KR20100060283A - 신규한 내열성 ｄｎａ 중합효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 아미노산 서열로 이루어진 Tod DNA 중합효소 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 Tod DNA 중합효소를 이용하면 RNA를 주형으로 역전사 단계 및 cDNA 증폭 단계가 하나의 효소를 이용하여 진행될 수 있으며, 다량의 RNA를 이용하지 않고도 신속하고 경제적으로 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있다.

Tod DNA 중합효소, 역전사, cDNA, 뉴클레오타이드, 중합효소연쇄반응, PCR

Description

신규한 내열성 ＤＮＡ 중합효소{Novel Thermostable DNA Polymerase}

본 발명은 신규한 내열성 DNA 중합효소, 이를 코딩하는 핵산 분자 및 그의 용도에 관한 것이다.

DNA 중합효소는 그 기능상 모든 생물이 가지고 있는 것으로 생각되고 아미노산 서열이 밝혀짐에 따라 최근에는 패밀리 A, B, C 및 X의 4종류로 분류 되고 있다. 그 중 패밀리 A는 대장균 DNA 중합효소 Ⅰ으로 대표되는 Pol Ⅰ패밀리이고 B는 사람 DNA 중합효소 α로 대표되는 α-패밀리로 분류된다. 패밀리 C는 대장균 DNA 중합효소 Ⅲ로, X는 사람 DNA 중합효소 β와 터미널 트랜스퍼라아제(Terminal transferase)로 대표된다. 같은 패밀리에 속하는 것은 공통의 아미노산 서열을 가지고 있고 효소의 생화학적 성질, 예를 들면 DNA 합성속도, 합성되는 뉴클레오타이드의 수, 주형-프라이머 종류에 대한 선호성이나 저해제에 대한 감수성에 있어서 유사하다. 한편, 중합효소연쇄반응(PCR, 중합효소 Chain Reaction)에 사용할 수 있는 DNA 중합효소의 절대 조건은 내열성이므로 호열성 세균 및 초호열성 고세균이 가지고 있는 DNA 중합효소가 대상이 되고, 진정세균 유래는 Pol Ⅰ패밀리에 속하고 고세균 유래는 α-패밀리에 속한다(Saiki et al., 1988).

내열성 DNA 중합효소로 처음 특성이 밝혀진 Taq DNA 중합효소는 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq.)로부터 분리되었고(Chien et al., 1976) 이후 많은 써머스 속 세균으로부터 Tfl 중합효소(Kaledin et al., 1981), Tth 중합효소(Ruttimann et al, 1985), Tca 중합효소(Park et al., 1993), Tfi 중합효소(Jung et al., 1997), Top 중합효소(Kim et al., 1998) 등이 분리되어 PCR에 적용되고 있다. 역전사 활성에 있어서는 대장균의 Pol Ⅰ이 이런 활성을 가지는 것으로 오래전부터 알려져 왔지만(Karkas et al., 1973), PCR의 출현 후 Taq 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한번에 PCR까지 수행하는 방법이 보고되었다(Tse et al., 1990). 그러나 증폭에는 다량(1-5 ㎍)의 RNA가 필요하거나 소량의 RNA를 검출하기 위해서는 노던 혼성화(Northern hybridization)가 필요하였기 때문에 실용적이지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 뉴클레오타이드 증폭 방법과 달리, DNA 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한 번에 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있으며, 다량의 RNA를 필요로 하지 않는 경제적인 호열성 DNA 중합효소를 발굴하고자 노력하였다. 그러한 노력의 일환으로 온천수에서 분리한 호열성 써머스 써머필러스 HJ6(Thermus thermophilus HJ6) 균주로부터 상기의 활성을 갖는 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고 염기서열을 확인하였으며, 이를 이용하여 뉴클레오타이드 증폭 및 역전사활성을 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 중합효소를 이용한 뉴클레오타이드의 증폭 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 Tod DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 뉴클레오타이드 증폭 방법과 달리, DNA 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 RNA로부터 한 번에 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있으며, 다량의 RNA를 필요로 하지 않는 경제적인 호열성 DNA 중합효소를 발굴하고자 노력하였다. 그 결과, 써머스 써머필러스 HJ6(Thermus thermophilus HJ6) 균주로부터 상기의 활성을 갖는 신규한 DNA 중합효소의 아미노산 서열 및 염기서열을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “Tod DNA 중합효소”는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 DNA 중합효소를 의미한다. 상기 Tod DNA 중합효소는 미생물로부터 유래된 것이며, 보다 바람직하게는 상기 Tod DNA 중합효소는 써머스 속 미생물로부터 유래된 것이고, 보다 더 바람직하게는 써머스 써머필러스로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 써머스 써머필러스 HJ6으로부터 유래된 것이다.

