KR20100013014A

KR20100013014A - 자기조립 블록 공중합체 박막상에 단백질 흡착이 향상된단백질 나노어레이의 제조방법 및 이에 따라 제조된 단백질나노어레이

Info

Publication number: KR20100013014A
Application number: KR1020080074493A
Authority: KR
Inventors: 김동하
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-30
Filing date: 2008-07-30
Publication date: 2010-02-09
Also published as: KR101018414B1

Abstract

본 발명은 자기조립 블록 공중합체 박막상에 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법 및 이에 따라 제조된 단백질 나노어레이에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 블록 공중합체의 자기조립 특성을 이용하여 나노어레이 형태의 템플레이트를 제조하되, 블록 공중합체의 두 고분자의 표면 경계면의 선밀도를 제어한 템플레이트를 제조하고, 상기 템플레이트 상에 선택적으로 단백질을 부착시키는 단계를 포함하는 패턴이 형성되고 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법 및 이에 따라 제조된 단백질 나노어레이에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법은 종래 단백질 고정화 방법을 개선하여 보다 간편하게 자기조립 블록 공중합체 상에 단백질을 선택적으로 흡착시킬 수 있게 하며, 상기 템플레이트 상에 블록 공중합체의 두 고분자의 표면 경계면의 선밀도를 제어함으로써 단백질의 흡착을 향상시켜 단백질 센서로서 향상된 효과를 제공할 수 있다.

자기조립 블록 공중합체, 단백질 나노어레이, 나노패턴, 단백질 칩, 나노칩, 바이오 센서, 표면 경계면 선밀도

Description

자기조립 블록 공중합체 박막상에 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법 및 이에 따라 제조된 단백질 나노어레이{The method for preparing patterned protein nanoarrays with enhanced protein adsorption on a self-assembled block copolymer thin film and the patterned protein nanoarrays thereby}

본 발명은 블록 공중합체 상의 나노패턴 표면과 단백질의 인력 제어를 이용하여 단백질 흡착을 향상시켜 효과적으로 단백질을 나노어레이하는 방법 및 이에 따라 제조된 단백질 나노어레이에 관한 것이다.

고효율의 핵산 분석용 고체 기반의 어레이(array)가 성공을 거둔 이후로 이와 유사한 프로테옴(proteome) 분석용 단백질 어레이가 주목을 받고 있다. 단백질 어레이를 바이오칩으로 이용하면, 생물의 생명현상에 대한 근본적 원리와 구조를 분석, 새로운 신약을 개발하거나 인간의 뇌의 정보처리 메카니즘을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 질병을 진단하고 예측할 수 있다. 또한 단백질 구조를 분석해 인공 유 전자를 개발하거나 지금까지는 처리할 수 없었던 다양한 목적과 기능을 가진 새로운 형태의 정보를 가공할 수 있는 바이오컴퓨터 개발은 물론 생물학적 전자부품에도 응용될 수 있다.

상기 단백질 어레이의 효율성을 높이기 위하여 단위 부피당 수집되는 정보의 양을 늘릴 필요가 있으며, 단백질은 핵산과 달리 증폭될 수 없기 때문에 단백질 나노어레이의 고집적화와 소형화가 요구된다.

단백질 마이크로어레이는 기판상에 폴리펩티드를 배열할 때 종래 광식각기술(photolithographics)을 대표로 하는 순차적인 기법(serial method) 위주로 이용해왔었다. 그러나 단백질 어레이는 DNA 어레이보다 소형화하거나 보다 감도를 좋게 하는 실질적인 포맷으로 집적화하거나 어레이하는 것이 쉽지 않다. 즉, DNA 올리고뉴클레오티드의 격자 패턴은 광식각 기술로 기질의 표면에 생성할 수 있으나, 수백 개 이상의 아미노산으로 구성된 단백질의 경우는, 항체가 일반적으로 약 1400 개의 아미노산을 가져야 하는 등, 질병의 정확한 진단을 위해서는 더욱더 고집적화된 고밀도의 격자패턴이 요구되나, 이를 실현하기는 쉽지 않다. 또 다른 문제점은 단백질은 쉽게 변성되는 단점이 있어서, 단백질 조작 시 많은 제한점이 있다.

