KR20100004107A - 인간 ｆｃ 감마 수용체 ⅲ - Google Patents

인간 ｆｃ 감마 수용체 ⅲ Download PDF

Info

Publication number
KR20100004107A
KR20100004107A KR1020097022932A KR20097022932A KR20100004107A KR 20100004107 A KR20100004107 A KR 20100004107A KR 1020097022932 A KR1020097022932 A KR 1020097022932A KR 20097022932 A KR20097022932 A KR 20097022932A KR 20100004107 A KR20100004107 A KR 20100004107A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
recombinant human
gamma receptor
seq
immunoglobulin
receptor iiia
Prior art date
Application number
KR1020097022932A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101213891B1 (ko
Inventor
울리히 브린크만
페터 브루엔커
콜러 클라우디아 페라라
마틴 란첸되르퍼
요에르그 토마스 레굴라
틸만 슐로트호이에르
스테판 세베르
안네 체크
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
글리카트 바이오테크놀로지 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게, 글리카트 바이오테크놀로지 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20100004107A publication Critical patent/KR20100004107A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101213891B1 publication Critical patent/KR101213891B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 면역글로불린 수용체의 분야에 관한 것이다. 인간 태아 신장 세포 및 중국 햄스터 난소 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 당 구조가 보고된다.

Description

인간 ＦＣ 감마 수용체 Ⅲ{HUMAN FC GAMMA RECEPTOR III}
본 발명은 인간 면역글로불린 수용체의 분야에 관한 것이다. 인간 태아 신장(HEK) 세포 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 당 구조(glycostructure)가 본원에서 보고되고, 특히 본 발명은 이의 당 구조에 관한 것이다.
면역글로불린은 일반적으로 2개의 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 항원과 특이적으로 상호작용할 수 있는 하나 이상의 결합 도메인을 함유하는 가변 영역(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 부분)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 불변 영역(일반적으로 카복시 말단 부분)을 또한 포함한다. 중쇄의 불변 영역은, 예를 들어 Fc 감마 수용체(FcγR)를 갖는 세포, 예컨대 식세포, 또는 브람벨(Brambell) 수용체로도 공지된 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 갖는 세포로의 면역글로불린의 결합을 조정한다. 이는 또한 전통적인 상보 시스템의 인자, 예컨대 성분(C1q)을 비롯한 일부 인자로의 결합을 조정한다.
면역글로불린 분자는 5개의 상이한 부류로 분류된다: IgA(부류 A의 면역글로불린), IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이러한 부류내에서, 면역글로불린은 이들의 전체 구조에 있어서는 상이하지만, 빌딩 블록은 매우 유사하다.
후렛(Hulett) 및 호가드(Hogarth)(문헌[Hulett, M.D. and Hogarth, P.M., Adv. Immunol. 57 (1994) 1-127])는 부류 G의 면역글로불린의 Fc 부분에 대한 세포외 수용체가 상이한 결합 특이성을 갖는 3개의 상이한 수용체 유형(FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII)을 포함하는 막 투과 당단백질의 계열이다. 유형 I의 수용체는 착물화되지 않은 IgG와 상호작용하는 반면에, 유형 II 및 III의 수용체는 바람직하게는 착물화된 IgG와 상호작용한다. 인간 FcγRIII(CD16)은 2개의 이성질형 및 2개의 다형체 형태로 존재한다. 제 1 이성질형 RcγRIIIa는 제 2 이성질형 RcγIIIb와는 상이한 유전자에 의해 코딩되는 막 투과 분자로서, GPI-고착된 막 단백질이다. 제 1 다형체 형태 V159는 아미노산 서열의 위치 159에 발린 잔기를 갖는 반면에, 제 2 다형체 형태 F159는 위치 159에 페닐알라닌 잔기를 갖는다.
다까하시(Takahashi) 등은 BHK 세포에서 생성된 재조합 인간 가용성 FcγRIII의 N-당화(glycosylation) 프로파일을 보고한다(문헌[Takahashi, N., et al., Glycobiology 12 (2002) 507-515]). FcγRIIIb 엑토도메인(ectodomain) 및 단량체성 인간 IgG 하위부류 사이의 상호작용의 친화도는 갈론(Galon) 등에 의해 보고되었다(문헌[Galon, J., et al., Eur. J. Immunol. 27 (1997) 1928-1932]). CD16 이성질형에 의한 리간드 결합 및 식세포 작용은 나가라잔(Nagarajan) 등에 의해 보고되었다(문헌[Nagarajan, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 25762-25770]). 유럽특허출원 제1314741호는 이특이적 항-CD19 x 항-CD16 항체 및 이의 용도를 보고한다.
본 발명의 목적은 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 특정 당 구조를 제공하는 것, 즉 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 특정 위치에 부착된 일련의 올리고당을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 Fc 감마 수용체의 당 구조의 분야에서의 여러 가지 양상을 포함한다. 제 1 양상은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고; SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa이다:
Figure 112009067353333-PCT00001
Figure 112009067353333-PCT00002
한 양태에서, 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 75에서 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00003
다른 양태에서, 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00004
Figure 112009067353333-PCT00005
다른 양태에서, 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 170에서 하기 N-결합 올리고당을 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00006
다른 양태에서, 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 180 또는 181에서 하기 O-결합 올리고당을 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00007
한 양태에서, 수용체는 아미노산 위치 159에서 페닐알라닌을 갖는다.
본 발명의 제 2 양상은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고; SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa이다:
Figure 112009067353333-PCT00008
본 발명의 제 3 양상은 (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계; (ii) 본 발명에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 제공하는 단계; (iii) 상기 면역글로불린을 상기 Fc 감마 수용체와 접촉시키는 단계; 및 (iv) 상기 Fc 감마 수용체에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법이다.
한 양태에서, Fc 감마 수용체는 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 고체 상에 접합된다.
다른 양태에서, Fc 감마 수용체 또는 면역글로불린의 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 아미노산 골격의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 또 다른 양태에서, Fc 감마 수용체 또는 면역글로불린의 접합은 스트렙타비딘(Streptavidin) 또는 아비딘(Avidin)/바이오틴; 항체/항원; 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 면역글로불린 G/단백질 A 및/또는 단백질 G 및/또는 단백질 L로 이루어진 특이적인 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 군으로부터 선택되는 특이적인 결합 쌍을 통해 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 양태에서, Fc 감마 수용체에 대한 면역글로불린의 결합의 측정은 표면 플라즈몬 공명, 어쿠스틱 공명, 형광 공명 에너지 전이, 면역 측정, 전반사, 섬유 광학, 표면 플라즈몬 공명 강화된 형광 또는 형광 활성화된 세포 분류에 의해 수행된다.
본 발명의 다른 양상은 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서, (a) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, HEK 293 세포에서 발현되고; (b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 상이한 N-결합 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 조성물이다:
Figure 112009067353333-PCT00009
Figure 112009067353333-PCT00010
본 발명의 또 다른 양상은 (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계; (ii) 본 발명에 따라서 HEK 293 세포로부터 수득한 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함 하는 조성물을 제공하는 단계; (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, HEK 293 세포로부터 수득된 본 발명에 따른 조성물에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법이다.
상기 방법의 한 양태에서, 재조합 인간 Fc 감마 수용체는 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 아미노산 골격의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀계 작용기, 또는 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 또 다른 양태는 고체 상에 대한 접합이 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴; 항체/항원; 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 면역글로불린 G/단백질 A 및/또는 단백질 G 및/또는 단백질 L로 이루어진 특이적인 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 군으로부터 선택되는 특이적인 결합 쌍을 통해 수행되는 것이다.
다른 양태에서, 측정은 표면 플라즈몬 공명, 어쿠스틱 공명, 형광 공명 에너지 전이, 면역 측정, 전반사, 섬유 광학, 표면 플라즈몬 공명 강화된 형광 및 형광 활성화된 세포 분류로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다. 표면 플라즈몬 공명에 의한 측정이 바람직하다. 방법의 다른 양태는 면역 측정, 예컨대 이종 면역 측정 또는 샌드위치 면역 측정에 의해 수행되는 것이다. 다른 양태에서, 샌드위치 면역 측정은 고체 상에 고정된 포획 항체, 및 직접 또는 간접 검출에 적합한 검출 항체를 포함한다. 한 양태에서, 검출 항체는 화학발광 기, 형광 기, 발광 금속 착물, 효소 및 방사성 동위원소로부터 선택되는 검출가능한 표지를 포함한다.
