KR20100007496A

KR20100007496A - 곤충병원선충 슈타이너네마 몬티콜럼에서 유래된곤충병원세균 세라티아 ｓｐ. ＡＮＵ101

Info

Publication number: KR20100007496A
Application number: KR1020080068144A
Authority: KR
Inventors: 김용균; 김근섭
Original assignee: 안동대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2010-01-22
Also published as: KR101038382B1

Abstract

본 발명은 곤충병원선충에서 유래된 새로운 곤충병원세균에 관한 것으로, 본 발명에서는 곤충병원선충인 슈타이너네마 몬티콜럼(Steinernema monticolum)으로부터 새로운 곤충병원세균을 분리 동정하였다. 본 발명에서 제공하는 새로운 곤충병원세균은 Enterobacteriaceae에 속하는 세라티아(Serratia) sp. ANU101(KACC 91380P)이다. 세라티아(Serratia) sp. ANU101(KACC 91380P)은 해충의 새로운 생물적 방제 인자로서 활용될 수 있다.

곤충병원세균, 선충공생세균, 곤충병원선충, Steinernema monticolum, Serratia sp., 해충 방제

Description

곤충병원선충 슈타이너네마 몬티콜럼에서 유래된 곤충병원세균 세라티아 ｓｐ. ＡＮＵ101 {An Entomopathogenic Bacterium, Serratia sp. ANU101 Isolated from an Entomopathogenic Nematode, Steinernema monticolum}

본 발명은 새로운 곤충병원세균에 관한 것으로, 특히 곤충병원선충에서 유래된 새로운 곤충병원세균에 관한 것이다.

곤충병원선충은 슈타이너네마(Steinernema)와 헤테로랍디티스(Heterorhabditis)의 두 분류군에 해당한다. 이들이 기주 곤충에 대해 나타내는 살충기작은 이들이 보유하고 있는 공생세균에서 주로 기인된다(Akhurst, 1980, 1986). 이들의 공생세균은 각각 선충의 기주에 따라 제노랍두스(Xenorhabdus)와 포토랍두스(Photorhabdus)로 대별된다(Kaya and Gaugler, 1993). 이 세균들은 선충의 장에 서식하면서 기주 선충이 대상 곤충의 혈강 속으로 침입하면, 선충 장으로부터 분비되어 곤충 혈강으로 침입하게 된다. 침입한 세균은 자신과 기주 선충을 보호하기 위해 곤충의 면역기능을 억제시킨다(Kim et al., 2000). 이후 혈강에서 증식된 세균은 기주 곤충의 패혈증을 유발하여 치사시키고, 치사된 곤충에서 선충은 증식하게 된다(Dunphy and Webster, 1984). 곤충 혈강에서 증식된 기주 선충 은 감염태 선충으로 발육되고, 이들은 다시 세균을 장내에 서식하게 하며, 곤충 몸 밖으로 나오고 다시 다른 곤충을 침입하게 된다. 즉, 선충은 공생세균에게 증식장소인 곤충의 혈강으로 운반하여 주는 벡터 역할을 하고, 공생세균은 곤충의 면역을 억제시키고, 치사된 곤충의 체내를 선충의 발육에 최적 조건으로 형성시켜주는 역할을 하여 상호 도움을 주는 공생관계를 유지하게 된다(Kaya, 1990).