본 명세서에서 용어“증폭 방법”은 핵산 분자를 증폭하는 방법을 의미한다. 다양한 증폭 방법들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(Wu, D. Y. & Wallace, R. B. (1989) Genomics 4, 560-569.; Barany, F. (1991) PCR Methods Appl. 1, 5-16.), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연 쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(Kwoh, D. Y., Davis, G. R., Whitfield, K. M., Chappelle, H. L., DiMichele, L. J. & Gingeras, T. R. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 1173-1177.; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., Kwoh, D. Y., Barringer, K. J., Richman, D. D. & Gingeras, T. R. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 1874-1878.; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(Walker, G. T., Little, M. C., Nadeau, J. G. & Shank, D. D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 89, 392-396.; Walker, G. T., Fraiser, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G. & Malinowski, D. P. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 1691-1696.) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. & Hase, T. (2000) Nucleic Acids Res. 28, E63.)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Tod DNA 중합효소는 써머스 써머필러스에서 분리되고, 다음과 같은 특성을 갖는다: (a) 최적온도 75℃ 내지 80℃; (b) 최적 pH 8.5 내지 9.0; (c) 최적 Mg²⁺ 농도 2-3 mM; (d) 최적 Mn²⁺ 농도 0.5-1.5 mM; 및 (e) 최적 KCl 농도 0-20 mM. 상기 Mn²⁺에 대한 Tod DNA 중합효소의 최대 활성은 Mg²⁺에 대한 최대 활성과 비슷(참고: 도 4의 패널 C)하여 대부분의 DNA 중합효소가 Mn²⁺에 대한 낮은 활성을 나타내는 것(Choi et al., 1999; Choi et al., 2004)과 비교하여 상이하다. 또한, 상기 KCl의 경우 낮은 농도에서는 Tod DNA 중합효소 활성에 별다른 영향을 미치지 않지만 20 mM 이상의 농도에서 점차 활성이 감소하여 80 mM 이상에서는 효소 활성이 완전히 저해(참고: 도 4의 패널 D)되는 것은 Taq 및 Tca DNA 중합효소(Park et al., 1993)와 비교하여 이들이 KCl의 첨가를 필수적으로 요구하는 것과 대조적이다.

일반적으로 DNA 중합효소 유전자는 2가지 도메인으로 구성된다. 첫 번째는 5’→3’엑소뉴클레아제 도메인이고 두 번째는 5’→3’중합효소 도메인이다. DNA 중합효소의 5’→3’엑소뉴클레아제 활성은 PCR 등의 반응에서 프라이머를 분해하는 등의 저해 요인으로 작용한다. 따라서, DNA 중합효소유전자의 5’→3’엑 소뉴클레아제 도메인을 제거할 경우 보다 효율적인 뉴클레오타이드 증폭이 이루어지게 된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Tod DNA 중합효소는 5’→3’엑소뉴클레아제 활성이 없는 것이며, 가장 바람직하게는 서열목록 제2서열의 아미노산 1-250이 결실되어 5’→3’엑소뉴클레아제 활성이 없는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Tod DNA 중합효소는 역전사 활성을 갖는 것이다. 본 명세서에 기술된 용어“역전사”는 RNA 주형에서 DNA를 합성하는 반응을 의미한다. 예컨대, 역전사 과정은 RT-PCR에 포함된다. 핵산 분자를 증폭하는 방법으로 PCR 방법이 소개된 이후, Taq DNA 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한번에 PCR까지 수행하는 방법이 보고(Tse et al., 1990) 되었지만, 핵산 분자의 증폭에는 1-5 ㎍ 정도에 이르는 다량의 RNA 주형이 필요하거나 소량의 RNA를 검출하기 위해서는 노던 혼성화가 필요하였기 때문에 실용적이지 않았다. 보다 경제적이고 효율적인 핵산 분자의 증폭을 위해서는 보다 소량의 RNA를 주형으로 이용할 수 있어야 하는데, 본 발명인 Tod DNA 중합효소의 가장 큰 특징 중 하나는 종래 기술과 비교하여 훨씬 더 소량의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이다. 바람직하게는 전체 반응액 20 ㎕ 기준으로 1-5,000 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이며, 보다 바람직하게는 1-1,000 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이고, 보다 더 바람직하게는 3-500 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이며, 가장 바람직하게는 5-250 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 Tod DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 핵산 분자는 Tod DNA 중합효소를 코딩하는 범위내에서, 첨부한 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 보다 바람직하게는, 단백질에서 변화를 가져오지 않는 범위내의 뉴클레오타이드에서의 변이를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드는 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하며, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-750이 결실된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-750은 5’→3’엑소뉴클레아제 활성을 코딩하는 부분으로, 상기 서열이 결실된 핵산 분자는 보다 효율적인 뉴클레오타이드 증폭능력을 갖는 Tod DNA 중합효소를 코딩하게 된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Tod DNA 중합효소를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 Tod DNA 중합효소의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼(Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 Tod DNA 중합효소를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 Tod DNA 중합효소를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 증폭 방법을 제공한다: (a) 상기 Tod DNA 중합효소를 RNA에 접촉시켜 이중쇄 cDNA를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 Tod DNA 중합효소를 이용하여 상기 이중쇄 cDNA를 증폭하는 단계.

본 발명자들은 종래의 뉴클레오타이드 증폭 방법과 달리, DNA 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 RNA로부터 한 번에 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있으며, 다량의 RNA를 필요로 하지 않는 신속하고도 경제적인 뉴클레오타이드 증폭 방법을 발굴하고자 노력하였다. 그 결과, Tod DNA 중합효소를 이용하여 상기의 특성을 갖는 뉴클레오타이드 증폭 방법을 발견하게 되었다.

본 발명인 뉴클레오타이드의 증폭 방법에서 이용되는 효소는 상술한 Tod DNA 중합효소로 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다;

