KR20100051036A - METHOD FOR ACTIVATING ANTIGEN-SPECIFIC AUTOLOGOUS CD8 T CELL USING α-GALACTOSYLCERAMIDE - Google Patents

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KR20100051036A
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Abstract

PURPOSE: An activation method of an antigen-specific autologous CD8 T cell using alpha-galactosylceramide is provided to minimize side effects by processing the activation in vitro, and to use the activated CD8 T as an anti-tumor vaccine composition. CONSTITUTION: An activation method of an antigen-specific autologous CD8 T cell comprises the following steps: dividing CD8 T cells from a biological material; mixing the CD8 T cells with an antigen presenting cell(APC); processing the mixed cells with alpha-galactosylceramide or its derivative and cultivating; and separating the activated CD8 T cell from the cultivated cells. The antigen-specific autologous CD8 T cell is combined with the alpha-galactosylceramide or its derivative to transfer the alpha-galactosylceramide or its derivative into a human body.

Description

알파-갈락토실세라미드를 이용한 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법{Method for activating antigen-specific autologous CD8 T cell using α-galactosylceramide}Method for activating antigen-specific autologous CD8 T cell using α-galactosylceramide}

본 발명은 알파-갈락토실세라미드를 이용한 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of activating antigen specific autologous CD8 T cells using alpha-galactosyl ceramide.

환자에게 면역세포를 투여하는데 있어서, 환자에게서 얻은 자가유래 CD8 T 세포를 선별한 후 자극을 주어 활성화시키고 환자에게 다시 투여하는 방법은 자가면역 세포를 이용하기 때문에 면역 반발을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있어 1970년대 이후로 관련 연구는 계속 진행되어 왔다(Cancer, 1996, 19:1743). 이러한 방법은 백신접종(vaccination)이나 화학요법(chemotherapy)과 같은 다른 방법과 병용하여 그 작용을 증진시키는 역할을 할 수 있을 것으로 기대되고 있다.In the administration of immune cells to a patient, the method of selecting, stimulating and activating autologous CD8 T cells obtained from the patient and re-administering the patient has the advantage of minimizing immune repulsion because of the use of autoimmune cells. Since the 1970s, relevant research has been ongoing (Cancer, 1996, 19: 1743). This method is expected to play a role in enhancing its function in combination with other methods such as vaccination or chemotherapy.

일반적으로, 자가유래 CD8 T 세포는 하기와 같은 5가지의 요건을 갖추어야 한다.In general, autologous CD8 T cells should meet the following five requirements.

첫째, 표적 특이성을 가져야 한다. 이를 위해 표적 특이적 CD8 T 세포의 선별 과정을 거쳐야 한다. 즉, 항-CD3 항체 또는 항-CD28 항체를 이용하여 활성화시 킨 후 표적 특이적 CD8 T 세포를 선별하거나, 또는 표적 특이적 CD8 T 세포를 먼저 선별하고 항-CD3 항체 또는 항-CD28 항체를 이용하여 활성화시켜야 한다.First, it must have target specificity. This requires a screening process for target specific CD8 T cells. That is, target-specific CD8 T cells are selected after activation with an anti-CD3 antibody or anti-CD28 antibody, or target-specific CD8 T cells are first selected and then anti-CD3 antibody or anti-CD28 antibody is used. Must be activated.

둘째, 분열증식(proliferation) 시키는 방법을 확보하여야 한다. 일반적으로 표적 특이적 CD8 T 세포를 얻을 수 있지만, 사용하기에는 그 수가 대부분 너무 적다. 따라서, 충분한 수의 표적 특이적 CD8 T 세포를 제조하기 위해서는 표적 특이적 CD8 T 세포의 분열증식 방법을 확보해야 한다. 인터루킨-2(IL-2)는 CD8 T 세포를 분열증식시키는 것으로 알려져 있으며, 현재 자가유래 CD8 T 세포의 제조에 없어서는 안될 중요한 사이토카인으로 사용되고 있다. 그러나 IL-2는 기억 T 세포를 결핍(depletion)시키거나 조절 T 세포를 분열 및 활성화시키는 사이토카인으로도 알려져 있어서(Nat Med. 2005, 11:1238), IL-2의 특성을 보완하는 연구가 필요하다.Second, a method of proliferation should be secured. In general, target specific CD8 T cells can be obtained, but most are too few to use. Therefore, in order to prepare a sufficient number of target specific CD8 T cells, it is necessary to secure a method for proliferation of target specific CD8 T cells. Interleukin-2 (IL-2) is known to proliferate CD8 T cells and is currently used as an essential cytokine in the production of autologous CD8 T cells. However, IL-2 is also known as a cytokine to deplete memory T cells or to divide and activate regulatory T cells (Nat Med. 2005, 11: 1238). need.

셋째, 기능성(functionality)을 가져야 한다. IL-2를 사용하여 자가유래 CD8 T 세포를 분열시키는 경우 충분한 수의 CD8 T 세포를 확보할 수 있으나, IL-2에 의해 자가유래 CD8 T 세포가 아네르기(anergy)에 빠지거나 내성에 빠지기도 한다 (Blood, 2008, 111:5326). 이를 극복하기 위하여, 다른 IL-21과 같은 사이토카인을 이용하는 방법, 조절 T 세포를 제거하는 방법, CTLA-4 또는 TGF-β의 신호를 막는 방법 등이 사용된다.Third, it must have functionality. When IL-2 is used to divide autologous CD8 T cells, a sufficient number of CD8 T cells can be obtained. However, IL-2 may cause autologous CD8 T cells to fall into anergy or become resistant. (Blood, 2008, 111: 5326). To overcome this, methods using cytokines such as other IL-21, a method of removing regulatory T cells, a method of blocking the signal of CTLA-4 or TGF-β, and the like are used.

넷째, 기억 T 세포가 생성되어야 한다. 기억 T 세포의 생성은 동일한 암의 재발을 막기 위해 필수적인 요소이다. 그러나, 분열증식에 사용되는 IL-2는 기억 T 세포의 생성을 저해하므로, 이를 극복하기 위해 기억 T 세포의 생성에 중요한 인터 루킨-7(IL-7) 또는 인터루킨-15(IL-15)와 같은 사이토카인을 같이 사용하는 연구가 이루어지고 있다(Annu. Rev. immunol. 2007, 25:243).Fourth, memory T cells should be generated. The production of memory T cells is an essential factor in preventing the recurrence of the same cancer. However, IL-2, which is used for proliferation, inhibits the production of memory T cells and, therefore, overcomes interleukin-7 (IL-7) or interleukin-15 (IL-15), which are important for the production of memory T cells. Studies using the same cytokines together have been made (Annu. Rev. immunol. 2007, 25: 243).

다섯째, 순환(recruitment)이 원활하게 이루어져야 한다. 환자에게 투여된 자가유래 CD8 T 세포가 효과를 나타내기 위해서는 투여 후 표적 위치로 이동하여 세포독성 T 림프구 반응(CTL response)을 보여주어야 한다.Fifth, recycling must be done smoothly. In order for autologous CD8 T cells administered to a patient to take effect, they must move to the target site after administration to show the cytotoxic T lymphocyte response (CTL response).

그러나, 종래의 자가유래 CD8 T 세포는 비바이러스성 종양에 대해 적절한 효과를 나타내지 못하는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 문제점을 개선시켜 항종양 효과를 우수하게 나타낼 수 있는 자가유래 CD8 T 세포에 관한 연구의 필요성이 요구되고 있다.However, conventional autologous CD8 T cells have a problem that they do not show an appropriate effect on non-viral tumors. Therefore, there is a need for a study on autologous CD8 T cells that can improve these problems and exhibit excellent antitumor effects.

한편, 알파-갈락토실세라미드[(2S,3S,4R)-1-O-(-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1,3,4-octadecanetriol; α-galactosylceramide; α-GalCer]는 해면동물에서 추출된 당지질(glycolipid)로서, 주조직적합성 복합체 클래스 I(MHC class I) 분자와 유사한 구조를 가지고 있는 CD1d 분자에 로딩된 후 자연 살해 T 세포(NK T cell)에 존재하는 불변 T 세포 수용체(invariant TCR, iTCR)와 결합하여 NKT 세포를 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Nat. Rev. Immunol. 2004, 4:231). α-GalCer는 NKT 세포의 Vα14+ T 세포 수용체(TCR)에 대한 리간드이고, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에 있는 CD1d 분자에 의해 제시됨이 알려져 있다(kawano et al., Science, 278: 1626, 1997). NKT 세포는 전체 림프구(lymphocyte)에서 2~3% 정도의 비율을 가지고 있지만, a-GalCer에 의해 활성화되어 여러 종류의 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 및 IL-4)을 다량으로 분비하고, 분 비된 사이토카인들은 특정 질병 또는 감염에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서, a-GalCer는 사이토카인을 바탕으로 면역 조절자로서의 역할을 수행할 수 있다(Chen et al., J. Immunol., 159: 2240, 1997; Wilson et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 10913, 2003). 또한, a-GalCer를 투여하는 방법, 투여 횟수, 투여 경로에 따라 Th1 반응(Th1 response)이 유도되기도 하고, Th2 반응이 유도되기도 한다(Nat. Rev. Immunol. 2002, 2:557).On the other hand, alpha-galactosylceramide [(2S, 3S, 4R) -1-O-(-D-galactopyranosyl) -2- (N-hexacosanoylamino) -1,3,4-octadecanetriol; α-galactosylceramide; α-GalCer] is a glycolipid extracted from sponges, which is loaded onto CD1d molecules, which have a structure similar to that of MHC class I molecules, to natural killer T cells (NK T cells). It is known to activate NKT cells by binding to invariant T cell receptors (iTCRs) present (Nat. Rev. Immunol. 2004, 4: 231). α-GalCer is a ligand for the Vα14 + T cell receptor (TCR) of NKT cells and is known to be presented by the CD1d molecule in antigen presenting cells (APC) (kawano et al., Science, 278: 1626). , 1997). NKT cells have a ratio of 2-3% of the total lymphocytes, but are activated by a-GalCer to secrete large amounts of various types of cytokines (eg, IFN-γ and IL-4). In addition, secreted cytokines can modulate the immune response to certain diseases or infections. Thus, a-GalCer can act as an immune modulator based on cytokines (Chen et al., J. Immunol., 159: 2240, 1997; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100: 10913, 2003). In addition, a Th1 response may be induced or a Th2 response may be induced depending on the method of administration of a-GalCer, the frequency of administration, and the route of administration (Nat. Rev. Immunol. 2002, 2: 557).