다른 양태에서, 검출 항체는 합텐 또는 항원/항체; 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘; 당/렉틴; 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산; 및 수용체/리간드로부터 선택되는 바이오아핀(bioaffine) 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 제 1 파트너를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 (i) 진핵 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 제공된 진핵 세포를 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 코딩하는 이종 핵산으로 형질감염시키는 단계; (iii) 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 발현하기에 적합한 조건하에 상기 형질감염된 진핵 세포를 배양하는 단계; 및 (iv) 상기 진핵 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 회수하는 단계를 포함하는, 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 재조합 제조하는 방법으로서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하는 조성물로서 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 제조하는 방법이다.
한 양태에서, 진핵 세포는 HEK 293 세포이고, 상기 2개 이상의 상이한 올리고당은 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택된다:
Figure 112009067353333-PCT00011
Figure 112009067353333-PCT00012
다른 양태에서, 진핵 세포는 CHO 세포이고, 상기 2개 이상의 상이한 올리고 당은 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택된다:
Figure 112009067353333-PCT00013
본 발명의 다른 양상은 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서, (a) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, CHO 세포에서 발현되고; (b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 조성물이다:
Figure 112009067353333-PCT00014
Figure 112009067353333-PCT00015
본 발명의 다른 양상은 (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계; (ii) 본 발명에 따라서 CHO 세포로부터 수득된 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계를 포함하 는, CHO 세포로부터 수득된 본 발명에 따른 조성물에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법이다.
한 양태에서, 재조합 인간 Fc 감마 수용체는 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 면역글로불린은 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 아미노산 골격의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀계 작용기, 또는 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 또 다른 양태는 고체 상에 대한 접합이 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴; 항체/항원; 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 면역글로불린 G/단백질 A 및/또는 단백질 G 및/또는 단백질 L로 이루어진 특이적인 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 군으로부터 선택되는 특이적인 결합 쌍을 통해 수행되는 것이다.
본 발명의 상기 양상의 다른 양태에서, 측정은 표면 플라즈몬 공명, 어쿠스틱 공명, 형광 공명 에너지 전이, 면역 측정, 전반사, 섬유 광학, 표면 플라즈몬 공명 강화된 형광 및 형광 활성화된 세포 분류로부터 선택되는 방법에 의해 수행된다. 표면 플라즈몬 공명에 의한 측정이 바람직하다. 다른 양태에서, 측정의 면역 측정에 의해 수행된다. 또 다른 양태에서, 면역 측정은 이종 면역 측정이다. 다른 양태에서, 면역 측정은 샌드위치 면역 측정이다. 다른 양태에서, 상기 샌드위치 면역 측정은 고체 상에 고정된 포획 항체, 및 직접 또는 간접 검출에 적합한 검출 항체를 포함한다. 다른 양태에서, 검출 항체는 화학발광 기, 형광 기, 발광 금속 착물, 효소 및 방사성 동위원소로부터 선택되는 검출가능한 표지를 포함한다. 또 다른 양태에서, 검출 항체는 합텐 또는 항원/항체; 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘; 당/렉틴; 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산; 및 수용체/리간드로부터 선택되는 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 파트너를 포함한다.
도 1은 SEQ ID NO: 1의 163 위치에서의 주된 N-결합 올리고당을 도시한다.
도 2는 pCLF60의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 3은 HEK 세포내에서 발현된 Fc 감마 RIIIa의 바이아코어(BIAcore) 분석 크로마토그램을 도시한다.
도 4는 CHO 세포에서 발현된 Fc 감마 RIIIa의 바이아코어 분석 크로마토그램을 도시한다.
도 5는 스캔 이벤트 사이클(scan event cycle)의 시간적 표현을 도시한다.
도 6은 엔도프로테인아제 Glu-C/키모트립신 절단부의 RP-분리에 대한 전체 이온 크로마토그램을 도시한다(A: 전체 이온 크로마토그램; B: SID-스캔, 당 특이적인 단편 이온에 대해 선택되는 이온 크로마토그램).
본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 하나의 N-결합 올리고당을 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함한다.
한 양태에서, 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa는 HEK 세포, 바람직하게는 HEK 293 세포에서 발현된다. 다른 양태에서, 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa는 CHO 세포에서 발현된다.
본 발명을 수행하는데 유용한, 당업자에게 공지된 방법 및 기술은 문헌[Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "핵산"은 재조합적으로 제조될 수 있는 폴리펩티드를 코팅하는, 자연적으로 발생하거나, 부분적으로 또는 완전히 비-자연적으로 발생하는 핵산을 지칭한다. 핵산은 단량체로서 뉴클레오티드를 포함하는 중합체 분자이다. 핵산은 화학적인 수단에 의해 단리되거나 합성되는 DNA-단편을 형성할 수 있다. 핵산은, 예를 들어 발현 플라스미드 또는 진핵 숙주 세포의 게놈/염색체내에서 다른 핵산에 통합될 수 있다. 용어 "플라스미드"는 셔틀 또는 발현 벡터를 포함한다. 전형적으로, 플라스미드는 또한 박테리아/원핵 생물내의 플라스미드의 복제 및 선택 각각을 위한, 복제 시발점(예를 들어, ColEl 복제 시발점) 및 선택 표지자(예를 들어, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성 유전자)를 포함하는 원핵 증식 단위를 포함할 것이다.
핵산은 또한 개별적인 뉴클레오티드로 구성된 핵산 서열 또는/및 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
"발현 카세트"는 적어도 세포내에 함유된 구조 유전자의 발현 및 분비에 필수적인 요소를 함유하는 핵산을 지칭한다.
"유전자"는, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 필수적인 플라스미드 또는 염색체상의 분절을 나타낸다. 코딩 영역 외에, 유전자는 프로모터, 인트론 및 종결자를 비롯한 다른 기능적인 요소를 포함한다.
"구조 유전자"는 신호 서열이 없는 유전자의 폴리펩티드 코딩 영역을 나타낸다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "내성 유전자" 또는 "선택 표지자"는 이를 갖는 세포가 상응하는 선택 시약의 존재하에 이를 위하여 또는 이에 대항하여 특이적으로 선택되도록 하는 유전자/핵산이다. 유용한 양성 내성 유전자는 항생 물질에 대한 내성 유전자이다. 이러한 선택 표지자는 상응하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포가 상응하는 항생 물질의 존재하에 이를 위하여 양성적으로 선택되도록 한다. 형질전환되지 않은 숙주 세포는 상응하는 선택 시약의 존재하에, 즉 선택적인 배양 조건하에 성장하고/하거나 생존할 수 없다. 선택 표지자는 양성, 음성 또는 이작용성일 수 있다. 양성 선택 표지자는 표지자를 갖는 세포의 선택을 가능하게 하는 반면에, 음성 선택 표지자는 표지자를 갖는 세포를 선택적으로 제거하도록 한다. 전형적으로, 선택 표지자는 약물에 내성을 주거나, 숙주 세포내의 대사 또는 이화 결함을 보충할 것이다. 진핵 세포에 유용한 선택 표지자는, 예를 들어 아미노글리코시드 인산 전이 효소(APH), 예컨대 하이그로마이신 인산 전이 효소(hyg), 네오마이신 및 G418 APH, 다이하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR), 티미딘 키나제(tk), 글루타민 합성 효소(GS), 아스파라긴 합성 효소, 트립토판 합성 효소(인돌), 및 히스티딘올 탈수소 효소(히스티딘올 D)를 위한 유전자, 및 푸로마이신, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로르암페니콜, 제오신(Zeocin) 및 마이코페놀산에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다. 추가의 선택 표지자는, 예를 들어 국제특허공개 제92/08796호 및 제94/28143호에 보고되었다.
분비된 폴리펩티드를 제조하기 위하여, 해당 구조 유전자는 또한 신호 서열/리더 펩티드를 코딩하는 DNA 분절을 포함한다. 신호 서열은 폴리펩티드가 분비를 위해 루트를 정할 수 있는 소포체(ER)의 막으로 및 막을 통해 새로이 합성된 폴리펩티드를 지향한다. 신호 서열은 단백질이 ER 막을 통과하는 동안 신호 펩티다제에 의해 분해된다. 신호 서열의 기능에 관하여, 숙주 세포의 분비 기관에 대한 인식이 필수적이다. 따라서, 사용된 신호 서열은 숙주 세포의 단백질 및 분비 기관의 효소에 의해 인식되어야 한다.
