KR20100012852A - 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 - Google Patents

대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암에 특이적인 진단 마커에 관한 것이다. 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 대장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
Figure P1020090127240
대장암, 진단 마커

Description

대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커{Colon cancer diagnostic markers using up-regulated genes}
본 발명은 대장암에 특이적인 진단 마커를 선별하고, 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 대장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
대장은 입으로 섭취된 음식물의 소화, 흡수가 이루어지는 곳이며, 잉여 음식물이 머무르는 곳이기도 하다. 또한, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변이 만들어 지고, 이와 더불어 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 사람의 경우, 대장의 길이는 약 2m정도이고, 결장과 직장, 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이다.
현재 우리나라에서 대장암 발생율은 매우 현저하게 증가하고 있다. 대장암 에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 네번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조사되어 지고 있다. 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다. 우리나라는 유럽이나 미국과 비교했을 때, 발생 연령이 10살 정도 어린 경향이 있다. 5%-10%의 빈도로 30대의 젊은 사람에게서도 발생하며, 이처럼 젊은 층에서 나타나는 대장암은 가족 사이에서 많이 발생하는 경향이 있기도 하다. 대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5%전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다. 이를 종합해보면, 대장암에 걸리기 쉬운 위험인자로서는 1) 대장용종에 걸린 경험이 있는 경우, 2) 가족력이 있는 경우, 3) 장기간 궤양성대장염에 시달리고 있는 경우, 4) 고치기 어려운 치루에 걸린 경우 등이 있다.
대장암에는 Dukes분류법과 UICC의 stage 분류법이 대표적이다. 그 기준은 암의 크기에 의해서가 아니라, 대장벽 속으로 암이 들어간 깊이 및 원격전이의 유무에 따라 진행도가 규정되어 있다. 하기의 표 1 및 2는 각각 Dukes분류법 및 stage 분류법의 구분기준을 설명한 것이다.
Dukes분류법의 특징
명칭 수술 후 5년 생존률 병리적 양상
Dukes A 90%이상 암이 대장벽 내에 머물러 있는 것
Dukes B 60~80% 암이 대장벽을 뚫었지만 림프절전이가 일어나 지 않은 것
Dukes C 20~50% 림프절전이가 일어난 것
Dukes D 20%이하 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것
stage분류법의 특징
명칭 병리적 양상
0기 암이 점막에 머물러 있는 것
1기 암이 대장벽에 머물러 있는 것
2기 암이 대장벽을 넘어섰지만 인접장기까지 미치지 않은 것
3기 암이 인접장기에 침윤하거나 림프절전이가 일어난 것
4기 복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것
두 가지의 분류 방식에는 아주 작은 차이가 있을 뿐이기 때문에, Dukes A는 0기,1기에, Dukes B는 2기에, Dukes C는 3기에, Dukes D는 4기에 해당하는 것이라고 현재 통용되고 있으며, 특히 Dukes분류는 국제적으로 널리 쓰이고 있는 방법이다.
대장암은 조기발견시 내시경 적절제나 외과요법에 의해 완전히 치유될 수 있으며, 진행되어 간이나 폐로 전이 (원격전이)되었더라도 수술이 가능한 시기라면 외과요법에 의한 완치를 기대할 수 있다. 다시 말하자면, 현재의 치료법 중에서는 외과요법이 가장 효과적이라 하겠다. 그러나 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 상기의 경우처럼 외과요법을 사용할 수 없기 때문에, 궁극적으로는 대장암의 효과적인 치료를 위해서는 조기 진단 및 치료가 필수적이라 하겠다.
외과적 요법으로서 수술을 받은 이후에는 재발하는 경우가 종종 있으므로, 수술 후에는 3-4개월 간격으로 재발유무를 점검하기 위한 정기검사를 받아야 한다. 신체 내의 장기들 중에서 간, 폐, 복막 등이 재발하기 쉬운 장기이며, 또 절제한 부위에서 국소적으로 재발하기도 한다. 대장암은 다른 암과 비교할 때 빠른 시기에 재발이 발견되며, 재발한 병소를 절제하여 완전히 치료할 수도 있다. 재발의 80%이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 된다.