또한, α-GalCer를 종양 치료에 이용하는 방법으로는, α-GalCer를 환자에 직접 투여하는 방법과 수지상 세포(Dendritic Cell, DC)의 CD1d에 α-GalCer를 로딩하여 전달하는 방법이 있다. 그러나, α-GalCer를 암환자에게 직접 투여하면 TNF-α, GM-CSF와 같은 혈청 사이토카인 수준은 높아지지만 항종양 효과를 나타내지 못하는 문제점이 있다(Clin. Cancer Res. 2002, 8:3702). 또한, α-GalCer를 DC에 로딩하여 암환자에게 전달하는 방법은 현재 임상 2a 단계의 연구가 진행 중에 있으나(Cancer Sci. 2006. 97:807), DC를 환자의 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)에서 얻는 것은 쉬운 일이 아니다. 따라서, 이를 보완하는 방법으로 상대적으로 PBMC에서 얻기 쉬운 항원제시세포(Antigen Presenting Cell, APC)인 B 세포를 이용하는 방법이 제시되기도 하였다(Int J Cancer. 2008, 122:2774).In addition, as a method of using α-GalCer for tumor treatment, there are a method of directly administering α-GalCer to a patient and a method of loading and delivering α-GalCer to CD1d of dendritic cells (DC). However, administration of α-GalCer directly to cancer patients raises serum cytokine levels such as TNF-α and GM-CSF, but does not exhibit antitumor effects (Clin. Cancer Res. 2002, 8: 3702). In addition, a method of loading α-GalCer in DC and delivering it to cancer patients is currently under study in the clinical stage 2a (Cancer Sci. 2006. 97: 807), but DC is used in peripheral blood mononuclear cells of patients. Cell, PBMC) is not easy. Therefore, a method of using B cells, which are relatively easy to obtain from PBMCs (Antigen Presenting Cell, APC), has been suggested as a complementary method (Int J Cancer. 2008, 122: 2774).

상기한 바와 같이, α-GalCer를 암환자에게 직접 투여하면 TNF-α, GM-CSF와 같은 혈청 사이토카인 수준은 높아지지만 항종양 효과를 효과적으로 나타내지 못하는 문제점이 있다.As described above, administration of α-GalCer directly to cancer patients increases serum cytokine levels such as TNF-α and GM-CSF, but does not effectively exhibit antitumor effects.

따라서, α-GalCer를 이용하여 생체 외에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 활성화시킨 후, 이를 생체내로 입양전달하여 수동면역 반응을 유도하면 항종양 효과를 우수하게 나타낼 수 있을 것으로 생각된다.Therefore, after activating antigen-specific CD8 T cells in vitro using α-GalCer, it is thought that the antitumor effect can be excellently induced by adopting and inducing a passive immune response.

본 발명자들은 α-GalCer를 이용하여 생체 외에서 CD8 T 세포를 활성화하는 방법에 대해 연구하던 중, 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리한 후 항원제시세포(APC)와 혼합하고, 상기 혼합된 세포를 항원과 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체로 처리하여 배양한 다음, 배양된 세포로부터 활성화된 CD8 T 세포를 분리하였으며, 상기 활성화된 CD8 T 세포가 생체내로 입양전달한 후 항원 특이적으로 격렬하게 분열증식하고, IFN-γ와 TNF-α의 분비 능력이 증진되며, 분열 후에도 IFN-γ와 TNF-α의 분비 능력을 유지하여 기능성을 더욱 향상시키고, 뛰어난 CTL 기능을 가지고 있어 표적 세포를 효과적으로 용해시키며, 우수한 기억 CD8 T 세포의 생성 유도 능력을 가지며, α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체와 결합한 상태로 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The present inventors are studying a method of activating CD8 T cells in vitro using α-GalCer, after separating the CD8 T cells from the biological sample of the individual and mixing them with antigen presenting cells (APC), the mixed cells Was treated with an antigen and α-GalCer or α-GalCer derivatives, and then cultured, and then the activated CD8 T cells were isolated from the cultured cells. It proliferates, enhances the secretion ability of IFN-γ and TNF-α, maintains the secretion ability of IFN-γ and TNF-α even after division, further enhances its functionality, and has excellent CTL function to effectively lyse target cells. , Has a good ability to induce the production of memory CD8 T cells and delivers the α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo in combination with the α-GalCer or α-GalCer derivative The present invention has been completed.

본 발명은 생체 외에서 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 이용한 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a method for activating antigen-specific autologous CD8 T cells using an α-GalCer or α-GalCer derivative in vitro.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 제공하고자 한다.The present invention also provides an antigen specific autologous CD8 T cell activated by the above method.

또한, 본 발명은 상기 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 생체내로 입양전달하여 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달하는 방법을 제공하고 자 한다.In addition, the present invention is to provide a method for delivering the antigen-specific self-derived CD8 T cells in vivo to deliver the α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo.

또한, 본 발명은 상기 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 유효성분으로 함유하는 항종양 백신 조성물을 제공하고자 한다.In addition, the present invention is to provide an anti-tumor vaccine composition containing the antigen-specific autologous CD8 T cells as an active ingredient.

본 발명은The present invention

1) 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리하는 단계,1) separating CD8 T cells from a biological sample of the subject,

2) 상기 분리된 CD8 T 세포와 항원제시세포(APC)를 혼합하는 단계,2) mixing the isolated CD8 T cells and antigen presenting cells (APC),

3) 상기 혼합된 세포를 항원과 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체로 처리하여 배양하는 단계, 및3) culturing the mixed cells by treating the antigen with an α-GalCer or α-GalCer derivative, and

4) 상기 배양된 세포로부터 활성화된 CD8 T 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법을 제공한다.4) It provides a method for activating antigen-specific autologous CD8 T cells in vitro, comprising the step of separating the activated CD8 T cells from the cultured cells.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 제공한다.The present invention also provides antigen specific autologous CD8 T cells activated by the above method.

또한, 본 발명은 상기 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 생체내로 입양전달하여 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of adopting and delivering the antigen-specific autologous CD8 T cells in vivo to deliver an α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo.

또한, 본 발명은 상기 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 유효성분으로 함유하는 항종양 백신 조성물을 제공한다.The present invention also provides an anti-tumor vaccine composition containing the antigen-specific autologous CD8 T cells as an active ingredient.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법은, 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리한 후 항원제시세포(APC)와 혼합하고, 상기 혼합된 세포를 항원과 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체로 처리하여 배양한 다음, 배양된 세포로부터 활성화된 CD8 T 세포를 분리하는 것을 특징으로 한다.The method for activating antigen-specific autologous CD8 T cells in vitro according to the present invention is to separate CD8 T cells from a biological sample of an individual, and then mix them with antigen presenting cells (APC), and mix the mixed cells with antigen and α-. After treatment with GalCer or α-GalCer derivatives, the activated CD8 T cells are separated from the cultured cells.

상기 CD8 T 세포를 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 세포 밀도, 세포 표면 에피토프에 대한 항체 친화도, 세포 크기, 형광 방출 정도에 의존하여 분리할 수 있다. 구체적으로는, 알부민, 덱스트란, 피콜, 메트리자미드(metrizamid), 퍼콜(Percoll) 등을 이용하는 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation) 방법; MACS(magnetic activated cell sorter) 등의 항체를 이용하는 방법; 원심 세정(centrifugal elutriation) 등의 세포 크기를 이용하는 방법; FACS 등의 형광을 이용하는 방법이 있다. 본 발명에서는 MACS를 이용하여 CD8 T 세포를 분리하였다.The method for isolating the CD8 T cells is not particularly limited, and may be separated depending on cell density, antibody affinity for cell surface epitopes, cell size, and degree of fluorescence emission. Specifically, a density gradient centrifugation method using albumin, dextran, picol, metrizamid, Percoll, etc .; A method using an antibody such as a MACS (magnetic activated cell sorter); Methods using cell size such as centrifugal elutriation; There is a method using fluorescence such as FACS. In the present invention, CDS was isolated using MACS.

상기 개체는 T 세포를 포함하는 단핵세포를 제공하는 제공자(donor)로, 혈관계(vascular system) 및 조혈세포(hematopoietic cell)를 가지는 유기체가 모두 포함될 수 있으며, 바람직하게는 인간, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 토끼, 개, 마우스, 랫트 등의 척추동물이다.The subject is a donor that provides mononuclear cells, including T cells, and may include all organisms having a vascular system and hematopoietic cells, preferably humans, cattle, horses, and sheep. , Vertebrates such as pigs, goats, camels, rabbits, dogs, mice, and rats.

상기 생물학적 시료는 혈액(blood), 혈장(plasma), 림프구(lymph node), 비장(spleen), 흉선(thymus) 및 골수(bone marrow) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.The biological sample includes, but is not limited to, blood, plasma, lymphocytes, spleen, thymus, bone marrow, and the like.

상기 항원은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 지질다당류 및 DNA 분자(폴리 뉴클레오티드), 암세포, 바이러스를 포함할 수 있으 나, 이에 한정되지 않는다.The antigen may include, but is not limited to, proteins of protein, recombinant proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins, lipopolysaccharides and DNA molecules (polynucleotides), cancer cells, viruses.

상기 α-GalCer는 피토스핑고신(phytosphingosine)을 헥사코사노익산 (hexacosanoic acid)과 결합시킨 다음, 보호/탈보호 및 갈락토실레이션에 의해 제조될 수 있다(Takikawa et al., Tetrahedron, 54: 3141, 1998).The α-GalCer can be prepared by combining phytosphingosine with hexacosanoic acid, followed by protection / deprotection and galactosylation (Takikawa et al., Tetrahedron, 54 : 3141, 1998).

상기 α-GalCer 유도체는 갈락토오스 등으로 이루어진 탄수화물 부분과, 아실 사슬 및 스핑고신 사슬로 이루어진 지질 부분이 알파 구조로 결합되어 있어서 α-GalCer와 유사한 구조를 가지며, α-GalCer와 같이 CD8 T 세포에 결합될 수 있고, 생체내에 입양전달되어 면역반응을 보조할 수 있는 것이라면 어느 것이나 무방하다. 구체적으로는, OCH[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-N-tetracosanoyl-2-amino-1,3,4-nonanetriol], α-C-GalCer[(2S,3S,4R)-1-CH2-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1,3,4-octadecanetriol; α-C-galactosylceramide], iGb3[isoglobo-galycoshpingolipid, C62H117NO18] 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.The α-GalCer derivative has a structure similar to α-GalCer because a carbohydrate moiety composed of galactose and the like, and a lipid moiety composed of an acyl chain and a sphingosine chain has an alpha structure, and binds to a CD8 T cell like α-GalCer. It may be any one that can be adopted and delivered in vivo to aid the immune response. Specifically, OCH [(2S, 3S, 4R) -1-O- (α-D-galactopyranosyl) -N-tetracosanoyl-2-amino-1,3,4-nonanetriol], α-C-GalCer [( 2S, 3S, 4R) -1-CH 2- (α-D-galactopyranosyl) -2- (N-hexacosanoylamino) -1,3,4-octadecanetriol; α-C-galactosylceramide], iGb3 [isoglobo-galycoshpingolipid, C 62 H 117 NO 18 ], and the like, but are not limited thereto.

