KR20100060674A

KR20100060674A - 아스피린 및 커큐민을 포함하는 간섬유화 억제용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20100060674A
Application number: KR1020080119368A
Authority: KR
Inventors: 강주섭; 김동욱; 홍정욱; 이민호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2010-06-07

Abstract

본 발명은 간섬유화 억제용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아스피린 및 커큐민을 포함하는 간섬유화 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

간섬유화, 간경화, 아스피린, 커큐민

Description

아스피린 및 커큐민을 포함하는 간섬유화 억제용 약학 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ASPIRIN AND CURCUMIN FOR INHIBITING HEPATIC FIBROSIS}

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다. 일단 생체내로 들어온 생체외 물질은 모두 간을 통과하게 되므로, 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 높으며, 따라서 그만큼 손상을 입을 확률도 다른 장기에 비하여 높다. 간조직 중에서는 영양물질의 흡수 및 대사, 저장, 혈장 단백질의 합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte), 간 내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간 손상 시 결합조직을 과다 합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포(hepatic stellate cell; HSC) 및 내피 세포(Endothelial cell), 오목 세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포 는 간조직을 구성하는 전체 세포의 약 90% 이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질 세포(parenchymal cell)로서 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이다.

간은 재생 능력이 우수한 장기로서 간세포가 약간 손상된 경우에는 충분히 정상으로 회복될 수 있으나, 지속적으로 손상될 경우에는 간세포가 완전히 파괴되고, 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하면서 결합조직이 과다축적되어 간조직에 반흔(scar)이 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 된다.

이러한 간 손상의 원인은 알코올, 담즙, 바이러스 등 다양하지만 손상이 지속되어 만성 간질환(chronic liver disease; CLD) 상태가 되면 그 원인과는 상관없이 염증상태의 지속, 세포외 기질(extra cellular matrix ; ECM)의 질적 및 양적 변화가 유발되게 된다. 여러 가지 원인에 의한 만성 간손상은 공통적으로 간섬유화를 초래하게 되며 그 기전은 하기와 같다. 즉, 여러 원인에 의하여 간세포가 손상되고, 간 내 대식세포인 쿠퍼 세포가 활성화되어 여러 종류의 사이토킨(cytokine)을 분비하게 되며, 이에 의하여 간성상세포가 활성화되어 결합조직을 생성하게 된다. 간 손상이 지속되는 경우, 손상된 간세포가 결합조직으로 대치되는 간질 복구(stromal repair)가 유발되므로써, 간조직 내 결합조직의 과다축적으로 인한 반흔이 형성되고, 간세포 손상으로 인하여 간기능이 저하되면서 간섬유화 및 간경화가 초래되는 것이다(문헌 [Rojkind et al., clinical Hepatology., 1983] 및 [Rubin et al., Essential pathology., second, 339-41, 1995]).

즉, 간섬유화(hapatic fibrosis)는 독성물질 또는 다양한 감염성, 면역성, 대사성 질환에 대한 반응으로 반흔이 남는 과정이다. 간섬유화는 세포외기질인 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 당단백질, 및 프로테오글리칸 등의 과도한 축적을 특징으로 하며, 상기 축적물 중 주된 성분은 콜라겐, 특히 제1형 콜라겐이다(문헌 [Olaso E et al., Molecular regulation of hepatic fibrogenesis, J Hepatol 29:836-847-, 1998] 및 [Friedman SL et al., Mechanisms and therapy of hepatic fibrosis: report of the AASLD Single Topic Basic Research Conference. Hepatology 32:1403-1404, 2000]). 이러한 간섬유화는 만성 간 손상에 대한 불가피한 간 병리학적 결과로써, 간부전 및 말기 간질환에서 빈발하는 합병증의 근본 원인이기도 하다. 간조직의 섬유화 반응은 처음에는 수동적인 병리 현상으로 알려졌으나, 최근에는 만성 간질환에서 몇 가지 세포외 기질 단백질들, 예컨대 프로테오글리칸, 탄수화물(히알루로난) 등이 축적되면서 지속적으로 세포외기질이 재분포하는 역동적인 과정의 일부인 것으로 밝혀졌다(문헌 [Bataller et al., Liver fibrosis. J Clin Invest 115:209-218, 2005] 및 [Gressner et al., Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-β as major players and therapeutic targets. J Cell Biol Med 10:76-99, 2006]). 또한, 다수의 연구결과에서 간섬유화 정도와 간조직내의 활성화된 HSC 의 수의 상관관계가 있는 것이 밝혀졌다(문헌 [Geerts PD. History, heterogeneity, developmental, biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Sem Liver Dis 21:311-335, 2001]; [Gawrich et al. Early hepatic stellate cell activation predicts severe hepatitis C recurrence after liver transplant. Liver Transplant 11:1207-1213, 2005] 및 [Russo et al. Early hepatic stellate cell activation is associate with advanced fibrosis after liver transplantation in recipients with hepatitis C. Liver Transpl 11:1235-1241, 2005]).