곤충병원선충인 슈타이너네마 몬티콜럼(Steinernema monticolum)은 국내 집단에서 최초로 발견되었다(Stock et al., 1997). 밭작물에 큰 피해를 주고 있는 배추좀나방(Plutella xylostella)과 파밤나방(Spodoptera exigua )에 대해서 높은 병원력을 발휘할 수 있어서 생물적 방제인자로서 기대를 모으고 있다. 그러나 이러한 선충을 이용하여 지상부의 작물체를 가해하는 해충을 방제하는 데는 어려움이 있다. 즉, 감염태 선충이 자외선 및 건조에 생존력이 떨어져 현장 적용에 문제가 있다(Lee et al., 2000). 이를 해결하기 위해 곤충의 병원력에 직접적 요인이 되는 세균을 분리하여 곤충에 적용하는 방법이 있다. 이를 위해 이러한 공생세균의 분리(Boemare, 2000) 및 세균 유래 다양한 독소 유전자 및 독소 물질의 분리 연구가 진행되어 왔다(Bowen and Ensign, 1998; Bowen et al., 1998; Babic et al., 2000; Brillard et al., 2002; ffrench-Constant et al., 2000; 2003). 일부 연구는 이 공생세균의 배양물을 처리하여 해충 방제 효과를 거둔 예도 있다(Mahar et al., 2004, 2006). 이러한 유용성에 비추어 이들 곤충병원선충이 가지고 있는 공생세균을 분리하고 동정하는 일은 실용적 의미도 지니게 된다. 그러나 국내에서 보고된 슈타이너네마 몬티콜럼(S. monticolum)이 보유하고 있는 공생세균은 아직까 지 보고되지 않았다.

[참고문헌]

Akhurst RJ. 1980. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121: 303-309.

Akhurst RJ. 1986. Xenorhabdus nematophilus subsp. poinarii: its interaction with insect pathogenic nematodes. Syst. Appl. Microbiol. 8: 142-147.

Babic, I., M. Fischer-Le Saux, E. Giraud, and N. Boemare. 2000. Occurrence of natural doxenic associations between the symbiont Photorhabdus luminescens and bacteria related to Ochrobactrum spp. in tropical entomopathogenic Heterorhanditis spp. (Nematoda, Rhabditida). Microbiol. 146: 709-718.

Boemare, N. E. 2002. Biology, Taxonomy and Systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus , pp. 35-56, In Gaugler, R. (ed.). Entomopathogenic Nematology. CABI Publishing, New York, NY.

Bowen, D. J. and J. C. Ensign. 1998. Purification and characterization of a high molecular weight insecticidal protein complex produced by the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3029-2035.

Bowen, D. J., T. A. Rocheleau, M. Blackburn, O. Andreev, E. Golubeva, R. Bhartia, and R. H. ffrench-Constant. 1998. Insecticidal toxins from the bacterium Photorhabdus luminscens. Science 280: 2129-2132.

Brillard, J., E. Duchaud, N. Boemare, F. Kunst, and A. Givaudan. 2002. The PhlA hemolysin from the entomopathogenic bacterium Photorhabdus luminescens belongs to the two-partner secretion family of hemolysins. J. Bacteriol. 184: 3871-3878.

Bucher, G. E. 1960. Potential bacterial pathogens of insects and their characteristics. J. Insect Pathol. 2: 172-195.

Cao. H., R. L. Baldini, and L. G. Rahme. 2001. Common mechanisms for pathogens of plants and animals. Annu. Rev. Phytopathol. 39: 259-284.

Dunphy, G. B. and J. M. Webster. 1984. Interaction of Xenorhabdus nematophilus subsp. nematophilus with the haemolymph of Galleria mellonella. J. Insect Physiol. 30: 883-889.

Gardiner, E. M. M. and M. R. Strand. 1999. Monoclonal antibodies bind distinct classes of hemocytes in the moth, Pseudoplusia includens. J. Insect Physiol. 45: 113-126.

Gho, H. G., S. G. Lee, B. P. Lee, K. M. Choi, and J. H. Kim. 1990. Simple mass-rearing of beet armyworm, Spodoptera exigua (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae), on an artificial diet. Kor. J. Appl. Entomol. 29: 180-183.

Grimont, F. and P. A. D. Grimont. 2005. Genus XXXIV. Serratia, pp. 799-811, In Brenner, D. J., N. R. Krieg, and J. T. Staley. (eds.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nded. Vol. 2. Part. B. Springer, New York.

Humason, G. L. 1972. Animal Tissue Techniques. 3rd Ed. W.H. Freeman and Company, San Francisco, CA.

Jung, S. and Y. Kim. 2006a. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp. aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Biol. Control 39: 201-209.

Jung, S. and Y. Kim. 2006b.Synergistic effect of entomopathogenic bacteria (Xenorhabdus sp. and Photorhabdus temperata ssp. temperata) on the pathogenicity of Bacillus thuringiensis ssp. aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). Environ. Entomol. 35: 1584-1589.