본 발명에 따른 방법으로 생체 외에서 활성화된 ＣＤ8 Ｔ 세포는, 생체내로 입양전달한 후 항원 특이적으로 격렬하게 분열증식하고, IFN-γ와 TNF-α의 분비 능력이 증진되며, 분열 후에도 IFN-γ와 TNF-α의 분비 능력을 유지하여 기능성을 더욱 향상시키고, 뛰어난 CTL 기능을 가지고 있어 표적 세포를 효과적으로 용해시키며, 우수한 기억 CD8 T 세포의 생성 유도 능력을 갖는다.CD8 T cells activated in vitro by the method according to the present invention, after adoptive delivery in vivo, vividly proliferate antigen-specifically, enhance the secretion ability of IFN-γ and TNF-α, and even after division, IFN-γ and It maintains the secretory ability of TNF-α to further improve its functionality, has excellent CTL function, effectively lysates target cells, and has the ability to induce the production of excellent memory CD8 T cells.

또한, 본 발명의 활성화된 ＣＤ8 Ｔ 세포는 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도 체와 결합한 상태로 생체내로 입양전달되어 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달할 수 있다. 본 발명의 활성화된 ＣＤ8 Ｔ 세포를 NKT 세포가 없는 마우스에 입양전달한 경우 입양전달한 ＣＤ8 Ｔ 세포의 분열이 일어나지 않아, α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 수령 마우스 내로 전달한 이후 입양전달한 CD8 T 세포의 분열에 있어서 수령 마우스의 NKT 세포가 중요한 역할을 담당한다는 것을 알 수 있다. 또한, OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 짧은 시간 동안 처리하거나, 또는 과량의 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 동시에 입양전달한 경우 입양전달한 CD8 T 세포의 분열을 유도할 수 있다. 또한, 항원 자극 시간이 늘어날수록 본 발명의 활성화된 CD8 T 세포에서 CD44와 CD62L의 발현이 증가되며, 상기 활성화된 CD8 T 세포에서 CD44와 CD62L의 발현이 높을 때 입양전달 이후 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체에 의해 입양전달한 CD8 T 세포의 분열이 유도됨을 알 수 있다.In addition, the activated CD8 T cells of the present invention can be delivered in vivo in combination with an α-GalCer or α-GalCer derivative to deliver an α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo. When adopting the activated CD8 T cells of the present invention in mice without NKT cells, the division of the adopted CDD T cells did not occur, resulting in the division of CD8 T cells adopted after delivery of the α-GalCer or α-GalCer derivatives into the recipient mice. It can be seen that NKT cells of the recipient mouse play an important role in. In addition, when the α-GalCer or α-GalCer derivatives were treated for a short time in activated Thy1.1 / OT-I cells by treatment with OVAp alone, or when an excessive amount of the α-GalCer or α-GalCer derivatives were simultaneously delivered to the host, it was adopted. Can induce division of CD8 T cells. In addition, as the antigen stimulation time increases, the expression of CD44 and CD62L is increased in the activated CD8 T cells of the present invention, and when the expression of CD44 and CD62L is high in the activated CD8 T cells, α-GalCer or α- after adoptive delivery. It can be seen that the division of CD8 T cells adopted by GalCer derivatives is induced.

또한, 본 발명의 활성화된 CD8 T 세포에서 CD44, CD62L, CD25의 발현은 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체의 처리 유무에 상관없이 차이를 나타내지 않으므로, 생체 외에서 NKT 세포는 CD8 T 세포 활성에 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 그러나, 활성화된 CD8 T 세포에 의해 생체내로 입양전달된 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체는 NKT 세포의 비율을 감소시킨 후 복원시킴으로써, NKT 세포가 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체에 의해 활성-유도 아폽토시스(activation-induced apoptosis)를 일으킨다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 활성화된 CD8 T 세포를 생체내로 입양전달한 후 이로부터 얻은 비장세포에서 전체 CD8 T 세포 중 입양 전달한 CD8 T 세포의 비율은, OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 α-GalCer를 처리한 수지상 세포를 동시에 입양전달한 것보다 더 높게 나타난다. 또한, 생체 외의 자극 처리 단계에서 α-GalCer를 처리하지 않은 경우 수령 마우스의 종류에 관계없이 입양전달한 활성화된 CD8 T 세포의 분열증식이 거의 일어나지 않으며, 생체 외의 자극 처리 단계에서 α-GalCer를 처리한 경우 대부분의 수령 마우스에서 입양전달한 활성화된 CD8 T 세포의 분열증식이 활발하게 일어난다.In addition, since the expression of CD44, CD62L, CD25 in the activated CD8 T cells of the present invention does not show a difference regardless of the treatment of α-GalCer or α-GalCer derivatives, in vitro NKT cells have a great effect on CD8 T cell activity. It can be seen that it does not give. However, α-GalCer or α-GalCer derivatives adopted in vivo by activated CD8 T cells are restored after decreasing the percentage of NKT cells so that NKT cells are active-induced by α-GalCer or α-GalCer derivatives. It can be seen that it causes activation-induced apoptosis. In addition, the ratio of CD8 T cells adopted and delivered to the splenocytes obtained by adopting the activated CD8 T cells of the present invention in vivo after adopting them, was treated with OVAp alone to activate Thy1.1 / OT-I cells. And dendritic cells treated with α-GalCer were higher than those adopted at the same time. In addition, if the α-GalCer was not treated in the stimulation process in vitro, the proliferation of activated CD8 T cells adopted by the adoptive mice was almost irrelevant regardless of the type of recipient mice, and the α-GalCer was treated in the stimulation process in vitro. In most recipient mice, proliferation of activated CD8 T cells adoptive transfer occurs.

또한, 본 발명의 활성화된 ＣＤ8 Ｔ 세포를 고형암이 유도된 마우스에 입양전달한 경우 고형암의 부피가 작아지며, 마우스의 생존율은 매우 높아지고, IFN-γ 분비 능력은 우수하다. 또한, 상기 활성화된 ＣＤ8 Ｔ 세포가 자가유래 특징을 가지므로 면역반발을 최소화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포는 항종양 백신 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.In addition, when the activated CD8 T cells of the present invention are transferred to a solid cancer-induced mouse, the volume of the solid cancer becomes small, the survival rate of the mouse is very high, and IFN-γ secretion ability is excellent. In addition, the activated CD8 T cells have self-derived characteristics, thereby minimizing immune repulsion. Therefore, the activated antigen specific autologous CD8 T cells according to the present invention can be usefully used as an anti-tumor vaccine composition.

본 발명의 조성물은 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포와 함께 항종양 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The composition of the present invention may contain at least one known active ingredient having an antitumor effect with activated antigen specific autologous CD8 T cells.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정 제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as an antioxidant, buffer And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여 또는 국소 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 예를 들어 정맥 내 투여, 피하 투여, 복강 내 투여 또는 근육 내 투여 등이 있으며, 특히 정맥 내 투여가 바람직하다. 상기 조성물은 활성물질이 표적 세포내로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 일일 투여량은 약 5×105~5×107세포/㎏, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.The composition of the present invention may be administered parenterally or topically according to the desired method, preferably parenteral administration, such as intravenous administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration or intramuscular administration, in particular intravenous My administration is preferred. The composition may be administered by any device in which the active agent can move into the target cell. Dosage varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient. More preferably, the daily dose of the activated antigen-specific autologous CD8 T cells is divided into about 5 × 10 5 to 5 × 10 7 cells / kg, once or several times daily.

본 발명의 조성물은 항종양 효과를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The compositions of the present invention may be used alone or in combination with methods for using surgery, hormonal therapy, drug therapy and biological response modifiers for antitumor effects.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.

실시예 1Example 1 : 활성화된 항원 특이적 자가유래 CD8 T 세포의 제조 : Preparation of Activated Antigen Specific Autologous CD8 T Cells

본 실험에 사용된 모든 마우스는 잭슨랩(Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA)에서 구입하여 포항공과대학(POSTECH, 한국)에서 동종교배시켜 사용하였다. Thy1.1 마우스, OT-I 마우스, Thy1.1/OT-I 마우스, C57BL/6 마우스는 유전적으로 C57BL/6 백그라운드를 가진 공통 유전자 혈통(congenic) 마우스로서, Thy1.1 마우스는 Thy1.1(Thymocyte differentiation antigen 1.1) 표면 마커를 가지고, C57BL/6 마우스는 Thy1.2 표면 마커를 가지며, OT-I 마우스는 OVAp 특이적 CD8 T 세포 수용체를 가지도록 형질전환된 마우스이다.All mice used in this experiment were purchased from Jackson Lab (Bar Harbor, USA) and used in homogeneous breeding at Pohang University of Science and Technology (POSTECH, Korea). Thy1.1 mice, OT-I mice, Thy1.1 / OT-I mice, and C57BL / 6 mice are genetically congenic mice with a genetically C57BL / 6 background. Thymocyte differentiation antigen 1.1) surface markers, C57BL / 6 mice have Thy1.2 surface markers, and OT-I mice are transformed mice with OVAp specific CD8 T cell receptor.

OT-I 마우스와 Thy1.1 마우스를 교배하여 얻은 Thy1.1/OT-I 마우스의 비장으로부터 Thy1.1/OT-I 세포를 CD8 T 세포 분리 키트(CD8 T cell isolation kit, Miltenyi Biotech, Cat. 130-090-859)를 이용하여 얻었다. 또한, C57BL/6 마우스로부터 CD8 결핍 비장세포(CD8 cell depleted splenocyte)를 CD8 T 세포 결핍 키트 (CD8 T cell depletion kit, Miltenyi Biotech, Cat. 130-049-401)를 이용하여 얻었다. 상기 두가지 세포를 각각 5×106씩 혼합하여 1㎖의 부피로 만들고, 여기에 1μM의 CD8 오브알부민 펩티드[CD8 Ovalbumin peptide : CD8 epitope, SINKEL, H2-Kb(OVAp 257~264)]와 200ng/㎖의 α-GalCer(일본 Kirin사의 KRN7000)를 같이 넣어 처리하여 12 웰 배양 디쉬에서 하룻 동안 배양하였다. 하루가 지난 후, 배양세포로부터 Thy1.1/OT-I 세포를 CD8 T 세포 분리 키트를 이용하여 분리하였다. 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 1×106를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하였다.Thy1.1 / OT-I cells were harvested from the spleens of Thy1.1 / OT-I mice obtained by crossing OT-I mice with Thy1.1 mice (CD8 T cell isolation kit, Miltenyi Biotech, Cat. 130-090-859). In addition, CD8 depleted splenocytes (CD8 cell depleted splenocytes) from C57BL / 6 mice were obtained using a CD8 T cell depletion kit (CD8 T cell depletion kit, Miltenyi Biotech, Cat. 130-049-401). Each of the two cells was mixed by 5 × 10 6 to a volume of 1 ml, and 1 μM of CD8 ovalbumin peptide [CD8 Ovalbumin peptide: CD8 epitope, SINKEL, H2-Kb (OVAp 257-264)] and 200 ng / ㎖ α-GalCer (KRN7000, Kirin, Japan) was added together and incubated in a 12 well culture dish for one day. After one day, Thy1.1 / OT-I cells were isolated from the culture cells using a CD8 T cell separation kit. Activated Thy1.1 / OT-I cells 1 × 10 6 were adopted and delivered intravenously to C57BL / 6 mice.