세포외기질 합성의 증가는 보통 간성상세포 및 기타 간기질을 생성하는 간장-유래 근섬유아세포-유사 세포 등의 활성화가 그 원인인 것으로 보고되었으며, 섬유 생성과정에서 발생하는 콜라겐의 대사가 억제됨으로써 기질 축적이 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 간경변증에서 간내 중형 및 대형 혈관내에 흔히 발생하는 혈전이 섬유화의 진행 및 악화에 매우 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되어 있으며(문헌 [Wanless et al., Role of thrombosis in the pathogenesis of congestive hepatic fibrosis(cardiac cirrhosis), Hepatology 21:1232-1237, 1995] 및 [Wanless et al., Hepatic and portal vein thrombosis in cirrhosis: possible role in development of parenchymal extinction and portal hypertension, Hepatology 21:1238-1247, 1995]), 이러한 간에서의 혈관폐색은 세포사멸(apoptosis) 및 세포위축(atrophy)에 있어서 중요한 요인으로 고려되고 있다.

최근 간섬유화의 기전에 대한 연구가 상당부분 진전되었음에도 불구하고 현재까지 공지된 간섬유화 억제 및 간경변증 치료에 대한 약물요법은 그 항섬유화 효능이 미미할 뿐만 아니라, 간성상세포의 활성화에 대한 특이적인 억제작용은 없는 것으로 보고되었다(문헌 [Poynard et al., Fibrosis in patients with chronic hepatitis C: detection and significance. Semin Liver Dis 20:47-55, 2000] 및 [Mathurin et al., Survival and prognostic factors in patients with severe hepatitis treated with prednisolone. Gastroenterology 110; 1847-1853, 1995]).

즉, 상기 언급한 바와 같이, 현재까지 공지된 간섬유화 억제 및 간경변증 치료에 대한 약물요법은 그 항섬유화 효능이 미미할 뿐만 아니라, 간성상세포의 활성화에 대한 특이적인 억제작용은 없는 것으로 보고되었는 바, 간섬유화 과정을 획기적으로 차단할 수 있는 새로운 약제의 개발의 필요성이 존재한다.

이에 본 발명자들은 항염증작용 및 간내 혈관에서 발생하는 혈전발생의 억제작용이 있는 비스테로이드성 항소염제와 간세포 손상을 억제하는 항산화작용이 있는 커큐민을 병합투여함으로써, 간섬유화 억제제 및 간경변증 치료제로서의 가능성을 탐색하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이를 위하여 본 발명에서는 우선 TAA(thioacetamide)-유발 간섬유화 흰쥐 모델을 제작하였다. TAA 는 그 자체로는 독성이 없지만 생체내로 투여되면 간 사이토크롬( cytochrome P450)에 의하여 강력한 간독소로 대사되며, 이에 의하여 강한 반응성 화합물을 생성하여 간 손상을 유발하는 것으로 알려진 물질이다(문헌 [Hunter et al. Thioacetamide-induced hepatic necrosis. I. Involvement of the mixed-function oxidase enzyme system. J Pharmacol Exp Ther 200:439-448, 1977]; [Balkan et al. Taurine has a protective effect against thioacetamide-induced liver cirrhosis by decreaseing oxidative stress. Hum Exp Toxicol 20:251-254, 2001] 및 [Bruck et al. Prevention of hepatic cirrhosis in rats by hydroxyl radical scavengers. J Hepatol 35:457-464, 2001]). TAA 에 의한 간손상 형태는 투여용량 및 투여기간에 좌우되며 고용량을 투여하는 경우 전격성 간부전(fulminant hepatic failure) 및 초기 사망을 유발할 수도 있고(문헌 [Bruck et al. Pyrrolidine dithiocarbamate protects against thioacetamide-induced fulminant hepatic failure in rats. J Hepatol 36:370-377, 2002]), 장기간 저용량을 투여하는 경우에는 뚜렷한 간경변증을 유발시킨다(문헌 [Pines et al, Halofuginone, a specific inhibitor of collagen type I synthesis, prevents dimethylnitrosamine-induced liver cirrhosis. J Hepatol 27:391-398, 1997]).