번역 조절 요소는 번역 개시자(AUG) 및 중단 코돈(TAA, TAG 또는 TGA)을 포함한다. 내부 리보솜 도입 부위(IRES)가 일부 구성체에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 숙주 세포내에서 발생하는 핵산의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 숙주 세포내의 목적 핵산의 전사의 수준은 상기 세포내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기초로 하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 핵산으로부터 전사된 mRNA는 PCR 또는 노턴(Northern) 하이브리드화에 의해 정량화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 참고). 선택된 핵산에 의해 코딩된 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 ELISA에 의해, 단백질의 생물학적 활성에 대한 분석에 의해, 또는 단백질을 인식하고 이에 결합하는 항체를 사용하는, 상기 활성과는 독립적인 분석, 예컨대 웨스턴 블로팅(Western blotting) 또는 방사 면역 측정을 사용하여 정량화될 수 있다(상기 삼브룩(Sambrook) 등의 1989년 문헌 참고),
"숙주 세포"는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자/핵산이 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 플라스미드/벡터의 증식에 사용된 원핵 세포, 및 구조 유전자의 발현에 사용된 진핵 세포 둘다를 포함한다. 전형적으로, 진핵 세포는 포유동물 세포이다.
"폴리펩티드"는 자연적으로 또는 합성적으로 생성되고, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭될 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 100개 이상의 아미노산의 길이의 단일 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드는 "단백질"로서 지칭될 수 있다.
"단백질"은 100개 이상의 아미노산의 길이의 단일 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 폴리펩티드를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드성 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 기 및 다른 비-펩티드성 성분은 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있고, 세포의 유형에 따라 변할 수 있다. 단백질은 본원에서 이의 아미노산 골격 구조/아미노산 서열에 의해 정의되고; 탄수화물 기와 같은 첨가물은 일반적으로 열거되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
"이종 DNA" 또는 "이종 폴리펩티드"는 소정 숙주 세포내에 자연적으로는 존재하지 않는 DNA 분자 또는 폴리펩티드, 또는 DNA 분자의 집단 또는 폴리펩티드의 집단을 지칭한다. 특정 숙주 세포와 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종으로부터 유래하는 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 숙주 DNA에 작동가능하게 결합된 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA를 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자인 것으로 간주된다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작동가능하게 결합된 내인성 구조 유전자를 포함할 수 있다.
비-숙주 DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포내에서 자발적으로 복제하는 능력을 갖는 핵산 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 파지이미드 또는 박테리아 인공 염색체(BAC)이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 측정가능한 방식으로 핵산의 삽입을 가능하게 하는 하나 또는 소수의 억제 엔도뉴클레아제 인식 부위, 및 클로닝 벡터로 형질감염된 세포의 동정 및 선택에 사용하기에 적합한 선택 표지자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 내성 유전자는 전형적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 플라스미드"는 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는, 예를 들어 대장균의 경우에 복제 시발점, 및 선택 표지자를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 플라스미드 증식 단위, 진핵 세포 선택 표지자, 및 각각 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결자를 포함하는 해당 구조 유전자의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 통상적으로 프로모터의 제어하에 위치되고, 이러한 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 결합된" 것으로 지칭된다. 유사하게, 조절 요소가 핵심 프로모터의 활성을 조절하는 경우, 조절 요소 및 핵심 프로모터는 작동가능하게 결합된다.
"단리된 폴리펩티드"는 세포 성분, 예컨대 탄수화물, 지질, 또는 자연적인 폴리펩티드와 회합된, 즉 공유 결합하지 않는 다른 단백질성 불순물을 본질적으로 오염시키지 않는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리된 폴리펩티드의 제형을 고도로 정제된 형태, 즉 약 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95% 초과의 순도, 또는 99% 초과의 순도의 폴리펩티드를 함유한다. 특정 단백질 제형이 단리된 폴리펩티드를 함유하는 것을 나타내는 하나의 방식은 단백질 제형의 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색에 따른 단일 밴드의 출현이다. 그러나, 용어 "단리된"은 선택적인 물리적 형태, 예컨대 이량체 또는 선택적으로 당화되거나 유도체화된 형태인 동일한 폴리펩티드의 존재를 제외하지 않는다.
용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변 영역 유전자 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 다양한 형식, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2 및 단일 쇄(scFv)로 존재할 수 있다(예를 들어, 문헌[Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426]; 일반적으로, 문헌[Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16]).
"면역글로불린 단편"은 면역글로불린의 쇄의 하나 이상의 불변 도메인, 즉, 면역글로불린의 중쇄의 CH1 도메인, 힌지-영역, CH2 도메인, CH3 도메인 및 선택적으로 CH4 도메인, 또는 면역글로불린의 경쇄의 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 이들의 유도체 및 변형을 포함한다. 부가적으로, 하나 이상의 아미노산 또는 아미노산 영역이 삭제된 가변 도메인이 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아미노산"은 알라닌(세글자 부호: ala, 한글자 부호: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소류신(ile, I), 류신(leu, L), 리신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 티로신(thr, Y) 및 발린(val, V)을 포함한다.
본 발명의 제 1 양상은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, HEK 293 세포에서 발현되어 단리되고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 N-결합 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa이다:
Figure 112009067353333-PCT00016
Figure 112009067353333-PCT00017
SEQ ID NO: 1은 한글자 부호로 주어진 하기 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112009067353333-PCT00018
SEQ ID NO: 1은 신호 펩티드를 포함하는 완전한 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2로 주어지는, 인간 Fc 감마 수용체 유형 III의 세포외 도메인을 나타낸다(예를 들어, 스위스-프로트(Swiss-Prot) 등록번호 P08637을 또한 참고).
본 발명의 상이한 N- 또는 O-결합 올리고당의 표시를 위해서, 개별적인 당 잔기는 올리고당 분자의 비-환원 말단으로부터 환원 말단까지 열거된다. 가장 긴 당 쇄는 표시를 위한 기본 쇄로서 선택된다. N- 또는 O-결합 올리고당의 환원 말단은 당 잔기이고, 수용체의 아미노산 골격의 아미노산에 직접 결합하는 반면, 기본 쇄의 환원 말단으로서 반대 말단에 위치하는 N- 또는 O-결합 올리고당의 말단은 비-환원 말단으로 지칭된다.
본 발명의 제 2 양상은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, CHO 세포에서 발현되어 단리되고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa이다:
Figure 112009067353333-PCT00019
SEQ ID NO: 1에서 5개의 N-당화 부위가 발견될 수 있는 사실에 기인하여, 당화 패턴은 전체 단백질 질량 분석, 또는 단지 글리칸의 분석에 의해 연구될 수 없다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 163 및 위치 170 각각에서의 당화 부위와 같이, SEQ ID NO: 1의 위치 39 및 위치 46 각각에서의 당화 부위는 서로 매우 근접하다. 이러한 당화 부위의 쌍을 분리하는 절단을 위해서, 특별한 효소가 필요하다.
폴리펩티드의 절단, 즉 효소적 분해를 위해서, 상이한 엔도프로테아제, 예컨대 Glu-C(황색포도상구균(Staphylococcus aureus; 프로테아제 V8(Protease V8)으로부터의 엔도프로테아제, C-말단 글루탐산 잔기에 대해 특이적임), 시알리다제(Sialidase, 말단 아세틸 뉴라민산 잔기의 가수분해를 촉매화하는 뉴라미다제) 및 키모트핍신(Chymotrypsin; 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌에 대한 N-말단 펩티드 결합을 분해하는 엔도펩티다제)이 사용될 수 있다.
놀랍게도, 선택적으로 부가적인 시알리다제와 함께, Glu-C 및 키모트립신을 사용한 조합된 절단이 당화의 분석을 위한 최선의 결과, 즉 SEQ ID NO:의 위치 163에서의 당 구조를 제공함이 본 발명에서 밝혀졌다. 당화의 분석이 폴리펩티드의 환원, 알킬화 및 효소적 분해, 및 이어서 전자분무 이온화를 사용하는 MS 검출(SID 스캔 및 MS-MS 커플링) 및 LTQ FT 질량 분광계(각각의 완전한 MS 스캔에 이어서 5개의 MS/MS 스캔을 사용하는 선형 트랩 질량 분광계)를 사용하는 역상(RP) HPL-크로마토그래피에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 당화 패턴은 매우 복잡하고, 놀랍게도, 구조 설명이 MS/MS 분석에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다.