Jung, S. and Y. Kim. 2007. Potentiating effect of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki on pathogenicity of entomopathogenic bacterium Xenorhabdus nematophila K1 against diamondback moth (Lepidoptera: Plutellidae). J. Econ. Entomol. 100: 246-250.

Kang, S., G. Y. Kim, and Y. Kim. 2008. Identification of an entomopathogenic nematode, Steinernema monticolum, and its pathogenicities to the beet armyworm, Spodoptera exigua , and the diamondback moth, Plutella xylostella, in laboratory tests. J. Basic Life Res. Sci. 8: in press.

Kaya, H. K. 1990. Soil Ecology, pp. 215-231, In Gaugler, R. and H. K. Kaya (eds.), Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. CRC, Boca Raton, FL.

Kaya, H. K. and R. Gaugler. 1993. Entomopathogenic nematodes. Annu. Rev. Entomol. 38: 181-206.

Kim, Y., D. Ji, S. Cho, and Y. Park. 2005. Two groups of entomopathogenic bacteria, Photorhabdus and Xenorhabdus , share an inhibitory action against phospholipase A2 to induce host immunodepression. J. Invertebr. Pathol. 89: 258-264.

Lee, S., Y. Kim, and S. Han. 2000. An improved collecting method of the infective juveniles of the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae Weiser. Kor. J. Soil Zool. 5: 97-100.

Mahar, A. N., A. A. Al-Siyabi, S. A. Elawad, N. G. M. Hague, and S. R. Gowen. 2006. Application of toxins from the entomopathogenic bacterium, Xenorhabdus nematophila, for the control of insects on foliage. Comm. Appl. Biol. Ghent University 71: 233-238.

Mahar, A. N., M. Munir, S. Elawad, S. R. Gowen, and N. G. M. Hague. 2004. Microbial control of diamondback moth, Plutella xylostella L. (Lepidoptera: Yponomeutidae) using bacteria (Xenorhabdus nematophila) and its metabolites from the entomopathogenic nematode, Steinernema carpocapsae. J. Zhejiang Univ. Sci. 5: 1183-1190.

Nalini, M. and Y. Kim. 2007. A putative protein translation inhibitory factor encoded by Cotesia plutellae bracovirus suppresses host hemocyte-spreading behavior. J. Insect Physiol. 53: 1283-1292.

Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Shea, J. E., J. D.Santangelo, and R. G. Feldman. 2000. Signature-tagged mutagenesis in the identification of virulence genes in pathogens. Curr. Opin. Microbiol. 3: 451-458.

Stock, S. P., H. Y. Choo, and H. K. Kaya. 1997. An entomopathogenic nematode, Steinernema monticolum sp. n. (Rhabditida: Steinernematidae) from Korea with a key to other species. Nematologica 43: 15-29.

Weisburg, G. W., S. M. Barns, D. A. Pelletier, and D. J. Lane. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 173: 697-703.

Yi, Y., H. W. Park, S. Shrestha, J. Seo, Y. O. Kim, C. S. Shin, and Y. Kim. 2007. Identification of two entomopathogenic bacteria from a nematode pathogenic to the oriental beetle, Blitopertha orientalis. J. Microbiol. Biotechnol. 17: 968-978.

본 발명에서는 최근 국내 안동지역에서 채집된 슈타이너네마 몬티콜럼(S. monticolum)이 병원력을 지닌다는 것(Kang et al., 2008)에 기초하여, 이 선충으로부터 공생세균을 분리하여 동정하였다. 본 발명은 곤충병원선충에서 유래된 새로운 곤충병원세균을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명에서는 이 곤충병원세균의 살충효과가 밝혀지고, 해충의 생물적 방제 인자로서의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명에서는 이 새로운 곤충병원세균을 기존의 생물농약과 혼용하는 등의 활용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서 제공하는 새로운 곤충병원세균은 Enterobacteriaceae에 속하는 세라티아(Serratia) sp. ANU101(KACC 91380P)이다. 본 발명에서는 세라티아 sp. ANU101 및 이의 배양액을 이용한 해충 방제제 및 해충 방제방법이 제공된다. 또한, 본 발명에서는 세라티아 sp. ANU101 또는 이의 배양액과 비티를 함께 포함하는 해충 방제제 및 이를 이용한 해충 방제방법이 제공된다.