본 발명에서는 상기와 같이 제작한 TAA-유발 간섬유화 흰쥐 모델에 비스테로이드성 항소염제와 커큐민을 병합투여하여 간섬유화 억제작용을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 비스테로이드성 항소염제와 커큐민을 포함하는 간섬유화 억제 및 간경변증 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물에서 사용되는 비스테로이드성 항소염제는 공지된 임의의 비스테로이드성 항소염제일 수 있으며, 그 구체적인 예는 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 인도메타신(indomethacin), 아스피린(aspirin), 메클로페나메이트(meclofenamate) 등이다. 본 발명의 약학 조성물에서 사용되는 바람직한 비스테로이드성 항소염제는 아스피린이다.

아스피린은 대표적인 항소염제 중 하나로써 비선택성 COX(cyclooxygenase) 억제제이다. 아스피린은 용량-의존적으로 혈소판 기능을 억제하고 피브린의 분해를 증가시키며, 혈장 응집을 억제하여 혈관내 발생하는 혈전증을 억제하는 작용을 나타낸다. 저용량의 아스피린(100 mg 이하)은 혈관내피세포의 프로스타글란딘(prostaglandin; PG)의 형성으로 인한 혈소판의 트롬복산(thromboxane; TX) 생성을 억제하여 혈전증을 예방할 수 있으므로 협심증 예방약으로도 사용되고 있다. 한편, 관상동맥을 결찰한 흰쥐에서 저용량 아스피린을 장기간 투여한 경우 무경색 심근부위의 콜라겐 축적에는 영향을 주었으나 TAA-유발 간경변증 동물 모델의 교량 섬유화에 대하여서는 효과가 없었다는 사실에 미루어, 간섬유화와 관련된 또 다른 기전, 특히 지질 산화반응이 관련되는 것으로 판단하였는 바, 본 발명자들은 저분자량 폴리페놀인 커큐민(bis-α,β-불포화 β-디케톤)의 병합투여를 고려하게 되었다.

커큐민은 항산화, 항염증성 및 암예방·치료 활성 등이 있으며 다양한 세포주에서 연구된 세포독성에 의하면 10^-6 내지 10^-3 M 농도에서 세포증식의 억제, 세포사멸의 유도 및 세포 분열을 세포주기 중 G₂/M 기에 정지하게 하는 효과 등이 유방, 신장, 간세포, 림프조직, 골수조직, 흑색종, 경구상피세포 및 전립선세포 유래 암세포 뿐만 아니라 전립선, 대장, 뼈 및 백혈병에서 유래된 암세포에서도 나타난 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에서 비스테로이드성 항소염제 및 커큐민의 용량의 중량비는 1 : 30 내지 1 : 6, 바람직하게는 1 : 12 내지 1 : 6, 더욱 바람직하게는 1 : 6 이다.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 발명에서는 흰쥐에 200 mg/kg 의 TAA 를 주당 2 회로 7 주간 복강내투여함으로써 간섬유화를 유발하였으며, 상기와 같이 항혈전작용이 있는 아스피린과 항산화작용이 있는 커큐민을 병합사용하였다. 보다 구체적으로, 커큐민은 1 일 300 mg/kg 을 매일 경구투여하였고, 아스피린은 각각 군별로 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 을 경구투여하고, 간섬유화에 대한 효과를 관찰하였다. 그 결과, 체중 및 장기(간장과 비장)무게의 변화는 있었으나 통계학적으로 유의한 수준은 아니었으며, 혈소판수 및 PT 의 변화도 유의하지 않았다.