본 발명에 따른 활성화된 항원 특이적 자가유래 CD8 T 세포의 제조 과정은 도 1에 나타내었다.The preparation of activated antigen specific autologous CD8 T cells according to the invention is shown in FIG. 1.

본 실험에서는 OT-I 마우스 대신 Thy1.1/OT-I 마우스로부터 CD8 T 세포를 분리하였는데, 이는 입양전달 후 수령 마우스인 C57BL/6 마우스 내의 Thy1.1 표면 마커를 가진 CD8 T 세포와 Thy1.2 표면 마커를 가진 다른 CD8 T 세포를 구별함으로써 입양전달된 세포를 추적하고 분석하기 위함이다.In this experiment, CD8 T cells were isolated from Thy1.1 / OT-I mice instead of OT-I mice. These were CD8 T cells and Thy1.2 with Thy1.1 surface markers in C57BL / 6 mice. To distinguish and adopt other CD8 T cells with surface markers to track and analyze adoptive cells.

또한, Thy1.1/OT-I 마우스를 수령 마우스로 사용하는 경우 동일한 Thy1.1 표면 마커를 가지므로 입양전달된 CD8 T 세포와 입양전달 전 수령 마우스 내에 존재하는 CD8 T 세포를 구별하는데 어려움이 있기 때문에 CD8 T 세포를 얻은 Thy1.1/OT-I 마우스 대신 C57BL/6 마우스를 수령 마우스로 사용하였다. 다만, Thy1.1/OT-I 마우스는 C57BL/6 마우스와 공통 유전자 혈통 관계이므로, CD8 T 세포를 Thy1.1/OT-I 마우스에 입양전달하는 경우 C57BL/6 마우스에 입양전달하는 경우와 동일한 결과를 가진다고 볼 수 있다.In addition, when Thy1.1 / OT-I mice are used as recipient mice, they have the same Thy1.1 surface marker, which makes it difficult to distinguish adoptive CD8 T cells from CD8 T cells present in the recipient mice. Therefore, C57BL / 6 mice were used as recipient mice instead of Thy1.1 / OT-I mice obtained with CD8 T cells. However, since Thy1.1 / OT-I mice have a common gene lineage relationship with C57BL / 6 mice, adopting and delivering CD8 T cells to Thy1.1 / OT-I mice is the same as adoptive delivery to C57BL / 6 mice. It can be said to have a result.

비교예 1Comparative Example 1 : :

상기 실시예 1의 배양단계에서 CD8 오브알부민 펩티드와 α-GalCer를 동시에 처리하는 것 대신 CD8 오브알부민 펩티드만을 처리하여 배양한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 CD8 T 세포를 활성화하였다.CD8 T cells were activated in the same manner as in Example 1 except that only the CD8 obalbumin peptide was cultured instead of the CD8 obalbumin peptide and α-GalCer at the same time. .

비교예 2Comparative Example 2 : :

상기 실시예 1의 배양단계에서 CD8 오브알부민 펩티드와 α-GalCer를 동시에 처리하는 것 대신 α-GalCer만을 처리하여 배양한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 하여 CD8 T 세포를 활성화하였다.CD8 T cells were activated in the same manner as in Example 1, except that only the α-GalCer was treated and cultured instead of simultaneously treating the CD8 ovalbumin peptide and α-GalCer in the culture step of Example 1.

실험예 1Experimental Example 1 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 항원 특이성 및 분열증식 능력 : Antigen Specificity and Proliferation Ability of Activated Thy1.1 / OT-I Cells

1. 말초혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)의 CD8 T 세포 중 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 개체비 변화 분석1. Analysis of Percent Changes of Activated Thy1.1 / OT-I Cells in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) CD8 T Cells

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사한 후, 2~3일 마다 혈액을 4~5 방울씩 시험관(E-tube)에 받았다. 이때, 시험관에 30㎕의 PBS(50mM EDTA)를 미리 넣어두어 혈액 응고를 방지하였다. 이후, 시험관에 적혈구 용해 완충액(RBC lysis Buffer, 증류수에 10배 희석시킴, BD, Cat. 555899) 1.2㎖를 넣고 5분간 방치하여 세포 다운(cell down) 시키고 말초혈액 단핵세포 (PBMC)를 얻었다. PBMC의 CD8 T 세포 중 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 개체비 (population ratio) 변화를 FACS를 이용하여 분석하였다. 이때, 입양전달된 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 검출하기 위해 CD8 APC(eBioscience, Cat. 17-0081-82)와 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 연결된 항-Thy1.1 항체인 Thy1.1/FITC(BD, Cat. 554894)를 이용하여 염색하였다. 또한, 대조군으로는 아무런 처리도 하지 않고 Thy1.1/OT-I 세포를 입양전달한 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC(no stimulation), 비교예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC(OVAp), 비교예 2의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC(α-GalCer)를 사용하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously injected into C57BL / 6 mice, and then 4-5 drops of blood were injected into the E-tube every 2-3 days. At this time, 30 μl of PBS (50 mM EDTA) was previously placed in a test tube to prevent blood coagulation. Thereafter, 1.2 ml of erythrocyte lysis buffer (RBC lysis Buffer, 10-fold dilution in distilled water, BD, Cat. 555899) was added and allowed to stand for 5 minutes to cell down to obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Changes in the population ratio of activated Thy1.1 / OT-I cells in CD8 T cells of PBMC were analyzed using FACS. At this time, Thy1.1, an anti-Thy1.1 antibody linked with CD8 APC (eBioscience, Cat. 17-0081-82) and Fluorescein isothiocyanate (FITC), was used to detect adopted activated Thy1.1 / OT-I cells. / FITC (BD, Cat. 554894). In addition, PBMC (no stimulation) obtained from C57BL / 6 mice adoptive transfer of Thy1.1 / OT-I cells without any treatment as a control, PBMC (OVAp) obtained from C57BL / 6 mice of Comparative Example 1, Comparative Example PBMC (α-GalCer) from 2 C57BL / 6 mice was used.

결과는 도 2에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC (OVAp+α-GalCer)의 경우 비교예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC(OVAp)보다 Thy1.1 양성 CD8 T 세포가 격렬히 분열증식하였다. 반면, 비교예 2의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 PBMC(α-GalCer)의 경우 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열증식이 일어나지 않았다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달한 경우에 발생하는 분열증식은 항원 특이적이라고 할 수 있다.As shown in FIG. 2, in the case of PBMC (OVAp + α-GalCer) obtained from the C57BL / 6 mouse of Example 1, Thy1.1 positive CD8 T cells were obtained from PBMC (OVAp) obtained from the C57BL / 6 mouse of Comparative Example 1 Violently dividing. On the other hand, PBMCs (α-GalCer) obtained from the C57BL / 6 mice of Comparative Example 2 did not develop Thy1.1 positive CD8 T cells. Therefore, the proliferation that occurs when the activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention are adopted by intravenous injection into C57BL / 6 mice is antigen specific.

2. 비장세포의 CD8 T 세포 중 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 분열 정도 분석2. Analysis of Division of Activated Thy1.1 / OT-I Cells among Splenocyte CD8 T Cells

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 10μM CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 처리하여 표지한 후, C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 3일 후 C57BL/6 마우스의 비장에서 비장세포를 얻었다. 그 다음, 비장세포의 CD8 T 세포 중 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 분열 정도를 FACS를 이용하여 CFSE 희석을 통해 분석하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were labeled with 10 μM CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), and then intravenously injected into C57BL / 6 mice for adoption and spleen of C57BL / 6 mice 3 days later. Splenocytes were obtained from. Then, the degree of division of activated Thy1.1 / OT-I cells in CD8 T cells of splenocytes was analyzed by CFSE dilution using FACS.

결과는 도 3에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 3에 나타난 바와 같이, 비장세포에서 α-GalCer 처리에 의해 Thy1.1 양성 CD8 T 세포가 격렬하게 분열증식함을 확인하였다.As shown in Figure 3, it was confirmed that Thy1.1 positive CD8 T cells violently dividing by the α-GalCer treatment in splenocytes.

실험예 2Experimental Example 2 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 기능성 평가 : Functional Evaluation of Activated Thy1.1 / OT-I Cells

1. IFN-γ 및 TNF-α의 분비 능력과 CD107a의 발현 정도 분석1. Secretion ability of IFN-γ and TNF-α and expression level of CD107a

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사 하여 입양전달하고, 3일 후 C57BL/6 마우스의 비장에서 비장세포를 얻었다. 그 다음 비장세포에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 IFN-γ 및 TNF-α의 분비량과 CD107a의 발현 정도를 FACS를 이용하여 측정하였다. 상기 CD107a의 발현량은 CTL 활성과 비례하여 증가한다고 알려져 있다(J Immunol. Methods, 2007,328(1-2):45-52). 구체적으로는, 3×106의 비장세포를 FACS 튜브에 넣고 1μM의 OVAp(SINFEKL), 5㎍/㎖의 BFA(Sigma, Cat. B7651), 및 CD107a FITC(BD, Cat. 553793)를 넣어 6시간 처리하였다. 이후 FACS 완충액(PBS containing 1% FBS) 및 Thy1.1/FITC(BD, Cat. 554894)와 CD8 APC(eBioscience, Cat. 17-0081-82)를 이용하여 비장세포를 염색하고, 용해 용액(lysing solution, 증류수에 10배 희석시킴, BD, Cat. 3492052)을 넣어 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 1~2% 사포닌을 포함한 FACS 완충액(PBS containing 1% FBS)으로 10분간 처리하였다가 IFN-γ PE(eBioscience, Cat. 12-7311-82) 또는 TNF-α PE(eBioscience, Cat.12-7321)로 염색하였다. 대조군으로는 비교예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포(OVAp)를 사용하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously injected into C57BL / 6 mice for adoption, and after 3 days, splenocytes were obtained from the spleens of C57BL / 6 mice. Next, the secretion of IFN-γ and TNF-α and the level of CD107a expression of activated Thy1.1 / OT-I cells in splenocytes were measured using FACS. The expression level of CD107a is known to increase in proportion to CTL activity (J Immunol. Methods, 2007,328 (1-2): 45-52). Specifically, 3 × 10 6 splenocytes were placed in a FACS tube and 1 μM OVAp (SINFEKL), 5 μg / ml BFA (Sigma, Cat. B7651), and CD107a FITC (BD, Cat. 553793) were added. Time was processed. Staining splenocytes using FACS buffer (PBS containing 1% FBS) and Thy1.1 / FITC (BD, Cat. 554894) and CD8 APC (eBioscience, Cat. 17-0081-82) and lysing solution, diluted 10 times in distilled water, BD, Cat. 3492052) was incubated overnight at 4 ℃. Thereafter, the cells were treated with FACS buffer containing 1 ~ 2% saponin (PBS containing 1% FBS) for 10 minutes and then IFN-γ PE (eBioscience, Cat. 12-7311-82) or TNF-α PE (eBioscience, Cat.12 -7321). As a control, splenocytes (OVAp) obtained from C57BL / 6 mice of Comparative Example 1 were used.