단계 (a): Tod DNA 중합효소를 RNA에 접촉시켜 이중쇄 cDNA를 제조

먼저, 상술한 Tod DNA 중합효소를 주형 RNA를 포함하는 혼합액과 반응시켜 역전사 반응을 수행한다. 역전사 반응은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 큰 특징 중 하나는, 역전사 단계와 이중쇄 cDNA 합성 단계가 별도 의 역전사 효소의 첨가 없이 소량의 Tod DNA 중합효소의 첨가만으로 단일 단계로 이루어지는 것이다. 종래 기술로서 Taq DNA 중합효소의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한번에 PCR까지 수행하는 방법이 보고(Tse et al., 1990) 되었지만, 핵산 분자의 증폭에는 1-5 ㎍정도에 이르는 다량의 RNA 주형이 필요하거나 소량의 RNA를 검출하기 위해서는 노던 혼성화가 필요하였기 때문에 실용적이지 않았다. 보다 경제적이고 효율적인 핵산 분자의 증폭을 위해서는 보다 소량의 RNA를 주형으로 이용할 수 있어야 하는데, 본 발명인 Tod DNA 중합효소의 가장 큰 특징 중 하나는 종래 기술과 비교하여 훨씬 더 소량의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이다. 예를 들어, RT-PCR의 경우 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.1 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂ 또는 MnCl₂, 올리고 dT 프라이머, 5 unit Tod DNA 중합효소에 RNA 주형 1 ng 이상을 포함하는 혼합액(20 ㎕)을 65℃에서 5 분간 반응한 후, 60℃에서 30 분간 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 제조할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 Tod DNA 중합효소는 1 ng 이상의 주형 RNA만으로도 cDNA를 제조할 수 있는 역전사 활성을 나타낸다. 바람직하게는 전체 반응액 20 ㎕ 기준으로 1-5,000 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이며, 보다 바람직하게는 1-1,000 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이고, 보다 더 바람직하게는 3-500 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것이며, 가장 바람직하게는 5-250 ng의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것 이다.

상기의 방법은 종래의 방법과 비교하여 신속하고 경제적이다. 예를 들어, RT-PCR의 경우 기존의 역전사 효소를 이용하는 역전사 반응과 별도의 DNA 중합효소를 이용하는 제2쇄 cDNA 합성 과정을 따로 진행하는 2단계 반응 대신에, Tod DNA 중합효소를 이용할 경우에는 역전사반응에 의한 제1쇄 cDNA 합성과정과 제2쇄 cDNA 합성 과정이 하나의 효소를 이용하여 진행될 수 있다.

단계 (b): Tod DNA 중합효소를 이용한 이중쇄 cDNA의 증폭

이어, Tod DNA를 이용하여 단계 (a)에서 제조한 cDNA를 증폭한다. cDNA의 증폭은 통상의 뉴클레오타이드 증폭방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, PCR, 리가아제 연쇄 반응, Gap-LCR, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응, 핵산 염기서열 기반 증폭, 가닥 치환 증폭 및 고리-중재 항온성 증폭을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, PCR 방법으로 cDNA를 증폭할 경우 역전사 반응이 종료된 튜브에 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.2 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂, 50 pM F-1 프라이머(5’-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3’), 50 pM R-1 프라이머(5’-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3’)를 포함하는 PCR 혼합액(80 ㎕)을 첨가하고 DNA 온도순환기를 사용하여 PCR 반응을 수행할 수 있다. PCR 조건은 95℃, 5 분간의 변성단계를 거쳐 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 72℃에서 1 분간을 30 회 반복 수행하고 72℃에서 5 분간 마지막 신장반응을 수행할 경우 전기영동을 통하여 cDNA 단편의 증폭을 확인할 수 있다(참고: 도 7).

상기의 Tod DNA 중합효소를 이용한 단일튜브 RT-PCR(single tube RT-PCR) 방법은 기존의 역전사 효소를 이용하여 역전사 반응과 PCR 반응을 따로 진행하는 2단계 RT-PCR 보다 조작 면에서 매우 간편한 장점을 갖는다.

본 발명의 특징 및 이점(advantages)를 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 신규한 아미노산 서열로 이루어진 Tod DNA 중합효소와 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 상기 Tod DNA 중합효소를 이용하여 뉴클레오타이드를 증폭하는 방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명에 따르면 종래의 공지된 뉴클레오타이드 증폭 방법과는 다르게 RNA를 주형으로 역전사 단계 및 cDNA 증폭 단계가 하나의 효소를 이용하여 진행될 수 있으며, 다량의 RNA를 이용하지 않고도 신속하고 경제적으로 뉴클레오타이드를 증폭할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

균주 분리

본 연구에 사용된 써머스 속 HJ6 균주는 일본의 아리마 온천수(온도는 92.8℃이고 pH는 6.8)에서 분리하였다. 분리방법으로는 온천수에 0.1% 이스트 추출물을 첨가하여 80℃에서 2 일간 배양한 후, 0.7% 젤라이트(Gelrite)를 포함하는 ATCC medium 1598(박토트립톤 2.5 g, 이스트 추출물 2.5 g, 니트릴로트리아세트산 100 ㎎, CaSO₄ x 2H₂O 4 ㎎, MgCl₂ x 6H₂O 200 ㎎, 0.01 M Fe-citrate 0.5 ㎖, 0.5 ㎖ 미량원소 용액, Na-K 포스페이트 완충액(pH 7.2, 0.16 M), per liter) 고체 배지에 접종하고, 80℃에서 1.5 일간 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주는 ATCC medium 697(8 g 폴리펩톤, 4 g 이스트 추출물, 4 g/L NaCl, pH 7.5)을 사용하여 80°C에서 정기적으로 계대배양 하였다.

유전자 클로닝 및 염기서열 분석

써머스 속 HJ6 균주의 염색체는 GeneAll^R GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, 서울, 한국)를 이용하여 추출하였다. 써머스 속 HJ6 유래 DNA 중합효소(Tod, Top Of DNA 중합효소)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈 염기서열이 밝혀진 써머스 써머필러스 HB8과 HB27의 DNA 중합효소 유전자 염기서열을 바탕으로 각각 개시코돈의 상류와 종결코돈의 하류에 해당하는 두가지 프라이머 (프라이머 1: 5’-caggtggccctggagtagcatg-3’, 프라이머 2: 5’-tctaaacggcagggccccccta-3’)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Taq DNA 중합효소를 사용하여 약 2.5 kb의 DNA 단편을 증폭하였고 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 후, pGEMTOD라고 명명하였다. 클로닝 된 DNA 단편의 염기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer(Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.