그러나, 간조직의 염증 정도를 평가하기 위한 혈청학적 검사에서는 간 군별 혈청학적 지표의 변화를 통하여, 정상대조군에 대하여 실험대조군에서 총 단백질, 알부민, ALT, AST, ALT/AST 비율, APase, 총 빌리루빈, TG 등에서 변화의 양상을 나타냈으며, 그 중에서도 ALT, AST, APase, 콜레스테롤의 수치가 유의한 변화를 나타냈고, 아스피린 50 mg 과 커큐민 300 mg을 병합투여한 군에서 정상대조군과 비교하여서는 유의한 변화가 없었으나 TAA 를 투여한 실험대조군에 비하면 ALT 및 APase 수치가 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 섬유화 정도를 평가하기 위한 조직검사소견에서는 크노델 평가법(Knodell's scoring)에 의하여 간조직의 섬유화 정도를 관찰·평가하였으며, TAA 투여로 인하여 간소엽 중심정맥간과 중심정맥과 문맥간에 발생한 교량섬유화와 중등도의 미세소포성 지방증(microvesicular steatosis)과 담관세포 증식(bile duct proliferation)을 관찰할 수 있었으며 섬유화 점수는 2 내지 3, 그 평균값은 2.28 이었다. 한편, 커큐민 용량은 고정하고 아스피린 용량은 다양하게 적용하여 10 mg 을 투여한 동물의 간섬유화 특징은 간소엽주위 섬유화(pericentral fibrosis)와 약간의 소형 소포성 지방증 및 간문맥 주변의 교량섬유화를 일부 관찰할 수 있었으며 섬유화 점수는 1 내지 3, 그 평균값은 2.00 이었다. 25 mg 을 투여한 동물의 간섬유화의 특징은 간소엽중심 주변의 섬유화와 문맥부에 중등도 섬유조직 침착과 증등도 소형 소포성 지방증 및 문맥부에 담관 증식을 관찰할 수 있었으며 섬유화 점수는 1 내지 3, 그 평균값은 1.89 였다. 한편, 아스피린 50 mg 을 투여한 동물에서는 대부분 소엽중심 및 약간의 간문맥 중심의 교량섬유화가 특징적이었고 섬유화 점수는 1 내지 3, 그 평균값은 1.78 로서 섬유화가 가장 개선된 상태를 나타내었다.

또한, 간조직내 콜라겐 생성량을 나타내는 4-하이드록시프롤린의 양(4-HP,μg/ml)도 정상동물에서는 329.83±65.12 이었던 반면, TAA 투여의 경우 정상동물과 비교하여 약 186% 가 증가된 613.30±178.31이었다. 그러나, 커큐민과 아스피린의 병합투여군의 경우에 있어서는, 아스피린의 용량증가에 따라 그 생성량이 점차로 감소하여 [아스피린 50 mg + 커큐민 300 mg] 을 투여한 동물군에서는 그 수치가 407.89±112.34 로서 정상동물에 비하여 약간 증가한 정도였으며, TAA 를 투여한 동물과 비교하여서는 유의하게 감소한 수치를 나타냈다.

따라서, 상기의 결과들을 통하여 본 발명자들은 본 발명에 의한 약학 조성물이 간 염증 및 간 섬유화 반응을 유의하게 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 의한 비스테로이드성 항소염제와 커큐민을 포함하는 약학 조성물은 간섬유화 억제제 및 간경변증 치료제로 사용될 수 있다.

이하에서, 본 발명을 하기의 실시예 및 첨부된 도면을 통하여 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 의도일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기의 실시예에 기재된 예만으로 국한되는 것은 결코 아니다. 또한, 하기의 실시예 뿐만 아니라, 당업자에 의해서 이로부터 용이하게 추론될 수 있는 사항까지도 본 발명의 보호범위에 속함은 자명하다.

TAA -유발 간섬유화 흰쥐 모델의 제작

평균 체중이 274.4±9.29 g 인 스프래그-다우리(Sprague-Dawley)계 수컷 흰쥐(SDR, 중앙실험동물, 한국)에 20% TAA 용액(thioacetamide, Sigma 사, 미국) 200 mg/kg 을 주당 2 회 복강내로 주사하였다.

