한 데이터를 수득하기 위하여 매우 어려운 프로세스라는 것 또는 사용하기에 간단한 장치라는 것이 발견된다. 어느 점 내림에 기반한 삼투압계는 더 큰 (밀리미터) 크기 샘플을 측정하는데 훨씬 더 적절하다.

SPR에 대한 흥미있는 사실은 현상이 샘플 크기에 관계없이 발생한다는 것이다. 용액이 감지 표면에 접촉하고 집중된 (선) 레이저 광을 덮는 한, SPR이 발생할 것이다. 원형 장치에서, 집중된 레이저 선의 폭은 대략 5 마이크론이었고, 실험은 나노리터 샘플 부피가 밀리미터 크기 샘플과 동일한 SPR 신호들을 생성한다는 것을 보여준다.

캘리브레이션

눈물 샘플 오스몰 농도를 측정하기 위하여, 장치는 먼저 공지된 오스몰 농도의 용액들로 조성된 실험실의 방식으로 캘리브레이션된다. 염화나트륨을 정확하게 측정하고 3번 증류된 물에 용해시켜 상이한 오스몰 농도를 갖는 여러 용액들을 제조했다. 이 용액들의 각각은 감지 표면상으로 증착되고 동시에 이미지에서 검은 선의 형태가 되었다. 상기 이미지를 포착하는 CCD 카메라로부터의 신호가 개인용 컴퓨터(426)에 장착된 프레임 그래버(428)에 공급되고 이미지는 프레임 그래버에 의해 디지털화되어 컴퓨터에 저장된다 (도 4a). 이 공정은 많은 용액들에 대하여 수행되고 각자에 대한 이미지가 획득된다.

컴퓨터가 검은 선을 갖는 명시야의 여러 이미지들을 갖기 때문에, 이는 용액에서 용액으로 검은선의 수직 이동을 검출한다. 결과는 추후 리콜을 위하여 컴퓨터에 저장되는 캘리브레이션 커브이다. 만일 이제 공지되지 않은 오스몰 농도의 용액이 감지 표면상으로 증착된다면, 컴퓨터는 선의 수직 위치를 찾고, 이를 캘리브레이션 용액 데이터에 비교하고, 밀리오스모스의 단위들에서 공지되지 않은 용액의 오스몰 농도를 출력할 수 있다.

플로우 셀(flow cell)

상이한 오스몰 농도를 갖는 많은 용액들을 감지 표면상에 증착하는, 캘리브레이션의 공정을 더 간단하게 하기 위하여, 펌프 시스템 및 플로우 셀이 구성되었다. 이 시스템은 필수적으로 유체 입력 포트, 작은 보유 챔버, 및 유체 출력 포트로 구성된다. 유닛은 감지 표면 꼭대기에 자리 잡고 실리콘 오링(o-ring)이 감지 표면과 넙촉한다. 이 유닛은 위치가 나사로 고정되고 감지 표면의 상부상의 오링의 압축이 새지않는 밀봉을 형성한다. 입력 포트에 부착된 것은 배관이고, 다른 쪽은 작은 펌프에 부착된다. 펌프의 입력은 캘리브레이션 유체에 이동하여, 이를 플로우 셀로 보내고, 보유 챔버를 통과하여 배출 포트를 통하여 나온다. 일단 유체가 감지 표면상에 내리면, 검은 선이 소정 수직 높이에서 이미지에 나타나고, 이는 컴퓨터에 의해 기록된다. 다른 용액들을 측정하기 위하여, 펌프의 입력으로 인도되는 배관은, 감지 표면을 세척하기 위하여, 먼저 물에 삽입되고 그 후에 처음과 상이한 오스몰 농도의 용액이 뒤따르고, 공정이 반복된다. 이는, 하나의 용액을 손으로 떨어뜨리고, 이미지를 기록하고, 방울을 제거하고, 물로 세정하고, 다음 방울을 적용하는 등과 비교하여, 짧은 시간 동안에 전체 데이터 세트를 컴퓨터에 준다.

눈물 추출

환자로부터의 눈물 추출은 유리 마이크로피펫을 사용하여 수행된다. 세극등 관찰하에, 의사는 눈물액(~200 나노리터)이 마이크로피펫으로 흘리도록(506) 마이크로피펫(502)을 아래 눈꺼풀 근처에 위치한다 (도 5).

마이크로피펫의 팁은 3mm 모세혈관 몸체로부터 약 0.5mm로 내려가게 가늘어지고, 바디에 대한 각도에서 구불어진다. 이는 눈물 추출 동안 피펫의 몸체가 얼굴로부터 떨어지도록 각도를 이룰 수 있고 공정이 오스몰 농도 판독을 왜곡할 수 있는 과잉 눈물 생성을 자극하지 않도록 하기 위해서이다.

이제 눈물 샘플이 마이크로피펫 팁에 포함되었기 때문에, 눈물을 빼내서 정확하게 위치시키는데 어려움이 있다. 이는 일상적으로 손으로 하지만, 상업적 도구에서는, 더 편리한 방법이 필요하다. 공기 압축이 마이크로피펫에서 눈물을 나오도록 강제하기 위해 흘림 동작을 극복하기 위하여 도입되어야 한다. 이는 압착벌브에 의하거나 행해지거나 단순히 끝을 불어서 행해질 수 있다. 나노리터 샘플 부피를 다루는데 지배적 문제는 그들이 너무 작고 샘플 근처의 모든 힘들(즉, 표면장력)이 샘플 덩어리보다 크다는 것인바, 이는 그 결과 무엇이든지 가장 가까이 있는 객체 도는 가장 큰 표면장력을 갖는 객체에 끌려갈 성향이 있다. 눈물이 가벼운 공기 압력으로 마이크로피펫에서 나오도록 강제될 때, 눈물 샘플은 마이크로피펫을 나오려는 경향을 가질 것이고 표면 장력 때문에 피펫의 측면으로 돌려는 경향을 가질 것이다. 그러나, 피렛을 나오는 즉시, 여전히 그 끝에 부착되는 눈물 샘플은 가가이 근접한 다른 표면(즉, 감지 표면)에 놓여지고, 감지 표면으로부터의 표면장력이 샘플을 상기 표면으로 글어당긴다. 이는 상당량의 연습 및 실습이 소요된다. 추가적 복잡한 문제들로, 눈물 샘플은 감지 표면상 집중된 레이저 빔상에 직접 있어야 한다. 따라서, 마이크로피펫에서 눈물 샘플을 끌어내어 감지 표면상에 정확하게 위치시키는 시스템이 고려된다. 하나의 방법은 상업적으로 사용가능한 마이크로디스펜싱(microdispensing) 시스템의 사용이다. 이 시스템은 주사기(이 경우 마이크로피펫)에서 정확한 양의 유체가 나오도록 강제하기 위하여 정밀한 공기 압력을 사용하고, 이는 마이크로포지셔닝(micropositioning) 시스템과 배합하여 마이크로피펫 팁을 감지 표면에 가까이 근접하게 가져올 것이고 집중된 레이저 선 이미지상의 눈물 샘플을 정확하게 분배하고 위치하도록 할 수 있을 것이다. 다른 작업이 유체의 작은 방울을 분배하기 위하여 전기력의 사용 영역에서 행해진다.