이러한 문제들의 해결점은 단백질의 3차 구조를 잃지 않고 얼마나 높은 고해상도(high resolution)로 단백질을 배열하느냐에 달려 있는데, 현재까지는 잉크젯 프린팅(inkjet printing), 드롭-온-디멘드(drop-on-demand) 기술, 마이크로컨택트 프린팅(micro-contact printing, μCP), 딥펜(dip-pen), 이온 또는 전자빔 식각기술, 연성 식각기술(soft lithography) 등 다양한 접근 방법이 시도되고 있다. 하지만, 상기 방법 역시 대부분 수십 μm ~ 수 mm의 스페이싱(spacing) 크기를 갖고 있어, 마이크로 또는 서브마이크로 크기에서는 적용하기에 충분치 못한 단점이 있다. 또한, 상기 기술 중 일부 기술들은 나노크기의 패턴을 제조하는데 사용되기는 하였지만, 큰 면적의 패턴을 형성하는데 제한이 있었다.

이에 비하여 블록 공중합체(block copolymer; BCP)의 자기-조립(self-assembly) 특성을 이용하면 큰 면적의 나노구조를 형성할 수 있으며, 종래 기술보다 훨씬 간편하게 나노패턴을 형성할 수 있는 장점이 있다.

블록 공중합체(BCP)는 두 개 또는 그 이상의 고분자 사슬이 공유결합으로 연결된 형태로 두 블록 간의 공유결합 연결점의 제약으로 인해 각 블록을 각각의 도메인으로 상분리시키는 경향을 띠게 된다.

상기와 같은 블록 공중합체는 자발적인 상분리에 의하여 10 nm 에서 100 nm 정도의 크기를 갖는 나노구조를 형성할 수 있고, 이러한 나노구조의 형태와 크기는 블록 공중합체의 분자량, 각 블록의 부피비, 각 블록간의 Flory-Huggins 상호작용계수 등에 의하여 결정되며, 나아가 한 블록에만 선택적인 용매에 용해시키면 자발적으로 나노미터의 크기를 갖는 구형, 원통형 등의 미셀을 형성할 수 있다.

상기와 같은 블록 공중합체의 자기-조립 특성을 이용하면 블록 공중합체의 나노구조 내에서 입자의 크기는 별도의 처리가 없어도 나노미터 크기로 제한될 수 있으며, 그 입자의 어레이 또한 나노구조에 크기와 간격에 의하여 제한되어 입자의 크기와 어레이를 조절가능하다.

종래 블록 공중합체를 이용한 다양한 나노어레이 템플레이트가 보고된 바 있다(M. J. Fasolka, A. M. Mayes, Annu. Rev. Mater. Res. 2001, 31, 323-355; I.W. Hamley, Nanotechnology 2003, R39; M. Lazzari, M. A. Lopez-Quintela, Adv. Mater. 2003, 15, 1583-1594; R. A. Segalman, Mater. Sci. Eng. R 2005, 48, 191-226; T. Thurn-Albrecht, J. Schotter, G. A. Kastle, N. Emley, T. Shibauchi, L. Krusin-Elbaum, K. Guarini, C. T. Black , M. T. Tuominen, t. P. Russel, Science 2000, 290, 2126-2129; X. Li, K. H. A. Lau, D. H. Kim, W. Knoll, Langmuir 2005, 21, 5212-5217).

단백질 나노어레이의 패턴형성을 위해서는 나노패턴화된 고분자 나노어레이 템플레이트 표면에 단백질을 원하는 패턴으로 고정화한 후 단백질 활성을 유지하는 것이 중요하다. 이를 위하여는 나노패턴화된 고분자 박막 표면과 단백질의 상호작용 조절이 매우 중요하다.

일반적으로 단백질을 나노패턴화된 고분자 박막 표면에 고정화하는 방법으로 적절한 연결 분자(linker molecule)와 화학적 공유 결합을 통해 고정화하는 방법이 사용되어 왔다. 하지만, 화학적 공유 결합은 단계가 복잡하고, 효율이 떨어져서 표면 단백질 밀도와 단백질 활성을 제한하는 문제점이 있었다. 반면에 물리적 흡착에 의한 단백질 고정화 방법은 단백질의 변성을 일으킬 가능성이 있고, 표면상에 단백 질이 무작위 방향으로 부착되어 단백질 활성이 낮은 단점이 있다. 그럼에도 불구하고, 방법이 간단하여 상당히 많이 적용되고 있다.