실험군의 구성

커큐민(Now Foods 사, 미국)은 1 일에 300 mg/kg 을 각 군별 매일 경구투여하였으며, 아스피린(Sigma 사, 미국)은 각 군별 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 용량으로 매일 경구투여하다. 한편, 하기와 같은 방법으로 정상대조군, 실험대조군 및 실험군 I 내지 III 을 구성하였다.

1) 정상대조군 : 실험기간 중 생리식염수를 투여하였다.

2) 실험대조군 : 상기 용량·용법으로 TAA 를 7 주간 투여 후 7 주간은 생리식염수를 투여하였다.

3) 실험군 I : 상기 용량·용법으로 TAA 를 7 주간 투여하고, 이후 커큐민(300 mg/kg)과 아스피린(10 mg/kg)을 7 주간 상기한 용량·용법으로 병합투여하 였다.

4) 실험군 II : 상기한 용량·용법으로 TAA 를 7 주간 투여하고, 이후 커큐민(300 mg/kg)과 아스피린(25 mg/kg)을 7 주간 상기한 용량·용법으로 병합투여하였다.

5) 실험군 III : 상기한 용량·용법으로 TAA 를 7 주간 투여하고, 이후 커큐민(300 mg/kg)과 아스피린(50 mg/kg)을 7 주간 상기한 용량·용법으로 병합투여하였다.

실시예 1 : 체중 및 장기(간장과 비장)무게 변화의 측정

실험동물의 입수 후 1 주일의 적응기간을 두었으며, 약물 투여 전 체중을 초기체중으로 하고 매주 1 회씩 각 개체의 체중을 측정하여 체중변화를 관찰하였다. 장기무게는 약물 투여 종료 후 1 일째에 측정하였으며, 금식 후의 금식체중도 측정하였다. 상기 결과를 기초로 간장과 비장의 무게 및 금식체중에 대한 간장과 비장무게의 비를 계산하였다.

체중 변화량에서는 정상대조군 이외에서는 실험군 III 의 평균 체중이 가장 크게 증가하였다. 대조군에서는 간장 무게와 간장/체중비율이 가장 크게 증가하였고, 약물투여군에서는 용량과 관계없이 감소하는 경향을 나타내었다. 이로써 TAA 에 의한 섬유화 초기에 나타나는 간비대 현상으로 섬유화가 본격적으로 진행되기 전 상태인 것으로 나타났다.

[표 1] 체중과 장기 무게의 변화

* 체중증가량 = 14 주 정상체중 - 0 주 체중

* 장기와 체중비율은 금식체중에 대한 장기무게의 비율임.

실시예 2 : 혈소판 수(10 ³ / mm ³ )와 프로트롬빈 시간( Prothrombin Time ; PT 분)의 변화의 측정

간경변증의 자연 경과로 비장 증대형 혈소판 감소증과 출혈 경향 증가를 관찰하였다.

혈소판 수에서는 의미있는 변화는 아니었으나, 실험군 II 에서 가장 크게 감소하였으며, PT 는 실험군 I 에서 가장 크게 증가하였다. 이는 COX 억제제인 아스피린의 영향에 기인한 것으로 추측된다.

[표 2] 혈소판 수와 프로트롬빈 시간(분)의 변화

* p< 0.05 vs. 실험대조군 및 정상대조군

실시예3 : 혈청학적 지표 및 간장의 조직학적 검사의 관찰

7 주간 약물투여 후 심천자로 혈액을 채집하여 하기의 항목으로 혈액검사를 실시하였다: 총 단백질(g/dl), 알부민(g/dl), ALT(alanine transaminase; IU/L), AST(aspartate transaminase; IU/L), 알칼리인산분해효소(Alkaline Phosphatase; IU/L), 총 빌리루빈(mg/dl), 콜레스테롤(mg/dl), 트리글리세리드(triglycerides; mg/dl). 그 후, 심천자로 사혈시키고 조직검사를 위하여 간조직을 얻고 일부 조직은 간조직내 4-하이드록시프롤린 양을 측정하여 섬유조직의 축적정도를 검사하였으며, 일부 조직은 헤마톡실린&에오신(H&E) 이중염색 및 마손 트리크롬(Masson's Trichrome)염색을 실시하여 광학현미경으로 조직변화를 관찰하고, 크노델 평가법(Knodell's scoring)으로 간섬유화 정도를 측정하였다(문헌 [Knodell et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing historical activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1:431-435, 1981]). 한편, 상기 크노델 평가법에서의 구체적 평가 내용은 하기 표와 같다:

[표 3]

상기의 조직학적 변화의 관찰은 수의병리학자가 수행하였으며,생화학자동분석기(TBA-20FR, 도시바사, 일본)를 이용하여 채혈된 혈액을 3000 rpm 에서 15 분간 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈청학적 지표를 측정하였다.

한편, TAA 로 유발된 간섬유화 정도를 정량적으로 평가할 수 있는 간조직내 교원질의 양을 측정하기 위하여 심천자 사혈로 희생시킨 뒤 얻은 간조직에서 검증된 측정법(문헌 [Jamall et al. A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues. Anal Biochem 112:70-75, 1981])으로 하기와 같이 간조직의 교원질을 가수분해시켜 생성되는 4-하이드록시프롤린의 양을 측정하였다. 보다 구체적으로, 4-하이드록시프롤린 표준품을 50% 이소프로필알콜로 용해시켜 0.05 ~ 10.0 ㎍/ml 이 되도록 희석하여 표준용액을 제조하였다. 각 용액 1.2 ml 를 취하여 6.7% 완충 클로라민 T 용액 0.2 ml 을 넣고 충분히 혼합한 후 실온에서 10 분간 방치하였다. 에를리히 용액 1 ml 을 첨가한 후 50℃ 에서 90 분간 배양시킨 후 흡광 광도계로 558 nm 에서 흡광도를 측정하여 정량선을 작성하였다. 간조직에서의 측정은 흰쥐 부검시에 개체 당 간조직 0.5 g 을 취하여 6N HCl 을 4 ml 첨가하여 균질화시킨 뒤 120℃ 에서 18 시간 동안 가수분해시킨 후 13,000 rpm 에서 15 분간 원심분리시켰다. 이 중 상등액 100 μl 를 취하여 질소 가스로 감압증발 건조시킨 후, 남은 잔사에 50% 이소프로필알콜을 1.2 ml 첨가하여 용해시키고 클로라민 T 용액 0.2 ml 를 첨가하고 실온에서 10 분간 방치하였다. 이후 에를리히 용액 1 ml 를 첨가하고 50℃ 에서 90 분간 배양한 후 동일한 조건에서 흡광도를 558 nm 에서 측정하였다.

간 군별 혈청학적 지표의 변화를 보면 정상대조군에 비하면 실험대조군에서 총 단백질, 알부민, ALT, AST, ALT/AST 비율, APase, 총 빌리루빈, TG 등에서 변화 양상을 나타냈으며, 이 중에서 ALT, AST, APase, 콜레스테롤 수치가 유의한 변화를 나타냈다. 또한, 실험군 III 에서는 정상대조군과는 유의한 변화는 없었으나 실험대조군에 비하면 ALT 및 APase 수치의 유의한 감소를 나타내었다. 따라서, 아스피린 50 mg 과 커큐민 300 mg 투여에 의한 효과인 것으로 결론지어졌다.

[표 4] 혈청학적 지표의 변화

ALT; 알라닌 아미노전이효소, AST: 아스파테이트 아미노전이효소, APase: 알칼리 인산분해효소, TG: 트리글리세리드

* p<0.05 vs. 정상대조군

** p<0.05 vs. 실험대조군

한편, 혈액 채취 후 간문맥을 통하여 생리식염수로 관류시킨 뒤 간조직을 적출하여 간무게를 측정하고 간의 육안적 소견을 관찰하였다. 조직은 10% 중성 포르말린 용액에 24 시간 동안 고정한 후 6 ㎛ 두께로 파라핀 절편을 만들어 H&E 이중염색과 마손 트리크롬 염색을 실시하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 간조직의 섬유화 정도의 평가는 크노델 평가법으로 정량화하였다.