본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "당 구조", "당화" 및 "클리코실화 패턴"은 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기에 부착되는 모든 올리고당을 포함한다. 세포의 당화 이종성에 기인하여, 재조합적으로 제조된 폴리펩티드는 특정 아미노산 잔기에서 한정된 단일 N- 또는 O-결합 올리고당뿐만 아니라, 각각 동일한 아미노산 서열을 갖지만 상기 특정 아미노산 위치에서 상이한 올리고당을 포함하는 폴리펩티드의 혼합물을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 특정 아미노산 위치에 부착되는 올리고당의 군, 즉 부착된 올리고당의 이종성을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "올리고당"은 2개 이상의 공유적으로 결합된 단당류 단위를 포함하는 중합체 당류를 나타낸다.
상기 보고된 접근법과 함께, 본 발명의 제 1 양상에 대해 SEQ ID NO: 1의 위치 163에서의 하기 주요 N-결합 올리고당이 동정되었다(□= N-아세틸글루코스아민[GlcNac], ∇= 푸코스[Fuc], ○=만노스[Man], □= N-아세틸헥소스[HexNAc], ◇= N-아세틸뉴라민산[NeuAc], ○=갈락토스[Gal]; 또한 도 1 참고):
Figure 112009067353333-PCT00020
Figure 112009067353333-PCT00021
본 발명의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa는 상이한 상대 빈도를 갖는 상기 동정된 N-결합 올리고당을 포함하는 상이하게 당화된 분자의 혼합물이다. 재조합 수용체는 또한 본원에 언급된 하나 이상의 당화 부위에서 어느 정도까지는 당화되지 않을 것이다. 따라서, 본원에 제공된 당화 프로파일은 평균 당화 프로파일이다. 따라서, 본 발명의 한 양상은 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, HEK 293 세포에서 발현되고/되거나 단리되고; SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 2개 이상의 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 조성물이다:
Figure 112009067353333-PCT00022
Figure 112009067353333-PCT00023
HEK 세포에서 발현되는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 SEQ ID NO: 1의 위치 163에서의 주요 N-결합 올리고당은 올리고당 번호 1이고, 제 2 N-결합 올리고당은 올리고당 번호 4이다.
상기 동정된 접근법을 사용하여, SEQ ID NO: 1의 다른 아미노산 위치에서의 N- 및 O-결합 올리고당이 또한 동정되었다.
본 발명의 한 양태에서, HEK 293 세포에서 발현되는 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 75에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00024
Figure 112009067353333-PCT00025
HEK 293 세포에서 발현되는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 SEQ ID NO: 1의 위치 75에서의 주요 N-결합 올리고당은 올리고당 번호 10이다. SEQ ID NO: 1의 위치 75에서의 제 2 N-결합 올리고당은 올리고당 번호 11 및 12중 하나이다.
다른 양태에서, HEK 293 세포에서 발현되는 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00026
Figure 112009067353333-PCT00027
다른 양태에서, HEK 293 세포에서 발현되는 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 170에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당을 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00028
다른 양태에서, HEK 293 세포에서 발현되는 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 180 또는 181에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 O-결합 올리고당을 포함한다:
Figure 112009067353333-PCT00029
한 양태에서, 수용체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 159에서 페닐알라닌을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "HexNAc"는 N-아세틸화된 갈락토스아민 또는 글루코스아민 당 잔기(GalNAc 또는 GlcNAc)를 나타낸다.
본 발명의 다른 양상은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, CHO 세포에서 발현되어 단리되고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa이다:
Figure 112009067353333-PCT00030
본 발명의 다른 양상은 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, CHO 세포에서 발현되고/되거나 단리되고; SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 2개 이상의 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 조성물이다:
Figure 112009067353333-PCT00031
본 발명의 다른 양상은 (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계; (ii) 본 발명에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 제공하는 단계; (iii) 상기 면역글로불린을 상기 Fc 감마 수용체와 접촉시키는 단계; 및 (iv) 상기 Fc 감마 수용체에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 Fc 감마 수용체에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법이다.
분석할 면역글로불린은, 예를 들어 단리된 면역글로불린, 면역글로불린의 혼합물, 또는 샘플일 수 있다.
다른 양상은 (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계; (ii) 본 발명에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체를 포함하는 조성물에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 조성물에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법이다.
본 발명에 따른 "샘플"은 임의의 조직 또는 액체 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 상기 샘플은 액체 샘플, 예컨대 타액, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 바람직하게는, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 바람직하게는, 샘플은 세포-부재 샘플, 즉 세포를 함유하지 않는 샘플이다.
본 발명에 따른 수용체에 대한 면역글로불린의 결합에 적합한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있거나, 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 조건하에, 면역글로불린은 수용체에 결합하고, 면역글로불린 및 수용체 사이의 면역학적 착물이 형성되어 면역글로불린-수용체-착물을 생성한다. 이러한 착물은 임의이 적합한 수단에 의해 검출될 수 있다.
한 양태에서, 면역글로불린-수용체-착물은 면역 측정에 의해 검출된다. 사용된 면역 측정은 바람직하게는 이종 면역 측정이다.
한 양태에서, 면역글로불린-수용체-착물의 검출은 경쟁적 면역 측정, 또는 소위 샌드위치 면역 측정에 의해 달성된다.
당업자는 면역글로불린-수용체-착물을 검출할 수 있는 면역 측정을 설정하는데 어려움이 없을 것이다. 예를 들어, 이러한 검출은 수용체에 결합하는 에피토프와 중첩되지 않는 에피토프에서 면역글로불린에 결합하는 포획 항체로서 항체를 사용하는 샌드위치 유형 면역 측정으로 수행될 수 있다. 면역글로불린-수용체-착물의 검출을 위해서, 면역글로불린 또는 포획 항체에 의해 인식되지 않는 에피토프에 결합하는 수용체에 대한 제 2 또는 검출 항체를 사용하는 것이 가능하다.
한 양태에서, 검출 항체-면역글로불린-수용체-착물 샌드위치를 형성하는데 사용할 수 있는 검출 항체가 사용된다. 상기 제 2 또는 검출 항체는 바람직하게는 직접 또는 간점 검출을 용이하게 하는 방식으로 표지된다.
직접 검출의 경우, 표지 기는 임의의 공지된 검출가능한 표지자 기, 예컨대 염료, 발광 표지 기, 예컨대 화학발광 기, 예컨대 아크리디늄 에스터 또는 다이옥세탄, 또는 형광 염료, 예컨대 플루오레세인, 쿠마린, 로드아민, 옥사진, 레소루핀, 사이아닌 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있다. 표지 기의 다른 예는 발광 금속 착물, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 착물, 예를 들어 ELISA 또는 CEDIA(클로닝된 효소 공여자 면역 측정, 예컨대 유럽특허출원 제0061888호)를 위해 사용되는 효소, 및 방사성 동위원소이다.
간접 검출 시스템은, 예를 들어 검출 시약, 예컨대 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 파트너로 표지된 검출 항체를 포함한다. 적합한 결합 쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예컨대 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합 쌍 구성원은 합텐, 항원 및 호르몬을 포함한다. 합텐, 예컨대 다이곡신, 다이곡시제닌 및 바이오틴 및 이들의 유사체가 특히 바람직하다. 상기 결합 쌍의 제 2 파트너, 예컨대 항체, 스트렙타비딘 등은 통상적으로 표지되어, 예를 들어 상기 언급한 바와 같은 표지에 의한 직접 검출을 가능하게 한다.
면역 측정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 측정, 및 실질적인 적용 및 절차를 수행하는 방법은 관련 문헌에 요약되어 있다. 관련 문헌의 예는 문헌[Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, in: Practice and theory of enzyme immunoassays Burdon, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990) pp. 221-278] 및 면역학적 검출 방법을 다루는 문헌[Methods in Enzymology, Colowick, S.P., Caplan, N.O., Eds. "Methods in Enzymology", Academic Press]의 다양한 권, 특히 70, 73, 74, 84, 92 및 121권이다.