대장암은 조기인 경우라면 거의 100%가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것은 매우 어려우므로, 주기적인 검사가 선행 되어야 한다. 대장암의 선별검사(screening)로서 대표적인 것은 잠혈 검사이나, 이 검사에서 양성반응이 나왔다고 해서 대장암에 걸렸다는 것은 아니며, 또 역으로 음성반응이라고 해서 대장암에 걸리지 않았다라고 말할 수 있는 것도 아니어서 정확한 진단용도로 사용되기에는 무리가 있다. 따라서 현재 사용되고 있는 유효한 결과를 보장하는 대장암 검사법은 아래 표 3과 같다.
대장암 검사법
검사명 검사방법 및 특징
대장조영검사 식사 제한 후에 장기를 충분히 비운 후 항문으로부터 바륨과 공기를 주입하여 X-ray 사진을 찍어 장의 모양을 검사
대장내시경 S-결장까지를 관찰하는 짧은 내시경과, 맹장까지 모든 대장을 관찰할 수 있는 긴 내시경이 있음 검사와 동시 바로 용종을 절제할 수도 있음
종양표지자 혈액 검사를 통해 신체 어딘가에 숨어 있는 암을 진단해내는 방법 그러나 현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 종양 표지자는 아직 없음 CEA라고 불리는 표지자가 일반적이지만, 대장암이 있어도 약 반수가 양성을 나타낼 뿐임 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용
방사선 진단 (CT, MRI, 초음파 등) 원발 병소의 진전 정도와 간으로의 원격전이 여부를 알아보기 위해 사용
현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 대장암 특유의 종양 표지자는 아직 밝혀진 바 없다. 물론, CEA라고 불리는 표지자가 있으나, 상기의 표 3에서도 언급한 바와 같이 대장암에 있어서 약 반수가 양성을 나타낼 뿐이므로, 주로 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용되고 있을 뿐, 초기의 진단을 위한 표지자로 사용하기에는 다소 무리가 있다.
이에 본 발명자들은 대장암과 관련이 있다고 예상되는 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 제작하여 대장암은 물론 위암, 유방암, 전립선암, 간암 등에서의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과, 대장암 조직에서만 특이적으로 과발현되는 유전자들을 선별할 수 있었고, 이러한 대장암 진단마커로서의 가능성 있는 유전자들을 최종 선별하고, 이들을 통하여 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 KLK6(kallikrein-related peptidase 6), CKS2 (CDC28 protein kinase regulatory subunit 2), IFITM1(Interferon induced transmembrane protein 1), SPP1(secreted phosphoprotein 1), DPEP1(dipeptidase 1), CST1(cystatin 1), CDH3(cadherin 3), ANLN(anillin), CXCL1(Chemokine (C-X-C motif) ligand 1), MELK(maternal embryonic leucine zipper kinase), CDCA1(NUF2; NDC80 kinetochore complex component), CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1), CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6), MMP1 (Matrix metallopeptidase), LCN2(Lipocalin 2), HS6ST2(Heparan sulfate 6-0-sulfotransferase 2), EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 및 CA9 (Carbonic anhydrase IX) 중에서 선택되는 1개 이상의 대장암 진단 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 또하나의 목적은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6 및 CA9 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기한 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 대장암 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1개 이상의 대장암 진단 마커에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어, “대장암(colon cancer)”은 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암으로, 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭한 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고 당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 대장암 진단 마커는 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 또는 CA9으로, 대장암 세포에서 발현이 증가하는 유전자들이다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 대장암 진단 마커는, 대장암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
이 때, 정상 대장 상피 세포와 대장암 세포에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자들은 제외하고, 예를 들어 대조군으로 사용한 정상 조직에서 발현되는 유전자들에 비해 대장암 조직에서 발현이 2-9배 이상으로 증가되는 유전자들을 선별하였다.
또다른 양태로서, 본 발명은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.
생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 대장암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로 니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1 이상의 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 대장암 진단 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 대장암 진단 마커 검출용 조성물은, KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1 이상의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, 염기서열 목록의 서열번호 1 내지 36으로 표시되는 프라이머들이다.
또다른 양태로서, 본 발명은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 대장암 진단 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 대장암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 대장암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 대장암 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또다른 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물 또는 상기 대장암 진단 키트를 이용한 대장암 진단 방법을 제공한다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.