이와 관련된 종래 등록 특허기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허 10-0532812호에서는 기질-금속 박막-블록 공중합체로 구성된 구조물을 에칭하여 노출된 금속에 바이오 리셉터를 부착하는 블록 공중합체의 나노패턴을 이용한 나노-바이오칩의 제조방법이 기재되어 있다. 이는 바이오 리셉터와 친화력이 있는 금속에 단백질 등을 부착시키는 것으로 금속과 단백질의 부착력이 약하며, 공정이 복잡한 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 단백질이 보다 정확하게 나노패턴으로 부착되고 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이를 제조하기 위하여 각고의 노력을 거듭한 결과, 자기조립 공중합체 템플레이트 박막 상에서 단백질-표면 상호작용을 조절할 수 있는 방법을 알아내고, 표면상에 선택적으로 단백질을 부착시켜 패턴이 형성된 단백질 나노어레이를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 보다 간편하게 패턴이 형성되고 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이를 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 단백질 나노어레이를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 블록 공중합체의 자기조립 특성을 이용하여 나노어레이 형태의 템플레이트를 제조하되, 블록 공중합체의 두 고분자의 표면 경계면의 선밀도를 제어한 템플레이트를 제조하고, 상기 템플레이트 상에 선택적으로 단백질을 부착시키는 단계를 포함하는 패턴이 형성되고 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 단백질 나노어레이를 제공한다.

본 발명에 따른 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법은 종래 단백질 고정화 방법을 개선하여 보다 간편하게 자기조립 블록 공중합체 상에 단백질을 선택적으로 흡착시킬 수 있게 하며, 상기 템플레이트 상에 블록 공중합체의 두 고분자의 표면 경계면의 선밀도를 제어함으로써 단백질의 흡착을 향상시켜 단백질 센서로서 향상된 효과를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기판 상에 용매에 용해시킨 랜덤 공중합체를 스핀코팅하여 중성 표면층을 형성하는 단계(단계 1); 상기 중성 표면층 위에 용매에 용해시킨 블록 공중합체를 분자량을 제어하여 스핀코팅하여 도포하는 단계(단계 2); 상기 블록 공중합체를 열처리하여 자기조립을 유도하고 규칙적인 구조를 형성하되, 블록 공중합체의 패턴 윤곽을 그리는 고분자 표면 경계면의 선밀도를 제어한 템플레이트로 제조하는 단계(단계 3); 상기 템플레이트를 단백질 용액에 침지하여 단백질이 흡착된 단백질 나노어레이를 제조하는 단계(단계 4); 및 상기 단백질 나노어레이를 세척하여 나노패턴을 형성시키는 단계(단계 5)를 포함하는 패턴이 형성되고 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명에 따른 상기 단계 1은 기판 상에 중성 표면층을 도포하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 기판은 단백질 나노어레이를 지지하기 위한 것으로, 폴리싱된 실리콘 기판 또는 유리기판을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상 DNA 센서, 나노칩 등에 사용되는 기판을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 중성 표면층은 블록 공중합체 나노 도메인의 배향을 임의의 기판에 수직인 방향으로 유도하기 위해 필요한 것으로서 폴리스티렌-폴리메틸메타크릴레이트 블록공중합체에 대하여 열역학적으로 중성인 랜덤 공중합체를 기판 상에 도포한다. 이때, 상기 랜덤 공중합체의 도포 방법으로는 자기조립 단분자막, 자외선-오존 조사법 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 랜덤 공중합체로는 폴리스티렌-폴리벤조사이클로부텐-폴리메틸메타크릴레이트[P(S-r-BCB-r-MMA)], 폴리스티렌-폴리메틸메타크릴레이트 랜덤공중합체 등을 들 수 있으며, 벤젠 등에 용해시켜 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

다음으로, 본 발명에 따른 단계 2는 단계 1의 중성 표면층에 용매에 용해시킨 블록 공중합체를 스핀 코팅하여 도포하는 단계이다.

상기 블록 공중합체는 두 가지 이상의 고분자가 합성될 때 공유결합으로 연결된 고분자 조합체를 의미한다. 이 물질은 같은 종류끼리 모이려는 자기-조립(self-assembly) 성질을 지니고 있고 그 결과 다양한 모양의 나노 패턴을 만들 수 있으므로 자기-조립 공중합체로도 불린다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 블록 공중합체로는 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트(PS-b-PMMA)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는 다.