본 발명의 세라티아 sp. ANU101(KACC 91380P)은 해충의 새로운 생물적 방제 인자로서 활용될 수 있다.

본 발명에서는, 곤충병원선충인 Steinernema monticolum에 공생하는 세균이 분리되어 동정되었다. 이 세균은 Enterobacteriaceae에 속하는 Serratia sp. ANU101 (KACC 91380P)이다. 이 세균은 주요 전작해충인 파밤나방(Spodoptera exigua)에 대해 병원성을 보였으며, 특히 기존의 미생물농약인 비티에 대해서 뛰어난 상승효과를 나타냈다.

[실시예]

이하, 실험예와 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

재료 및 방법

1. 선충과 곤충사육

S. monticolum이 안동지역 토양에서 채집되었다(Kang et al., 2008). 감염태 선충이 파밤나방 5령충을 이용하여 증식되었고, 이를 개량된 Baermann 깔대기법(Lee et al., 2000)으로 수거하였다. 파밤나방 유충은 25± 1℃에서 인공사료(Gho et al., 1990)로 사육하였다.

2. 선충으로부터 공생세균 분리

약 50 ㎕의 감염태 선충을 250 ppm 스트렙토마이신을 포함한 0.06% 염화나트륨(sodium hypochloride) 용액에서 30분간 침지시켜 표면소독하였고, 다시 살균된 식염수(Humason, 1972)로 3회 세척하였다. 이후 다시 식염수에서 균질한 후 추출된 세균 용액을 NBTA (nutrient agar containing 0.0025% bromothymol blue, 0.004% triphenyltetrazolium chloride)에 도말하였다. 이를 28℃의 혐기성배양기에서 48시간동안 배양시켰다. 성장된 4개의 다른 세균 종류를 다시 TSB(tryptic soy broth, Difco, USA)에서 단일균주로 배양시킨 후 냉동 저장하였으며, 이후 이어지는 실험은 이 냉동 보관 균주를 사용하여 연속적 배양에 따른 균주변화를 억제시켰다. 세균 제제화를 위해서 TSB에서 25℃, 48시간 배양시킨 세균을 동결건조기(Bondiro, Busan, Korea)를 이용하여 3일 동안 분말 제제화하였다. 세균 농도는 콜로니 형성수(colony-forming unit, cfu)로 표현하였다. 본 실험에 사용된 동결건조세균(Serratia sp.)은 1.35 x 10¹³ cfu/g의 농도를 보였다.

3. 세균병원성 분석

세균병원성은 파밤나방을 대상으로 혈강주사법과 섭식법의 두 가지를 모두 이용하여 분석하였다. 혈강주사법은 5 ㎕의 세균현탁액(2 x 10⁵ - 2 x 10⁷ cfu/㎖ 식염수)을 10 ㎕ 용량의 Hamilton microsyringe (Hamilton, Nevada, USA)를 이용하여 곤충 혈강으로 주입하였다. 대조구에는 식염수만을 주입하였다. 각 세균농도는 10마리를 실험단위로 하여 3반복 실시하였다. 살충 효과는 처리 후 24시간 간 격으로 조사하였다. 섭식 병원력 조사를 위해 배추잎은 약 1 ㎠으로 절편한 후 조제된 세균현탁액(2.0x10³-2.0x10¹⁰ cfu/ml 식염수)에 5분간 침지하였다. 침지된 배추잎을 10분 동안 음건한 후 파밤나방 유충에 섭식 처리하였다. 한 실험단위는 15마리로 구성되었으며 3반복 실시하였다. 살충 효과는 처리 후 24시간 간격으로 조사하였다. 살충효과 검정은 끝이 무딘 봉으로 처리된 유충에 물리적 접촉자극을 주어 자의적 움직임이 없는 경우를 치사된 것으로 판단하였다. 비티농약(Bacillus thuringiensis, Bt)과 협력효과를 조사하기 위해 상용화된 비티제품(Bt subsp. kurstaki, Thuricide, Misung Inc., Korea)을 이용하였으며, 이 제품은 세균포자와 내독소가 공존하였으며, 세균 농도는 3.0 x 10¹⁰ cfu/g를 나타냈다.