생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 대장암 발병에 의해 대장암 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 대장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 대장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 대장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다(도 8~11). 한편, DNA 칩은 상기 대장암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 KLK6, CKS2, IFITM1, SPP1, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, LCN2, HS6ST2, EGFL6, 및 CA9 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단 방법을 제공한다.
생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 대장암 마커 단백질과 이에 특이 적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ , [RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않 는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다(도 12).
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역 조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장 상피 조직 및 대장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지여부를 판독한다(도 13~17).
본 발명은 대장암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 대장암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다.
또한, 상기 대장암 진단 마커들은 대장암 특이적 항암제 개발연구에 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. DNA 칩을 이용한 대장암 과발현 유전자 발굴
정상 대장 상피세포에 비하여 대장암 세포에서만 특이적으로 과발현하는 유전자를 1차적으로 추출하고자 DNA 칩(48K 인간 마이크로어레이, Illumina사)을 이용하여 2,230개의 유전자에 대하여 그 발현도를 조사하였다.
우선, 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 total RNA를 추출하였다. total RNA의 추출은 RNeasy Mini Kit (QIAGEN사)를 이용하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 하이브리드화를 위해 상기 추출된 total RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하였다. T7 Oligo(dT) primer를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro transcription을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System Wash Buffer (Illumina사)를 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 ‘quantile’ 기능을 이용하여 보정하였다.
상기의 과정으로 얻어진 1,601개의 유전자 발현 정도 분석을 통하여 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때 군집화 분석(hierarchical clustering analysis)를 이용하였으며, 그 결과, 정상 대장 상 피세포와 대장암 세포는 크게 두 개의 군집으로 나누어지는 것을 알 수 있었다(도 1).
또한, 정상 및 대장 상피세포와 비교하여 60% 이상의 환자에서 2배 이상의 발현차이를 나타내는 유전자들을 발견할 수 있었는데(표 4), 이중 과발현과 저발현이 각각 281개 및 605개였으며, 위암, 유방암, 췌장암에서도 동일한 유전자들의 발현을 비교한 결과(도7) 대장암에서만 특이적으로 발현되는 유전자들을 최종 선발할 수 있었다. (도 3~6).
대장암에서 과발현된 유전자들
Gene symbol Unigene Cluster Log2(FC) P value
MMP7 Hs .2256 9.268 7.74E-08
CST1 Hs .123114 7.686 6.19E-04
CDH3 Hs .461074 5.874 0.025
CLDN1 Hs .439060 5.748 2.29E-05
ESM1 Hs .129944 5.701 0.022
DPEP1 Hs .109 5.379 0.002
CLDN2 Hs .522746 5.262 2.14E-06
HS6ST2 Hs .385956 4.201 1.47E-06
ABHD7 Hs .201555 3.743 4.05E-08
SLC35D3 Hs .369703 3.692 0.004
CXCL1 Hs .789 3.624 3.84E-09
CDCA1 - 1.76 5.37e-06
CA9 Hs .63287 3.47 0.001
VSNL1 Hs .444212 3.159 3.28E-04
MMP1 Hs .83169 3.116 0.032
ANLN Hs .62180 3.091 0.021
LCN2 Hs .204238 3.059 0.001
TPX2 Hs .244580 3.029 0.035
EGFL6 Hs .12844 2.974 0.009
LGR5 Hs .658889 2.899 6.75E-07
KLK6 Hs .79361 2.842 1.68E-05
COMP Hs .1584 2.818 2.98E-06
NLF1 Hs .202656 2.799 3.92E-06
MAD2L1 Hs .591697 2.787 0.002
PROX1 Hs .585369 2.731 1.46E-09
CKS2 Hs .83758 2.522 0.001
MELK Hs .184339 2.517 0.003
HCAP -G - 2.509 0.045
OLR1 Hs .412484 2.503 0.002
ATAD2 Hs .370834 2.467 0.005
PROSAPIP1 Hs .90232 2.35 1.53E-07
SOX9 Hs .694731 2.318 8.75E-08
MMP12 Hs .1695 2.306 0.022
CCNB1 Hs .23960 2.293 0.046
KRT23 Hs .9029 2.241 1.14E-04
ASB9 Hs .19404 2.209 2.44E-05
CHEK1 Hs .24529 2.201 2.94E-09
CSE1L Hs .90073 2.185 6.10E-06
SLC7A11 Hs .390594 2.105 3.05E-05
ENC1 Hs .104925 2.059 0.004
PLAU Hs .77274 2.001 0.003
HIG2 Hs .433213 1.995 2.96E-04
RNF183 Hs .211374 1.97 7.35E-07
RAD51AP1 Hs .591046 1.932 0.021
RRM2 Hs .226390 1.818 0.044
UBE2S - 1.818 3.66E-09
PCSK9 Hs .18844 1.77 9.31E-07
C6ORF173 Hs .486401 1.734 5.45E-09
SLC12A2 - 1.728 0.003
TSTA3 Hs .404119 1.716 0.006
TGFBI Hs .369397 1.711 1.02E-04
PRDX4 Hs .83383 1.281 0.038
실시예 2. 조직 및 세포에서의 mRNA 분리
역전사 중합효소 반응을 위하여 20명의 대장암 환자로부터 대장 정상 상피세포 조직과 대장암 세포조직을 적출하여 총 40개의 조직에서 mRNA를 분리하였다. 우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 RNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.