실험대조군의 간섬유화의 특징은 간소엽 중심정맥사이(central-central) 및 중심정맥과 문맥사이(central-portal) 교량 섬유화 및 중등도의 미세소포성 지방증(microvesicular steatosis)과 담관세포 증식(bile duct proliferation)을 나타냈으며, 조직 섬유화 점수는 2 내지 3 정도로 그 평균값은 2.28 이었다. 실험군 I 의 간조직의 섬유화 특징은 간소엽주위 섬유화(pericentral fibrosis)와 약간의 소형 소포성 지방증 및 간문맥 주변의 교량 섬유화가 일부 관찰되었으며, 조직 섬유화 점수는 1 내지 3 로 다양하였으나 그 평균값은 대조군보다 감소한 2.00 이었다. 실험군 II 의 간 섬유화 특징은 간소엽 중심 주변의 섬유화 및 문맥부에 중등도 섬유조직 침착과 증등도 소형 소포성 지방증 및 문맥부에 담관 증식을 나타냈으며, 조직 섬유화 소견 점수는 1 내지 3 으로 다양하게 나타났으나 그 평균값은 1.89 였다. 실험군 III 은 대부분 소엽중심 및 약간의 간문맥 중심의 교량 섬유 화가 특징적이었고 섬유화 점수는 1 내지 3 였으며, 그 평균값은 1.78 로 실험대조군보다 섬유화가 개선된 상태를 보여 주었다. 상기의 각 군별 섬유화 수치의 분포는 [표 5] 에 나타냈다. 평균 섬유화 수치를 비교하여 보면, 약물투여군에서 섬유화가 억제되었으며, 특히 실험군 III 에서 섬유화 억제효과가 유의한 것으로 나타났다.

또한, 간조직내 콜라겐 생성량을 나타내는 4-하이드록시프롤린의 양(4-HP,㎍/ml)도 정상대조군에서는 329.83±65.12 이었던 반면, 실험대조군에서는 정상대조군과 비교하여 약 186% 가 증가된 613.30±178.31 을 나타냈다. 또한, 약물투여군에서는 아스피린의 용량 증가에 따라 그 생성량이 점차로 감소하여 실험군 III 인 아스피린 [50 mg + 커큐민 300 mg] 병합 투여군에서는 그 수치가 407.89±112.34 로서 정상대조군보다는 약간 증가하였으나 실험대조군보다는 유의하게 감소한 수치를 나타냈다(표 5 참조).

[표 5] 크노델 평가법에 의한 간섬유화 정도 점수 및 4-하이드록시프롤린 양의 변화

* p<0.05 vs. 정상대조군

** p<0.05 vs. 실험대조군

도 1 은 정상대조군의 간조직 H&E 소견과 마손 트리크롬 염색소견을 나타낸 것이다(섬유화 점수 = 0 ; 40 배).

도 2 는 실험대조군의 간조직 H&E 소견과 마손 트리크롬 염색소견을 나타낸 것이다(섬유화 점수 = 3 ; 40 배).

도 3 은 실험군 I 의 간조직 H&E 소견과 마손 트리크롬 염색소견을 나타낸 것이다(섬유화 점수 = 1 ; 40 배).

도 4 는 실험군 II 의 간조직 H&E 소견과 마손 트리크롬 염색소견을 나타낸 것이다(섬유화 점수 = 1 ; 40 배).

도 5 는 실험군 III 의 간조직 H&E 소견과 마손 트리크롬 염색소견을 나타낸 것이다(섬유화 점수 = 1 ; 40 배).

Claims

비스테로이드성 항소염제와 커큐민을 포함하는 간섬유화 억제 및 간경변증 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항소염제는 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 인도메타신(indomethacin), 아스피린(aspirin) 및 메클로페나메이트(meclofenamate)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항소염제가 아스피린인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항소염제 및 커큐민의 용량의 중량비가 1 : 30 내지 1 : 6 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항소염제 및 커큐민의 용량의 중량비가 1 : 12 내지 1 : 6 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 비스테로이드성 항소염제 및 커큐민의 용량의 중량비가 1 : 6 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.