4. 세균의 생화학적 특성 조사

세균의 탄소원은 미생물동정장치(Biolog, USA)를 이용하였다. 세균의 조제 및 기타 분석 기술은 제조사의 방법을 따랐다. 간략하게 분리된 세균을 28℃에서 BUG+B (BUG agar + 0.2% sheep's blood)의 배양액으로 24 시간 배양하였다. 배양된 세균 용액을 63±3%으로 희석한 후 GN2 microplate (Biolog, USA)에서 2일 동안 배양한 후 분석에 이용하였다.

5. 세균의 16S rDNA 염기서열 분석

배양된 세균으로부터 전체 게놈 DNA가 일반 DNA 분리 방법(Sambrook et al., 1989)으로 분리되었다. 16S rDNA 영역(약 1.6 kb)을 증폭하기 위해 universal polymerase chain reaction (PCR) 프라이머(Cao et al., 2001; Weisburg et al., 1991)를 이용하였다. 이때 전방향과 역방향 프라이머는 각각 5´-GAAGAGTTTGATCATGGCTC-3´과 5´-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3´를 이용하였다. PCR 반응물(50 ㎕)의 조성은 5 ㎕의 10 X PCR buffer, 5 ㎕의 dNTP mixture (각각 2.5 mM), 2 ㎕의 25 pmol 전방향 프라이머, 2 ㎕의 25 pmol 역방향 프라이머, 1 ㎕의 Taq polymerase (5 U/㎕), 1 ㎕의 template DNA 및 34 ㎕의 증류수를 포함했다. PCR 기기(PTC-100 MJ Research, Minnesota, USA) 조건은 35반복 증폭 주기로 각 주기는 94℃에서 1 min, 50℃에서 1 min 그리고 72℃에서 2 min으로 구성되었다. PCR 결과물은 pGEM-T 벡터(Promega, Madison, USA)에 클로닝되어 양방향으로 염기서열 분석되었다. 염기서열 분석은 마크로젠(대전, 한국)에서 실시하였다. 서열분석된 자료는 DNAstar program (Version 5.01, DNAstar Inc, Madison, USA)을 이용하여 기존에 알려진 16S rDNA의 서열과 비교하여 분석하였다.

6. 전자현미경 분석

세균현탁액이 formvar-coated grid 올려진 후 25분 동안 2% uranyl acetate로 염색하였다. 염색된 grid는 투과전자현미경(transmission electron microscope) (LEO 906E, Oberkochen, Germany)에서 검경되었다.

7. 혈림프 수거 및 혈구 조사

혈구조제는 Nalini and Kim (2007)의 방법을 따랐다. 간략하게 기술하면, 항응고완충용액이 8 ㎎의 L-cysteine·HCl (Sigma, St. Louis, USA)을 5 ㎖의 Tris 완충용액식염수 혼합되고 0.1N NaOH로 pH 7.5로 조절하였다. 파밤나방 5령충이 70% 에탄올로 표면살균된 후 복부 다리를 제거한 후 흘러나오는 혈림프(약 50 μl/유충)를 500 ㎕의 항응고완충용액과 혼합하였다. 혈구수 조사는 혈림프를 항응고완충용액으로 10배 희석한 후 hemocytometer (Superior, Germany)를 이용하여 밀도 측정하였다. 전체 및 혈구조성별 밀도는 위상차현미경(BX41, Olympus, Japan)을 이용하여 40배 배율의 bright-field 조건에서 관찰하였다. 혈구분류는 Gardiner and Strand (1999)가 기술한 형태특징을 이용하여 원시혈구(prohemocyte, PH), 과립혈구(granular cell, GR), 부정형혈구(plasmatocyte, PL), 소구형혈구(spherulocyte, SP) 및 편도혈구(oenocytoids, OE)로 분류하였다.