대장암 세포주들은 총 10개를 선정하여(DLD-1, HT29. HCT116, colo205, SW480, SW620, SNU C1, SNU C2A, KM 12C, KM 12SM), 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다. 각각의 최적 배양배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/ Streptomycin, Sigma사)를 첨가하여 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서와 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스팩트로포토메터를 사용하여 정량하였고, 사용전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.
실시예 3. 역전사 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교
상기 실시예 1의 결과 선발된 대장암 특이 과발현 유전자들 중에서 13개를 선정하여(데이터 마이닝) 중합효소 반응을 실시하였다.
프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 CoreNucleotide(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, Primer3 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인 하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현정도를 확인하였다(도 8~10). 각각의 프라이머 서열은 표 5와 같다.
프라이머서열
유전자 명 염기서열 산물 크기
CKS 2 Forward CAC TAC GAG TAC CGG CAT GTT 186bp
Reverse TTG ATC TTT TGG AAG AGG TCG T
IFITM 1 Forward ATG TCG CTCT GGT CCC TGT TC 224bp
Reverse TGT CAC AGA GCC GAA TAC CA
KLK 6 Forward GCA AGA CAG CAG CAG ATG GTG AT 304bp
Reverse CAC TTG GCC TGA ATG GTT TT
SPP 1 Forward TCC AAC GAA AGC CAT GAC CA 347bp
Reverse TCC TCG CTT TCC ATG TGT GA
CEACAM 6 Forward CGC ATA CAG TGG TCG AGA GA 318bp
Reverse GTC ATG TGG CAA TTG GAC AG
DPEP 1 Forward ACT TGG CTC ACG TGT CTG TG 249bp
Reverse CCA CCT CCT TGA TGT GAT CC
CST1 Forward CCA TGG CCC AGT ATC TGA GT 320bp
Reverse GAA GGC ACA GGT GTC CAA GT
CDH3 Forward CAC TGC AGA AGA CCC TGA CA 333bp
Reverse GAC AGG TCC TTG TCC GTG AT
ANLN Forward GAC ACC AGG AGG AAC AGG AA 399bp
Reverse TGG TTT TCG GTC ACC TTT TC
CXCL 1 Forward AGG GAA TTC ACC CCA AGA AC 204bp
Reverse CAC CAG TGA GCT TCC TCC TC
MELK Forward TGG CTC TCT CCC AGT AGC AT 343bp
Reverse TAG CAC TGG CTT GTC CAC AG
CDCA1 Forward CCT GAA CTT GGA GGA CCA AA 378bp
Reverse TCC TCT GCT GCC TTT TCA AT
CTHRC 1 Forward TGG ACA CCC AAC TAC AAG CA 353bp
Reverse GAA CAA GTG CCA ACC CAG AT
HS6ST2 Forward CTT CGG CCT CAC TGA GTT TC 239bp
Reverse CCT CCT GAT GCT CTT TCT GC
EGFL6 Forward CCT GAT TCT GGT CCA AAG GA 336bp
Reverse GCC AGG GCA TTG TTA CTG TT
LCN2 Forward ACA AAG ACC CGC AAA AGA TG 305bp
Reverse CGA AGT CAG CTC CTT GGT TC
MMP1 Forward GAT GGG AGG CAA GTT GAA AA 334bp
Reverse CTG CTT GAC CCT CAG AGA CC
CA9 Forward CAC TCC TGC CCT CTG ACT TC 365bp
Reverse TCT CAT CTG CAC AAG GAA CG
역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)를 이용하여 수행하였고, 상기의 반응 결과로 얻은 cDNA와 표 5의 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응을 사용하였다. 그 결과 도 8 내지 10과 같이 정상 대장 세포와 대장암 세포 간의 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 도 11에서와 같이 대장암 세포주에서의 발현도 확인할 수 있었다.