감지 표면상에 눈물을 위치하는 것은 3-축 (병진) 마이크로포지셔닝 시스템으로 간단하게 행해질 수 있는 바, 이는 감지 표면을 마주하는 팁으로 마이크로피펫을 수직적으로 보유한다. 팁이 감지 바로 표면 위에 거의 접촉할 정도일 때까지 제어 나사를 통한 3축의 조정은 손동 및 시각적 검사를 통하여 행해질 수 있다. 그러나, 이는 상업적 제조에서 불편하다 (그리고 잠재적으로 비싸다). 마이크로피펫이 감지 표면위에 장착된 집기(fixture)로 삽입되고 이의 위치가 반복가능하도록, 특정 내구성에 대한 맞춤형 마이크로피펫의 제조는 감지 표면상 눈물을 간단하고 정확하게 위치하는 하나의 방법이다. 도 15는 감지 표면(1508)상 집중된 레이저 선(1506) 위에 선을 따르는 3개 마이크로피펫 팁(1504)으로 위치하는데 사용된 집기(1502)를 도시한다.

눈물을 추출하기 위한 다른 하나의 방법은 눈물막 또는 스트립에 접촉할 때 눈물 샘플을 흡수하는 흡수성 물질(즉, 종이)로 행해질 수 있다. 그 후에 이 젖은 종이는 감지 표면에 접촉할 수 있고 검은 선이 이전과 같이 이미지에 나타날 것이다. 눈물 샘플을 흡수하기 위하여 종이 스트립을 사용하는 것의 이점은 추출하기 위하여 세극등 현미경이 필요하지 않다는 것이다.

이미지 특징 및 샘플 크기

테스트되는 용액이 어떻게 감지 표면상으로 증착되었는가에 따라서 최종 이미지의 특징들이 결정된다. 그러나, 모든 방법은 명시야에 의해 둘러싸인 검은 수직선을 나타낼 것이다. 도 6a와 관련하여, 직사각형 감지 표면의 평면도가 602에서 도시된다. 이 시스템에서 원통형 렌즈는 레이저 광을 도면에서 도시되는 바와 같이 감지 표면상의 선 이미지(604)로 모은다. 이 감지 표면상에 선 이미지를 덮으면서 샘플 용액(606)이 증착된다. 상응하는 이미지는 오스몰 농도에서의 변화로 수직적으로 병진하는 명시야(610)에서 수평적 검은 선(608)이다. 그러나, 이 선의 길이는 집중된 레이저 선을 덮는 용액량에 의해 결정된다. 만일 용액(612)이 도 6b에 도시된 바와 같이 감지 표면(616)상 레지저 선(614)의 절반만 덮는다면, 이미지에서 생성된 검은 선(618)은 CCD 카메라의 절반만 덮을 것이고, 나머지는 명시야(620)일 것이다.

그러나, 나노리터 부피의 눈물(702)를 다룰 때에, 감지 표면(704) 상에 위치할 때, 레이저 선 이미지(706)의 작은 부분만을 덮을 것이다. CCD상의 이미지에서 결과는 '짧은' 검은 선(710)을 갖는 명시야(708)일 것이다. 이는 도 7a에서 그림으로 도시된다. 눈물의 오스몰 농도가 변하기 때문에, 이 짧은 선도 이미지에서 수직적으로 이동할 것이다. 감지 표면이 눈물의 부피에 비해 크기 때문에, 하나 이상의 눈물(즉, 오른쪽 눈 및 왼쪽 눈)이 동시에 감지 표면상에 배치되어, 두 개를 즉각적으로 판독하도록 할 수 있다. 추가적으로, 여러 개의 눈물이 동시에 표면상에 배치될 수 있어 다중 판독할 수 있다. 도 7b는 감지 표면(718)상에 상이한 오스몰 농도를 갖는 4개의 눈물 샘플(711,712,714,716) 및 명시야(730) 중에 상이한 수직 위치에서 4개의 검은 선(722,724,726,728)을 도시하는 CCD 카메라상의 생성된 이미지를 도시한다. 선들의 상이한 수직적 위치들은 각 샘플의 상이한 오스몰 농도를 가리킨다.

검은 선의 수직적 위치를 결정하기 위한 이미지 공정 순서

상술한 바와 같이, 용액이 감지 표면상으로 도입될 때, CCD 카메라에 의해 보여지는 이미지가 도 2a 및 도 2b에서 도시된다. 그러나, 실행에서, 이 이미지는 명시야 및 검은 선뿐만 아니라, 제 자리에 있는 공간 필터에도 불구하고, 스퓨리어스 굴절들로부터의 잡음(밝거나 어두운 패치들) 및 많은 소스들로부터의 원치않는 굴절을 포함한다. 일반적으로 잡음은 검은 선의 위치를 결정하는데 있어서 불확실의 원인일 수 있다. 그러나, 이 잡음으로도, 감소되는 강도의 특징적 SPR 신호 (도 3 참조)가 보여질 수 있고 간단한 평균치로 신뢰할만한 측정이 행해질 수 있다. 오스몰 농도를 측정할 때에, 다른 것들이 SPR 각도에서 매우 작은 변화 또는 이미지에서 검은 선의 수직적 위치와 동일한 것을 나타내는 대략 1mOs가 검출될 필요가 있다. 따라서, 컴퓨터가 잡음 요소를 제거하기 위하여 또는 최소한 잡음 요소를 감소시키기 위하여 CCD 카메라로부터 포착된 각 이미지를 프로세스하는 것이 필요하다.

도 2에 도시되는 검은 선의 이미지는 시스템으로 수득한 실제 이미지를 도시하지 않는다. SPR 신호 존재를 갖는 이상적 시스템에서, CCD 카메라상에 떨어지는 광의 강도가 CCD의 픽셀의 한 칼럼을 따라서 수직적으로 도시되었다면, 결과는 도3에 도시된 커브일 것이다. 실제에서, 이 커브는 그 위에 무작위 잡음 요소들이 있다. 용액의 오스몰 농도를 정밀하게 결정하기 위하여, 컴퓨터는 이 커브의 최초시츨 찾아야 하고, 이를 캘리브레이션 표에 비교하여야 한다. 컴퓨터가 최소치의 위치를 자동적으로 더 정확하게 결정할 수 있을수록, 오스몰 농도의 측정은 더 정확해 질 것이다. 너무 많은 잡음이 존재하면, 컴퓨터는 잡음을 SPR 최소치로서 잘못 해석할 수 있고 오스몰 농도의 잘못 된 값을 보고할 수 있다. 추가적으로, 잡음이 존재하면, 컴퓨터는 오스몰 농도에 가까운 용액들이 측정될 때(즉, 312.0 mOs 및 312.5 mOs), 수직선의 이동에서 작은 변화를 감지할 수 없을 수 있다. 임상적으로 유용할 오스몰 농도의 측정을 위하여, 시스템은 바람직하게 실제값의 1-2 mOs 내의 오스몰 농도를 보고한다. 이론적으로 시스템은 임상적 관점에서 중요하지 않은 0.1 mOs까지 내려간 변화를 검출할 수 있을 수 있다.