8. 혈구세포에 대한 세포독성 분석

파밤나방 5령을 대상으로 각각 3 ㎕의 갓 배양된 세균용액(2.0 x 10⁸cells/ ㎖)을 혈강 주입하였다. 처리된 유충은 25℃에 놓여지고 시기별로 혈림프를 추출하여 전체 혈구수 및 세균수를 조사하였다. 세균수 조사는 TSA에 도말하여 16시간 동안 25℃에서 배양한 후 밀도조사하였다. 각 처리는 3반복하였다. 세균배양액의 세포독성 분석은 세균배양액에서 세균을 제거한 후 얻어진 배양액을 이용하여 분석하였다. 세균제거는 8,000 x g에서 20분 동안 원심분리한 후 얻어진 상층액을 0.22 ㎛ 여과지에서 세균을 걸러내어 분리하였다. 이 여과된 상층액 5 ㎕를 파밤나방에 혈강 주입한 후, 25℃에서 6시간 처리하였다. 이후 혈림프를 수거하여 전체 및 혈구종류별 밀도를 분석하였다. 각 처리는 3반복으로 실시하였다.

결과

곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충을 이용하여 공생세균을 분리하였다. 혐기성배양기에서 2일 동안 배양시킨 후 NBTA 배지에서 성장한 균총을 살펴보면 다양했다. 형태적으로 보면 4가지로 구분될 수 있다. 도 1은 곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충으로부터 분리되어 NBTA에서 성장한 4개의 다른 콜로니들, 즉 'BR', 'SB', 'PR' 및 'MR'을 보여주는 사진이다. 이 세균들은 상기 선충으로부터의 추출물로부터 얻어지고 혐기성 인큐베이터에서 48시간 동안 배양되었다. 균총의 모양이 적색과 갈색으로 구분되었다. 적색 균총은 크기에 있어서 큰 것('BR'), 작으면서 핑크빛이 나는 것('PR'), 그리고 우유빛 우산 모양으로 퍼지는 것('MR')으로 구분되었다. 그리고 갈색의 것('SB')은 비교적 작은 균총 크기를 보였다. 도 2는 콜로니 숫자에서 이들 4개의 상대적인 빈도를 그래프로 나타낸 것이다.

이들 세균들을 각각 단일세균으로 배양한 후 각각 파밤나방을 이용한 곤충병원력 검정, 항생제 내성, 미생물동정장치를 이용한 동정 및 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 도 3은 16S rDNA 염기서열을 이용한 이들의 계통발생도(phylogenetic tree)이다. 이들의 염기서열의 Genbank accession numbers는 BR 이 1102107, SB가 1102283, PR가 1102282, 그리고 MR이 1102108 이다. 계통발생도 상의 숫자는 DNAstar program에 의해 분석된 각 가지 상의 similarity index의 퍼센테이지를 가리킨다. 4개 균주는 모두 곤충병원력을 지녔다. 그러나 앰피실린 또는 가나마이신(kanamycin)의 항생제에 대한 내성에서는 서로 차이를 보였다. 또한 미생물동정 장치와 16S rDNA의 염기서열을 비교하여 보면 각각 서로 다른 세균 종이라는 것을 알 수 있었다. 흥미로운 것은 이들 세균에 의해 치사된 곤충의 체색은 SB를 제외하고 모두 흑색인 반면, SB는 마치 기주선충에 의해 치사된 곤충처럼 갈색을 나타냈다. 다음 표 1은 곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충으로부터 분리된 4개의 분리 균주들의 형태(morphology) 및 생물학적 활성(biological activities)을 비교한 것이다.

^a 도 1 참조.

^b Highest sequence identity species matched by Blast search in NCBI Genbank.

^c Hemocoelic injection of 6.0 x 10⁵ bacterial cells to 5th instar larvae. Insecticidal activity was measured 24 h after the injection.