실시예 4. 웨스턴 블롯을 이용한 혈청 내 단백질 발현량 비교
대장암 환자와 정상인의 혈청 내 발현되는 KLK6의 발현 정도를 웨스턴블럿 을 이용하여 비교하였다.
우선, 대장암 환자 및 정상인으로부터 얻은 혈액에서 혈청을 분리하고, 동량 부피의 샘플 완충용액(125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀 블루, 1.8% BME)을 넣고 5분간 끓인후, 12%의 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분자크기별로 분리된 단백질이 포함된 상기 SDS-PAGE를 니트로셀룰로오스 막과 접촉하고 전류를 통하게 하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시킨다. 이에 3% 우태아혈청 알부민이 포함된 TBST 용액(10mM Tris, 100mM 염화나트륨, 0.05% 트윈 20)에서 30분간 반응한 두 KLK6 항체(ABNOVA,1:2000)를 넣고 4℃에서 교반시키면서 2 시간동안 반응시킨다. 이후 여분의 항체를 TBST로 세척하여 제거하고, HRP가 결합된 2차항체(ABCAM, Rabbit polyclonal to Mouse IgG)를 넣고 4℃에서 교반시키면서 1시간동안 반응한다. 이후, 니트로셀룰로오스 막을 MILLIPORE사 ECL의 solution A (Luminol과 enhancer 포함)와 Solution B(Hydrogen peroxide포함)를 동량으로 섞어 1분간 잘 흔들어준 다음 membrane의 물기를 적당히 제거한후 필름카세트에 잘 붙이고 암실로 가서 현상하였다. 그 결과, 도 12에서 보는바와 같이 정상인의 경우(2, 3, 4번 레인)에서는 KLK6 단백질이 검출되지 않았으나, 대장암 환자의 경우(6, 7, 8번 레인)에는 KLK6가 발현 되는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 면역염색을 이용한 조직 내 단백질 발현량 비교
정상 대장 상피 조직과 대장암 조직에서의 단백질 존재여부 및 발현 위치를 확인하고자 조직 슬라이드를 대상으로 면역 염색을 실시하였다. 우선, 외과적 절제술을 통하여 대장암 환자들로부터 대장 정상 상피세포 조직과 대장암 세포조직을 적출하여 파라핀 포매 블록을 만들었다. 이를 마이크로톰을 이용하여 5um의 두께로 잘라 유리슬라이드에 붙여 조직 슬라이드를 만들었다. 이들을 공지의 면역염색법으로 염색하여 현미경으로 조직내 단백질의 존재 여부 및 위치를 확인하였다. 면역에 사용된 항체로는 CEACAM 6(ABCAM, 1:5000), SPP1(ABNOVA, 1:2000 ), IFITM 1 55-1-8(SANTA CRUZ, 1:1000), 및 CKS 2(ZYMED Laboratories, 1:2000) 이다.
그 결과, 면역조직화학 염색에서 CKS2(도 16)는 핵내 단백질 발현을 하였고, KLK6(도 17)는 세포질 및 세포막에서 단백질 발현 양상을 보였으며, 대장암환자의 혈액에서 검출된 것으로 보아 혈액내에 분비되는 것을 알수있었다. 또한 5종의 항체 모두가 정상 대장 점막보다는 종양세포에서의 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다.
이 외에도, CEACAM6(도 13), SPP1(도 14)은 혈액으로 분비된다고 생각되며, IFITM1(도 15), KLK6(도 17)는 분비 가능성이 있음을 알 수 있었다. 즉, 도 13 및 14에서 볼 수 있듯이 CEACAM6, SPP1의 경우 세포막, 세포질, 그리고 선상 구조(glandular structures)의 강(lumen) 내 물질에서 양성반응을 보이고 있어 분비 가능성이 높다고 예상할 수 있었다. IFITM1 및 KLK6은 선상 구조(glandular structures)의 발현이 없어 분비가능성을 생각할 수 없으나, 단백질 구조상 분비 가능성이 있고 면역조직화학염색에서 세포질 또는 간혹 세포막 발현을 보여 그러한 가능성이 있음을 시사하였다.