상기 블록 공중합체는 이중블록 공중합체로서 양쪽 블록에 모두 친화성이 있는 용매에 용해시킨다. 이때, 용매는 벤젠을 사용하여 제조하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 용매에 용해되는 공중합체의 비율은 0.5 내지 2 중량%인 것이 바람직하다. 상기 블록 공중합체가 0.5 중량% 미만이거나 2 중량 %를 초과하면 나노 도메인의 배향이 정렬되지 않아 나노 패턴이 형성되지 않는 문제가 있다.

상기 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트 이중블록 공중합체(PS-b-PMMA)에서 폴리스티렌 블록과 폴리메틸메타크릴레이트 블록간의 부피비는 2.5:7.5 ~ 7.5:2.5 범위 내에서는 제한이 없다. 상기 범위를 벗어나면 구형 도메인이 얻어지고 그 경우 표면에서 패턴이 관찰되지 않는 문제가 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 블록 공중합체는 단백질 흡착이 향상되도록 분자량(M_n)을 제어할 수 있으며, 35 ~ 1,725 kg/mol 범위의 분자량을 사용하여 제조가능하며, 42 ~ 205 kg/mol 범위의 분자량을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

다음으로, 본 발명에 따른 단계 3은 블록 공중합체를 열처리하여 자기조립을 유도하고 규칙적인 구조를 형성한 템플레이트로 제조하는 단계이다.

상기 단계는 단계 2에서 스핀코팅된 블록 공중합체를 유리전이온도(glass transition temperature, T_g) 이상으로 온도를 올린 후에 서냉하여 자기조립을 유도 하는 단계로서, 160 ~ 180 ℃의 진공상태에서 2 ~ 3일 동안 방치하여 자기조립을 유도할 수 있다.

이때, 상기 블록 공중합체상에서 패턴 윤곽을 그리는 고분자 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)를 8 ~ 84 ㎛/㎛²로 제어하는 것이 바람직하다. 상기 블록 공중합체로서 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트 이중블록 공중합체(PS-b-PMMA)를 사용하여 PS와 PMMA의 분자량을 변화시키면서 PS와 PMMA의 표면 경계면의 선밀도를 변화시킴에 따라 단백질 IgG의 흡착량을 측정한 결과, PS와 PMMA의 표면 경계면의 선밀도가 증가함에 따라 경계면의 IgG의 흡착량이 증가하는 것으로 나타났다(도 4 참조). 따라서, 상기 블록 공중합체상의 고분자 표면 경계면의 선밀도를 크게 하는 것이 바람직하다. 그러나 상기 표면 경계면의 선밀도가 너무 커지면 블록 공중합체의 두 고분자 사이의 배향 폭이 너무 짧아 단백질 흡착의 선택성이 낮아지므로 효과적인 패턴을 형성하면서 단백질 흡착을 향상시키기 위하여 상기 표면 경계면의 선밀도는 5 ~ 100 ㎛/㎛²로 제어하는 것이 바람직하며, 8 ~ 84 ㎛/㎛²로 제어하는 것이 더욱 바람직하다.

다음으로, 본 발명에 따른 단계 4는 단계 3에서 형성된 템플레이트에 단백질을 부착시키는 단계로서, 템플레이트를 일정한 농도의 단백질 용액에 침지시킴으로서 물리적으로 단백질이 흡착되도록 한다.

상기 단백질은 표적 생체분자, 예를 들면 단백질, 핵산, 항체, 효소, 탄수화 물, 지질 또는 기타 생체 유래의 생물분자와 반응하거나 결합할 수 있는 바이오 리셉터 역할을 하는 것으로서, 표적 생체분자와 특이적 결합을 수행할 수 있는 관능화(functionalization)된 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 면역글로불린G(IgG), 바이오티닐화된 면역글로불린G(Biotinylated IgG) 또는 소혈청알부민(BSA)일 수 있다.

최적의 패턴 형성을 위해서는, 침지시키는 단백질 농도와 침지시간이 중요한데, 본 발명에서는 바람직하게는 10 ~ 20 μg/mL의 단백질 용액에 8 내지 18분간 자기조립이 유도된 템플레이트를 침지시켜 최적의 패턴을 형성시킬 수 있다. 상기와 같이 단백질 흡착시간과 용액 내 단백질의 농도를 조절함으로써 perfect template registration에 대하여 % deviation이 40% 이하가 되도록 조절할 수 있다.