모든 상기 면역학적 검출 방법에서, 조건은 사용된 시약의 결합, 예를 들어 이의 상응하는 수용체로의 면역글로불린의 결합을 가능하게 하도록 선택된다. 본 발명에 따라 검출된 면역글로불린-수용체-착물은, 당해 분야의 절차에 관한 문헌에 의하면, 예를 들어 샘플내의 면역글로불린 또는 수용체의 상응하는 농도에 대한 당업계의 절차의 언급과 관련된다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 Fc 감마 수용체는 고체 상에 접합된다. 다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법에서 면역글로불린은 고체 상에 접합된다.
다른 양태에서, Fc 감마 수용체 또는 면역글로불린의 접합은 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 아미노산 골격의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀계 작용기, 및/또는 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행된다. 다른 양태에서, 접합은 수동적인 흡착에 의해 수행된다. 또 다른 양태에서, Fc 감마 수용체 또는 면역글로불린의 접합은 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴; 항체/항원; 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 면역글로불린 G/단백질 A 및/또는 단백질 G 및/또는 단백질 L로 이루어진 특이적인 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 군으로부터 선택되는 특이적인 결합 쌍을 통해 수행된다.
다른 양태는 Fc 감마 수용체에 대한 면역글로불린의 결합의 측정이 표면 플라즈몬 공명, 어쿠스틱 공명, 형광 공명 에너지 전이, 면역 측정, 전반사, 섬유 광학, 표면 플라즈몬 공명 강화된 형광 및 형광 활성화된 세포 분류로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것이다. 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명, 효소 결합된 면역 흡착 분석, 또는 형광 공명 에너지 전이이다.
"고체 상"은 비-유체 물질을 나타내고, 중합체, 금속(상자성, 강자성 입자), 유리 및 세라믹과 같은 물질로부터 제조된 입자(마이크로입자 및 비드를 포함함); 실리카, 알루미나 및 중합체 겔과 같은 겔 물질; 중합체, 금속, 유리 및/또는 세라믹으로 만들어질 수 있는 모세관; 제올라이트 및 다른 다공성 물질; 전극; 마이크로티터 플레이트; 고체 스트립; 및 큐벳, 관 또는 다른 분광계 샘플 용기를 포함한다. 분석물의 고체 상 성분은 "고체 상"이 이의 표면에 하나 이상의 잔기를 함유하는 점에서 분석물이 접촉될 수 있는 불활성 고체 표면과 구별되고, 이는 분자와 화학적으로 상호작용할 목적으로 사용된다. 고체 상은 고정 성분, 예컨대 칩, 튜브, 스트립, 큐벳 또는 마이크로티터 플레이트일 수 있거나, 또는 비-고정 성분, 예컨대 비드 및 마이크로입자일 수 있다. 마이크로입자는 또한 균질한 분석물 형식을 위한 고체 상으로서 사용될 수 있다. 단백질 및 다른 물질의 비-공유 또는 공유 부착을 가능하게 하는 다양한 마이크로입자가 사용될 수 있다. 이러한 입자는 중합체 입자, 예컨대 폴리스타이렌 및 폴리(메틸메트아크릴레이트); 금 입자, 예컨대 금 나노입자 및 금 콜로이드; 및 세라믹 입자, 예컨대 실리카, 유리 및 금속 산화물 입자를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고로서 혼입되어 있는 문헌[Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, May 1 (1998) 322A-327A]를 참고한다. 고체 상은 완전히 또는 특정 영역에서 선택적으로 코팅될 수 있다. 물질의 표면상에 임의 배열의 장소 또는 구역이 가시적으로 또는 배위되어 존재한다. 각각의 장소 또는 구역상에, 물질의 표면에 대한 결합기 또는 스페이서가 존재하거나 부재하는 폴리펩티드가 고정될 수 있다. 바람직하게는, 고정된 폴리펩티드는 부류 G(IgG)의 면역글로불린의 Fc 부분을 결합할 수 있는 본 발명에 따른 수용체이다. 본 발명에 따른 면역 측정을 위한 고체 상은 당해 분야에 광범위하게 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23] 참고).
본 발명에 따른 수용체를 사용한 고체-상 면역 측정은, 예를 들어 고체 상에 흡착되거나 결합된 항체(포획 항체), 수용체, 수용체에 결합하는 면역글로불린, 및 면역글로불린 또는 수용체의 다른 에피토프에 결합하고 검출가능한 표지자에 접합하는 항체(추적자 항체) 사이의 착물의 형성을 포함한다. 따라서, 착물 샌드위치가 형성된다: 고체 지지체-포획 항체-수용체-면역글로불린-추적자 항체 또는 지지체-포획 항체-면역글로불린-수용체-추적자 항체. 샌드위치에서, 추적자 항체-접합된 검출가능한 표지의 강도는 배양 배지내의 면역글로불린 농도에 비례한다. 문헌[Mire-Sluis, A.R., et al., in J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16]은 생명 공학 제품에 대한 숙주 항체의 검출을 사용하는 면역 측정의 고안 및 최적화를 위한 추천 사항을 요약한다.
본 발명의 한 양태에서, 수용체 또는 면역글로불린은 검출가능한 표지에 접합하고, 바람직하게는 특이적인 결합 쌍을 통해 접합한다. 이러한 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)은, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴; 항체/항원(예를 들어, 문헌[Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996]) 참고); 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 IgG/단백질 A 및/또는 G 및/또는 L 등이다. 바람직하게는, 접합은 다이곡시제닌, 및 검출가능한 표지에 대한 다이곡시세닌에 대한 항체를 통한다. 선택적으로, 수용체 또는 면역글로불린은 전기화학발광 표지, 예컨대 루테늄 비스피리딜 착물에 접합된다.
상이한 면역 측정의 원리가, 예를 들어 문헌[Hage, D.S., in Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R]에 기술되어 있다. 문헌[Lu, B., et al., in Analyst 121 (1996) 29R-34R]은 면역 측정에 사용하기 위한 항체의 배향된 고정화를 보고한다. 아비딘-바이오틴-조절된 면역 측정은, 예를 들어 문헌[Wilchek, M. and Bayer, E.A., in Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469]에 의해 보고된다.
항체, 특히 이의 불변 도메인은 결합 파트너, 예컨대 표면, 단백질, 중합체(예컨대, PEG, 셀룰로스 또는 폴리스티롤), 효소, 또는 결합 쌍의 구성원에 커플링시키기 위한, 아미노산 쇄 작용기, 즉 화학적 반응성 기를 함유한다. 항체의 화학적 반응성 기는, 예를 들어 아미노 기(리신의 입실론-아미노 기, 알파-아미노 기), 티올 기(시스틴, 시스테인 및 메티오닌), 카복실산 기(아스파트산, 글루탐산) 및 당 알콜 기이다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌[Aslam, M. and Dent, A., Bioconjugation MacMillan Ref. Ltd. (1999) 50-100]에 기술되어 있다. 예를 들어, 고체 상에 대한 폴리펩티드의 접합을 위해서, 적합한 화학적 보호 약품이 요구된다. 이러한 형태는, 예를 들어 보호되지 않은 측쇄 아민에 결합하고, N-말단에서의 상기 결합보다 덜 안정적이고 상이하다. 이러한 많은 화학적 보호 약품은 공지되어 있다(예를 들어, 유럽특허출원 제0651761호 참고). 바람직한 화학적 보호 약품은 환형 다이카복실산 무수물, 예컨대 말레산 또는 시트라코닐산 무수물을 포함한다.
색원체(형광 또는 발광 기 및 염료), 효소, NMR-활성 기 또는 금속 입자, 합텐, 예컨대 다이곡시제닌은 "검출가능한 표지"의 예이다. 검출가능한 표지는 또한 광활성화가능한 가교 기, 예를 들어 아지도 또는 아지린 기일 수 있다. 전기화학발광에 의해 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 바람직한 신호-방사 기이고, 루테늄 킬레이트, 예를 들어 루테늄(비스피리딜)3 2+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적합한 루테늄 표지 기는, 예를 들어 유럽특허출원 제0580979호, 국제특허공개 제90/05301호, 제90/11511호 및 제92/14138호에 기술되어 있다.