본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 3일 후 비장세포의 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 IFN-γ와 TNF-α의 분비량 및 CD107a의 발현 정도(A,C), 및 IFN-γ와 TNF-α의 평균형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)로 나타낸 그래프(B,D)는 도 4에 나타내었다.Activated Thy1.1 / OT-I cells according to the present invention were intravenously delivered to C57BL / 6 mice for adoption and delivered three days later. IFN-γ and TNF- of Thy1.1 positive CD8 T cells in splenocytes CD8 T cells. The amount of α secretion and the degree of expression of CD107a (A, C) and the mean fluorescence intensity (MFI) of IFN-γ and TNF-α are shown in FIG. 4.

도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포 (OVAp+α-GalCer)의 경우 분열된 Thy1.1 양성 CD8 T 세포에서 CD107a이 발현되고, IFN-γ와 TNF-α가 더 많이 분비되었다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포는 분열 후에 기능성이 더욱 향상됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 4, splenocytes (OVAp + α-GalCer) obtained from the C57BL / 6 mice of Example 1 express CD107a in divided Thy1.1 positive CD8 T cells, and IFN-γ and TNF-α. Was secreted more. Therefore, it can be seen that the activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention further improve the function after division.

2. 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL) 기능 분석2. Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Function Analysis

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6일 후 C57BL/6 마우스의 비장에서 비장세포를 얻어 이의 CTL 기능을 분석하였다. 먼저, TC-I 세포(ATCC CRL-2785)에 OVAp(SINFEKL)를 37℃에서 30분간 펄싱(pulsing)하여 표적 세포를 준비하고, TC-I 세포(ATCC CRL-2785)에 아무런 처리 없이 37℃에서 30분간 배양하여 대조 세포(control cell)를 준비하였다. 이후, 평평한 96 웰 플레이트의 일부 웰에 각각 4×104의 표적 세포를 깔았다. 이후, 상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고, 6일 후 C57BL/6 마우스의 비장에서 얻은 비장세포 1×106, 3.3×105, 1×105을 그 위에 깔고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 또한, 일부 웰에는 비교예 1의 C57BL/6 마우스로부터 얻은 비장세포를 동일한 방법으로 깔고 배양하였다. 20시간 이후 배지와 비장세포를 세척하고, 붙어 있는 표적 세포를 확인하기 위해 염색 용액(staining solution, 0.1% crystal violet, 10% formalin, 4% ethanol)으로 실온에서 10분간 처리하였다.The Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously injected into C57BL / 6 mice for adoption, and after 6 days, splenocytes were obtained from the spleens of C57BL / 6 mice and analyzed for their CTL function. First, target cells were prepared by pulsing OVAp (SINFEKL) at 37 ° C. for 30 minutes on TC-I cells (ATCC CRL-2785), and 37 ° C. without any treatment on TC-I cells (ATCC CRL-2785). Incubated for 30 minutes at to prepare a control cell (control cell). Then, some wells of the flat 96 well plates were each plated with 4 × 10 4 target cells. Subsequently, the Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously delivered to C57BL / 6 mice for adoption, and after 6 days, splenocytes obtained from the spleen of C57BL / 6 mice were 1 × 10 6 , 3.3 ×. 10 5 , 1 × 10 5 were laid thereon and incubated at 37 ° C. for 20 hours. In addition, some wells were cultured with splenocytes obtained from the C57BL / 6 mice of Comparative Example 1 in the same manner. After 20 hours, the medium and splenocytes were washed, and treated with staining solution (staining solution, 0.1% crystal violet, 10% formalin, 4% ethanol) for 10 minutes at room temperature to identify the target cells.

결과는 도 5에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 얻은 비장세포의 경우 비교예 1에서 얻은 비장세포의 경우보다 표적 세포가 훨씬 잘 용해되었다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포는 뛰어난 CTL 기능을 가지고 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 5, the splenocytes obtained in Example 1 lysed the target cells much better than the splenocytes obtained in Comparative Example 1. Thus, it can be seen that the activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention have excellent CTL function.

실험예 3Experimental Example 3 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 기억 CD8 T 세포 유도 능력 : Memory CD8 T Cell Induction Ability of Activated Thy1.1 / OT-I Cells

상기 실시예 1(OVAp+α-GalCer)에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 1×106을 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 56일 후, 즉 콘트랙션 상 (contraction phase) 이후에 C57BL/6 마우스에서 PBMC와 비장세포를 얻고, FACS를 이용하여 남아있는 Thy1.1/OT-I 세포를 분석하였다. 이러한 분석 결과로부터 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 기억 CD8 T 세포 유도 능력을 알아보았다. 대조군으로는 비교예 1(OVAp)과 비교예 2(α-GalCer)에서 얻은 PBMC와 비장세포를 사용하였다. 비장세포의 FACS 분석에서는 CD44 APC(eBioscience, Cat.17-0441-82)와 Thy1.1/FITC(BD, Cat.554894)를 사용하였고, PBMC의 FACS 분석에서는 CD8 APC (eBioscience, Cat. 17-0081-82)와 Thy1.1/FITC(BD, Cat.554894)를 사용하였다. CD44는 이펙터-기억 T 세포(effector-memory T cell)의 마커로 이용되는 세포 표면 당단백질이다.Thy1.1 / OT-I cells 1 × 10 6 activated in Example 1 (OVAp + α-GalCer) were intravenously delivered to C57BL / 6 mice for adoption and delivered 56 days later, that is, the contraction phase Thereafter, PBMCs and splenocytes were obtained from C57BL / 6 mice, and remaining Thy1.1 / OT-I cells were analyzed using FACS. From these assays, memory CD8 T cell induction ability of activated Thy1.1 / OT-I cells was investigated. As a control, PBMC and splenocytes obtained in Comparative Example 1 (OVAp) and Comparative Example 2 (α-GalCer) were used. CD44 APC (eBioscience, Cat. 17-0441-82) and Thy1.1 / FITC (BD, Cat. 554894) were used for FACS analysis of splenocytes. CD8 APC (eBioscience, Cat. 17- 17) was used for FACS analysis of PBMC. 0081-82) and Thy1.1 / FITC (BD, Cat. 554894) were used. CD44 is a cell surface glycoprotein that is used as a marker for effector-memory T cells.

결과는 도 6에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 얻은 비장세포에서 모두 CD44를 발현하였으며, 특히 실시예 1(OVAp+α-GalCer)에서 얻은 비장세포에서 가장 많은 Thy1.1 양성/CD44 양성 세포를 나타내었다. 또한, Thy1.1 양성 CD8 T 세 포는 실시예 1의 PBMC에서 가장 많이 존재하였으며, 비교예 1 및 비교예 2에서 얻은 PBMC에서의 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 비율과 크게 변하지 않았다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에서 기억 CD8 T 세포의 생성이 유도되고 유지됨을 알 수 있다.As shown in FIG. 6, CD44 was expressed in all splenocytes obtained in Example 1, Comparative Examples 1 and 2, and in particular, the most Thy1.1 positive / in splenocytes obtained in Example 1 (OVAp + α-GalCer). CD44 positive cells were shown. In addition, Thy1.1 positive CD8 T cells were most present in the PBMCs of Example 1, and did not change significantly with the ratio of Thy1.1 positive CD8 T cells in PBMCs obtained in Comparative Examples 1 and 2. Thus, it can be seen that the production of memory CD8 T cells is induced and maintained in the activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention.

실험예 4Experimental Example 4 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 α-GalCer 전달 매개체 : Α-GalCer Delivery Mediator of Activated Thy1.1 / OT-I Cells

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달할 때 α-GalCer가 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 전달되는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스 또는 Jα18-/-에 정맥주사하여 입양전달하고 6일 후에 비장 속의 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 수를 측정하였다. B6는 C57BL/6 마우스, Jα18-/-는 Jα18(iTCR, NKT 세포에 발현하는 T 세포 수용체)이 녹아웃(knock-out)된 마우스(즉, NKT 세포가 없는 마우스)로서, 수령 마우스의 NKT 세포 의존도를 알아보기 위해 사용하였다.In order to confirm whether α-GalCer is delivered by activated Thy1.1 / OT-I cells when the Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 are injected intravenously into C57BL / 6 mice, The following experiment was performed. Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were injected intravenously into C57BL / 6 mice or Jα18 − / − to be adopted for 6 days after the adoption of Thy1.1 positive CD8 T cells in all spleen CD8 T cells in the spleen. The number was measured. B6 is a C57BL / 6 mouse, Jα18 − / − is a mouse knocked out of Jα18 (iTCR, a T cell receptor expressing NKT cells) (ie, a mouse without NKT cells), and NKT cells from recipient mice. It was used to determine the dependency.

결과는 도 7에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 NKT 세포가 없는 Jα18-/- 마우스에 입양전달한 경우, 입양전달한 Thy1.1/OT-I 세포의 분열이 일어나지 않았다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포는 α-GalCer와 결합한 상태로 α-GalCer를 C57BL/6 마우스 내로 전달하고, 수령 마우스 의 NKT 세포는 입양전달한 Thy1.1/OT-I 세포의 분열 증식에 중요한 역할을 담당한다는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 7, when the Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were transferred to Jα18 − / − mice without NKT cells, the division of the adopted Thy1.1 / OT-I cells did not occur. Did. Thus, activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention deliver α-GalCer into C57BL / 6 mice in combination with α-GalCer, and NKT cells of recipient mice were adoptive Thy1.1 / OT-I cells. It can be seen that it plays an important role in the division and proliferation of cells.

실험예 5Experimental Example 5 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포가 생체내로 입양전달한 후 α-GalCer에 의해 분열되는 조건 : Conditions in which activated Thy1.1 / OT-I cells are divided by α-GalCer after adoptive transfer in vivo

α-GalCer가 상기 실시예 1의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 전달되는 조건을 알아보았다. 이를 위해 OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 또는 실시예 1(OVAp+α-GalCer)의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 1×105을 수령 마우스에 정맥주사하여 입양전달하였다. 또한, OVAp만으로 처리된 Thy1.1/OT-I 세포에 과량의 α-GalCer(2㎍)를 같이 정맥주사 하거나(도 8의 (+)), 또는 입양전달하기 전 OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 5분간 α-GalCer를 처리한 후(도 8의 [+]) 수령 마우스에 정맥주사하여 입양전달하였다. 입양전달하고 6일 후 비장 속의 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 수를 측정하였다. 또한, 입양전달하기 전 활성화된 Thy1.1/OT-I의 조건을 알아보기 위해 실시예 1의 생체 외에서 자극 시간을 달리하여 CD44와 CD62L의 발현 정도를 확인하였다.The conditions under which α-GalCer is delivered by the activated Thy1.1 / OT-I cells of Example 1 were examined. To this end, Thy1.1 / OT-I cells activated by treatment with OVAp alone or 1 × 10 5 activated Thy1.1 / OT-I cells of Example 1 (OVAp + α-GalCer) were intravenously injected into recipient mice for adoption. Delivered. In addition, Thy1.1 / OT-I cells treated with OVAp alone were injected with an excess of α-GalCer (2 μg) intravenously ((+) in FIG. 8), or treated with OVAp alone prior to adoptive delivery to Thy1. After treatment with .1 / OT-I cells for 5 minutes with α-GalCer ([+] in FIG. 8), the mice were intravenously injected for adoption. Six days after adoptive transfer, the number of Thy1.1 positive CD8 T cells in the total CD8 T cells in the spleen was measured. In addition, the expression level of CD44 and CD62L was confirmed by varying the stimulation time in vitro of Example 1 to determine the conditions of activated Thy1.1 / OT-I before adoptive delivery.

OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 α-GalCer를 짧은 시간 동안 처리하거나, 또는 과량의 a-GalCer을 동시에 입양전달한 후 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 비율은 도 8에 나타내었으며, 자극 시간을 다르게 하고 입양전달하기 직전의 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 CD44와 CD62L 발 현 정도(A)와 이에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I의 혈액 내 개체비 변화(B)는 도 9에 나타내었다.The ratio of Thy1.1 positive CD8 T cells out of total CD8 T cells after treatment with α-GalCer for a short time in activated Thy1.1 / OT-I cells by treatment with OVAp alone, or after adopting and delivering an excess of a-GalCer simultaneously 8 shows the degree of CD44 and CD62L expression (A) and thus activated Thy1.1 / OT of activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention immediately before adoptive delivery with different stimulation times. The change in the population ratio (B) of blood in -I is shown in FIG. 9.

도 8에 나타난 바와 같이, OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 α-GalCer를 짧은 시간 동안 처리하거나, 또는 과량의 a-GalCer을 동시에 입양전달하는 것만으로도 비장 속의 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 비율을 높게 나타내어, 입양전달한 Thy1.1/OT-I 세포의 분열을 유도할 수 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 8, treatment of α-GalCer to activated Thy1.1 / OT-I cells by treatment with OVAp alone for a short time, or by adoptive delivery of an excess of a-GalCer simultaneously, total CD8 in the spleen It can be seen that the ratio of Thy1.1 positive CD8 T cells in the T cells is high, which can induce division of the adopted Thy1.1 / OT-I cells.

또한 도 9에 나타난 바와 같이, 자극 시간이 늘어날수록 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에서 CD44와 CD62L의 발현이 증가되었으며, Thy1.1/OT-I 세포의 CD44와 CD62L의 발현이 높을 때 입양전달 이후 α-GalCer에 의해 Thy1.1/OT-I 세포의 분열이 유도되었음을 알 수 있다.As shown in FIG. 9, the expression of CD44 and CD62L was increased in activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention, and the expression of CD44 and CD62L in Thy1.1 / OT-I cells was increased. It can be seen that Thy1.1 / OT-I cell division was induced by α-GalCer after adoptive delivery.

실험예 6Experimental Example 6 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 NKT 세포와의 관계 : Relationship between Activated Thy1.1 / OT-I Cells and NKT Cells

1. 생체 외에서 NKT 세포가 Thy1.1/OT-I 세포의 활성에 미치는 영향1. Effect of NKT Cells on Thy1.1 / OT-I Cell Activity in Vitro

생체 외에서 NKT 세포가 Thy1.1/OT-I 세포의 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에서 CD44, CD62L, CD25의 발현 정도를 0시간, 2시간, 3시간, 9시간, 19시간, 25시간, 47시간에서 측정하였다.To determine whether NKT cells affect the activity of Thy1.1 / OT-I cells in vitro, the expression level of CD44, CD62L, and CD25 in activated Thy1.1 / OT-I cells was measured at 0 hours, 2 hours, and 3 hours. It measured at time, 9 hours, 19 hours, 25 hours, and 47 hours.

결과는 도 10에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 10에 나타난 바와 같이, 생체 외에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에서 CD44, CD62L, CD25의 발현은 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 생체 외에서 NKT 세 포가 Thy1.1/OT-I 세포의 활성에 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있다.As shown in FIG. 10, there was no difference in the expression of CD44, CD62L, and CD25 in Thy1.1 / OT-I cells activated in vitro. Thus, it can be seen that NKT cells do not significantly affect the activity of Thy1.1 / OT-I cells in vitro.

2. 입양전달한 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 수령 마우스의 NKT 세포의 비율2. Proportion of NKT cells in recipient mice by adoptive transferred activated Thy1.1 / OT-I cells

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 C57BL/6 마우스의 비장에서 지정된 시간에 비장세포를 얻어 CD3 양성 NK1.1 양성 세포(NKT 세포)의 비율을 확인하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously injected into C57BL / 6 mice for adoption, and splenocytes were obtained at a specified time in the spleen of C57BL / 6 mice to obtain CD3-positive NK1.1 positive cells (NKT). Percentage of cells).

결과는 도 11에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 11에 나타난 바와 같이, 비장세포에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 또는 naive Thy1.1/OT-I 세포에 의해 입양전달된 α-GalCer가 CD3 양성 NK1.1 양성 세포 (NKT 세포)의 비율을 감소시킨 후 복원시켰다. 따라서, NKT 세포가 α-GalCer에 의해 활성-유도 아폽토시스(activation-induced apoptosis)를 일으켰음을 알 수 있다 (Nature Immunol. 2002, 3(9):867-874).As shown in FIG. 11, α-GalCer adopted by activated Thy1.1 / OT-I cells or naive Thy1.1 / OT-I cells in splenocytes is CD3-positive NK1.1 positive cells (NKT cells). The ratio was reduced and then restored. Thus, it can be seen that NKT cells caused activation-induced apoptosis by α-GalCer (Nature Immunol. 2002, 3 (9): 867-874).

3. α-GalCer가 생체내에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 naive Thy1.1/OT-I 세포에 의해 NKT 세포에 미치는 영향3. Effects of α-GalCer on NKT Cells by In Vivo Activated Thy1.1 / OT-I Cells and Naive Thy1.1 / OT-I Cells

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6시간 후 C57BL/6 마우스의 비장에서 비장세포를 얻은 후 비장세포의 IFN-γ 분비 능력과 NK 세포의 IFN-γ 세포내 분석을 실시하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously delivered to C57BL / 6 mice for adoption, and after 6 hours, splenocytes were obtained from the spleens of C57BL / 6 mice, and then splenocytes secrete IFN-γ. IFN-γ intracellular analysis of and NK cells was performed.

비장세포의 IFN-γ 분비 능력을 확인하기 위하여 ELISPOT를 실시하였으며, 구체적으로는 2×105 비장세포를 96 웰 플레이트에 삼중으로 깔고, 자극이 없는 상 태, OVAp 자극 또는 α-GalCer 자극을 주고 37℃에서 18~24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 증류수로 10분간 세척하여 용해시키고, IFNγ-비오틴 항체를 3시간 동안 붙였다. 이후 스트렙타비딘-AKP를 30분간 붙이고 발색하여 spot을 측정하였다.ELISPOT was performed to confirm IFN-γ secretion capacity of splenocytes. Specifically, 2 × 10 5 splenocytes were tripled on 96-well plates, giving no stimulation, OVAp stimulation, or α-GalCer stimulation. Incubated at 37 ℃ for 18-24 hours. Thereafter, the cultured cells were washed with distilled water for 10 minutes to lyse, and the IFNγ-biotin antibody was attached for 3 hours. After streptavidin-AKP was added for 30 minutes and the color was measured by spot.

또한, NK 세포의 IFN-γ 세포내 분석을 위해서는, 3×106 비장세포를 FACS 튜브에 넣고, 자극이 없는 상태, OVAp 자극 또는 α-GalCer 자극을 주고 37℃에서 4~6시간 동안 배양하였다. 이후, NK1.1, CD3 항체를 붙이고 고정시킨 후, 0.5% 사포닌 FACS 완충액으로 다시 IFN-γ를 염색하여 FACS로 분석하였다.In addition, for IFN-γ intracellular analysis of NK cells, 3 × 10 6 splenocytes were placed in a FACS tube, incubated for 4-6 hours at 37 ° C. with no stimulation, OVAp stimulation or α-GalCer stimulation. . Thereafter, NK1.1 and CD3 antibodies were attached and fixed, and then IFN-γ was stained with 0.5% saponin FACS buffer and analyzed by FACS.

또한, NKT 세포가 더 많이 활성화되었음을 확인하기 위해 직접적인 증거를 얻고자 상기와 동일 조건의 수령 마우스에서 얻은 비장세포를 이용하여 IL-2의 분비 능력을 확인하기 위하여 ELISPOT를 실시하였다. 이때 비장세포를 자극하기 위해 OVAp와 α-GalCer를 이용하였다.In addition, ELISPOT was performed to confirm the secretion ability of IL-2 using splenocytes obtained from recipient mice under the same conditions to obtain direct evidence to confirm that the NKT cells were more activated. At this time, OVAp and α-GalCer were used to stimulate splenocytes.

본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6시간 후 비장세포에서 IFN-γ 분비 능력을 ELISPOT로 측정한 결과(A)와 NK 세포의 IFN-γ 세포내 분석 결과(B)는 도 12에 나타내었다. 또한 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6시간 후 비장세포에서 NKT 세포의 IL-2의 분비 능력을 ELISPOT로 측정한 결과는 도 13에 나타내었다.The activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention were intravenously injected into C57BL / 6 mice for adoptive transfer, and after 6 hours, IFN-γ secretion capacity was measured by ELISPOT in splenocytes (A) and IFN of NK cells. -γ intracellular analysis result (B) is shown in FIG. In addition, after 6 hours of adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention to C57BL / 6 mice, the secretion ability of NKT cells in the spleen cells was measured by ELISPOT. Shown in

도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달한 후 얻은 비장세포에서 IFN-γ가 OVAp와 α-GalCer 자극에 상관없이 매우 높게 분비함을 확인하였다. 또한 이러한 IFN-γ는 NK 세포에서 주로 나오는 것을 확인하였다. NK 세포는 NKT 세포가 활성화된 이후 순차적으로 활성화 된다고 알려져 있다. 또한 IL-2가 α-GalCer 자극에 의해 활성화됨을 확인하였다. 따라서 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포가 NKT 세포의 IL-2 분비 능력을 향상시킴을 알 수 있다. 즉, 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 naive Thy1.1/OT-I 세포에 α-GalCer를 처리하면 모두 NKT 세포를 활성화시키지만, 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포가 더 강하게 NKT 세포를 활성화시켜 NK 세포로 하여금 IFN-γ를, NKT 세포로 하여금 IL-2를 분비하도록 유도함을 알 수 있다.As shown in FIGS. 12 and 13, IFN-γ correlates with OVAp and α-GalCer stimulation in splenocytes obtained after adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells to C57BL / 6 mice intravenously. Very high secretion was confirmed without. In addition, it was confirmed that such IFN-γ mainly comes from NK cells. NK cells are known to be activated sequentially after NKT cells are activated. It was also confirmed that IL-2 is activated by α-GalCer stimulation. Therefore, it can be seen that the activated Thy1.1 / OT-I cells in Example 1 enhance the IL-2 secretion ability of NKT cells. In other words, the treatment of activated Thy1.1 / OT-I and naive Thy1.1 / OT-I cells activates NKT cells, but the activated Thy1.1 / OT-I cells are stronger in NKT. It can be seen that the cells are activated to induce NK cells to secrete IFN-γ and NKT cells to IL-2.