마지막으로, 본 발명에 따른 단계 5는 단백질이 부착된 템플레이트를 세척하는 단계로서, 흐르는 물 또는 인산완충용액(PBS)를 이용하여 세척하거나, 단백질 용액을 희석해가면서 세척할 수 있다.

또한, 본 발명은 자기조립이 형성된 블록 공중합체 템플레이트 중 상기 템플레이트를 구성하는 일부 영역에 배타적으로 단백질이 부착된 패턴이 형성되며, 고분자 표면 경계면의 선밀도를 제어함으로써 단백질 흡착이 향상된 것을 특징으로 하는 단백질 나노어레이를 제공한다.

일례로, 본 발명에서 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트 공중합체(PS-b-PMMA) 템플레이트에 IgG 단백질을 부착시키는 경우, 상기 IgG는 선택적으로 소수성 PS 영역에만 흡착되며, 이때 PS와 PMMA 사이의 표면 경계면의 선밀도를 제어함으로써 경계면에 IgG의 흡착이 향상된다. 구체적으로 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트(PS-b-PMMA)를 이용한 자기조립의 결과 형성된 템플레이트에 대하여, 고분자의 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)를 증가시킴에 따라 단백질 흡착정도가 선형으로 증가하게 된다(도 4 참조). 따라서, 본 발명에 따른 단백질 나노어레이는 단백질의 흡착이 향상되어 단백질 센서로서 향상된 효과를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 등에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 블록 공중합체 템플레이트를 이용한 단백질 나노어레이의 제조

기판( substrate )의 준비

실리콘 기판은 폴리싱된(polished) 실리콘 기판(substrate)(522 mm 두께)을 시-맷(Si-Mat; Landsberg, Germany)사에서 구입하여 사용하였다.

유리 기판은 열증착(thermal evaporation; Autolab 306, BOC Edwards, UK)에 의해 2 nm의 크롬 접착층(adhesion layer)을 갖는 45 nm의 금으로 코팅된 폴리싱된 LaSFN9 고굴절율 유리 기판을 Hellma Optik GmbH(Jena, Germany)사에서 구입하여 사용하였다.

단계 1: 중성 표면층의 제조

상기 준비한 유리 기판 위에 수 평균 분자량(Mn; number average molecular weight)이 25 kg/mol이고, 다분산성(polydiversity)이 1.18인 스티렌, 반응성 벤조사이클로부텐(BCB) 및 메틸 메타크릴레이트로 이루어진 가교성 랜덤 공중합체(random copolymer)(P(S-r-BCB-r-MMA))를 스핀코팅하여 표면 에너지가 중성인 표면층을 도포하였다. 폴리스티렌/폴리벤조사이클로부텐/폴리메틸 메타크릴레이트의 비율은 55/3/42로 조정하였다. 제조방법은 하기와 같이 활성 프리-라디칼 중합(living free radical polymerization)에 의하여 제조하였다.

먼저, P(S-r-BCB-r-MMA)을 벤젠에 0.3 중량%로 용해시킨 후, 유리 기판에 적하시키고, 3000 rpm에서 60초 동안 스핀코팅하였다. 그 후, 상기 스핀코팅된 층의 열가교를 위해 220 ℃의 진공 상태하에서 하룻밤 동안 방치하여 어닐(anneal)시키고, 톨루엔으로 세척하여 랜덤 공중합체 중성 표면층을 제조하였다. 상기 제조된 중성 표면층의 두께를 표면 프로파일러(모델 P-10, KLA Tencor, USA)를 이용하여 측정한 결과, 약 10 nm였다.

단계 2: 자기-조립 블록 공중합체 템플레이트의 제조

상기 단계 1에서 제조한 중성 표면층 위에 자기-조립 블록 공중합체 템플레이트를 제조하였다.

총 분자량(M_n)이 104 kg/mol이고, 폴리스티렌:폴리메틸 메타크릴레이트 부피비가 35:65인 폴리스티렌-블록-폴리메틸 메타크릴레이트(PS-b-PMMA)를 톨루엔에 1% 농도로 용해시킨 후 단계 1에서 제조한 중성 표면층 위에 3000 rpm으로 스핀코팅하였다. 그리고 나서, 상기 스핀코팅된 층을 180 ℃의 진공 상태하에서 2일간 보존하여 열처리시켰다. 상기 열처리된 자기-조립 블록 공중합체 템플레이트는 에탄올로 세척하여 보관하였고, 사용시 탈이온수로 재세척하여 사용하였다.