감지 표면상에 샘플이 없다면, '기준치(baseline)' 이미지는 광의 밝은 패치로 구성된다. 광의 이 밝은 패치에 (공간) 잡음을 포함한다. 이 잡음은 일반적으로 회절 패턴 및 렌즈, 먼지 입자들 등의 작은 스크래치 또는 피트(pits)에 의해 야기되는 간섭으로부터의 기타 패치들로 구성된다. 추가적으로, 레이저 광의 강도는 분포된 가우스이다. 샘플이 감지 표면상에 위치되고 검은 선이 SPR 대문에 형성될 때, 기준치 이미지에서 이 원치않는 모든 특징들이 나타난다. 이 원치않는 공간 잡음을 제거하기 위하여, 컴퓨터가 두 개의 이미지를 추출할 수 있고 이에 따라 공정된 이미지에서 이러한 특성들을 제거할 수 있다. 그러나, 기준치 이미지와 검은 선을 갖는 이미지 사이의 진폭 차이가 있고, 그래서 축소비가 각 이미지의 동일한 작은 부분을 분석하고 두 영역 사이의 평균 픽셀 값을 비교함으로써 결정된다. 결과는 축소된 공간 잡음 요소를 밝은 흰 선으로 갖는 암시야이다.

심지어 추출 후에도 기타 잡음원이 여전히 신호에 존재한다. 이는 검은 선의 정확한 위치(또는 위치에서의 변화)를 결정하는데 어려움이 되는 전자적 잡음과 같은 지배적으로 무작위의 파동이다.

하나의 방법은 검은 선의 최소치의 최소 강도 표시의 픽셀뿐만 아니라 이를 모니터하고 이 주변의 여러개의 픽셀을 모니터하는 것이다. 최소치 강도의 포인트를 포함하는 SPR 커브의 낮은 부분은 포물선으로서 근사치를 낼 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 포물선을 최소치를 둘러싸는 포인트들에 맞추고, 그 후에 포물선상의 모든 포인트들을 모니터한다. 이 방법에서, 만일 포물선이 한 픽셀 이하로도 이동한다면, 컴퓨터는 일반적으로 서브픽셀(subpixel) 분해능이라고 알려진 이를 검출할 수 있다.

만일 선이 도 4a에 도시된 갈라지는 렌즈를 사용하여 넓어진다면, 이는 검은 선의 큰 수직적 이동을 달성한다. 만일 누군가 CCD의 꼭대기로부터 바닥까지의 강도를 표시한다면, 도 3a에서 길이를 줄인 버전의 커브가 결과될 것이다. 만일 두 개의 용액이 테스트되고 CCD상의 강도가 즉시 조사된다면, 두 개의 넓어진 길이를 줄인 커브가 수득될 것이다. 원형 도구상에서 테스트된 두 개의 용액으로부터의 실질적 커브가 도 8a에 도시된다. 이 커브는 샘플이 제 자리에 있는 감지 표면으로부터 반사되는 레이저 광의 축소된 강도를 보이고, 그렇지 않으면 매끄러운 커브에서 고주파 리플(ripple)들로서 도면에서 도시되는 잡음을 포함한다. 각 커브는 오스몰 농도에서의 변화를 가리키면서 서로 약간씩 이동된다. 이 커브 또는 이동 사이의 거리는 주어진 용액에 대한 오스몰 농도 값을 결정하기 위하여 측정된다. 도 8a에 도시된 커브 사이의 이동을 측정하는 하나의 방법은 직선을 커브의 각 측면에 맞추는 것이다. 이 선들이 교차하는 지점이 주목될 수 있고 이는 각 커브에 대하여 행해진다. 이는 거리에 의해 분리되는 두 개의 특징적 포인트를 수율할 것이고, 이 거리는 실제 커브에서 이동을 나타낸다. 이는 도 8b에 도시된다.

검은 선의 수직 위치의 성공적 검출의 다른 방법은 평균 위치를 찾고, 데이터를 표시하고, 커브의 가중된 중심을 찾는 것이다. 이는, 컷오프 값이 각 용액에 대하여 결정되어야 할 필요가 없도록, 먼저 데이터를 정상화하는게 이롭다. 도 9는 중심 방법을 사용한 데이터 분석의 프로세스를 도시한다. 감지 표면상에 눈물 샘플을 위치하는 것은 몇몇 수직 위치(902)에서 명시야 중 수평 면의 일부분을 덮는 검은 선으로 CCD상 이미지를 발생시킨다. 비디오의 프레임이 획득되어 PC에 저장된다. 컴퓨터 프로그램은 사용자가 마우스의 클릭 및 드래그로 이미지에서 관심 영역(904)인 소위 검은 선 및 상기 선 위아래의 명시야 부분을 선택하는 능력을 허락하도록 기입될 수 있다. 버튼이 눌러지고 소프트웨어가 마우스로 선택된 관심 영역을 평균을 내면서 시작된다. 소프트웨어는 각 행에 대한 하나의 밝기값에 도달하기 위하여 영역의 각 수평 행에서 모든 픽셀의 밝기의 평균을 낸다. 생성된 데이터는 원 영역과 동일한 높이의 단일 수직선으로 붕괴된 영역으로서 생각될 수 있는데, 여기에서 선상의 각 포인트는 그 높이에서 원 영역의 전체 옆쪽으로 행의 평균처럼 밝거나 어둡다. 이는 검은 선(906)의 평균 수직 위치를 나타내는 단일 커브를 생성한다.

상이한 오스몰 농도의 샘플을 추가하는 것은 커브의 이동의 원인이 되고, 두 개의 유사한 형태이나 측면으로 병진되는 SPR 커브(906,908)를 생성한다. 프로세싱은 피크를 커브의 나머지와 분리하기 위하여 컷오프 수준(910)을 생성하도록 계속되며, 피크에서 중력중심 또는 나머지 데이터 포인트의 중심을 계산한다. 이 방법은 커브의 단일 정점을 선택하는 것보다 더 견고한데, 그 이유는 이것은 커브 근처에 더 많은 데이터가 이의 최종 결과에 연관되고, 몇몇 커브는 이상하게 비대칭일 수 있고, 부정확한 정점들을 주기 때문이다. 상이한 오스몰 농도의 용액들로부터의 커브 피크 섹션들의 각각은 중심화되고 틱 마크(tick mark)는 아래로 끌어지고 수평 비율 상의 값이 할당되는 바, 이는 용액의 오스몰 농도 값으로 캘리브레이션될 수 있다.