도 1은 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사)을 사용하여 정상 대장 조직과 대장암조직에서 2,230개의 유전자 발현을 비교한 결과이다(p value <0.05). 도면 상단의 DF는 Disease-free를 RC는 Recurrent를 의미한다.
도 2 는 48K 인간 마이크로 어레이 칩(Illumina사) 분석 결과를 토대로 대장암조직에서 특이적으로 과발현되는 유전자를 도표화한 것이다.
도 3 내지 6은 대장암 특이적인 유전자의 마이크로어레이 결과를 바탕으로 공개되어 있는 여러 마이크로어레이 데이터를 비교분석(data mining)한 예들로서, 도 3은 KLK6 유전자, 도 4는 CKS2 유전자, 도 5는 IFITM1 유전자, 그리고 도 6는 SPP1 유전자의 비교분석 결과이다.
도 7은 대장암, 위암, 유방암, 전립선암, 간암에서 동일한 유전자들을 대상으로 DNA 칩을 이용하여 유전자의 과발현을 비교한 결과이다.
도 8은 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 CKS2, IFITM1, KLK6, 및 SPP1 진단 마커의 발현정도를 확인한 전기영동 사진이다(홀수 레인은 정상조직, 짝수 레인은 암조직).
도 9는 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의CEACAM6, DPEP1, CST1, CDH3, ANLN, CXCL1, MELK, CDCA1, 및 CTHRC1 진단 마커의 발현정도를 확인한 전기영동 사진이다(홀수 레인은 정상조직, 짝수 레인은 암조직).
도 10은 역전사 중합효소반응을 이용한 정상조직과 대장암 조직에서의 HS6ST2, EGFL6, LCN2, MMP1, 및 CA9 진단 마커의 발현정도를 확인한 전기영동사진이다(홀수 레인은 정상조직, 짝수 레인은 암조직).
도 11은 역전사 중합효소반응을 이용하여 10종의 대장암 세포주(Lane 1, DLD-1; Lane 2, HT29; Lane 3, HCT116; Lane 4, colo205; Lane 5, SW480; Lane 6, SW620; Lane 7, SNU C1; Lane 8, SNU C2A; Lane 9,KM 12C; Lane 10, KM 12SM)에서 ANLN, CEACAM6, CST1, CTHRC1, DPEP1, KLK6, 및 MELK 진단마커들의 발현정도를 확인한 전기영동 사진이다.
도 12는 웨스턴블럿을 통하여 정상인의 혈청과 대장암 환자의 혈청에서 KLK6 항체의 발현 여부를 확인한 그림이다.
도 13 내지 17은 면역조직염색법을 통하여 정상점막(좌측)과 대장암 조직(우측 상, 하)에서 단백질의 발현을 비교한 사진이다. 도 13은 CEACAM6, 도 14는 SPP1, 도 15는 IFITMI 55-1-8, 도 16은 CKS2, 그리고 도 17은 KLK6 항체를 사용하여 염색한 결과이다.