상기 제조된 자기-조립 블록 공중합체 템플레이트를 도 1F에 나타내었다. PS 영역은 어두운 영역으로 6각형으로 배열된 원형이며, PMMA에 의해 둘러싸여 있고, 평균 중심간 반복주기(repeat period)는 약 50 nm였다. 또한, 표면 경계면의 선밀도는 48 ㎛/㎛² 이었다.

단계 3: 단백질 나노어레이의 제조

상기 단계 2에서 제조된 블록 공중합체 템플레이트 위에 단백질을 흡착시켜 단백질 나노어레이(nanoarray)을 제조하였다.

면역글로불린-G(IgG)를 인산완충식염수(PBS; pH 7.4)에 17 ㎍/mL의 농도로 용해시켜 단백질 용액을 제조한 후 상기 단계 2에서 제조된 블록 공중합체 템플레이트를 4분간 침지시켜 IgG 단백질을 흡착시켰다. 상기 단백질이 흡착된 나노어레이에 인산완충식염수(PBS) 또는 탈이온수를 10초 이내로 흘려주어 세척하였다.

실험예 1: 블록 공중합체 분자량에 따른 나노 패턴 특성 분석

블록 공중합체 분자량에 따른 본 발명의 블록 공중합체 단백질 나노어레이의 특성을 알아보기 위하여 총 분자량(M_n)이 각각 42, 71, 72, 104, 205 및 1725 kg/mol인 PS-b-PMMA를 대상으로 AFM을 측정하였다. PS와 PMMA 비율은 1:1의 부피비로 하였다.

측정결과는 도 1A 내지 도 1F에 나타내었다. 이때, 도 1A는 42 kg/mol, 도 1B는 72 kg/mol, 도 1C는 205 kg/mol, 도 1D는 1725 kg/mol, 도 1E는 71 kg/mol, 도 1F는 104 kg/mol인 PS-b-PMMA의 AFM 영상을 나타낸다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 도 1A ~ 1D는 주름진 선의 형태로, 도 1E ~ 1F는 육각형의 형태로 패턴이 나타났으며, PS-b-PMMA의 분자량이 증가할수록 PS 영역 라인 폭(d _PS)이 13 ~ 200 nm으로 증가하며, 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)는 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 2: 단백질의 흡착 동역학 측정

IgG는 많은 고분자 표면에 흡착하며, 일반적으로 PMMA보다 PS에 흡착되는 단백질의 양이 많다고 알려져 있다. 본 실험에서는 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance, SPR) 분광기(spectrophotometer)를 이용하여 실시간(in situ) IgG 흡착 동역학(adsorption kinetics)을 측정하였다. 상기 SPR은 단백질 흡착의 결과 증가된 표면상의 광학적 밀도를 측정함으로써 단백질 층 두께를 측정하게 된 다. 상기 실험을 위하여 45 nm의 금으로 코팅된 유리 기판 위에 실험군으로 도 1F의 PS-b-PMMA가 코팅된 막을 사용하였으며, 비교군으로서 순수한 PS 및 PMMA가 코팅된 막을 사용하였다.

상기 실험군과 비교군의 나노패턴 표면에 인산완충식염수(PBS)에 용해시킨 17 ㎍/ml의 IgG을 흘려주면서 IgG의 흡착정도를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, IgG는 PMMA보다 PS에 흡착되는 것을 더 선호한다는 것을 알 수 있다. 또한, PS-b-PMMA인 경우에는, IgG가 단독 PS와 PMMA일 경우의 평균 무게 표면비에 해당하는 흡착률을 나타낼 것으로 예상했으나, 측정 결과 그보다 더 높은 흡착률을 나타내었다.

다음으로, 두 종류의 IgG(MxG 및 GxR)에 대하여 도 1A ~ 1F의 PS-b-PMMA에 180분 동안 흡착시킨 후, 고분자의 평균 중심간 반복주기(λ_C-C)에 대하여 단백질의 흡착정도를 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 고분자의 평균 중심간 반복주기(λ_C-C)가 증가할 수록 단백질의 흡착정도가 감소되나, 특별한 상관관계를 나타내지는 않는 것으로 나타났다.