4. 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 활성화된 NKT 세포가 혈액 속에 면역유도에 중요하다고 알려진 사이토카인 분비에 미치는 영향4. Effect of NKT Cells Activated by Activated Thy1.1 / OT-I Cells on Cytokine Secretion Known Important for Immunity Induction in Blood

상기 실시예 1에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 지정된 시간에 C57BL/6 마우스의 플라즈마를 얻어 혈액 속에 존재하는 IL-2, IFN-γ, IL-4의 농도를 ELISA를 통해 분석하였다.The Thy1.1 / OT-I cells activated in Example 1 were intravenously injected into C57BL / 6 mice to be adopted for delivery, and plasma of the C57BL / 6 mice was obtained at a designated time, and IL-2, IFN-γ, The concentration of IL-4 was analyzed by ELISA.

결과는 도 14에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 활성화된 NKT 세포가 혈액 속에서 IL-2, IFN-γ, IL-4를 높게 발현시켰으며, 특히 IL-2가 활성화된 Thy1.1/OT-I에 의해 강하게 발현됨을 확인하였다. IL-2는 NKT 세포에 의해 분비된다.As shown in FIG. 14, NKT cells activated by activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention expressed high levels of IL-2, IFN-γ, and IL-4 in the blood, and specifically, IL- 2 was strongly expressed by the activated Thy1.1 / OT-I. IL-2 is secreted by NKT cells.

실험예 7Experimental Example 7 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포, NKT 세포와 다른 면역성과의 관계 : Relationship between Activated Thy1.1 / OT-I Cells and NKT Cells and Other Immunity

1. 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 수지상 세포를 같이 입양전달한 C57BL/6 마우스의 비장세포에서 Thy1.1/OT-I 세포 비율1. Thy1.1 / OT-I Cell Ratio in Spleen Cells of C57BL / 6 Mice Adopted with Activated Thy1.1 / OT-I Cells and Dendritic Cells

OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 α-GalCer를 처리한 수지상 세포를 같이 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6일 후 C57BL/6 마우스의 비장세포에서 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1/OT-I 세포 비율을 조사하였다.Thy1.1 / OT-I cells activated by treatment with OVAp alone and dendritic cells treated with α-GalCer were injected intravenously to C57BL / 6 mice for 6 days, and total CD8 T in splenocytes of C57BL / 6 mice. The percentage of Thy1.1 / OT-I cells in the cells was investigated.

결과는 도 15에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 15에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 활성화된 CD8 T 세포를 생체내로 입양전달한 후 이로부터 얻은 비장세포에서 전체 CD8 T 세포 중 입양전달한 CD8 T 세포의 비율은, OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 α-GalCer를 처리한 수지상 세포를 동시에 입양전달한 것보다 더 높게 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포가 α-GalCer를 처리한 수지상 세포보다 더 효과적으로 입양전달한 Thy1.1/OT-I 세포를 증가시킴을 알 수 있다.As shown in FIG. 15, the ratio of CD8 T cells adopted in the splenocytes obtained from the spleen cells obtained after adopting the activated CD8 T cells in vivo and adopting them was treated with OVAp alone to activate Thy1. It was confirmed that the 1 / OT-I cells and the dendritic cells treated with α-GalCer were higher than those adopted for simultaneous transfer. Thus, it can be seen that the activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention increase Thy1.1 / OT-I cells that have been adopted for delivery more effectively than dendritic cells treated with α-GalCer.

2. α-GalCer 처리 유무 및 수령 마우스의 종류에 따른 입양전달 후 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열증식 여부2. Proliferation of Thy1.1-positive CD8 T Cells after Adoption Delivery According to α-GalCer Treatment and Type of Recipient Mice

생체 외에서 자극에 의해 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 제조할 때 α-GalCer 처리 유무 및 수령 마우스의 종류에 따른 입양전달 후 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열증식 여부를 알아보았다. 본 실험에 사용된 수령 마우스는 잭슨랩(Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA)에서 구입하여 포항공과대학(POSTECH, 한국)에서 동 종교배시킨 것으로, B6는 C57BL/6, IL17-/-는 IL17이 녹아웃된 마우스, IFN-γ-/-는 IFN-γ가 녹아웃된 마우스, IL12RI-/-는 IL12RI이 녹아웃된 마우스, IL12RII-/-는 IL12RII가 녹아웃된 마우스, LYSTBG-/-는 자연적으로 발생된 돌연변이 마우스로서 NK 세포 결함 모델로 이용하였다.When the Thy1.1 / OT-I cells activated by in vitro stimulation were prepared, we examined whether Thy1.1-positive CD8 T cells were proliferated after adoptive delivery according to the presence of α-GalCer treatment and the type of recipient mouse. Recipient mice used in this experiment were purchased from Jackson Lab, Bar Harbor, USA, and were obtained from Pohang University of Science and Technology (POSTECH, Korea). B6 is C57BL / 6, IL17 -/- is IL17. Knocked out mice, IFN-γ -/- are knocked out IFN-γ, IL12RI -/- are knocked out of IL12RI, IL12RII -/- are knocked out of IL12RII, LYSTBG -/- are naturally occurring As mutant mice it was used as NK cell defect model.

결과는 도 16에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 16에 나타난 바와 같이, 생체 외의 자극 처리 단계에서 α-GalCer를 처리하지 않은 경우 수령 마우스의 종류에 관계없이 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열증식이 거의 일어나지 않았고, 생체 외의 자극 처리 단계에서 α-GalCer를 처리한 경우 대부분의 수령 마우스에서 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열증식이 활발하게 일어났다.As shown in FIG. 16, when the α-GalCer was not treated in the in vitro stimulation treatment step, no proliferation of Thy1.1 positive CD8 T cells occurred regardless of the type of recipient mice, and the α- in the in vitro stimulation treatment stage. GalCer treatment showed active proliferation of Thy1.1 positive CD8 T cells in most recipient mice.

실험예 8Experimental Example 8 : 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 항종양 효과 : Antitumor Effect of Activated Thy1.1 / OT-I Cells

세포주로는 EG7 세포주(OVA transfected EL4 cell line)를 이용하였으며, 각 실험군에는 약 10마리의 C57BL/6 마우스를 할당하였다. EG7 세포 1×106을 마우스의 배쪽에 피하주사하여 고형암을 유도하였다. 그 후 7일 뒤, 고형암의 지름이 모두 6~8㎜에 이르는 마우스는 선택하고, 그렇지 못한 마우스는 제외하여 각 군의 종양 성장의 시작을 동일하게 맞추었다. 그 다음 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포 1×105을 C57BL/6 마우스에 정맥주사하였다. 이후, 종양의 부피와 마우스의 생존율을 확인하 였다. 그리고 입양전달 15일 후에 마우스의 PBMC를 얻어 OVAp 자극 이후 6시간 동안 BFA(brefeldin A)와 함께 배양하고, Thy1.1과 CD8 표면 마커를 붙였다. 이후 세포를 1% 포름알데히드로 고정하고 0.5% 사포닌을 이용하여 마우스의 혈액 속에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 IFN-γ 분비 능력을 FACS로 분석하였다.An EG7 cell line (OVA transfected EL4 cell line) was used as a cell line, and about 10 C57BL / 6 mice were allocated to each experimental group. Solid tumors were induced by subcutaneous injection of EG7 cells 1 × 10 6 into the ventral side of mice. Seven days later, mice with solid tumors all 6-8 mm in diameter were selected, except for mice that did not, and the tumor growth of each group was matched equally. Activated Thy1.1 / OT-I cells 1 × 10 5 were then injected intravenously into C57BL / 6 mice. Then, the volume of the tumor and the survival rate of the mouse was confirmed. After 15 days of adoption, PBMCs of mice were obtained, incubated with BFA (brefeldin A) for 6 hours after OVAp stimulation, and Thy1.1 and CD8 surface markers were attached. Cells were then fixed with 1% formaldehyde and IFN-γ secreting ability of activated Thy1.1 / OT-I cells in mouse blood using 0.5% saponin was analyzed by FACS.

고형암이 유도된 마우스에 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 정맥주사한 후 고형암의 부피(A)와 마우스의 생존율(B)을 측정한 결과, 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 입양전달 15일 후 마우스의 혈액 속에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 IFN-γ 분비 능력을 FACS로 분석한 결과(C), 및 (C)의 1사분면(Thy1.1+IFN-γ+)의 값을 수치화하여 나타낸 그래프(D)는 도 17에 나타내었다.After intravenous injection of activated Thy1.1 / OT-I cells into solid cancer-induced mice, the volume of solid cancer (A) and survival rate (B) of mice were measured. After 15 days of adoptive delivery, IFN-γ secretion ability of activated Thy1.1 / OT-I cells in mouse blood was analyzed by FACS (C), and one quadrant of (C) (Thy1.1 + IFN- The graph (D) showing the numerical value of γ + ) is shown in FIG. 17.

도 17에 나타난 바와 같이, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포(OVAp+α-GalCer)를 정맥주사한 경우 OVAp 또는 α-GalCer 단독으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 정맥주사한 경우보다 고형암의 부피가 매우 작았으며, 마우스의 생존율도 매우 높았다. 또한, 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포(OVAp+α-GalCer)의 입양전달 15일 후 마우스의 혈액 속에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 IFN-γ 분비 능력이 우수하게 나타났다.As shown in FIG. 17, when intravenously injected activated Thy1.1 / OT-I cells (OVAp + α-GalCer) of the present invention were treated with OVAp or α-GalCer alone, activated Thy1.1 / OT-I The volume of solid cancer was much smaller than that of intravenous cells, and the survival rate of mice was also very high. In addition, after 15 days of adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells (OVAp + α-GalCer) of the present invention, IFN-γ secretion ability of activated Thy1.1 / OT-I cells in the blood of mice was decreased. Appeared excellent.

본 발명에 따른 생체 외에서 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법은, 소량의 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체만으로 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 활성화시킴으로써, α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체에 직접 투여하 거나 항원제시세포(APC)를 로딩하여 투여하는 방법에 비해 우수하고 부작용을 최소화할 수 있다.The method for activating CD8 T cells in vitro according to the present invention is to activate an α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo by activating antigen-specific autologous CD8 T cells in vitro with only a small amount of α-GalCer or α-GalCer derivatives. Compared to direct administration or loading and presenting antigen presenting cells (APC), it is superior and can minimize side effects.

도 1은 본 발명에 따른 활성화된 항원 특이적 자가유래 CD8 T 세포의 제조 과정을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the preparation of activated antigen-specific autologous CD8 T cells according to the present invention.