Tod DNA 중합효소 생산 및 정제

온도 감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 발현 벡터 pJLA503(Schauder at al., 1987; 일본, 오사카 대학에서 분양), 에 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하기 위하여 pGEMTOD 플라스미드를 주형으로 프라이머 3(5’-ctggagtcatatggaggcgatgctt-3’, 밑줄은 Nde I 부위)과 프라이머 4(5’-tggaattcctaacccttggcggaa-3’, 밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 2.5 kb의 DNA 단편은 Nde I과 Eco RI으로 절단한 후 같은 효소로 절단한 pJLA503 벡터에 연결하고 E. coli DH5α(Novagen, Germany)에 형질전환 하였다. 클로닝 된 플라스미드를 pJLATOD로 명명하고 E. coli BL21 (DE3) codon plus(Novagen, Germany)에 다시 형질전환한 후 2 x YTA 배지(트립톤 16 g/L, 이스트 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 암피실린 100 ㎍/㎖)에서 30℃로 20 시간 전배양 하였다. 전배양액의 1%를 새로운 2 x YTA 배지에 접종한 후, 흡광도(A₆₀₀)가 0.6이 되었을 때 42℃로 온도를 올려 5 시간 동안 유도배양 하였다. 배양된 균체는 원심분리를 통하여 집균하고 완충액 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM 다이티오트레이톨)에 녹인 다음 초음파로 파쇄 하였다. 초음파 파쇄 후 세포추출물은 80°C에서 20 분간 열처리한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 (GE Healthcare, USA)을 이용하여 완충액 A로 평형화시킨 HiTrap^TM Q 칼럼(GE Healthcare, USA)에 로딩한 후 0-1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 분획은 DNA 중합효소 활성을 측정한 후 활성이 있는 분획을 모아 Amicon(Milipore, USA) 필터로 농축한 다음 완충액 B(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol)로 투석하였다. 투석액은 완충액 B로 평형화된 HiPrep^TM Sephacryl S-200 HR 26/60 칼럼(GE Healthcare, USA)에 로딩하고 완충액 B를 이용하여 용출 하였다. 용출된 단백질의 정제도는 SDS-PAGE(10% acrylamide gel)를 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 쿠마쉬 염색(coomassie staining)으로 확인하였다.

5’→3’ Exo ^- Tod DNA 중합효소 생산 및 정제

Tod DNA 중합효소 유전자에서 N 말단의 250 아미노산에 해당하는 유전자를 결실하기 위하여, pGEMTOD 플라스미드를 주형으로 프라이머 5(5’-ggctctcccatatgcgcaccgacc-3’, 밑줄은 Nde I 부위)와 프라이머 4(5’-tggaattcctaacccttggcggaa-3’, 밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 1.75 kb의 DNA 단편은 Nde I과 Eco RI으로 절단한 후 같은 효소로 절단한 pJLA503 벡터에 연결하고 E. coli DH5α에 형질전환 하였다. 클로닝 된 플라스미드를 pJLA△TOD로 명명하고 E. coli BL21 (DE3) codon plus에 다시 형질전환한 후 Tod DNA 중합효소의 유도발현과 같은 방법으로 생산 및 정제하였다.

PCR 조건

PCR에 사용한 프라이머는 λ-phage DNA를 주형으로 하여 1, 2, 4, 6 kb의 DNA 단편을 증폭할 수 있게 설계되었다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: 프라이머 1 (7131-7153) 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’(forward); 프라이머 2 (8111-8130) 5’-GGCGTACCTTTGTCTCACGG-3’ (reverse); 프라이머 3 (9111-9131) 5’-TAGCTGTCGTCATAGGACTC-3’ (reverse); 프라이머 4 (11101-11120) 5’-CTTAACCAGTGCGCTGAGTG-3’ (reverse); 프라이머 5 (13121-13140) 5’-CCACATCCATACCGGGTTTC-3’ (reverse). 괄호안의 숫자는 λ-phage DNA상의 위치를 나타낸다. PCR 혼합물(50 ㎕)은 2.5 pmol 프라이머, 200 μM dNTP, 1 unit Tod DNA 중합효소, λ-phage DNA를 포함한다. PCR 조건은 95℃, 5 분간의 변성단계를 거쳐 94℃에서 1 분, 64℃에서 1 분, 72℃에서 1 분간을 25 회 반복 수행하고 72℃ 에서 5 분간 마지막 신장반응을 수행하였다. 그리고 증폭하려는 단편의 길이에 따라 신장 반응 시간을 다르게 조절하였다. 증폭된 단편은 밀도계(densitometry; Gel-Pro Analyzer 3.1, MediaCybernetics, MD, USA)를 이용하여 정량 분석하였다.

엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성 측정

5’ 말단이 표식된 DNA 기질을 만들기 위하여 PCR 반응으로 2.5 kb의 Tod DNA를 증폭하고 [γ-³²P]ATP(Izotop, Budapest, Hungary)와 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Takara, Japan)를 이용하여 5’말단을 인산화 하였다. 3’말단 표식을 위해서는 pET-21a 플라스미드(Novagen, Germany)를 제한효소 Not I으로 절단하고 [α-³²P]dCTP(Izotop, Budapest, Hungary)와 클레노우 단편(Klenow fragment)(Takara, Japan)을 이용하여 돌출말단을 수복하였다. 방사능 표식된 DNA 기질은 50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 3 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.01% BSA 및 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소와 함께 75℃에서 반응하였다. 반응은 5% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid : TCA) 1 ㎖를 첨가하여 정지시키고 원심분리 후 상등액에 대하여 방사능 활성을 측정하였다.