면역글로불린-수용체-착물의 검출을 위해서, 상이한 방법, 예컨대 방사 명역 측정(RIA), 효소 결합된 면역 흡착 분석(ELISA), 면역 방사 측정(IRMA) 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR)이 사용될 수 있다. 한 양태에서, SPR, ELISA 또는 FRET(형광 공명 에너지 전이)에 의해 검출된다.
항체의 결합 특성, 특히 Kdiss는 바람직하게는 바이아코어(등록상표명) 기구에 의해 사정된다. 이러한 방법에서, 결합 특성을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에서의 변화에 의해 평가된다. 조사중인 물질을 고체 상(칩으로 지칭됨)에 결합하고, 상기 코팅된 칩에 대한, 예를 들어 모노클론성 항체, 폴리클론성 항체, 또는 심지어 IgG를 포함하는 혈청의 결합을 평가하는 것이 편리하다. 이러한 분석은 세척 단계 없이(동종 면역 측정) 또는 세척 단계와 함께(이종 면역 측정) 수행될 수 있다.
상기 모든 면역학적 검출 방법에서, 시약 조건은 사용된 시약의 결합, 예를 들어 이의 상응하는 항원의 항체의 결합을 가능하게 하도록 선택된다. 당업자는 용어 착물을 사용하여 상기 결합 현상의 결과를 지칭한다. 본 발명에 따른 분석 방법에서 형성된 착물은, 당해 분야의 절차에 관한 문헌에 의하면, 샘플내의 상기 항체/면역글로불린의 상응하는 온도와 관련된다. 사용된 검출 시약에 따라서, 이러한 관련 단계는 활성 또는 항원-결합된 총 치료적 항체의 농도를 야기한다.
예를 들어, 면역글로불린의 생체내 효과의 평가에 유용한 시험관내 데이터를 제공하기 위하여, 분석 시스템은 가능한 정확하게 생체내 조건과 유사하게 사용되어야 한다. 무엇보다도, 분석 화합물은 생체내의 경우와 최고로 동일하도록 사용되어야 한다. 본 발명에서, 분석 시스템에 사용된 화합물은 생명 공학적 방법에 의해 재조합적으로 제조된다. 이러한 분석 시스템에 사용된 폴리펩티드의 경우, 생체내 대응물과 동일한 아미노산 서열 및 당화를 갖는 것이 가장 중요하다. 따라서, 살아있는 포유동물에서 생성된 것과 동일한 아미노산 서열 및 당화 패턴을 갖는 폴리펩티드로서, 분석 시스템에 유용한 폴리펩티드의 제조를 가능하게 하는 용이한 제조 방법을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 요구를 지지하는 비율은 분석 시스템이 생체내 조건과 가능한 가까울수록, 생체내 효과에 대한 분석 결과의 더욱 정확한 관련성이 수득될 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 재조합 제조하는 방법으로서, 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물로서 수득하는 방법을 포함한다:
(i) 진핵 세포를 제공하는 단계;
(ii) 상기 제공된 진핵 세포를 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 코딩하는 이종 핵산으로 형질감염시키는 단계;
(iii) 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 발현하기에 적합한 조건하에 상기 형질감염된 진핵 세포를 배양하는 단계; 및
(iv) 상기 진핵 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 회수하는 단계.
한 양태에서, 상기 진핵 세포는 HEK 293 세포이고, 상기 상이한 올리고당은 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택된다:
Figure 112009067353333-PCT00032
다른 양태에서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포이고, 상이 상이한 올리고당은 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택된다:
Figure 112009067353333-PCT00033
하기 실시예, 서열 목록 및 도면이 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되고, 이의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 개시되어 있다. 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 개시된 절차가 개질될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1
플라스미드 pCLF60
척수 증식성 육종 바이러스(MPSV) 프로모터의 제어하에 가용성 인간 FcγRIIIa 수용체를 발현하기 위하여 플라스미드 pCLF60을 구성하였다. 플라스미드는 아데노바이러스 트라이파타이트 리더(TPL) 서열 및 합성 인트론(IVS)을 함유한다. HEK 293 EBNA 세포내의 에피솜 복제를 위하여, oriP 요소를 삽입하였다. 주석이 달린 플라스미드 맵을 도 2에 제공한다. 정제 목적을 위해서, 헥사히스티딘 태그를 Fc 감마 RIIIa 코딩 핵산에 대한 C-말단에 클로닝하였다.
CHO 세포내의 가용성 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 발현을 위하여 동일한 플라스미드를 또한 사용하였다. 따라서, C-말단 헥사히스티딘 태그를 코딩하는 핵산 서열을 제거하였다.
실시예 2
(a) 플라스미드 pCLF60을 사용한 HEK 293 세포의 세포 배양 및 형질감염, 헥사히스티딘 태그를 사용한 HEK-발현된 Fc 감마 RIIIa의 발현, 단리 및 정제
세포 배양
인간 태아 신장 세포 HEK 293 EBNA(스위스 소재 인비트로겐(Invitrogen))를 Ca-감소 및 강화 배지에서 혈청-부재 성장에 적용하였다(문헌[Schumpp, B., and Schlaeger, E.J., J. Cell Sci. 97 (Pt 4, 1990) 639-47; Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]).
80 내지 100rpm으로 진탕하면서 세포를 스피너 플라스크(벨코(Bellco); 스위스 도트리콘 소재 이노테크 아게(Inotech AG))에서 일상적으로 성장시켰다. 대규모 배양 및 형질감염을 5ℓ 교반 탱크(스위스 소재 인포스(Infors)) 또는 24ℓ 공기 펌프 생물 반응기(케맵(Chemap); 스위스 취리히 소재 엠베에르(MBR))에서 수행하였다.
pCLF60을 위한 플라스미드 제조를 시판중인 키트(뉴클레오본드 액스(Nucleobond Ax); 스위스 소재 마커레이-나겔 아게(Macherey-Nagel AG))를 사용하여 수행하였다. 플라스미드 농도를 분광 광도계로 측정하고, 표준 물질로서 pUC18 DNA(스위스 취리히 소재 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech))를 사용한 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였다.
형질감염 과정
형질감염 실험을 위해서, 세포를 6-10 x 105세포/㎖의 밀도까지 배양하고, 460xg로 5분 동안 원심분리하고(독일 소재 헤라에우스-켄드로(Heraeus-Kendro)), 헤파린-부재 HL 배지로 1회 세척하고, 헤파린-부재 HL 배지에 재현탁하였다(칼슘 부재 염기 HL 배지는 문헌[Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods, 194 (1996) 191-199]에 기술된 바와 같은 강화된 DHI 및 RPMI 1640 배지(2:1중량/중량)의 혼합물이다. 세포 농도를 5.5-6 x 105세포/㎖까지 조정하고, 배양균을 형질감염이 일어나기 1 내지 2시간 전에 생물 반응기에서 배양하였다. 형질감염 착물을 생물 반응기에 무균적으로 첨가하고, 세포를 상청액을 수확하기 전에 4일 동안 배양하였다. 글루코스, 글루타민 및 펩톤을 함유하는 농축 공급 용액을 세포에 공급하였다(문헌[Schumpp, B. and Schlaeger, E.J., J. Cell Sci. 97 (Pt 4, 1990) 639-647; Schlaeger, E.J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]).
형질감염 착물의 제조
실온에서 헤파린 없는 HL 배지중 1/10의 배양균 부피로 DNA 착물을 제조하였다. 최적화된 유전자 전달 조건하에, 1㎖ HEK 293 EBNA 세포에 대해 0.4㎍ DNA를 0.1㎖ 신규 배지에 첨가하고, 천천히 혼합하였다. 2분 후, 1㎕ 엑스트림 젠(Xtreme Gene; 미국 인디아나폴리스 소재 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 첨가하고, 혼합하였다. 실온에서 15분 동안 배양한 후, 형질감염 착물을 당량의 세포로 옮기고, 37℃에서 배양하였다(문헌[Schlaeger, E.J. and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83]).
수확 및 정제
심층 여과(depth filtration) 단계(스위스 소재 쿠노 필터 시스템스(Cuno Filter Systems))에 의해 상청액을 수확하였다. 이어서, 10kD 절단 셀룰로스 막를 사용하는 한외 여과 장치(밀리포어 헬리콘(Millipore Helicon, 상표명) UF 여과 카트리지)(스위스 소재 밀리포어)에 의한 농도 및 완충액 교환 단계를 수행하였다. 세포 배양균 상청액을 정제 전에 멸균처리된 필터 및 500mM NaCl을 함유하는 50mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 8.0)으로 교환하였다. 한외 여과된 용액을 크로마토그래피에 의한 정제 전에0.22㎛ 필터에 적용하였다.