도 2는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 PBMC의 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 개체비 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.Figure 2 is adopted by intravenous injection of activated Thy1.1 / OT-I cells in C57BL / 6 mice according to the invention and analyzed by FACS to change the population ratio of Thy1.1 positive CD8 T cells in CD8 T cells of PBMC Figure 1 shows the results.

도 3은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 CFSE로 처리하여 표지한 후, C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 3일 후 비장세포의 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 분열 정도를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 도이이다.FIG. 3 shows the activated Thy1.1 / OT-I cells treated with CFSE for labeling, followed by intravenous injection to C57BL / 6 mice for adoption and three days later, Thy1.1 in CD8 T cells of splenocytes. Fig. 8 shows the results of FACS analysis of the degree of division of positive CD8 T cells.

도 4는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 3일 후 비장세포의 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 IFN-γ와 TNF-α의 분비량 및 CD107a의 발현 정도(A,C), 및 IFN-γ와 TNF-α의 평균형광강도(mean fluorescence intensity, MFI)로 나타낸 그래프(B,D)이다.FIG. 4 shows IFN-γ of Thy1.1 positive CD8 T cells in splenocytes CD8 T cells after 3 days of adoptive transfer of activated Thy1.1 / OT-I cells intravenously into C57BL / 6 mice. And TNF-α secretion levels and CD107a expression levels (A, C) and IFN-γ and TNF-α mean fluorescence intensity (MFI).

도 5는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6일 후 비장세포의 CTL 기능을 분석한 도이다.FIG. 5 is a diagram illustrating the CTL function of splenocytes after 6 days of adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells to C57BL / 6 mice.

도 6은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 56일 후 비장세포에 남아있는 Thy1.1 양성/CD44 양성 세포의 FACS 분석결과(A) 및 PBMC의 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 개체 변화를 FACS로 분석한 결과(B)를 나타낸 도이다.FIG. 6 shows FACS analysis of Thy1.1 positive / CD44 positive cells remaining in splenocytes 56 days after adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells to C57BL / 6 mice. A) and (B) show the results of analyzing the individual change of Thy1.1 positive CD8 T cells among CD8 T cells of PBMC by FACS.

도 7은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달할 때 α-GalCer가 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 의해 전달되는지 여부와 수령 마우스의 NKT 세포의 필요성 여부를 분석한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 7 shows whether and receiving α-GalCer is delivered by activated Thy1.1 / OT-I cells upon adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells to C57BL / 6 mice according to the present invention. FIG. Figure shows the results of analyzing the necessity of NKT cells in the mouse.

도 8은 OVAp만으로 처리하여 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에 α-GalCer를 짧은 시간 동안 처리하거나, 또는 과량의 a-GalCer을 동시에 입양전달한 후 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 비율을 나타낸 도이다.FIG. 8 shows that Thy1.1-positive CD8 T cells in total CD8 T cells after treatment with OVAp alone for a short time or α-GalCer activation to Thy1.1 / OT-I cells activated by an excess of a-GalCer. Figure shows the percentage of cells.

도 9는 자극 시간을 다르게 하고 입양전달하기 직전의 본 발명의 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 CD44와 CD62L 발현 정도(A)와 이에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I의 혈액 내 개체비 변화(B)를 나타낸 도이다.Figure 9 shows the degree of CD44 and CD62L expression (A) of activated Thy1.1 / OT-I cells of the present invention immediately before adoptive delivery with different stimulation times and thus activated Thy1.1 / OT-I in blood. It is a figure which shows the individual ratio change (B).

도 10은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포에서 자극시간을 다르게하고 CD44, CD62L, CD25의 발현 정도를 나타낸 도이다.10 is a diagram showing the expression of CD44, CD62L, CD25 and different stimulation time in activated Thy1.1 / OT-I cells according to the present invention.

도 11은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 C57BL/6 마우스의 비장에서 지정된 시간에 비장세포를 얻어 CD3 양성, NK1.1 양성 세포(NKT 세포)의 비율을 확인한 도이다.Figure 11 adopts Thy1.1 / OT-I cells activated by intravenous injection into C57BL / 6 mice to adopt and transfer splenocytes at a specified time in the spleen of C57BL / 6 mice CD3-positive, NK1.1 positive It is a figure which confirmed the ratio of cells (NKT cell).

도 12는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6시간 후 비장세포에서 IFN-γ 분비 능력을 ELISPOT로 측정한 결과(A)와 NK 세포에서 IFN-γ 세포내 분석 결과(B)를 나타낸 도이다.FIG. 12 shows the result of measuring IFN-γ secretion ability in splenocytes by ELISPOT after 6 hours of adoptive delivery of activated Thy1.1 / OT-I cells to C57BL / 6 mice. IFN-γ intracellular assay result (B) in NK cells.

도 13은 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 6시간 후 비장세포에서 NKT 세포의 IL-2의 분비 능력을 ELISPOT로 측정한 결과를 나타낸 도이다.Figure 13 shows the adoption of activated Thy1.1 / OT-I cells by intravenous injection into C57BL / 6 mice for adoption and measuring the IL-2 secretion ability of NKT cells in splenocytes 6 hours after ELISPOT Is a diagram showing.

도 14는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥주사하여 입양전달하고 지정된 시간에 C57BL/6 마우스의 플라즈마를 얻어 혈액 속에 존재하는 IL-2, IFN-γ, IL-4의 농도를 ELISA를 통해 분석한 도이다.Figure 14 is adopted by the intravenous injection of activated Thy1.1 / OT-I cells in C57BL / 6 mice to obtain a plasma of the C57BL / 6 mice at a specified time, IL-2, IFN- The concentration of γ and IL-4 is analyzed by ELISA.

도 15는 본 발명에 따른 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포와 수지상 세포를 같이 입양전달한 C57BL/6 마우스의 비장세포에서 Thy1.1/OT-I 비율을 나타낸 도이다.15 is a diagram showing the ratio of Thy1.1 / OT-I in splenocytes of C57BL / 6 mice adopting and delivering activated Thy1.1 / OT-I cells and dendritic cells according to the present invention.

도 16은 생체 외의 자극 처리 단계에서 α-GalCer의 처리 유무 및 수령 마우스의 종류에 따른 입양전달 6일 후 수령 마우스 비장세포 중 전체 CD8 T 세포 중 Thy1.1 양성 CD8 T 세포의 비를 나타낸 도이다.FIG. 16 is a diagram showing the ratio of Thy1.1 positive CD8 T cells among total CD8 T cells among recipient mouse splenocytes after 6 days of adoptive delivery according to the treatment of α-GalCer and the type of recipient mouse in vitro stimulation treatment step. .

도 17은 고형암이 유도된 마우스에 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포를 정맥주사한 후 고형암의 부피(A)와 마우스의 생존율(B)을 측정한 결과, 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 입양전달 15일 후 마우스의 혈액 속에서 활성화된 Thy1.1/OT-I 세포의 IFN-γ 분비 능력을 FACS로 분석한 결과(C), 및 (C)의 1사분면(Thy1.1 + IFN-γ+)의 값을 수치화하여 나타낸 그래프(D)를 나타낸 도이다.Figure 17 shows the activated Thy1.1 / OT- as a result of measuring the volume of solid cancer (A) and the survival rate (B) of mice after intravenous injection of activated Thy1.1 / OT-I cells in the solid cancer induced mice The IFN-γ secretion ability of activated Thy1.1 / OT-I cells in the blood of mice 15 days after adoptive delivery of I cells was analyzed by FACS (C), and one quadrant of (C) (Thy1.1). + (D) is a graph showing the numerical value of + IFN-γ +).

Claims (9)

1) 개체의 생물학적 시료로부터 CD8 T 세포를 분리하는 단계,1) separating CD8 T cells from a biological sample of the subject, 2) 상기 분리된 CD8 T 세포와 항원제시세포(APC)를 혼합하는 단계,2) mixing the isolated CD8 T cells and antigen presenting cells (APC), 3) 상기 혼합된 세포를 항원과 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체로 처리하여 배양하는 단계, 및3) culturing the mixed cells by treating the antigen with an α-GalCer or α-GalCer derivative, and 4) 상기 배양된 세포로부터 활성화된 CD8 T 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법.4) A method for activating antigen-specific autologous CD8 T cells in vitro, comprising separating activated CD8 T cells from the cultured cells. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 림프절, 비장, 흉선 및 골수로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법.The method of claim 1, wherein the biological sample is at least one selected from the group consisting of blood, plasma, lymph nodes, spleen, thymus and bone marrow. 제 1항에 있어서, 상기 항원은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 지질다당류 및 DNA 분자(폴리 뉴클레오티드), 암세포 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법.The method of claim 1, wherein the antigen is in vitro, characterized in that one selected from the group consisting of proteins, recombinant proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins, lipopolysaccharides and DNA molecules (polynucleotides), cancer cells and viruses. Activation method of antigen specific autologous CD8 T cells. 제 1항에 있어서, 상기 α-GalCer 유도체는 OCH[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-N-tetracosanoyl-2-amino-1,3,4-nonanetriol], α-C-GalCer [(2S,3S,4R)-1-CH2-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1,3,4-octadecanetriol; α-C-galactosylceramide], 및 iGb3[isoglobo-galycoshpingolipid, C62H117NO18]로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 생체 외에서 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포의 활성화 방법.The method of claim 1, wherein the α-GalCer derivative is OCH [(2S, 3S, 4R) -1-O- (α-D-galactopyranosyl) -N-tetracosanoyl-2-amino-1,3,4-nonanetriol] , α-C-GalCer [(2S, 3S, 4R) -1-CH 2- (α-D-galactopyranosyl) -2- (N-hexacosanoylamino) -1,3,4-octadecanetriol; A method for activating antigen-specific autologous CD8 T cells in vitro, characterized in that it is one selected from the group consisting of α-C-galactosylceramide] and iGb3 [isoglobo-galycoshpingolipid, C 62 H 117 NO 18 ]. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 활성화된 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포.An antigen specific autologous CD8 T cell activated by the method of any one of claims 1-4. 제 5항의 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 생체내로 입양전달하여 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달하는 방법.A method of adopting and delivering the antigen-specific autologous CD8 T cells of claim 5 in vivo to deliver an α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo. 제 6항에 있어서, 상기 ＣＤ8 Ｔ 세포는 α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달하는 방법.The method of claim 6, wherein the CD8 T cells are bound to an α-GalCer or α-GalCer derivative, wherein the α-GalCer or α-GalCer derivative is delivered in vivo. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 α-GalCer 유도체는 OCH, α-C-GalCer 및 iGb3로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, α-GalCer 또는 α-GalCer 유도체를 생체내로 전달하는 방법.The method of claim 6 or 7, wherein the α-GalCer derivative is one selected from the group consisting of OCH, α-C-GalCer and iGb3, to deliver the α-GalCer or α-GalCer derivative in vivo. Way. 제 5항의 항원 특이적 자가유래 ＣＤ8 Ｔ 세포를 유효성분으로 함유하는 항종양 백신 조성물.An anti-tumor vaccine composition comprising the antigen-specific autologous CD8 T cells of claim 5 as an active ingredient.
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