역전사 반응 조건

역전사 반응은 PrimeScript^TM RT-PCR 키트(Takara, Japan)를 사용하여 제조 사에서 제시한 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.1 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂ 또는 MnCl₂, 올리고 dT 프라이머, 5 unit Tod DNA 중합효소, 다양한 양의 플라스미드 pSPTet3(Takara, Japan) 유래 RNA 주형(5-250 ng)을 포함하는 혼합액(20 ㎕)을 65℃에서 5 분간 반응한 후, 60℃에서 30 분간 역전사 반응을 수행하였다. 반응 후 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.2 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂, 50 pM F-1 프라이머(5’-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3’), 50 pM R-1 프라이머(5’-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3’)을 포함하는 PCR 혼합액(80 ㎕)을 첨가하고 DNA 온도순환기(DNA Thermal cycler, Takara, Japan)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조건은 95℃, 5 분간의 변성단계를 거쳐 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 72℃에서 1 분간을 30 회 반복 수행하고 72℃에서 5 분간 마지막 신장반응을 수행하였다. PCR 반응액(5 ㎕)은 1% 아가로스 전기영동을 통하여 분석하였다.

실험결과

DNA 중합효소 유전자의 클로닝

써머스 써머필러스 HJ6 균주로부터 DNA 중합효소의 유전자를 클로닝 하기 위하여 이미 게놈 염기서열이 밝혀진 써머스 써머필러스 HB8과 써머스 써머필러스 HB27의 DNA 중합효소 유전자 염기서열을 바탕으로 프라이머를 설계하고, PCR 기법을 이용하여 DNA 중합효소를 암호화 하는 것으로 예상되는 유전자를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 효소 생산을 위해 다시 pJLA503 벡터에 서브클로닝 하였다. 도 1은 Tod DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pJLATOD의 구축과정을 나타낸 것이다. 클로닝 된 유전자의 ORF(open reading frame)는 2505 bp의 길이로 834 아미노산을 암호화하고 있었다. 예상된 분자량은 93,795 달톤이고, 등전점은 6.3 이었다. 도 2에서는 클로닝 된 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열과 상동성을 가지는 단백질을 대상으로 얼라인먼트를 작성하였다. 클로닝 된 유전자는 써머스 써머필러스 HB8(NCBI Accession No. BAD70877) 유래와 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus)의 DNA 중합효소(Accession No. AAB81398)와는 각각 98%와 97%의 높은 상동성을 나타냈다. 또한, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 유래의 DNA 중합효소(Accession No. BAA06775)와는 86%, 써머스 필리포미스(Thermus filiformis) 유래의 것(Accession No. AAC46079)과는 79%의 상동성을 나타냈다. 이와 같은 생물정보학 분석을 통하여 써머스 써머필러스 HJ6의 염색체로부터 클로닝 한 유전자는 DNA 중합효소(Tod)를 암호화하는 것으로 예상되었다.

Tod DNA 중합효소의 생산

온도 감수성 프로모터(Tandem promoter)를 포함하는 pJLA503 벡터시스템을 이용하여 Tod 유전자를 클로닝하고 플라스미드 pJLATOD로 명명하였다. 여기서 효소 생산을 위한 숙주균으로는 E. coli BL21 (DE3) codon plus 균주를 사용하였다. Tod 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 희귀 코돈(rare codon)을 다수 가지고 있기 때문에 희귀 tRNA 합성효소가 보강된 codon plus 균주를 사용하였다. 플 라스미드 pJLATOD로 E. coli BL21 (DE3) codon plus를 형질전환하고 30°C에서 배양하여 세포성장이 600 nm에서 흡광도가 0.5-0.6에 도달하였을 때 온도를 42°C로 올려 단백질의 생산을 유도하였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 80℃에서 20 분간 열처리한 후, HiTrap^TM Q 칼럼 및 HiPrep^TM Sephacryl S-200 칼럼으로 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 93 kDa 부위에서 DNA 중합효소의 밴드가 확인되었다(도 3, 1번 레인). 이 밴드의 분자량은 DNA 중합효소의 아미노산 서열에서 계산된 분자량과도 잘 일치하였다.

5′→3′ Exo ^- Tod DNA 중합효소의 생산

Tod DNA 중합효소 유전자는 Taq DNA 중합효소와 유사하게 2가지 도메인으로 구성된다. 첫 번째는 5’→3’엑소뉴클레아제 도메인이고 두 번째는 5’→3’중합효소 도메인이다. DNA 중합효소의 5’→3’엑소뉴클레아제 활성은 PCR 반응에서 프라이머를 분해하는 등의 저해 요인으로 작용한다. Taq DNA 중합효소의 경우 N-말단의 289 아미노산에 해당하는 유전자를 결실하여 중합 활성과 안정성에는 큰 영향을 미치지 않고 5’→3’엑소뉴클레아제를 성공적으로 제거한 바 있다(Lawyer et al., 1989). 본 연구에서도 Tod DNA 중합효소 유전자에서 5’→3’엑소뉴클레아제 활성에 관여하는 부분(개시코돈에서 750 bp)이 결실된 Tod 유전자를 클로닝하고 발현 벡터 pJLA503에 삽입하였다. 야생형 Tod DNA 중합효소와 같은 방법으로 E. coli BL21 (DE3) codon plus 균주에서 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소를 유도생 산하고 정제 하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 65 kDa 부위에서 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소의 밴드가 확인되었다(도 3, 2번 레인). 이 밴드의 분자량은 아미노산 서열에서 계산된 분자량과도 잘 일치하였다.