이미다졸로 상기 수득된 단백질 용액을 최종 농도 10mM까지 보충하였다. 상기 용액을 3㎖/분의 유속으로 4℃에서 Ni-NTA 컬럼에 적용하였다. 결합된 단백질을 세척 단계 후에 0 내지 500mM 이미다졸의 50mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 8.0, 500mM NaCl로 보충됨)중 이미다졸 구배를 사용하여 용리하였다. 분획을 함유하는 생성물을 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 사용하는 SDS-PAGE 전기영동으로 동정하였다.
분획을 함유하는 생성물을 풀링(pooling)하고, 세파크릴(Sephacryl, 등록상표명) S200 SEC 컬럼상의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 위해 농축하였다. 100mM 나트륨 클로라이드로 보충된 25mM 나트륨 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 사용하여 SEC 크로마토그래피를 수행하였다.
(b) 아비태그(Avitag)를 사용하여 Fc 감마 RIIIa를 코딩하는 플라스미드에 의한 CHO 세포의 형질감염, 아비태그를 사용하여 CHO-발현된 Fc 감마 RIIIa의 발현, 단 리 및 정제
CHO 세포내의 인간 Fc 감마 RIIIa의 발현을 위해서, pCLF60을 기제로 하는 발현 플라스미드를 사용하였다. 이러한 플라스미드에서, Fc 감마 RIIIa를 위한 발현 카세트는 사후 정제 바이오틴화를 위해 아비태그를 코딩한다.
인간 Fc 감마 RIIIa를 발현하는 CHO 세포의 제조, 배양, 단리 및 정제를 위해서, 상기 개시된 바와 동일한 과정이 사용되었다.
크로마토그래피에 의한 정제 후, 예를 들어, 대장균의 효소 바이오틴 전효소 합성 효소(BirA)(바이오틴 리가제)를 사용한 효소적 바이오틴화가 수행될 수 있다.
실시예 3
발현된 Fc 감마 RIIIa의 당화의 설명
조합된 엔도프로테인아제 Glu-C/키모트립신 절단(독일 소재 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))으로부터 수득된 펩티드를 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다. 용리액을 직렬 질량 스펙트로미트리 및 병렬 질량 유발된 분획 수집을 위해 분리하였다. 펩티드 절단부를 자동 샘플러, 나노 유동 세포 및 온도 제어된 컬럼 구획을 갖는 이중 파장 자외선 검출기(울티메이트(Ultimate) 3000; 다이오넥스 코포레이션(Dionex Corp.))가 장착된 역상 HPLC(울티메이트 3000; 미국 소재 다이오넥스 코포레이션)로 분리하였다. 하이퍼실 골드(Hypersil Gold) C18 컬럼(250 x 0.3mm I.D., 5㎛ 입자 크기, 175Å 공극 크기; 미국 소재 테르모 피셔 인코포레이티드(Thermo Fisher Inc.))을 분리를 위해 사용하였다. 용매는 A(물중 0.1%(v/v) 폼산(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 및 B(아 세토나이트릴(베이커(Baker))중 0.1% 폼산)이다. 컬럼을 2부피% B로 평형을 맞추고, 5㎕/분의 유속을 사용하여 하기 구배를 적용하였다: 10분 동안 2부피% B, 40분내에 50부피% B까지, 40분내에 80부피% B까지, 4분내에 95부피% B까지, 2분 동안 95부피% B, 25분 동안 2부피% B. 절단된 펩티드를 예비처리 없이 컬럼에 주사하였다.
용출액을 트리버사 나모메이트(Triversa NanoMate, 애드비온(Advion))를 사용하여 1:20의 비로 분리하였고, 약 200nℓ/분을 직렬 질량 스펙트로미트리(LTQ FT ICR, 터모 피셔 코포레이션(Thermo Fisher Corp.))에 사용하였다. 잔여 4.8㎕/분을 질량 유발된 분획 수집에 사용하였다. 정확한 질량 MS를 위한 FT ICR 세포, 및 높은 감도 MS/MS를 위한 선형 이온 트랩을 사용하는, 당화 및 비-당화 효소 펩티드의 특징화 및 온-라인 동정에 사용된 스캔 이벤트 사이클의 시간적 표현이 도 5에 도시된다.
엔도프로테인아제 Glu-C/키모트립신형 절단부의 역상 분리를 위한 전형적인 전체 이온 크로마토그램 및 수행된 SID-스캔에 대한 상응하는 선택된 이온 크로마토그램이 도 6에 도시된다. 명백히 보이는 보이는 바와 같이, SID 스캔은 당펩티드의 용리를 확인하는데 매우 유용하다.
이종 당화에 기인하여, 많은 상이한 올리고당이 상이한 당화 부위에 존재한다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 163의 경우에 하기 올리고당이 발견될 수 있다.
하기 표 1은 HEK 293 발현된 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa내의 Asn 163- 결합 올리고당의 상대 존재비를 나타낸다.
Figure 112009067353333-PCT00034
실시예 4
바이아코어-분석
(a) HEK 293 세포에서 발현된 Fc 감마 RIIIa
실시예 2 (a)의 단리된 수용체를 리신 잔기를 통해 CM5 칩 표면의 덱스트란 매트릭스에 아민 커플링시켰다. 이를 위해, 덱스트란 매트릭스를 먼저 EDC(1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필] 카보다이이미드 하이드로클로라이드) 및 NHS(N-하이드록시 숙신이미드)의 혼합물로 활성화시켰다. 수용체-희석액을 주사하고, 아민 기를 통해 아민 커플링시켰다.
수용체를 pH 6.0 내지 6.5의 나트륨 아세테이트 완충액 또는 말레산 완충액을 사용하여 0.05mg/㎖의 농도까지 희석하였다. 5㎕/분으로 설정된 유속으로 커플링을 수행하였다. 주사 시간을 25분으로 설정하였다. EDC/NHS-혼합물에 의한 덱스트란 매트릭스의 7분 활성화, 및 이어서 수용체 희석액의 25분 주사(부피 125㎕)를 수행하였다. 893 RU의 수준을 고정시켰다.
항-IGF-1R-항체(예를 들어, 국제특허공개 제2004/087756호에 보고됨)를 50mM HBS-P 완충액(바이아코어; 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20)에 6.25 내지 100nM의 상이한 농도로 용해시켰다. 항체의 용액을 바이아코어(등록상표명) 3000 기구에서 상기 제조된 유동 세포와 접촉시켰다. 고정된 수용체와의 회합을 5분 주사에 의해 측정하고, 칩 표면을 항체-부재 완충액으로 5분 동안 세척함으로써 해리를 측정하였다. 105 RU의 최대 반응을 기록하였다(도 3).
(b) CHO 세포에서 발현된 Fc 감마 RIIIa
실시예 2 (b)의 단리된 수용체를 아비딘/스트렙타비딘 코팅된 CM5 칩의 표면상에 고정시켰다.
수용체를 pH 6.0 내지 6.5의 나트륨 아세테이트 완충액 또는 말레산 완충액을 사용하여 0.05mg/㎖의 농도까지 희석하였다. 5㎕/분으로 설정된 유속으로 커플링을 수행하였다. 주사 시간을 25분으로 설정하였다. 916 RU의 수준을 고정시켰다.
항-IGF-1R-항체를 50mM HBS-P 완충액(바이아코어; 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P-20)에 6.25 내지 100nM의 상이한 농도로 용해시켰다. 항체의 용액을 바이아코어(등록상표명) 3000 기구에서 상기 제조된 유동 세포와 접촉시켰다. 고정된 수용체와의 회합을 5분 주사에 의해 측정하고, 칩 표면을 항체-부재 완충액으로 5분 동안 세척함으로써 해리를 측정하였다. 105 RU의 최대 반응을 기록하였다(도 4).