^d 250 ppm

이들 세균의 병원력을 파밤나방을 대상으로 비교하였다. 도 4 및 5는 곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충으로부터 분리된 4개의 분리 균주들의 곤충병원력 검정 결과이다. 파밤나방 5령충에 4가지 분리 균주를 한 균주 당 세 가지의 다른 농도로 주입하였으며, 10마리를 한 실험단위로 하였다. 도 4는 24시간 경과 후의 치사율을 나타낸 것이고, 도 5는 48시간 경과후의 치사율을 나타낸 것이다. 모든 세균은 48시간이 경과하면 병원력을 보이나, 이들 병원력에는 차이가 있었다. 이 가운데 SB는 가장 높은 살충력을 보유하였다. Bucher (1960)의 기준에 따르면 10⁴ 세균밀도 이하의 세균농도에서 병원력이 유발되면 곤충병원세균으로 간주하는 데, SB는 10³ 세균밀도에서도 병원력을 유발하여 곤충병원세균으로 간주할 수 있었다. 이러한 결과는 이 선충의 주요 공생세균이 SB일 가능성이 높음을 시사하는 것이다. 이러한 가능성은 이 세균의 높은 병원력과 치사된 곤충의 체색에서도 뒷받침된다.

다시 SB 세균의 종 동정을 위해 16S rDNA를 분석한 결과 세라티아(Serratia) 속의 종일 가능이 높았다. 다음 표 2는 SB 세균의 16S rDNA를 분석하여 다른 세균 종과 비교한 결과이다.

¹ NCBI access number: ^aEF070125, ^bEF208031, ^cEU036987, ^dDQ439976.

² Match score was obtained from NCBI blast.

전자현미경 사진에서는 이 세균류의 운동성을 뒷받침해줄 수 있는 편모(flagella)의 모습이 뚜렷하게 관찰되었다 (도 6). 도 6은 SB 세균의 투과전자현미경 사진으로, 왼쪽은 3,000 배율로 관찰한 사진이며, 오른쪽은 12,000 배율로 관찰한 사진이다. 사진의 화살표는 이 세균의 편모(flagella)가 난 세포벽 부위를 가리킨다.

세균이 이용하는 탄소원을 대상으로 SB 세균과 세라티아 속에 속하는 10개의 종들을 비교하였다. 결과는 다음 표 3과 같다.

^a 세라티아 속의 특성은 Grimont and Grimont [22]로부터 인용되었다.

'Sm': S. marcescens,

'Sg': S. grimesii

'Sl': S. liquefaciens

'Sr': S. rubidaea

'Sfi': S. ficaria

'So': S. odorifera

'Sfo': S. fonticola

'Spl': S. plymuthica

'Spr': S. rubidaea

'Se': S. entomophila

'+': 균주의 90% 이상이 양성

'-': 균주의 10% 이하가 양성

'v(+)': 균주의 50% 이상이 양성

'v(-)': 균주의 50% 이상이 음성

'w':　weak reactions.

비교 결과, SB는 Serratia marcescens와 가장 높은 유사도를 나타냈다. 이러한 결과를 토대로 본 발명에서 분리된 SB 세균을 세라티아(Serratia) sp. ANU101로 명명하고, 수탁번호 KACC 91380P로 농업생명공학연구원에 2008년 5월 21일자로 기탁하였다.

Serratia sp. ANU101의 유용성을 살펴보기 위해 이 세균의 단독 및 비티 상용화제품과의 혼용을 실시하였다. 파밤나방 5령충을 대상으로 하였으며, 모든 실험은 섭식법으로 진행되었다. 'SB'는 2,000 ppm을 투여하고, 'BT'는 500 ppm을 투여하였으며, 대조군('CON')에는 대신 증류수를 투여하였다. 치사율은 처치 3일 후의 생존 데이터로 산출하였다. 각 처치는 10마리를 실험단위로 하여 3반복 실시하였다. 결과는 도 7과 같다. Serratia sp. ANU101을 단독으로 섭식 처리하면 살충력을 보이지 않았다. 그러나 비티제품과 혼용하여 처리하면 비티의 병원력을 크게 높이는 상승효과를 가져왔다. 유사한 면역억제 곤충병원세균들이 비티와의 혼합효과를 보여(Jung and Kim, 2006a,b; Yi et al., 2007) 이러한 현상을 뒷받침하여 주고 있다.