Tod DNA 중합효소 활성의 최적 조건

Tod DNA 중합효소의 pH 의존성은 pH 6.0-10.0의 범위에서 측정하였다. 완충액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5-9.0), 50mM Glycine-NaOH(pH 9.0-10.5)을 사용하였다. 본 효소의 최적 pH는 9.0을 나타내었다(도 4, 패널 A). 따라서, 다른 PCR 상업용 효소인 Taq DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, pfu 중합효소의 최적 pH (pH8.5-9.0)와 비슷한 양상을 나타내었다. Tod DNA 중합효소의 온도 의존성은 50-90℃ 범위에서 측정한 결과 최적 온도는 75-80℃를 나타내었고(도 4, 패널 B) 85℃ 이상에서는 활성을 보이지 않았다.

Tod DNA 중합효소의 2가 양이온에 대한 영향을 검토하기 위해 MgCl₂, MnCl₂를 사용하였다. Mg²⁺과 Mn²⁺에 대한 최적 농도는 각각 2.5 mM과 1 mM로 나타났다. 또한 2가 양이온이 없는 조건에서는 활성을 나타내지 않아서 본 효소의 DNA 합성 반응에는 2가 양이온을 반드시 요구하는 것으로 나타났다. Mg²⁺에 의한 Tod DNA 중합효소의 활성은 다른 DNA 중합효소의 Mg²⁺ 이온에 대한 효과와 일치하였다(Choi et al., 2004). Mn²⁺에 대한 Tod DNA 중합효소의 최대 활성은 Mg²⁺에 대한 최대 활 성과 비슷하여 대부분의 DNA 중합효소가 Mn²⁺에 대한 낮은 활성을 나타내는 것과 비교하여 상이한 결과를 나타냈다(도 4, 패널 C)(Choi et al., 1999; Choi et al., 2004). Tod DNA 중합효소의 KCl 농도에 대한 영향은 또한 검토되었다. KCl에 대해서는 낮은 농도에서는 효소활성에 별다른 영향을 미치지 않지만 20 mM 이상의 농도에서 점차 활성이 감소하여 80 mM 이상에서는 효소 활성이 완전히 저해되었다(도 4, 패널 D). 이것은 PCR 반응에 KCl의 첨가가 필수적인 Taq 및 Tca DNA 중합효소 (Park et al., 1993)와는 대조적인 반면 Tfi DNA 중합효소(Choi et al., 1999)와는 비슷한 결과를 나타냈다.

이상의 결과에서 PCR 반응을 위한 Tod DNA 중합효소의 최적 완충액 조성은 50 mM Tris/HCl(pH 9.0), 2.5 mM MgCl₂, 0.01% tween-20(반응 촉진제)로 확인되었다. Tod DNA 중합효소에 의한 PCR 반응을 수행하기 위하여 λ-phage DNA 단편을 주형으로 하고 각각 프라이머 1과 2(1 kb 단편 증폭), 1과 3(2 kb 단편 증폭), 1과 4(4 kb 단편 증폭), 1과 5(6 kb 단편 증폭)를 사용하여 위의 완충액 조성에서 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 Tod DNA 중합효소는 1, 2, 4, 6 kb의 DNA 단편을 모두 증폭하였다(도 5). 따라서 본 효소는 6 kb의 긴 단편을 증폭할 수 있기 때문에 분자생물학, DNA 진단, DNA 지문검사 등에서 Long-PCR 반응에 적용 가능성이 높다. 또한 Tod DNA 중합효소는 기존의 내열성 DNA 중합효소와 다른 몇 가지 특성을 나타내기 때문에 다른 DNA 중합효소에 의해 잘 증폭되지 않는 PCR 샘플에 사용 가능하다.

Tod DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성

DNA 중합효소는 dNTP가 없는 상태에서 선상 DNA 단편과 함께 존재하면 단편을 분해하는 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Tod DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 측정한 결과 30 분 안에 기질 DNA로부터 87%의 인산기를 제거하는 활성을 나타냈다(도 6). 이것은 Tod DNA 중합효소가 5’→3’엑소뉴클레아제를 가진다는 것을 의미한다. 반면 N-말단 250 아미노산을 결실한 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소의 경우 5’→3’엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않았다(도 6). 한편, 야생형과 결실 돌연변이 Tod DNA 중합효소는 3’→5’엑소뉴클레아제 활성에 대해서는 모두 활성을 보이지 않았다.

Tod DNA 중합효소의 RT-PCR 반응

내열성 DNA 중합효소의 역전사 반응 활성은 cDNA 합성에 대해 이온의 종류와 이온강도에 영향을 받는 것으로 조사된 바 있다(Grebennikova et al., 1995). 본 실험에서는 Tod DNA 중합효소의 역전사 반응 활성을 조사하기 위하여 각기 다른 양(5-250 ng)의 RNA 주형과 Mg²⁺ 및 Mn²⁺ 이온을 반응액에 첨가하여 역전사 반응과 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 Tod DNA 중합효소는 Mg²⁺ 존재 하에서는 5, 25, 100, 250 ng을 주형 RNA로 사용한 반응에서 모두 cDNA 단편이 강하게 증폭되었지 만, Mn²⁺ 존재 하에서는 모든 반응에서 매우 약하게 cDNA 단편의 증폭이 확인되었다(도 7). 이와 같이 Tod DNA 중합효소는 Mg²⁺ 존재 하에서 효율적으로 역전사 반응과 PCR 반응을 수행하였기 때문에 본 효소를 이용하여 Mg²⁺ 존재 하의 하나의 튜브에서 역전사 반응과 PCR 반응을 연결시켜 함께 반응하는 단일튜브 RT-PCR(single tube RT-PCR)을 수행하였다. 그 결과도 7과 동일하게 cDNA 단편의 증폭이 확인되었다. 따라서 기존의 역전사 효소를 이용하여 역전사 반응과 PCR 반응을 따로 진행하는 2단계 RT-PCR 대신에, Tod DNA 중합효소를 이용한 단일튜브 RT-PCR은 조작 면에서 매우 간편할 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 Tod DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pJLATOD의 구축과정을 나타낸다.