다음으로, 두 종류의 IgG(MxG 및 GxR)에 대하여 도 1A～1F의 PS-b-PMMA에 180분 동안 흡착시킨 후, 고분자의 표면 경계면의 선밀도(l _interf _.)에 대하여 단백질의 흡착정도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 고분자의 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)가 증가할수록 단백질의 흡착정도가 선형으로 증가되는 것으로 나타났다. 이로부터 단백질의 흡착정도를 결정짓는 중요한 변수는 경계면의 선밀도인 것을 알 수 있다.

그러므로, 단백질의 나노어레이시 템플레이트가 되는 블록 공중합체를 열처리하여 자기조립을 유도하고 규칙적인 구조를 형성할 때, 패턴 윤곽을 그리는 고분자 표면 경계면의 선밀도(l _interf _.)를 제어함으로써 단백질의 흡착을 향상시킬 수 있으며, 이를 이용하여 효과적인 단백질 활성을 나타내는 단백질 센서를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 PS-b-PMMA 블록 공중합체를 도포한 후 자기조립을 유도하고 규칙적인 나노 구조를 갖게 된 템플레이트의 구조를 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PS, PMMA, PS-b-PMMA 블록 공중합체의 단백질 흡착률을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PS-b-PMMA 블록 공중합체의 고분자의 평균 중심간 반복주기(λ_C-C)에 대한 단백질 흡착률을 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PS-b-PMMA 블록 공중합체의 고분자의 표면 경계면의 선밀도(l _interf _.)에 대한 단백질 흡착률을 나타내는 그래프이다.

Claims

기판 상에 용매에 용해시킨 랜덤 공중합체를 스핀코팅하여 중성 표면층을 형성하는 단계(단계 1);

상기 중성 표면층 위에 용매에 용해시킨 블록 공중합체를 단백질 흡착이 향상되도록 블록 공중합체의 분자량(M_n)을 35 ~ 1,725 kg/mol로 제어하여 스핀코팅하여 도포하는 단계(단계 2);

상기 블록 공중합체를 열처리하여 자기조립을 유도하고 규칙적인 구조를 형성하되, 패턴 윤곽을 그리는 고분자 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)를 8 ~ 84 ㎛/㎛²로 제어한 템플레이트로 제조하는 단계(단계 3);

상기 템플레이트를 단백질 용액에 침지하여 단백질이 흡착된 단백질 나노어레이를 제조하는 단계(단계 4); 및

상기 단백질 나노어레이를 세척하여 나노패턴을 형성시키는 단계(단계 5)를 포함하여 이루어지는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1의 랜덤 공중합체는 폴리스티렌-폴리벤조사이클로부텐-폴리메틸메타크릴레이트[P(S-r-BCB-r-MMA)] 또는 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트 랜덤 공중합체인 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2의 블록 공중합체는 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트는 폴리스티렌:폴리메틸메타크릴레이트 부피비가 2.5:7.5 ~ 7.5:2.5의 범위인 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3은 사용한 블록 공중합체의 유리전이온도 이상으로 온도를 올린 후에 서냉하는 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4의 단백질은 표적 특이적 결합을 수행할 수 있는 관능화(functionalization)된 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상 된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 4의 단백질 흡착은 perfect template registration에 대하여 % deviation이 40% 이하가 되도록 흡착 시간과 용액 내 단백질의 농도를 조절하는 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 5는 흐르는 물 또는 인산완충용액(PBS)에 단백질 나노어레이를 세척하여 나노패턴을 형성시키는 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이의 제조방법.
폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트(PS-b-PMMA)를 이용한 자기조립이 형성된 템플레이트 중 상기 템플레이트를 구성하는 폴리스티렌(PS) 영역에 배타적으로 단백질이 부착되어 패턴이 형성된 것을 특징으로 하는 제1항의 방법에 의해 제조되는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이.
제9항에 있어서, 상기 단백질 나노어레이는 폴리스티렌-블록-폴리메틸메타크릴레이트(PS-b-PMMA)를 이용한 자기조립의 결과 형성된 템플레이트에 대하여, 고분자의 표면 경계면의 선밀도(l _interf.)를 증가시킴에 따라 단백질 흡착정도가 선형으로 증가하는 것을 특징으로 하는 단백질 흡착이 향상된 단백질 나노어레이.