포토다이오드 방법 및 프로브 설계

SPR 눈물 삼투압계의 다른 구성은 CCD 카메라를 다중요소 포토다이오드로 대체하는 것을 포함한다. 소형화는 상업적 의학 장치의 성공에 중요한 역할을 한다고 생각되는데, 현실적 이유로서 시술중인 의사가 단순히 사무실 공간의 부족 때문에 그들의 분야에서 사용가능한 모든 기술적 도구를 사용하는 것을 방지하기 때문이다. 시스템으로부터 CCD 카메라를 제거하는 것은 요소의 관점에서 상당한 비용을 절약하는 것이 아닐 수 있고; 이는 프로세싱 이후 하드웨어에서(즉, 프레임 그래버, 컴퓨터)에서 절약될 것이다. CCD 카메라의 사용은 단지 연구인력을 위한 것들을 단순화하고, 컴퓨터의 사용은 변화를 신속하게 하도록 한다. 컴퓨터들은 문제적이고 비용을 추가하는데, 그래서 많은 프론트로부터 휴대용이라도 독립형을 갖는 것이 바람직하다.

SPR 눈물 삼투압계 시스템은 상술한 모든 동일한 요소로 제조되었으나, CCD 카메라(도 1 및 도 4)는 4 요소(4분면) 포토다이오드(UDT Sensors, Inc. 분할된 4분면 포토다이오드)로 대체되었다. 도 10a에 도시된, '4분할 검출기'는 필수적으로 사이의 작은 사공간(deadspace)(1004)을 갖는 동일한 기판상의 4개의 포토다이오드(1002)이다. 이 경우에, 검은 선의 수직 위치는 도 10b에 도시된 바와 같이 검은 선의 일부분을 위에 및 일부분을 상부 및 하부 4분면 아래가 되도록 함으로써 결정된다. 우측 상부 및 하부 4분면(1006)은 소정 오스몰 농도 값 및 검은 선(1008)의 수직 위치를 갖는 오른쪽 눈으로부터 취한 샘플을 나타낼 수 있고, 좌측 상부 및 하부 4분면(1010)은 상응하는 검은 선(1012)를 갖는 왼쪽 눈으로부터의 샘플을 나타낼 수 있다. 포토다이오드는 광이 표면상에 입사할 때 전류를 발생시킨다. 상부 및 하부 포토다이오드는 각각 그들상에 입사광의 양에 기반한 그들 자체의 전류를 발생시킬 것이고, 이는 검은 선의 위치에 의해 영향을 받는다. 실행에서, 전류는 증폭되고 (Burr-Brown Corp. OPA-128 전류 Op-Amp) 전압으로 전환되는데, 이는 비교될 수 있고 검은 선 (SPR 최소치)의 상대적 위치가 암시된다. 매우 유사한 프로세싱이 CCD로부터 수득된 이미지에 대해 개시된 것과 같이 행해질 수 있으나, 포토다이오드 경우에, 하나는 대신에 아날로그 전압을 다룬다. 아나로그 전압은 컴퓨터 또는 바람직하게 마이크로프로세서로 디지털화될 수 있는데, 이는 검은 선의 위치에 상응하는 값을 생성하고 이런 이유로 샘플의 오스몰 농도를 생성하기 위하여 디지털화된 전압에서 작동될 수 있다.

검출기로서 포토다이오드, 및 신호 프로세싱, 마이크로-광학, 및 새 프리즘 배열에 대한 집적 전자장비의 사용은 전체 시스템의 크기를 극적으로 축소할 수 있고, 상대적으로 값싸게 높은 부피에서 제조될 수 있는 제조 도구에 도움이 될 수 있다. 비록 SPR 분광기에 대한 수 많은 배열이 화학적 및 생물학적 시약의 분석에 대하여 제안되었지만, 아무 것도 눈물 오스몰 농도 및 나노리터 샘플 크기, 분해능, 샘플 위치 등과 연관되는 어려움에 특정되지 않았다.

SPR 분광기의 광학적 시스템의 복잡성의 수준은 핸드헬드 프로브로 소형화하기에 충분하다. 입사광의 각도가 바른 한, SPR이, 용액의 부피가 얼마이든 발생할 것인데, 즉, 눈물 스트립을 조사하고 눈물 유체를 마이크로피펫으로 흘리는 것보다, 도구의 감지 표면이 눈물막 자체와 접촉하게 될 수 있다. 이는 눈물을 추출해야만 하는 단계를 줄이고, 감지 표면상 눈물 대체의 문제를 해결한다. 도 11은 눈물 삼투압계 프로브의 컴퓨터 모델을 도시하고, 프로브의 핸드피스(1102)는 측정을 하기 위하여 눌러지는 버튼(1106)을 포함하고 SPR 시스템의 모든 필요한 요소를 포함한다.

프로브는 광학적 유리로 대략 약 3mm의 작은 지름과 0.5mm의 두께인 팁(1104)을 갖는다. 이 팁(1104)은 광학 유리상 금이 증착되는 곳이고 잠깐 동안 눈(1204) (바람직하게는 공막) 위의 아무곳에서 눈물막(1202)에 접촉하게 된다 (도 12). 도 13과 관련하여, 눈물 오스몰 농도를 측정하는데 필요한 입사의 각도가 제1 표면 거울(1302)로서 역할을 하고 핸드피스(1102)의 코어(1302)의 일부인 두 측면에 의해 유지된다. 이 코어는 각이 진 거울(1302)을 위하여 연마되고 연식된 플랫들을 갖는 광학 물질의 딱딱한 조각으로 도시된다. 광이 감지 표면을 가격하기 전에 짙은 (유리) 매질에 있기 때문에, 시스템을 간결하고 소형화하는 이 구성하에서 프리즘이 필요하지 않다.

SPR에 사용되는 금속 코팅이 너무 얇기 때문에, 이는 매우 내구적이지 않고 반복되는 소제를 견딜 수 없다. 또한, 감지 표면은 SPR 커브를 쉽게 오염시키고 저하시킨다 (잡음을 더한다). 그리고, 이 도구가 일반인구에서 사용되도록 의도되기 때문에, 눈물 오스몰 농도를 측정하는데 이 설계가 이 자체를 그렇게 하도록 하는 휴대용 감지 표면을 갖는게 바람직하다. 이는 감지 표면 디스크(1308)를 보유하는 시스(1306)로서 도시되고 전체 시스템(시스 및 디스크)은 사용후에 배치된다.

시스템의 코어는 코어를 보호하고 시스의 장착을 촉진하는 마운팅 쉘(1310)내에 하우징된다. 후면 쉘(1312)은 SPR 시스템용 나머지 요소들을 포함하고 또한 측정을 개시하기 위한 버튼(1106)을 하우징한다. 전력 및 신호 출력이 후면 쉘을 나와 케이블(1314)를 통하여 제공되고 신호는 마이크로프로세서 (또는 컴퓨터)를 포함하는 외부 프로세싱 유닛을 사용하여 프로세스된다.

후면 쉘내에 하우징된 개별 광학 요소들이 도 14에 도시된다. 레이저 다이오드(1402)로부터의 광이 평행하게 하는 렌즈(1404)에 의해 평행하게 되고 편광 필터(1406)를 통과한다. 초점렌즈(1408)는 빛을 코어 표면에 의해 형성된 집적 거울(1414)에 반사시킴으로써 감지 표면(1412)로 선(1410)으로 집중시킨다. 감지 표면으로부터 반사된 빛은 갈라지고 집적 거울(1416)로부터 반사되고 평행하게 하는 렌즈(1418)에 의해 평행하게 된다. 다중-요소 포토다이오드(1420)는 감지 표면에 의해 빛 흡수의 패턴을 인코딩하는 전기적 SPR 신호를 검출한다. 컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 광-감지 장치, 즉, 포토다이오드로부터의 이미지를 분석하도록 작동된다.

상술한 장치는, 자연적으로 적어도 하나의 항원 용질 또는 염에 추가하여 분석대상물의 농도를 포함하는, 눈물 샘풀의 복수의 용질의 농도를 검출 및 측정하기 위하여 변경될 수 있다. 금 감지 표면(108)은 단백질 또는 기타 복잡한 분자, 박테리아, 바이러스, 박테리아 항원 또는 바이러스 항원과 같은, 염 이온 이외의 기타 관심있는 항원 분석대상물에 부착된 항체를 운반하기 위해 변경된다. 또한, 컴퓨터(426)는 일련의 흡수-선 또는 공진-각도를 결정하기 위하여 그리고 염 이온 이외의 용질의 농도에 속하는 흡수선 데이터를 분리하기 위한 각도 차이를 계산하기 위하여 전기적 신호를 주기적으로(예, 매 1/30 초) 프로세스하도록 프로그램된다.

따라서, 눈물 샘플의 염 농도를 결정하기 위하여, 개시 흡수선 위치 또는 공진 각도를 색인 또는 캘리브레이션 표와 비교하는 것에 더하여, 컴퓨터(426)는 눈물 샘플에서 단백질과 같은 다른 분석대상물 또는 용질의 농도를 결정하기 위하여 도출된 흡수선 위치 또는 공진 각도를 색인 도는 캘리브레이션 표와 비교한다. 캘리브레이션 표는 소정 용질 또는 분석대상물의 농도를 갖는 흡수선 위치와 연관성이 있는 미리 기록된 데이터를 포함한다. 염 및 기타 분석대상물 농도의 배합은 질병 진단 또는, 순수하게 눈 또는 신체 전체에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 질병 질환(당뇨병(diabetes) 등)의 진단을 촉진한다.

컴퓨터(426)는 메모리에 공진 각도 데이터의 많은 표를 저장할 수 있는데, 각 표는 다양한 눈물 샘플에서 찾을 수 있는 각 용질에 속한다. 각 표는 용질 농도의 기능으로서 공진 각도 목록을 포함한다. 따라서, 단일 SPR 눈물 삼투압계는 상이한 부착된 항체를 갖는 일련의 감지 표면(108)을 사용하여 다중 용질 농도를 측정할 수 있다.

SPR 장치의 포토다이오드(1001 또는 1420)는 초당 다중 전기적 신호를 컴퓨터(426)로 전송하도록 작동되는 바, 여기서 전기적 신호의 각각은 항체-운반 감지 표면(108)에 의해 광 흡수의 패턴을 인코드하고, 전기적 신호는 적어도 하나의 미리 설정된 시간 간격에 의해 서로 분리된다. 또한, 컴퓨터 또는 마이크로프로세서(426)는 전기적 신호의 각각에 인코드된 광 흡수의 패턴을 분석하도록 작동된다.

SPR 장치로 눈문 오스몰 농도를 측정할 때, 제1 몇 밀리세컨드내에 수득된 SPR 신호의 부분을 분석한다. 염 용액 및 단백질 모두를 포함하는 눈물액의 주어진 샘플에 대하여, 염 용액은 작은 분자 또는 감지 표면으로 신속히 이동하는 이온을 포함한다. 더 부피가 큰 단백질은 감지 표면에 도달하고 결합되기에 더 많은 시간이 소요된다. 두 부분(two-part) 시간에 기반한 측정에 의해, 염의 농도 (오스몰 농도)를 반영하는 제1 신호 및, 염 및 감지 표면에 결합하는 단백질로서 단백질 농도 모두를 반영하는 제2 더 큰 신호, 모두를 측정한다. 간단한 신호 추출 및 분석을 통하여 단백질의 농도를 결정한다 (즉, 큰 신호 작은 신호는 단백질 농도에 비레한다).

컴퓨터(426)은 예를 들어, 감지 표면에 의한 최대 흡수의 각도 (흡수선 위치)를 결정하기 위하여 광 흡수의 패턴을 분석하도록 프로그램된다. 따라서, 표면플라스몬 공진 장치의 작동은 표면 공진 각도 또는 전기적 신호의 각각으로부터의 흡수선 위치를 결정하기 위하여 컴퓨터(426)을 작동하는 것을 더 특이하게 포함할 수 있다. 이 공진 각도 또는 흡수선 위치는 제1 공진 각도 또는 전기적 신호의 제1의 것과 임시로 연관되는 흡수선 위치 (예, 감지 표면(108)로 눈물 샘플을 접촉한 후 1/30 초 내), 및 제2 공진 각도 또는 전기적 신호의 큰 것과 연관되는 (예, 감지 표면(108)과 눈물 샘플과 접촉한 후 2/30, 3/30, 4/30 초에) 흡수선 위치를 포함한다. 그 후에 컴퓨터(426)는 제1 용질 농도값 (오스몰 농도)를 결정하기 위하여 제1 공진 각도 또는 흡수선 위치를 제1 캘리브레이션 표의 항목들과 비교하고, 생성된 공진 각도 또는 흡수선 위치를 결정하기 위하여 제1 공진 각도 또는 흡수선 위치 및 제2 공진 각도 또는 서로로부터 흡수선 위치를 추출하고, 제2 용질 (예, 단백질 또는 항원) 농도를 결정하기 위하여 생성된 공진 각도를 제2 캘리브레이션 표의 목록과 비교한다.

제1 용질 농도는 염 농도이다. 이는 염이 눈물 샘플의 기타 용질 요소들보다 감지 표면으로 더 신속하게 이동하기 때문이다. 수반되는, 눈물 샘플의 염 농도에만 상응하는 흡수선 위치 또는 감지 표면 공진 각도를 수득하기 위하여, 다른 용질들(예, 단백질, 박테리아)의 임의의 상당량이 감지 표면으로 이동할 충분한 기회를 갖기 이전에 측정을 수득하는 것이 필요하다. 그 상황에서, 흡수선 또는 기본 위치(용매, 물에 의하고 임의의 용질에 의하지 않게 결정되는 굴절 각도)에 상대적인 감지 표면 공진 각도는 눈물 샘플의 염 농도만에 의하고 임의의 기타 용질 농도에 의해서는 아니다. 감지 표면상 눈물 샘플의 증착 시간으로부터 약 1/30초만의 지연은, 최초 비디오 신호가 기타 물질들의 농도 때문에 오차가 적거나 없게 염 농도를 포획하기에, 일반적으로 충분히 신속하다. 측정 프로브가 눈물 샘플을 수득하기 위하여 눈 표면에 접촉하는 경우, 이 처음 신호는 물론 여러 개의 추후 측정들도 불가피하게 측정되어야 하는 반면, 프로브는 여전히 눈에 접촉하고 있다.

질병 검출을 위한 화학적 항원들

화학적 항원 센서로서 SPR을 사용하기 위한 일반적 기술은 다음과 같다. 먼저 바람직한 화학적 항원에 특이적으로 결합할 항체를 확인하는 것이 필요하다. 일단 확인되면, 특이적 항체는 습식 화학적 기술을 통하여 감지 표면에 결합된다. 항체를 SPR 감지 표면에 결합하는 것은 공지되었고, 다양한 방법들이 존재하지만, 하나의 방법이 다음에 개시된다.

눈물 샘플이, 만일 눈물 샘플이 바람직한 화학적 항원을 포함한다면, 결합된 항체를 운반하면서 감지 표면(108)상에 도입되고, SPR 신호에서 변화 (현상이 발생하는 각도에서의 변화)가 관찰된다. 만일 화학적 항원이 눈물 샘플에 없다면, 신호는 흔들리지 않는다. 아래는 항체를 결합하는 것과 화학적 항원을 검출하는 것의 요약이다.

항체의 고정(Immobilization)

항체는 공지된 티올 화학 기술을 사용하여 금 감지 표면(108)에 결합될 수 있다. 티올 분자는 항체와 금 사이에서 접착층으로서 기능한다. 티올 유닛은 화학흡착하고 자체가 금에 부착되는 반면, 아미노 그룹 또는 카르복실산 그룹을 갖는 다른 끝은 말단 카르복실산 또는 아미노 그룹 중 하나와 각각 반응하고, 이에 따라 항체를 부착한다. 티올 접착제의 예는 11-디오운데칸산(thioundecanoic) 또는 2-아미노에탄티올 하이드로클로라이드(2-aminoethanethiol hydrochloride)이다. 도 16 및 도 17은 후자를 사용한 반응식을 도시한다. 그러나, 어느 것이라도 동일하게 효과적이고 그들의 사용은 문제의 특이적 항체상 말단 반응 사이트의 사용가능성에 의해 지배될 것이다.

SPR 감지 표면(108)은 금을 잘 부착하기 위한 적절한 하층 (즉, 2nm 크롬) 을 갖는 유리상으로 50nm 두께 층의 금을 증착함으로써 상술한 이전과 같이 제조된다. 항체 결합 이전에, 2-아미노에탄티올 하이드로클로라이드 용액이 먼저 상술한 바와 같이 입력 포트, 보유 챔버, 출력 포트 및 펌프를 구비하는 플로우 셀을 사용하여 금 감지 표면상으로 흐른다. 플로우 셀 시스템은 다양한 유체들이 편하게 와서 감지 표면에 접촉하도록 한다. 감지 표면 위로 2-아미노에탄티올 하이드로클로라이드 용액이 통과하는 것은 자가조립 단층 (self-assembled monolayer, SAM)을 야기한다. 결과적으로, 항체와 EDC의 혼합물이 동일한 플로우 셀 장치를 사용하이 이 SAM 위로 흐른다. SAM상의 아미노 그룹들은 항체에서 말단 카르복실산 그룹에 반응할 것이고, 항체의 금 표면에의 부착을 야기할 것이다. 반응식이 도 17에 도시된다. 도 16이 반응에 관여되는 상이한 화학적 요소들의 화학적 구조를 도시한다. 도면에서, R1, R2 및 R3은 반응에 참여하지 않는 분자의 영역의 약칭 표기이다. 서면상에 반응식을 도시할 때 이 약칭을 사용하는 것은 통상적 관례이다.

이 처리 후에, 감지 표면(108)이 특이적 고정된 항체를 운반하고 화학적 항원 검출에 대해 준비된다. 그 후에, 감지 표면(108)이 장비에 장착되고 (예를 들어, 감지 표면(1104,1308)은 도 11 및 도 13에 도시된 프로브 설계에서 유리 코어(1310)의 팁에 장칙된다) 그 후에 눈물 샘플에 접촉하도록 가져온다. 항체의 존재에 따라, 바람직한 결합이 각 항원에 특이적으로 발생할 것이고, 이에 따라 SPR 신호로 될 것이다.

이제, 금 감지 표면에 결합될 수 있는 특이적 화학적 항원에 대한 항체를 발생시킴으로써 검출되고, 모니터 되고/되거나 전개되는 특이적 병리학이 더 상세히 제공된다.

눈물에서 염증

눈물에서 염증을 검출하고 모니터하는 것은 안검염, 안구건조 및 눈 알러지를 진단 및 드러내는 것에 도움이 된다.

종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor-alpha), 인터루킨 1-베타 (Interleukin 1-beta)(IL-1-beta), IL-11, IL-4, IL-4, IL-6, 인터루킨-6 가용성 수용체(soluble receptor)(IL-6sR), IL-7, 에오탁신-2 (eotaxin-2), 대식세포 염증성 단백질 1알파 (macrophage inflammatory protein 1alpha)(MIP-1alpha), MIP-1베타, 인터페론 (MIG)-감마에 의해 유도된 모노카인 (monokine induced by interferon (MIG)-gamma), 및 인터페론-감마-유도성 단백질 (IP)-10 (interferon-gamma-inducible protein (IP)-10)을 포함하되 이에 한정되지 않는 친염증성 (pro-inflammatory) 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)에 대한 항체가 SPR를 갖는 이러한 사이토카인 및 케모카인을 측정하는데 사용될 수 있다.

점액 (mucus)

안구 건조에서, 눈 표면으로부터 특이 점액의 손실이 있다. 예를 들어, 안구 건조에서, MUC 5a의 감소가 있다.

MUC 1, 4, 5a, 16에 대한 항체가 SPR 기술로 이러한 점액들을 측정하는데 사용될 수 있다.

알러지 눈 질병

알러지 결막염은 꽃가루(pollen)과 같은 알레르겐(allergen)이 알레르겐-특이 IgE 항체의 합성을 자극할 때 시작되는 I형 과민증(hypersensitivity) 반응이다. IgA 항체들은 봄 알러지 눈 빌환에서 증가된다. 항체들은 IgE 및 IaG 에 대해 증가될 수 있고 이러한 항체들은 SPR 기술을 사용하여 측정될 수 있다.

박테리아 감염

박테리아 감염은 예를 들어 그램(gram) 음성과 그램 양성 감염 사이의 차이(differetiation)을 허용하는 SPR 눈물 프로브를 사용하여 진단 및 분류될(catergorized) 수 있다.

예를 들어, 특이적 그램 음성 박테리아 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)(LPS) O 항원에 대한 항체가 그램 음성 감염을 확인하기 위하여 SPR 기술과 사용될 수 있다. 항체들은 또한 슈도모나스(pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은, 이에 한정되지 않고, 개별 박테리아 종을 인지하기 위하여 생성될 수 있다.

바이러스 감염

단순 포진(herpes simplex) 및 대상 포진(herpes zoster)를 진단하고 구별하는 것은 어려울 수 있다. 특이적 항체들이 SPR 기술과 사용될 수 있는 진단 목적을 위하여 이러한 및 기타 바이러스에 대하여 생성될 수 있다.

진균 감염 (fungal infections)

진균 간염을 진단하는 것은 어렵다. 항체들은 아스페르질루스(Aspergillus), Blastomyces Coccidioides 및 히스토플라즈마(Histoplasma)와 같은, 이에 한정되지 않고, 특이적 진균 유기체(organisms)에 대하여 생성되었다.

클라미디아(chlamydial) 및 Acanthameobal 감염

항체가 SPR 기술을 사용하여 눈물막에서 이러한 감염들을 진단하기 위하여 클라미디아 및 아칸타메바(Acanthameoba)에 대하여 상승될 수 있다.

실행 장치 작동

눈물액에서 단백질 검출을 위하여, 도 1 내지 도 15를 참조하여 상술된 장치의 하드웨어의 어느 것도 변경할 필요가 없다. 단백질은 SPR 기술을 통하여 농도 검출을 허용하기 위하여 금 감지 표면으로 이동하여 거기에 부착될 것이다. 단백질을 보호하기 위하여, 소프트웨어는 위에서 논의된 바와 같이 변경되어야 한다. 질병 검출을 위하여 (단백질 이외의) 화학적 항원의 농도를 측정하는 경우에, 하드웨어는 또한 감지 표면(108)이 부착된 항체들을 운반하도록 변경되는 것을 제외하고는 아무 변경이 필요하지 않다. 다시, 컴퓨터(426)는 상술한 바와 같이 추가적 프로그래밍을 포함하도록 변경된다. 금 감지 표면(108)은 복잡한 분자, 박테리아 또는 바이러스와 같은 관심있는 항원 분석대상물에 부착된 항체를 운반하기 위하여 변경된다. 또한, 컴퓨터(426)는 일련의 흡수-선 또는 공진-각도를 결정하기 위하여 그리고 염 이온 이외의 용질의 농도에 속하는 흡수선 데이터를 분리하기 위한 각도 차이를 계산하기 위하여 전기적 신호를 주기적으로(예, 매 1/30 초) 프로세스하도록 프로그램된다.

단백질 및 항원 분석대상물을 검출할 때, 소프트웨어 (또는 신호 검출 전기장치 - 즉, 마이크로프로세서)는 시간 동안 발생되는 신호를 포착한다. 예를 들어, 감지 표면이 눈물 샘플과 접촉하도록 올 때, 신호는, 감지 표면이 샘플에 접촉하는 바로 그 순간에 포착된다. 그 후에, 신호는 그 이후에 예를 들어, 몇 초간 표준 비디오 카메라에와 같이 1초의 매 1/30에 포착된다. 비디오의 제1 프레임은 눈물 오스몰 농도에 관련된 신호를 나타낸다. 단백질이 감지 표면에 결합하기 시작하거나 항원 분석대상물이 감지 표면상 항체에 결합하기 시작하기 때문에, 신호는 변할 것이고, 소프트웨어는 단백질 또는 기타 항원 분석대상물 농도를 결정하기 위하여 이후에 수득된 뒤를 잇는 프레임을 분석할 것이다. 확인되어야 할 각 특이적 화학 항원에 대하여, 감지 표면이 신호 검출을 위하여 표면에 결합된 필요한 항체로 제공된다.

도 11 내지 도 13을 참조하여 본원에 개시된 프로브 도구에서, 작은 감지 표면 팁이 특이적 항체에 결합한다. 도 1 내지 도 15를 참조하여 개시된 하드웨어의 균형은 개시된 구성으로부터 변하지 않는다. 호스트(host) 물질은 여전히 인간 눈물이기 때문에, SPR이 발생하는 명목상 각고 범위는 변하지 않고 이런 이유로 레이저 빔의 입사각에 대하여 조정이 필요하지 않다. 신호 검출은 다중-요소 검출기를 사용하여 여전히 발생한다.

다시, 소프트웨어는 몇몇 변경이 필요하다. 오스몰 농도 또는 염 농도 측정으로, 소프트웨어는 획득된 SPR 신호를 분석한다. 주어진 오스몰 농도에 대하여, SPR 신호의 각도가 결정되고 이 값은 컴퓨터에 저정된 캘리브레이션 표와 비교된다.

감지 표면에 결합된 특이적 항체를 사용하여 화학적 항원을 검출할 때, 소프트웨어는 오스몰 농도 이의의 측정이 일어났다는 것을 '알아야'만 한다. 상업적 장치로서, 사용자는 항체 특이적 감지 표면 칩을 구매하고, 이를 도구에 적용시키고, 눈물 샘플이 감지 표면에 접촉하도록 한다. 만일 화학적 항원이 존재한다면, SPR 신호는 변화를 도시하고 소프트웨어는 변화의 정도를 결정하기 위하여 SPR 신호를 분석한다.

본 발명은 눈물 샘플에서, 항체가 없는 금 감지 표면을 사용하여, 염 이온을 첨가하여, 몇몇 용질의 농도를 결정할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 몇몇 단백질은 자연스럽게 금 감지 표면으로 이동하고 위에서 논의된 바와 같이 변경된 공진 각도를 야기한다.