Serratia sp. ANU101의 살충 병원 효과가 어디에서 기인되는 지를 알아보기 위해 이들 세균이 보이는 면역억제 효과를 살펴보았다. SB 세균의 세포독성 분석결과는 도 8 내지 10과 같다. 먼저 이 세균을 충체에 주입한 결과 시간 경과에 따라 파밤나방의 혈구 밀도가 감소하는 것으로 관찰되었고, 이에 따라 세균의 밀도가 증가하게 되어 결국 패혈증이 일어나게 되었다 (도 8). 이때 이 세균의 배양액중에 이러한 면역억제물질이 있는지 알아보기 위해 배양액을 0.22㎛의 여과지에서 세균을 제거한 후 배양액을 곤충에 다시 주입하였다. 주입된 지 6시간만에 혈구를 조사하여 보니, 전체 혈구수의 감소는 물론이고(도 9), 면역 기능에 중요한 과립혈구와 부정형혈구가 선택적으로 감소하는 것을 관찰하였다(도 10). 도 10에서 분석된 혈구(Hemocyte)에는 GR(granular cell), PL(plasmatocyte), OE(oenocytoid), SP(spherulocyte), PH(and prohemocyte)가 포함된다.

이상의 결과는 S. monticolum에서 분리된 Serratia sp. ANU101이 주요 곤충병원세균이며, 이 세균이 곤충의 면역기능을 억제하여 패혈증을 유발하는 인자임을 시사한다. 또한 이 세균과 비티를 혼합할 경우 비티의 높은 병원력을 유발하는 상승효과를 가져올 수 있다.

도 1은 곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충으로부터 분리되어 NBTA에서 성장한 4개의 다른 콜로니들, 즉 'BR', 'SB', 'PR' 및 'MR'을 보여주는 사진이며, 도 2는 이들 4개 콜로니의 상대적인 빈도를 그래프로 나타낸 것이며, 도 3은 16S rDNA 염기서열을 이용한 이들의 계통발생도(phylogenetic tree)이다.

도 4 및 5는 곤충병원선충(S. monticolum)의 감염태 유충으로부터 분리된 4개의 분리 균주들의 곤충병원력 검정 결과로, 도 4는 24시간 경과후의 치사율을 나타낸 것이며, 도 5는 48시간 경과 후의 치사율을 나타낸 것이다.

도 6은 SB 세균의 투과전자현미경 사진으로, 왼쪽은 3,000 배율로 관찰한 사진이며, 오른쪽은 12,000 배율로 관찰한 사진이다.

도 7은 파밤나방 5령충을 대상으로 한 섭식실험결과로, 'SB'는 2,000 ppm을 투여하고, 'BT'는 500 ppm을 투여하였으며, 대조군('CON')은 대신 증류수를 투여하였다 (Different letters on the standard deviations represent significant differences among means at Type I error = 0.05 (LSD test)).

도 8은 SB 세균의 세포독성 분석결과로, 시간 경과에 따른 파밤나방의 혈구 밀도 및 세균 밀도를 나타낸 것이다 (The error bars represent standard deviations).

도 9 및 10은 SB 배양액 중의 세균을 제거하고 배양액을 다시 곤충에 주입한 후 6시간 뒤의 결과로, 도 9는 전체 혈구수 결과이며, 도 10은 혈구 종류별 결과로 GR(granular cell), PL(plasmatocyte), OE(oenocytoid), SP(spherulocyte), PH(and prohemocyte)의 결과이다 (Asterisk above standard deviation indicates significant difference between two means at Type I error = 0.05 (LSD test), while 'ns'represents not-significant difference).

Claims

슈타이너네마 몬티콜럼(Steinernema monticolum)에서 유래된 세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P).
세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P) 또는 이의 배양액을 포함하는 해충 방제제.
세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P)와 비티를 포함하는 해충 방제제.
세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P)의 배양액과 비티를 포함하는 해충 방제제.
세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P) 또는 이의 배양액을 사용하는 해충 방제방법.
세라티아(Serratia) sp. ANU101 (KACC 91380P) 또는 이의 배양액을 비티와 함께 사용하는 해충 방제방법.