도 2는 Tod DNA 중합효소의 아미노산 서열과 써머스 속(Thermus sp.) 유래 내열성 DNA 중합효소 아미노산 서열들의 비교를 나타낸 도면이다. Tt6은 써머스 써머필러스 HJ6(Thermus thermopilus HJ6) DNA 중합효소; Tt8은 써머스 써머필러스 HB8(Thermus thermopilus HB8) DNA 중합효소; Tc는 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) DNA 중합효소; Ta는 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) DNA 중합효소; 및 Tf는 써머스 필리포미스(Thermus filiformis) DNA 중합효소를 나타낸다.

도 3은 정제된 Tod DNA 중합효소의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도면이다. M은 표준시료; 레인 1은 Tod DNA 중합효소(야생형); 및 레인 2는 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소(돌연변이)를 나타낸다.

도 4는 Tod DNA polymerase의 특징을 분석한 결과이다. 패널 A는 Tod DNA 중합효소 활성에서 pH의 효과로 검은 삼각형(▲)은 Tris-HCl를, 검은 사각형(■)은 Glycine-NaOH을 나타낸다. 패널 B는 Tod DNA 중합효소 활성에서 온도의 효과를 나타낸다. 패널 C는 Tod DNA 중합효소 활성에서 2가 양이온에 대한 효과로 흰 원(○)은 Mg²⁺를, 검은 원(●)은 Mn²⁺를 나타낸다. 패널 D는 Tod DNA 중합효소 활성에서 KCl의 효과를 나타낸다.

도 5는 최적 PCR 조건에서의 PCR 산물 분석결과를 나타낸 도면으로 λ-phage DNA 단편을 주형으로 50mM Tris-HCl (pH 9.0)과 2.5 mM MgCl₂를 포함하는 50 ㎕ 반응 혼합액에서 PCR 반응을 수행하고 1.0% 아가로오스 겔에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)로 염색하여 분석하였다. M은 λ Hind Ⅲ DNA 분자량 마커; 레인 1은 1 kb 증폭산물; 레인 2는 2 kb 증폭산물; 레인 3은 4 kb 증폭산물; 및 레인 4는 6 kb 증폭산물을 나타낸다.

도 6은 Tod DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. 검은 원(●)은 dNTP가 없는 조건에서 야생형 Tod DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 나타내며 검은 삼각형(▲)은 돌연변이 5’→3’ Exo^- Tod DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다.

도 7은 Tod DNA 중합효소의 RT-PCR에 대한 Mg²⁺ 및 Mn²⁺ 이온의 효과를 나타내는 것으로 1-4 레인은 Mg²⁺ 이온, 5-8 레인은 Mn²⁺ 이온의 효과를 보여주는 도면이다. M은 표준시료; 레인 1과 5는 RNA 5 ng; 레인 2와 6은 25 ng; 레인 3과 7은 100 ng; 및 레인 4와 8은 250 ng의 RNA를 주형으로 이용한 결과이다.

<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> Novel Termostable DNA Polymerase <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2505 <212> DNA <213> Thermus thermophilus HJ6 <220> <221> CDS <222> (1)..(2502) <400> 1 atg gag gcg atg ctt ccg ctc ttt gaa ccc aaa ggc cgg gtc ctc ctg 48 Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 gcg gac ggc cac cac ctg gcc tac cgc acc ttc ttc gcc ctg aag ggc 96 Ala Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 ctc acc acg agc cgg ggc gaa ccg gtg cag gcg gtc tac ggc ttc gcc 144 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 aag agc ctc ctc aag gcc ctg aag gag gac ggg tac aag gcc gtc ttc 192 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 gtg gtc ttt gac gcc aag gcc ctc tcc ttc cgc cac gag gcc tac gag 240 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Leu Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 gcc tac aag gcg ggg agg gcc ccg acc ccc gag gac ttc ccc cgg cag 288 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 ctc gcc ctc atc aag gag ctg gtg gac ctc ctg ggg ttt acc cgc ctc 336 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 gag gtc ccc ggc tac gag gcg gac gac gtc ctc gcc acc ctg gcc aag 384 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 aag gcg gaa aaa gaa ggg tac gag gtg cgc atc ctc acc gcc gac cgg 432 Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 gac ctc tac cag ctc gtc tcc gac tgc gtc gcc gtc ctc cac ccc gag 480 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Cys Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 ggc cac ctc atc acc ccg gag tgg ctt tgg gag aag tac ggc ctc agg 528 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 ccg gag cag tgg gtg gac ttc cgc gcc ctc gtg ggg gac ccc tcc gac 576 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 aac ctc ccc ggg gtc aag ggc atc ggg gag aag acc gcc ctc aag ctc 624 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 ctc aag gag tgg gga agc ctg gaa aac ctc ctc aag aac ctg gac cgg 672 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 gtg aag ccg gaa aac gtc cgg gag aag atc aag gcc cac ctg gaa gac 720 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 ctc agg ctc tcc ttg ggg ctc tcc cgg gtg cgc acc gac ctc ccc ctg 768 Leu Arg Leu Ser Leu Gly Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 gag gtg gac ctc gcc cag ggg cgg gag ccc gac cgg gag ggg ctt agg 816 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 gcc ttc ctg gag agg ctg gag ttc ggc agc ctc ctc cac gag ttc ggc 864 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 ctc ctg gag gcc ccc gcc ccc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg 912 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 gaa ggg gcc ttc gtg ggc ttc gtc ctc tcc cgc ccc gag ccc atg tgg 960 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 gcg gag ctt aaa gcc ctg gcc gcc tgc agg gac ggc cgg gtg cac cgg 1008 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg 325 330 335 gca gcg gac ccc ttg gcg ggg cta aag gac ctc aag gag gtc cgg ggc 1056 Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 ctc ctc gcc aag gac ctc gcc gtc ttg gcc tcg agg gag ggg cta gac 1104 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 ctc gtg ccc ggg gac gac ccc atg ctc ctc gcc tac ctc ctg gac ccc 1152 Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 tcc aac acc acc ccc gag ggg gtg gcg cgg cgc tac gga ggg gag tgg 1200 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 acg gag gac gcc gcc cac cgg gcc ctc ctc tcg gag agg ctc cat cag 1248 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Gln 405 410 415 aac ctc ctt aag cgc ctc cag ggg gag gag aag ctc ctt tgg ctc tac 1296 Asn Leu Leu Lys Arg Leu Gln Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 cac gag gtg gaa aag ccc ctc tcc cgg gtc ctg gcc cac atg gag gcc 1344 His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 acc ggg gta cgg ctg gac gtg gcc tac ctt cag gcc ctt tcc ctg gag 1392 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 ctt gcg gag gag atc cgc cgc ctc gag gag gag gtc ttc cgc ttg gcg 1440 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 ggc cac ccc ttc aac ctc aac tcc cga gac cag ctg gaa agg gtg ctc 1488 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 ttt gac gag ctt agg ctt ccc gcc ttg ggg aag acg caa aag acg ggc 1536 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 aag cgc tcc acc agc gcc gcg gtg ctg gag gcc cta cgg gag gcc cac 1584 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 ccc atc gtg gag aag atc ctc cag cac cgg gag ctc acc aag ctc aag 1632 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 aac acc tac gtg gac ccc ctc cca agc ctc gtc cac ccg agg acg ggc 1680 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 cgc ctc cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc aca ggg agg ctt 1728 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 agt agc tcc gac ccc aac ctg cag aac atc ccc gtc cgc acc ccc ttg 1776 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 ggc cag agg atc cgc cgg gcc ttc gtg gcc gag gcg gga tgg gcg ttg 1824 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 gtg gcc ctg gac tat agc cag ata gag ctc cgc gtc ctc gcc cac ctc 1872 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 tcc ggg gac gag aac ctg atc agg gtc ttc cag gag ggg aag gac att 1920 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 cac acc cag acc gca agc tgg atg ttc ggc gtc ccc ccg gag gcc gtg 1968 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val 645 650 655 gac ccc ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acg gtg aac ttc ggc gtc ctc 2016 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 tac ggc atg tcc gcc cac cgg ctc tcc cag gag ctc tcc atc ccc tac 2064 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr 675 680 685 gag gag gcc tcg gcc ttc att gag cgc tac ttc cag agc ttc ccc aag 2112 Glu Glu Ala Ser Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 gtg cgg gcc tgg ata gaa aag acc ctg gag gag ggg agg aag cgg ggc 2160 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 tac gtg gaa acc ctc ttc gga aga agg cgc tac gtg ccc gac ctc aac 2208 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 gcc cgg gtg aag agc gtc agg gag gcc gcg gag cgc atg gcc ttc aac 2256 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 atg ccc gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctc gcc atg gtg 2304 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 aag ctc ttc ccc cgc ctc cgg cag atg ggg gcc cgc atg ctc ctc cag 2352 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Gln Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 gtc cac gac gag ctc ctc ctg gag gcc ccc caa gcg cgg gcc gag gag 2400 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 gtg gcg gct ttg gcc aag gag gcc atg gag aag gcc tat ccc ctc gcc 2448 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 gtg ccc ctg gag gtg gag gcg ggg atc ggg gag gac tgg ctt tcc gcc 2496 Val Pro Leu Glu Val Glu Ala Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 aag ggt tag 2505 Lys Gly <210> 2 <211> 834 <212> PRT <213> Thermus thermophilus HJ6 <400> 2 Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Leu Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Cys Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Arg Leu Ser Leu Gly Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Gln 405 410 415 Asn Leu Leu Lys Arg Leu Gln Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Ser Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Gln Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Ala Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly

Claims (11)

1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 Tod DNA 중합효소(Tod DNA polymerase).
2. 제 1 항에 있어서, 상기 Tod DNA 중합효소는 서열목록 제2서열의 아미노산 1-250이 결실되어 5’→3’엑소뉴클레아제 활성이 없는 것을 특징으로 하는 Tod DNA 중합효소.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 Tod DNA 중합효소는 써머스 써머필러스(Thermus thermophilus)에서 분리되고, 하기의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 Tod DNA 중합효소:

   (a) 최적온도 75℃ 내지 80℃

   (b) 최적 pH 8.5 내지 9.0

   (c) 최적 Mg²⁺ 농도 2-3 mM

   (d) 최적 Mn²⁺ 농도 0.5-1.5 mM

   (e) 최적 KCl 농도 0-20 mM.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 Tod DNA 중합효소는 역전사 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 Tod DNA 중합효소.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 Tod DNA 중합효소는 1 ng 이상의 RNA 주형에 대하여 역전사 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 Tod DNA 중합효소.
6. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 Tod DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 염기 서열은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-750이 결실된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
8. 상기 제 6 항의 Tod DNA 중합효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 Tod DNA 중합효소 발현용 벡터.
9. 상기 제 8 항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
10. 다음의 단계를 포함하는 뉴클레오타이드 증폭 방법:

    (a) 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 Tod DNA 중합효소를 RNA에 접촉시켜 이중쇄 cDNA를 제조하는 단계; 및

    (b) 상기 Tod DNA 중합효소를 이용하여 상기 이중쇄 cDNA를 증폭하는 단계.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 RNA의 양은 1 ng 이상인 것을 특징으로 하는 방법.

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