Claims (23)

1. 테스트 방법에 있어서,
   표면 플라스몬 공진(surface plasmon resonance) 장치를 제공하는 단계;
   상기 표면 플라스몬 공진 장치에 감지 표면을 제공하는 단계;
   환자의 눈에서 눈물 샘플을 상기 감지 표면에 접촉하여 위치시키는 단계; 및
   상기 눈물 샘플에서 복수의 용질들의 농도들을 판단하기 위하여 상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계를 포함하는 테스트 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치는 광 감지 장치, 및 상기 광 감지 장치에 동작가능하게 연결된 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 포함하고,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계는,
   상기 감지 표면에 의해 광 흡수의 패턴을 인코딩한 전기 신호를 상기 컴퓨터로 송신하도록 상기 광 감지 장치를 작동시키는 단계; 및
   상기 전기 신호로 인코딩된 광 흡수의 패턴을 분석하도록 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 포함하는 테스트 방법.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계는,
   초 당 다수의 전기 신호들을 상기 컴퓨터로 송신하도록 상기 광 감지 장치를 작동시키는 단계로서, 상기 전기 신호들은 각각 상기 감지 표면에 의해 광 흡수의 패턴을 인코딩하고, 상기 전기 신호들은 적어도 하나의 미리 정해진 시간 간격에 의해 서로 분리된 단계; 및
   상기 전기 신호들 각각에 인코딩된 광 흡수의 상기 패턴을 분석하기 위해 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 포함하는 테스트 방법.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계는 상기 전기 신호들 각각으로부터 표면 공진 각도 또는 흡수 선 위치를 판단하도록 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 더 포함하고, 상기 공진 각도 또는 상기 흡수 선 위치는 일시적으로 상기 전기 신호들 중 제1 전기 신호와 연관된 제1 공진 각도 또는 흡수 선 위치, 및 상기 전기 신호들 중 다음의 전기 신호와 연관된 제2 공진 각도 또는 흡수 선 위치를 포함하는 테스트 방법.
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계는 제1 용질 농도 값을 판단하기 위해 제1 캘리브레이션(calibration) 표의 항목들로 상기 제1 공진 각도 또는 흡수 선 위치를 비교하고, 결과적인 공진 각도 또는 흡수 선 위치를 판단하기 위해 상기 제1 공진 각도 또는 흡수 선 위치와 상기 제2 공진 각도 또는 흡수 선 위치를 서로 감산하고, 제2 용질 농도를 판단하기 위해 제2 캘리브레이션 표의 항목들로 상기 결과적인 공진 각도를 비교하도록 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 더 포함하는 테스트 장치.
6. 청구항 2에 있어서,
   상기 광 감지 장치는 카메라이고, 상기 전기 신호는 비디오 신호인 테스트 장치.
7. 청구항 2에 있어서,
   상기 광 감지 장치는 다중 요소 포토다이오드(photodiode)이고, 상기 전기 신호는 아날로그 차동 신호인 테스트 장치.
8. 청구항 2에 있어서,
   상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계는,
   흡수선 위치를 오스몰 농도(osmolarity)와 상관하는(correlating) 미리 기록된 데이터로 흡수 선 위치를 비교하도록 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 작동시키는 단계를 포함하는 테스트 장치.
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 표면 플라스몬 공진 장치는 휴대용 프로브의 형태를 취하고, 상기 눈물 샘플을 위치시키는 단계는 상기 감지 표면을 환자의 눈물 견딤 부분(tear-bearing portion)과 접촉하게 하도록 상기 프로브를 조작하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 표면 플라스몬 공진 장치에 상기 감지 표면을 제공하는 단계는,
    상기 프로브의 작동 팁(operative tip) 상의 미리 정해진 위치에 시스(sheath)를 운반하는 금속 막을 배치하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
11. 청구항 1에 있어서,
    상기 표면 플라스몬 공진 장치에 상기 감지 표면을 제공하는 단계는,
    상기 표면 플라스몬 공진 장치 상의 미리 정해진 위치에 금속 막 운반기를 배치하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 금속 막 운반기는 플레이트(plate)이고,
    상기 금속 막 운반기를 배치하는 단계는 상기 표면 플라스몬 공진 장치의 원통형 프리즘(prism)으로 상기 플레이트를 배치하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
13. 청구항 1에 있어서,
    상기 눈물 샘플을 배치하는 단계는 환자의 눈에서 상기 눈물 샘플을 추출하고 상기 눈물 샘플을 상기 감지 표면 상에 배치하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 눈물 샘플을 추출하는 단계는 마이크로피펫(micropipette)을 사용하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
15. 청구항 13에 있어서,
    상기 눈물 샘플을 추출하는 단계는 흡수력 있는 다공성 물질을 사용하는 단계를 포함하는 테스트 장치.
16. 청구항 1에 있어서,
    상기 표면 플라스몬 공진 장치를 작동시키는 단계는 각 시간 지점과 연관되어 복수의 공진 각도들 또는 흡수 선 위치들 각각을 판단하는 단계, 및 결과적인 각도를 판단하기 위해 하나의 공진 각도를 다른 공진 각도에서 감산하는 단계를 포함하고, 상기 결과적인 각도에 대응하는 상기 용질들 중 하나의 농도를 판단하는 단계를 더 포함하는 테스트 장치.
17. 표면 플라스몬 공진 장치(surface plasmon resonance apparatus)를 포함하는 의학적 진단 시스템에 있어서,
    환자의 눈에서 눈물 샘플에 접촉하는 감지 표면을 포함하고, 광 감지 장치 및 상기 감지 표면에 의한 광 흡수의 패턴을 인코딩하는 전기 신호를 거기에서 수신하는 상기 광 감지 장치에 동작가능하게 연결된 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 더 포함하고, 상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 상기 감지 표면과 접촉하여 상기 눈물 샘플의 복수의 용질 농도 파라미터들을 판단하기 위해 상기 광 감지 장치에서 데이터를 분석하도록 프로그램된 의학적 진단 시스템.
18. 청구항 17에 있어서,
    상기 광 감지 장치는 카메라이고, 상기 전기 신호는 비디오 신호인 의학적 진단 시스템.
19. 청구항 17에 있어서,
    상기 광 감지 장치는 다중 요소 포토다이오드(photodiode)이고, 상기 전기 신호는 아날로그 차동 신호인 의학적 진단 시스템.
20. 청구항 17에 있어서,
    상기 컴퓨터 또는 마이크로프로세서는 흡수 선 위치를 용질 농도와 상관하는(correlating) 미리 기록된 데이터로 흡수 선 위치를 비교하도록 프로그램된 의학적 진단 시스템.
21. 청구항 17에 있어서,
    상기 플라스몬 표면 공진 장치는 환자의 눈의 눈물 견딤 부분(tear-bearing portion)과 작동 팁(operative tip) 상의 감지 표면의 접촉을 용이하게 하도록 적응된 상기 작동 팁이 있는 핸드헬드(handheld) 휴대용 케이싱(casing)을 포함하는 의학적 진단 시스템.
22. 청구항 17에 있어서,
    상기 감지 표면은 제2 금속의 제2 층 상에 배치된 제1 금속의 제1 층을 포함하는 의학적 진단 시스템.
23. 청구항 22에 있어서,
    상기 제2 층은 투명 물질의 기판 상에 차례대로 배치된 의학적 진단 시스템.

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