<110> KOREAN RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> COLON CANCER DIAGNOSTIC MARKERS USING UP-REGULATED GENES <130> PA090460KR <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKS2-FW <400> 1 cactacgagt accggcatgt t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CKS2-RV <400> 2 ttgatctttt ggaagaggtc gt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFITM1-FW <400> 3 atgtcgctct ggtccctgtt c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFITM1-RV <400> 4 tgtcacagag ccgaatacca 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK6-FW <400> 5 gcaagacagc agcagatggt gat 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK6-RV <400> 6 cacttggcct gaatggtttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPP1-FW <400> 7 tccaacgaaa gccatgacca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPP1-RV <400> 8 tcctcgcttt ccatgtgtga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6-FW <400> 9 cgcatacagt ggtcgagaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6-RV <400> 10 gtcatgtggc aattggacag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPEP1-FW <400> 11 acttggctca cgtgtctgtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DPEP1-RV <400> 12 ccacctcctt gatgtgatcc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CST1-FW <400> 13 ccatggccca gtatctgagt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CST1-RV <400> 14 gaaggcacag gtgtccaagt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3-FW <400> 15 cactgcagaa gaccctgaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDH3-RV <400> 16 gacaggtcct tgtccgtgat 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANLN-FW <400> 17 gacaccagga ggaacaggaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANLN-RV <400> 18 tggttttcgg tcaccttttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1-FW <400> 19 agggaattca ccccaagaac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1-RV <400> 20 caccagtgag cttcctcctc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MELK-FW <400> 21 tggctctctc ccagtagcat 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MELK-RV <400> 22 tagcactggc ttgtccacag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDCA1-FW <400> 23 cctgaacttg gaggaccaaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDCA1-RV <400> 24 tcctctgctg ccttttcaat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-FW <400> 25 tggacaccca actacaagca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1-RV <400> 26 gaacaagtgc caacccagat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS6ST2-FW <400> 27 cttcggcctc actgagtttc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS6ST2-RV <400> 28 cctcctgatg ctctttctgc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL6-FW <400> 29 cctgattctg gtccaaagga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL6-RV <400> 30 gccagggcat tgttactgtt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-FW <400> 31 acaaagaccc gcaaaagatg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCN2-RV <400> 32 cgaagtcagc tccttggttc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1-FW <400> 33 gatgggaggc aagttgaaaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1-RV <400> 34 ctgcttgacc ctcagagacc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA9-FW <400> 35 cactcctgcc ctctgacttc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA9-RV <400> 36 tctcatctgc acaaggaacg 20

Claims (11)

  1. ANLN(anillin), MELK(maternal embryonic leucine zipper kinase) 및 CDCA1(NUF2; NDC80 kinetochore complex component) 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 KLK6(kallikrein-related peptidase 6), CKS2 (CDC28 protein kinase regulatory subunit 2), IFITM1(Interferon induced transmembrane protein 1), CDH3(cadherin 3), CXCL1(Chemokine (C-X-C motif) ligand 1), CTHRC1(collagen triple helix repeat containing 1), CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6), MMP1 (Matrix metallopeptidase), HS6ST2(Heparan sulfate 6-0-sulfotransferase 2), EGFL6(EGF-like-domain, multiple 6) 및 CA9 (Carbonic anhydrase IX) 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상 기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
  4. 제3에 있어서, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 중 ANLN에 대한 프라이머는 서열번호 17 및 18인 프라이머 쌍, MELK에 대한 프라이머는 서열번호 21 및 22인 프라이머 쌍, CDCA1에 대한 프라이머는 서열번호 23 및 24인 프라이머 쌍, KLK6에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6인 프라이머 쌍, CKS2에 대한 프라이머는 서열번호 1 및 2인 프라이머 쌍, IFITM1에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4인 프라이머 쌍, CDH3에 대한 프라이머는 서열번호 15 및 16인 프라이머 쌍, CXCL1에 대한 프라이머는 서열번호 19 및 20인 프라이머 쌍, CTHRC1에 대한 프라이머는 서열번호 25 및 26인 프라이머 쌍, CEACAM6에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10인 프라이머 쌍, MMP1에 대한 프라이머는 서열번호 33 및 34인 프라이머 쌍, HS6ST2에 대한 프라이머는 서열번호 27 및 28인 프라이머 쌍, EGFL6에 대한 프라이머는 서열번호 29 및 30인 프라이머 쌍 및 CA9에 대한 프라이머는 서열번호 35 및 36의 프라이머 쌍인 대장암 진단용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
  8. ANLN, MELK 및 CDCA1 중에서 선택되는 1 개 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 대장암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및
    상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 측정하는 단계 및 비교하는 단계는 KLK6, CKS2, IFITM1, CDH3, CXCL1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, HS6ST2, EGFL6 및 CA9 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자를 추가로 측정 및 비교하는 것을 포함하는 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  10. ANLN, MELK 및 CDCA1 중에서 선택되는 1 이상의 단백질에 특이적인 항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및
    상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질 수준을 확인하는 단계 및 비교하는 단계는 KLK6, CKS2, IFITM1, CDH3, CXCL1, CTHRC1, CEACAM6, MMP1, HS6ST2, EGFL6 및 CA9 중에서 선택되는 1 이상의 단백질의 수준을 추가로 확인 및 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
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