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG & GlycArt Biotechnology AG <120> Human Fc Gamma Receptor III <130> 24216 WO-ASK <140> PCT/EP2008/002569 <141> 2008-04-01 <150> EP 07006952.1 <151> 2007-04-03 <150> EP 07010939.2 <151> 2007-06-04 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln 1 5 10 15 Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly 20 25 30 Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser 35 40 45 Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val 50 55 60 Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser 65 70 75 80 Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala 85 90 95 Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His 100 105 110 Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly 115 120 125 Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly 145 150 155 160 Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly 165 170 175 Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250

Claims (26)

  1. 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서,
    (a) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, HEK 293 세포에서 발현되고;
    (b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는
    조성물:
    Figure 112009067353333-PCT00035
    Figure 112009067353333-PCT00036
  2. (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계;
    (ii) 제 1 항에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항에 따른 조성물에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법.
  3. (i) 진핵 세포를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제공된 진핵 세포를 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 단계;
    (iii) 상기 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 발현하기에 적합한 조건하에 상기 형질감염된 진핵 세포를 배양하는 단계; 및
    (iv) 상기 진핵 세포 또는 상기 배양 배지로부터 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 회수하는 단계
    를 포함하는, 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물을 재조합 제조하는 방법으로서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하는 조성 물로서 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 제조하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    진핵 세포가 HEK 293 세포이고, 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 방법:
    Figure 112009067353333-PCT00037
    Figure 112009067353333-PCT00038
  5. 제 3 항에 있어서,
    진핵 세포가 CHO 세포이고, 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는 방법:
    Figure 112009067353333-PCT00039
  6. 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물로서,
    (a) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고, CHO 세포에서 발현되고;
    (b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서의 N-결합 올리고당이 상이한, 2개 이상의 SEQ ID NO: 1의 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa의 혼합물을 포함하되, 상기 상이한 N-결합 올리고당이 각각 존재하지 않거나, 또는 하기 올리고당으로부터 선택되는
    조성물:
    Figure 112009067353333-PCT00040
  7. (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계;
    (ii) 제 6 항에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 포함하는 조성물에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하는, 제 6 항에 따른 조성물에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법.
  8. (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖고;
    (b) SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 163에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는
    재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa:
    Figure 112009067353333-PCT00041
    Figure 112009067353333-PCT00042
  9. 제 8 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 75에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa:
    Figure 112009067353333-PCT00043
    Figure 112009067353333-PCT00044
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 46에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당중 하나를 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa:
    Figure 112009067353333-PCT00045
  11. 제 8 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 170에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 N-결합 올리고당을 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa:
    Figure 112009067353333-PCT00046
  12. 제 8 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 180 또는 181에서 올리고당이 존재하지 않거나, 또는 하기 O-결합 올리고당을 포함하는 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa:
    Figure 112009067353333-PCT00047
  13. SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 159에서 페닐알라닌을 갖는, 제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa.
  14. (i) 분석할 면역글로불린을 제공하는 단계;
    (ii) 제 8 항에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa를 제공하는 단계;
    (iii) 상기 면역글로불린을 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa와 접촉시키는 단계; 및
    (iv) 상기 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 측정하는 단계
    를 포함하는, 제 8 항에 따른 재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa에 대한 면역글로불린의 결합을 측정하는 방법.
  15. 제 2 항, 제 7 항 및 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 인간 Fc 감마 수용체 IIIa가 고체 상에 접합되는 방법.
  16. 제 2 항, 제 7 항 및 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,
    면역글로불린이 고체 상에 접합되는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    접합이 N-말단 및/또는 ε-아미노 기(리신), 상이한 리신의 ε-아미노 기, 아미노산 골격의 카복시-, 설프하이드릴-, 하이드록실- 및/또는 페놀계 작용기, 또는 탄수화물 구조의 당 알콜 기를 통한 화학적 결합에 의해 수행되는 방법.
  18. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    고체 상에 대한 접합이 스트렙타비딘 또는 아비딘/바이오틴; 항체/항원; 렉틴/다당류; 스테로이드/스테로이드 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체; 효소/기질; 및 면역글로불린 G/단백질 A 및/또는 단백질 G 및/또는 단백질 L로 이루어진 특이적인 결합 쌍(제 1 성분/제 2 성분)의 군으로부터 선택되는 특이적인 결합 쌍을 통해 수행되는 방법.
  19. 제 2 항, 제 7 항 및 제 14 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 있어서,
    측정이 표면 플라즈몬 공명, 어쿠스틱 공명, 형광 공명 에너지 전이, 면역 측정, 전반사, 섬유 광학, 표면 플라즈몬 공명 강화된 형광 및 형광 활성화된 세포 분류로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    측정이 표면 플라즈몬 공명에 의해 수행되는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    측정이 면역 측정에 의해 수행되는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    면역 측정이 이종 면역 측정인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    면역 측정이 샌드위치 면역 측정인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    샌드위치 면역 측정이 고체 상에 고정된 포획 항체, 및 직접 또는 간접 검출에 적합한 검출 항체를 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    검출 항체가 화학발광 기, 형광 기, 발광 금속 착물, 효소 및 방사성 동위원소로부터 선택되는 검출가능한 표지를 포함하는 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    검출 항체가 합텐 또는 항원/항체; 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘; 당/렉틴; 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산; 및 수용체/리간드로부터 선택되는 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 파트너를 포함하는 방법.
KR1020097022932A 2007-04-03 2008-04-01 인간 ｆｃ 감마 수용체 ⅲ KR101213891B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07006952.1 2007-04-03
EP07006952 2007-04-03
EP07010939 2007-06-04
EP07010939.2 2007-06-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100004107A true KR20100004107A (ko) 2010-01-12
KR101213891B1 KR101213891B1 (ko) 2012-12-18

Family

ID=39588029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097022932A KR101213891B1 (ko) 2007-04-03 2008-04-01 인간 ｆｃ 감마 수용체 ⅲ

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20080248510A1 (ko)
EP (1) EP2134745A1 (ko)
JP (1) JP5211150B2 (ko)
KR (1) KR101213891B1 (ko)
CN (1) CN101772514A (ko)
AU (1) AU2008234091A1 (ko)
BR (1) BRPI0809697A2 (ko)
CA (1) CA2686506A1 (ko)
IL (1) IL201072A (ko)
MX (1) MX2009010646A (ko)
WO (1) WO2008119545A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10221210B2 (en) 2011-07-20 2019-03-05 Zepteon, Incorporated Polypeptide separation methods
EP2738556B1 (en) * 2011-07-28 2019-11-06 Konica Minolta, Inc. Method for measuring amount of analyte and device for spfs
FR2980271B1 (fr) * 2011-09-16 2013-10-11 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
EP2900264A4 (en) * 2012-09-26 2016-05-25 Momenta Pharmaceuticals Inc GLYKOPROTEINZUBEREITUNGEN
US10670607B2 (en) 2014-02-27 2020-06-02 University Of Helsinki Protein L based bioassay method for determining presence of soluble antibodies in a sample and kit therefor
JP6665414B2 (ja) * 2015-03-25 2020-03-13 東ソー株式会社 Ｆｃ結合性タンパク質の保存方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1888649A2 (en) * 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors

Also Published As

Publication number Publication date
EP2134745A1 (en) 2009-12-23
IL201072A (en) 2013-02-28
BRPI0809697A2 (pt) 2014-10-07
US20110183354A1 (en) 2011-07-28
JP2010523508A (ja) 2010-07-15
KR101213891B1 (ko) 2012-12-18
US20080248510A1 (en) 2008-10-09
JP5211150B2 (ja) 2013-06-12
IL201072A0 (en) 2010-05-17
CA2686506A1 (en) 2008-10-09
AU2008234091A1 (en) 2008-10-09
CN101772514A (zh) 2010-07-07
WO2008119545A1 (en) 2008-10-09
MX2009010646A (es) 2009-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101213891B1 (ko) 인간 ｆｃ 감마 수용체 ⅲ
US11959109B2 (en) Recombinant Factor C and method for producing the same, and method for measuring endotoxin
EP3517956B1 (en) Modification-dependent activity assays
US7897328B2 (en) Blood group antigens of different types for diagnostic and therapeutic applications
KR101921012B1 (ko) 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법 및 측정용 키트
KR20170028637A (ko) 면역화학적 분석에서 신호증폭과 항체의 표면 고정을 담당하는 범용성 재조합 2차 항체 유사체
US20110091956A1 (en) Biomolecule-immobilized carrier and method for immobilizing biomolecule on carrier

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee