KR20090124311A

KR20090124311A - 시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 ｄｎａ추출방법

Info

Publication number: KR20090124311A
Application number: KR1020080050444A
Authority: KR
Inventors: 하승모; 조웅; 안유민; 이동호; 김현중; 황승용
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2009-12-03

Abstract

시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 DNA 추출방법을 개시한다. 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩은 시료 세포가 주입되는 반응조 및 상기 반응조에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부를 구비한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩에 있어서, 상기 반응조는 시료 세포로부터 순수한 DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터를 구비한 사선 형상의 채널이 형성된 PDMS칩 및 상기 PDMS칩의 일면에 접합되는 박막 유리칩을 포함하고, 상기 가열부는 상기 박막 유리칩의 하부에 놓여지는 유리칩 및 상기 유리칩의 일면에 크롬 및 금을 증착하여 형성된 마이크로 히터 및 온도센서를 포함하여, 시료 전 처리를 수행에 소요되는 시간, 인력, 비용 및 시료의 양을 줄일 수 있다.

반응조, 가열부, 마이크로 필라, 마이크로 비드

Description

시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 ＤＮＡ 추출방법{MICRO BIO CHIP FOR SAMPLE PRE-TREATMENT AND DNA PURIFICATION METHOD USING THE SAME}

본 발명은 별도의 외부 장치가 필요 없이 세포 용해 및 DNA 추출 등의 시료 전처리(前處理) 과정을 수행할 수 있는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 DNA 추출 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 'PCR'이라 함)은 매우 잘 알려진 DNA(deoxyribonucleic acid) 복제법으로 이 기술을 이용하면 어떤 DNA도 선택적으로 빠르게 대량 복제할 수 있으며 유전병 진단 및 치료 또는 법의학 등 다양한 유전분야에 필수적으로 이용되고 있다. 이는 복제하고자 하는 DNA를 DNA 중합효소를 사용하며 복제 단계별 반응온도를 가지고 이를 반복적으로 행하여 복제하는 것이다.

이러한, 복제과정은 열적으로 제어되는 반응과정의 주기적인 순환을 이용하며, 초기 시작 분자는 온도 순환과정을 거듭하여 결국엔 10억 개 가량의 양만큼 늘어나게 된다.

PCR을 통한 DNA 복제과정은 단계별 복제과정을 거쳐 실행하게 된다. 즉, PCR은 이중가닥 DNA로 시작하고, 각 순환주기의 첫 반응은 열처리를 통한 두 가닥의 상호 분리단계로, 이 과정을 디네이쳐링(denaturing)이라 하며 통상 94℃에서 실행된다. 다음은 냉각과정으로, 프라이머(primer)들이 분리된 두 DNA 가닥의 상보적 서열에 이종화를 시키는 것으로, 이 과정은 어닐링(annealing)이라고 하며 55℃에서 실행하게 된다. 마지막 단계는 중합과정으로, 혼합물 속의 DNA 중합효소가 네 개의 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 이용하여 두 프라이머(primer)로부터 DNA 합성을 시작하는 것으로, 이 과정은 익스텐션(extension)이라고 하며 72℃ ~ 74℃에서 실행하게 되는 것이다.

이와 같은, 시험관 내에서 행해지는 DNA 증폭 과정인 PCR 과정은 실험단계의 단순함과 실험을 위한 부가장치들의 구성이 간단하므로 전체 실험 시스템을 소형화하기에 가장 알맞은 생화학적 분석 과정으로 여겨지고, 이런 소형화된 시스템에서는 종래의 것과 달리 실험에 쓰이는 시료의 소모를 줄일 수 있으며, 종래의 것보다 훨씬 작은 열용량으로 인한 빠른 승온 속도와 냉각속도로 전체 실험 시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 손에 들고 다닐 수 있는 휴대용 장치로서의 장점도 지닐 수 있게 된다.

그러나, 종래에 실시되고 있는 실리콘과 유리가 접합된 PCR에 적용되는 칩은 DNA 추출과정 없이 세포용해 과정과 PCR 과정이 하나의 챔버에서 수행되므로 불순물에 의한 오차 발생이 컸으며, 실리콘 및 유리의 재료 특성에 의해 생화학적 안정성이 떨어지는 문제점이 있었다.

또한, 종래의 마이크로 바이오칩 상에서 PCR 과정을 수행하려면 세포 용해 및 DNA를 추출하는 과정이 선행되어야 하며, 계면활성제와 같은 세포용해용 버퍼를 이용하거나 열 또는 전기적 방법으로 세포막 파열을 유도하고 잔여물 처리과정 내지 세척과정을 거쳐야 하는데, 이 과정은 PCR 과정만큼 많은 시간과 인력이 소요되는 문제점도 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 시료 전처리 과정을 수행할 수 있는 마이크로 바이오칩들이 연구된 바가 있지만, 이러한 바이오칩들은 생화학적 안정성이 떨어지거나 제작공정이 복잡한 실리콘 재질을 사용하였거나 칩의 작동을 위한 밸브의 구동을 위해 공압기기 등과 같은 외부장치가 필요하고 칩의 동작시 세척 등 여러 절차가 필요하다는 단점도 있었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 외부 장치 필요 없이 세포용해 및 DNA 추출을 수행할 수 있는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 시료 전처리 과정은 마이크로 히터를 이용해 세포벽 파열을 유도하고, 이 때 배출되는 DNA 이외의 여러 잔여물들은 마이크로 비드와 마이크로 필라를 이용해 걸러냄으로써 순수한 DNA를 추출할 수 있는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 DNA 추출방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 외부 장치가 필요 없기 때문에 사용자가 쉽고 편리하게 마이크로 바이오칩을 이용할 수 있으며, 여러 종류의 단일 마이크로 바이오칩을 집적화 시키는 데에 유용하게 적용될 수 있는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 제공한다.

본 발명은 상술한 바와 같은 과제를 달성하기 위하여, 시료 세포가 주입되는 반응조 및 상기 반응조에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부를 구비한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩에 있어서, 상기 반응조는 시료 세포로부터 순수한 DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터를 구비한 사선(蛇線, serpentine) 형상의 채널이 형성된 PDMS(Polydimethylsiloxane)칩 및 상기 PDMS칩의 일면에 접합되는 박막 유리칩을 포함하고, 상기 가열부는 상기 박막 유리칩의 하부에 놓여지는 유리칩 및 상기 유리칩의 일면에 크롬 및 금을 증착하여 형성된 마이크로 히터 및 온도센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 제공한다.

상기와 같이 구성함으로써, 별도의 외부 장치 없이 세포용해 및 DNA 추출 등의 시료 전처리 과정을 수행할 수 있으며 PCR 실험을 빠르고 간편하게 수행할 수 있다.

여기서, 상기 마이크로 필터는 상기 채널의 폭 방향을 따라 일정한 간격으로 이격 형성된 미세 기둥에 해당하는 마이크로 필라(micro-pillar) 및 상기 마이크로 필라의 사이에 구비되는 마이크로 비드(micro-bead)를 포함하여 구성될 수 있다. 이와 같이 구성된 마이크로 필터를 이용하여 DNA를 추출하기 때문에 DNA 추출을 위한 외부 장치가 필요 없으며, 단순한 구조의 마이크로 바이오칩을 사용하므로 제작이 용이하며 시료 주입만으로 DNA를 추출할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 상기 마이크로 필터는 상기 채널의 출구부 가까이에 형성되는 것이 바람직하다. DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터를 채널의 출구부 가까이에 형성함으로써, 시료 세포가 채널을 유동하는 시간을 길게 하여 충분한 세포 용해를 유도할 수 있다. 또한, 마이크로 필터를 통과하여 추출된 DNA가 통과해야 하는 채널의 길이를 가능한 줄임으로써 채널에 붙는 등 PCR에 이용되지 못하는 DNA를 줄여서 보다 많은 DNA를 추출할 수 있다.

한편, 상기 반응조는 상기 가열부와 분리 가능하게 형성되는 것이 바람직하다. 이와 같이 형성함으로써, 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 전 처리용 바이오 칩의 반응조는 일회용으로 사용하되, 가열부는 재활용하여 사용할 수 있다. 즉, 일회용으로 사용하기에 적합하도록 반응조 부분을 분리하여 제작하여 반응조 세척 등과 같은 후속 절차 없이 사용자가 간편하게 사용할 수 있다.

여기서, 상기 온도센서는 상기 마이크로 히터에 공급되는 전원을 조절하기 위해 상기 반응조의 온도를 감지하며, 상기 마이크로 히터는 시료 세포의 세포벽 파열을 유도하여 세포용해를 수행하는 것을 특징으로 한다. 즉, 온도센서를 이용하여 마이크로 히터의 발열량을 조절함으로써, 반응조에 주입된 시료 세포의 세포 용해를 효율적으로 수행할 수 있고, 시료 세포를 가열하기 위해 별도의 외부 장치를 구비할 필요가 없다.

한편, 발명의 다른 분야에 따르면, 본 발명은 상기한 바와 같은 과제를 달성하기 위하여, 시료 세포가 주입되는 반응조 및 상기 반응조에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부를 구비한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서, 상기 반응조에 형성된 사선형의 채널에 마이크로 비드를 주입하는 단계; 상기 마이크로 비드가 상기 채널에 구비된 마이크로 필라에 걸리게 하는 단계; 상기 채널에 시료 세포를 주입하는 단계; 상기 채널에 주입된 시료 세포를 상기 가열부에 구비된 마이크로 히터로 가열하여 시료 세포의 세포벽을 파괴하는 세포용해 단계; 및 세포벽이 파열된 시료 세포에 포함된 DNA 이외의 잔여물들은 상기 마이크로 필라 및 상기 마이크로 비드에 의해 걸러지고 DNA는 상기 마이크로 필라 및 상기 마이크로 비드를 통과하는 DNA 추출 단계;를 포함하는 DNA 추출 방법을 제공한다.

상기와 같은 DNA 추출 방법을 이용함으로써, 시료 세포의 주입만으로 DNA를 추출할 수 있다.

여기서, 상기 DNA 추출 단계에서 상기 잔여물들은 서로 이웃하는 상기 마이크로 필라 사이의 간격 보다 크거나 동일한 직경을 가진 상기 마이크로 비드 및 상기 마이크로 비드의 직경 보다 큰 직경을 가진 상기 마이크로 필라에 의해 걸러지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 세포용해 단계는 상기 가열부에 구비된 온도 센서에 의해 상기 반응조의 온도를 감지하여 상기 마이크로 히터에 공급되는 전원을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.

한편, 상기 마이크로 비드를 주입하는 단계는 상기 가열부 위에 상기 반응조를 올려 놓고 고정하는 단계를 포함할 수도 있다. 즉, 이러한 방법을 사용함으로써, 가열부는 재사용할 수 있고 반응조는 일회용으로 사용함으로써 반응조 세척 등의 단계가 필요 없게 된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩은 시료 전 처리를 수행함에 소요되는 시간, 인력, 비용 및 시료의 양을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로 바이오칩은 외부의 부가장치 없이 세포용해 및 DNA 추출을 수행할 수 있으며, 구조가 단순하며 제작공정이 간편하고 다른 세포분석용 바이오칩과의 집적화에 유용하게 적용될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 DNA 추출방법은 추출되는 DNA 이외의 여러 잔여물들은 마이크로 비드와 마이크로 필라가 얽혀 형성된 마이크로 필터에 의해 걸러지고 순수한 DNA만 추출되기 때문에, 별도의 공정 없이 시료 세포의 주입만으로 DNA를 추출할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로 바이오칩은 일회용으로 사용하기에 적합하도록 반응조 부분과 영구적으로 사용할 수 있는 가열부를 분리하여 제작하였기 때문에, 반응조 세척 등과 같은 후속 절차 없이 사용자가 간편하게 사용할 수 있다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 구성 및 작용에 관하여 상세히 설명한다. 이하의 설명은 특허 청구 가능한 본 발명의 여러 태양(aspects) 중 하나이며, 하기의 기술(description)은 본 발명에 대한 상세한 기술(detailed description)의 일부를 이룬다.

다만, 본 발명을 설명함에 있어서, 공지된 기능 혹은 구성에 관한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 명료하게 하기 위하여 생략하기로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 도시한 투시 사시도, 도 2는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 분해 사시도 및 DNA의 추출 모습을 확대 도시한 개략도, 도 3은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 채널 및 마이크로 필터를 확대 도시한 도면이다.

도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩(100)은 시료 세포가 주입되는 반응조(120) 및 반응조(120)에 주입 된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부(150)를 포함한다.

반응조(120)는 시료 세포로부터 순수한 DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터(134)를 구비한 사선(蛇線, serpentine) 형상의 채널(132)이 형성된 PDMS (Polydimethylsiloxane)칩(130) 및 PDMS칩(130)의 일면에 접합되는 박막 유리칩(140, thin glass)을 포함할 수 있다.

한편, 가열부(150)는 박막 유리칩(140)의 하부에 위치하는 유리칩(160) 및 유리칩(160)의 일면에 크롬(Cr) 및 금(Au)을 증착하여 형성된 마이크로 히터(170) 및 온도센서(180)를 포함한다.

상기와 같이 구성함으로써, 별도의 외부 장치 없이 세포용해 및 DNA 추출 등의 시료 전처리 과정을 수행할 수 있으며, PCR 실험을 빠르고 간편하게 수행할 수 있다.

도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩(100)을 구성하는 칩들의 상호 위치를 간략히 살펴 보면, 가장 하부에 유리칩(160)의 가열부(150)가 위치하고 그 위에 얇은 유리로 된 박막 유리칩(140)이 위치하며 박막 유리칩(140)의 상면에 PDMS칩(130)이 부착되는 형태를 가진다.

반응조(120)를 구성하는 PDMS칩(130)에는 시료 세포가 주입되는 채널(132)이 형성되는데, 이 채널(132)은 PDMS칩의 소수성(疏水性)을 고려하여 사선(蛇線, serpentine) 형태로 형성된다. 즉, 수차례 절곡된 S자 형상으로 형성된다. 여기서, 채널(132)의 양단에는 시료 세포를 주입하기 위한 입구부(132a)와 추출된 DNA를 배출하기 위한 출구부(132b)가 구비된다.

채널(132)은 정확한 실험 결과를 얻기 위해서 충분한 용량을 가질 것이 요구되는데, 본 발명에 따른 바이오칩(100)의 채널(132)의 높이와 폭은 각각 150㎛와 600㎛이고, 총 용량은 20㎕인 것이 바람직하다. 한편, 반응조(120)의 전체 크기는 가로 25mm, 세로 18mm인 것이 바람직하다.

채널(132)의 입구부(132a)는 직경이 약 1mm인 원형으로 구비함으로써 시린지(syringe)에 의해 시료 세포를 용이하게 주입할 수 있다.

채널(132)에는 시료 세포로부터 DNA만을 추출하기 위한 마이크로 필터(134)가 구비되어 있는데, 마이크로 필터(134)는 채널(132)의 폭 방향(도 3 (b)의 "W" 참조)을 따라 일정한 간격으로 이격 형성된 마이크로 기둥 내지 마이크로 필라(micro-pillar, 136) 및 마이크로 필라(136)의 사이에 제공되는 마이크로 비드(micro-bead, 138)를 포함하여 구성될 수 있다. 이와 같이 구성된 마이크로 필터(134)를 이용하여 DNA를 추출하기 때문에, DNA 추출을 위한 외부 장치가 필요 없으며 단순한 구조의 칩을 사용하므로 제작이 용이하며 시료 주입만으로 DNA를 추출할 수 있다는 장점이 있다.

도 3에 도시된 바와 같이, 수십 마이크로미터 단위의 기둥(pillar) 형태인 마이크로 필라(136)를 채널(132) 내에 형성하고, 마이크로 필라(136) 사이에 50㎛~80㎛ 직경을 갖는 마이크로 비드(138)를 채워 넣어 서로 엉키게 함으로써, DNA를 필터링 할 수 있는 마이크로 필터(134)를 형성할 수 있다.

도 3의 (a)를 참조하면, 사선(蛇線, serpentine) 형상의 채널(132) 중 한 곳에 채널(132)의 폭방향으로 기둥형상의 마이크로 필라(136)가 형성되어 있음을 알 수 있다. 여기서, 가장 양단에 위치하는 마이크로 필라(136)는 채널(132)의 벽을 돌출 형성하여 만들 수도 있다. 도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, 마이크로 필라(136)는 일정한 간격(G)을 가지도록 형성될 수 있다. 여기서, 마이크로 필라(136)의 간격(G) 및 직경은 마이크로 비드(138)의 직경 내지 크기에 따라 결정되는 것이 바람직하다.

도 3의 (c)에 도시된 바와 같이, 마이크로 비드(138)는 마이크로 필라(136) 사이의 간격(G)을 통과할 수 없는 정도의 직경을 가지는 것이 바람직하다. 즉, 마이크로 비드(138)의 직경을 50㎛~80㎛로 하면, 마이크로 필라(136)의 간격(G)은 최대 50㎛이어야 하며 마이크로 필라(136)의 직경은 100㎛ 정도로 할 수 있다.

이와 같이, 마이크로 비드(138)의 직경은 서로 이웃하는 마이크로 필라(136) 사이의 간격(G) 보다 크거나 동일하게 형성하고 마이크로 필라(136)의 직경은 마이크로 비드(138)의 직경 보다 크게 형성함으로써, 시료가 채널(132)을 유동함에 따라 마이크로 비드(138)가 마이크로 필라(136)에 걸리게 되어 마이크로 필라(136)와 마이크로 비드(138)가 함께 마이크로 필터(134)로 기능할 수 있다. DNA는 엉키어 있는 마이크로 필라(136)와 마이크로 비드(138)의 사이를 통과할 수 있으나 다른 세포 잔여물들은 통과할 수 없기 때문에 DNA만 추출할 수 있다.

도 2에는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩(100)의 마이크로 필터(134)에서 일어나는 DNA의 추출 모습을 확대 도시한 개략도인데, 이를 참조하면 마이크로 필라(136)와 마이크로 비드(138)의 작용에 대해서 좀더 분명히 알 수 있다.

도 2에 도시된 바와 같이, 마이크로 필라(136)에 마이크로 비드(138)가 걸림 으로써, DNA는 마이크로 필라(136)와 얽히어 있는 마이크로 비드(138) 사이를 통과할 수 있으나, DNA 보다 상대적으로 큰 세포 용해 후 잔존하는 잔여물들은 마이크로 비드(138) 사이를 통과하지 못하고 마이크로 비드(138)에 걸리게 된다. 이러한 과정을 거치면서 DNA만 추출되는 것이다.

한편, 시료에 대한 생화학적 안정성을 높이기 위해 PDMS칩(130)은 박막 유리칩(140)에 접합된다. 이와 같이 PDMS칩(130)과 박막 유리칩(140)을 이용하여 반응조(120)를 형성함으로써, 생화학적 안정성을 높일 수 있다.

채널(132) 및 마이크로 필터(134)를 구비하는 PDMS칩(130) 및 박막 유리칩(140)의 제조 과정에 대해서는 후술하도록 한다.

또한, 마이크로 필터(134)는 도 2에 도시된 것처럼 채널(132)의 출구부(132b) 가까이에 형성되는 것이 바람직하다. DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터(134)를 채널(132)의 출구부(132b) 가까이에 형성함으로써 시료 세포를 충분히 세포 용해시킬 수 있으며, 추출된 DNA가 통과해야 하는 채널의 길이를 줄임으로써 보다 많은 DNA를 추출할 수 있다.

마이크로 필터(134)에 의해 DNA가 추출되기 위해서는 시료 세포의 세포벽이 먼저 파열되어야 한다. 즉, DNA 추출 전에 세포 용해가 이루어져야 하는데 이를 위해 가열부(150)가 필요하다.

가열부(150)는 반응조(120)의 박막 유리칩(140)이 놓여지는 유리칩(160) 및 유리칩(160)에 열기상 증착법(thermal evaporation)으로 크롬과 금을 각각 200Å, 1000Å 두께로 증착시킨 후 사진식각(photolithography)기법을 이용하여 형성되는 마이크로 히터(170) 및 온도센서(180)를 포함할 수 있다.

여기서, 마이크로 히터(170)는 반응조(120)의 채널(130)에 주입된 시료 세포를 가열하여 세포벽을 파열시키는 세포 용해 과정을 수행하며, 온도센서(180)는 반응조(120)의 온도를 감지하여 마이크로 히터(170)에 공급되는 전원을 조절할 수 있다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 마이크로 히터(170)는 유리칩(160)의 상부면 및 하부면 중 일면에 크롬 및 금과 같은 금속의 박막으로 형성되며, 마이크로 히터(170)의 중앙에는 열저항 방식으로 작동하는 온도센서(180)가 구비된다.

마이크로 히터(170)에는 전극 내지 전원인가부(171)를 통해 마이크로 히터(170)에 전원이 인가되고, 온도센서(180)에 의해 저항을 측정할 수 있도록 1mA 전류를 걸어주는 전류부(172)가 구비되며, 전압검출부(173)를 통해 옴의 법칙에 따른 저항과 전류의 관계에 의해 발생된 전압값을 검출하게 되는 것이다.

마이크로 히터(170)는 반응조(120)의 채널(132)이 형성된 부분과 대응하는 부분에 위치하여, 채널(132)에 주입된 시료를 가열하게 된다.

또한, 가열부(150)의 전체 크기는 가로 28mm, 세로 20mm로 가로 25mm, 세로 18mm인 반응조(120) 보다 더 큰 것이 바람직하다. 이와 같이, 가열부(150)를 반응조(120) 보다 더 크게 형성함으로써, 실험 준비 과정에서 가열부(150) 위에 반응조(120)를 위치시키는 것이 용이할 뿐만 아니라 가열부(150)의 마이크로 히터(170)에 전원을 공급하기 위한 전극 내지 전원인가부(171)가 반응조(120)에 의해 덮이지 않도록 할 수 있다.

온도센서(180)는 마이크로 히터(170)에 공급되는 전원을 조절하기 위해 반응조(120)의 온도를 감지하며, 마이크로 히터(170)는 시료 세포의 세포벽 파열을 유도하여 세포용해를 수행하게 된다. 즉, 온도센서(180)를 이용하여 마이크로 히터(170)의 발열량 내지 공급되는 전원의 양을 조절함으로써, 반응조(120)에 주입된 시료 세포의 세포 용해를 효율적으로 수행할 수 있고 시료 세포를 가열하기 위해 별도의 외부 장치를 구비할 필요가 없게 된다.

마이크로 히터(170) 및 온도센서(180)를 포함하는 가열부(150)의 제조 방법에 대해서는 후술하도록 한다.

한편, 반응조(120)는 가열부(150)와 분리 가능하게 제공되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩(100)의 반응조(120)는 일회용으로 사용하되 가열부(150)는 재활용하여 사용할 수 있다. 즉, 일회용으로 사용하기에 적합하도록 반응조(120) 부분을 분리하여 제작함으로써 반응조(120)의 세척 등과 같은 후속 절차 없이 사용자가 간편하게 사용할 수 있다. 이 때, 반응조(120)와 박막 유리칩(140)은 마이크로 몰딩에 의해 접합될 수도 있다.

한편, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩(100)을 이용한 DNA 추출 방법은 다음과 같다.

시료 세포가 주입되는 반응조(120) 및 반응조(120)에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부(150)를 구비한 세포용해와 DNA추출용 마이크로 바이오칩(100)을 이용한 DNA 추출방법에 있어서, 반응조(120)에 형성된 사선형의 채널(132)에 마이크로 비드(138)를 주입하는 단계(S110), 마이크로 비 드(138)가 채널(132)에 구비된 마이크로 필라(136)에 걸리게 하는 단계(S120), 채널(132)에 시료 세포를 주입하는 단계(S130), 채널(132)에 주입된 시료 세포를 가열부(150)에 구비된 마이크로 히터(170)로 가열하여 시료 세포의 세포벽을 파괴하는 세포용해 단계(S140) 및 세포벽이 파열된 시료 세포에 포함된 DNA 이외의 잔여물들은 마이크로 필라(136) 및 마이크로 비드(138)에 의해 걸러지고 DNA는 마이크로 필라(136) 및 마이크로 비드(138)를 통과하는 DNA 추출 단계(S150)를 포함하는 DNA 추출 방법을 제공한다.

여기서, DNA 추출 단계(S150)에서 상기 잔여물들은 서로 이웃하는 마이크로 필라(136) 사이의 간격 보다 크거나 동일한 직경을 가진 마이크로 비드(138) 및 마이크로 비드(138)의 직경 보다 큰 직경을 가진 마이크로 필라(136)에 의해 걸러지는 것이 바람직하다.

또한, 세포용해 단계(S140)는 가열부(150)에 구비된 온도 센서(180)에 의해 반응조(120)의 온도를 감지하여 마이크로 히터(170)에 공급되는 전원을 조절하는 단계(S145)를 포함할 수 있다.

한편, 마이크로 비드(138)를 주입하는 단계(S110)는 가열부(150) 위에 반응조(120)를 올려 놓고 고정하는 단계(S115)를 포함할 수도 있다. 즉, 이러한 방법을 사용함으로써, 가열부(150)는 재사용할 수 있고 반응조(120)는 일회용으로 사용함으로써 반응조(120)를 세척해야 하는 번거로움을 없앨 수 있다.

상기에서 언급한 DNA 추출방법은 하나의 예시에 불과하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 밝혀 둔다.

이하에서는 도면을 참조하여 본 발명에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩(100)의 반응조(120) 및 가열부(150)의 제조 방법에 대해서 간략히 설명한다.

도 5는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 반응조를 형성하는 단계를 보여주는 도면이고, 도 6은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 가열부를 형성하는 단계를 보여주는 도면이다.

도 5에 도시된 바와 같이 반응조(120)를 형성하는 단계는, 실리콘 웨이퍼를 SPM(황산과 과수 혼합물)용액 등에서 담궈 이물질을 제거하는 클리닝 단계(a), 클리닝을 실행한 후에 스핀 코팅을 통해 실리콘 웨이퍼의 상부면에 100㎛ 두께로 음성감각막인 SU-8을 올린 다음 소프트 베이크를 실시하게 되는데(b), 이 때 음성감광제에 있는 유기용제를 제거하도록 실행하게 된다.

음성감각막인 SU-8은 음성후막감광제(negative photoresist)의 일종으로 마이크로머시닝(micromachining)등을 위해 화학적으로 증폭된 에폭시를 기본으로 한 감광제로서, IBM사에 의해 처음 개발되었으며 현재 Microchem사와 Sotec Microsystems사 가 IBM으로부터 판매권을 얻어 제조 및 판매를 하고 있는 것이다.

이에, 상기 SU-8은 유리(Glass), 세라믹(Ceramic) 등과의 연계성이 좋고, 광학적 성질이 매우 우수하며, 코팅 조건에 따라 1~1000㎛대의 고형상비 구조물 제작이 가능할 뿐만 아니라 반도체 제작공정과의 연계성도 우수하여 구조물 제작 시 반도체 장비인 UV aligner을 사용하여 쉽게 노광(expose)이 가능하고 플라즈마 이온 식각 공정(Plasma Ion Etching Process)에도 적합하다. 또한 200℃ 이상의 고온에서도 잘 견디는 장점이 있고, 특히 기존의 UV aligner을 사용하여 쉽게 노광(expose)이 가능하므로 고가의 synchrotron X-Ray 장비를 사용해야만 했던 LIGA(Lithographie, Galvano-formung, Abformung) 공정을 대체할 수 있는 LIGA-like 공정의 발달을 가져오기도 하는 등의 특징이 있다.

상기의 소프트 베이크가 완료된 후에는 SU-8에 형상을 전사하고(c) 현상하면(d), 칩을 제작하기 위한 SU-8 몰드가 만들어지게 되고(e), 이 때 진공 상태에서 기포를 제거하게 된다.

상기의 실행이 완료되면, PDMS와 경화제를 일정한 비율(예를 들어 10:1)로 섞은 다음 이를 몰드의 상부에 붓고 65℃에서 3시간30분 동안 경화시킨 후에 몰드에서 PDMS를 떼어내면 PDMS칩(10)이 형성되는 것이다(f). 떼어낸 PDMS를 작게 커팅 및 펀칭을 한 후(g), 박막 유리칩과 접합함으로써(h) 최종적인 반응조(120)가 얻어지게 된다.

다음으로 도 6에 도시된 바와 같이 가열부(150)를 형성하는 단계는, 파이렉스 유리 웨이퍼를 SPM(황산과 과수 혼합물)용액 등에서 담궈 이물질을 제거하는 클리닝 단계(a), 클리닝을 실행한 후에 유리 웨이퍼에 크롬 200Å(b) 및 금 1000Å(c)를 열기상 증착법에 의해 증착시키게 된다.

이어 크롬 및 금의 박막 위에 AZ1512라는 양성감광제 내지 포토레지스트(PR, photoresist)를 스핀 코팅한 후에(d) 노광(e) 및 현상 공정(f)을 실행하게 된다.

상기 AZ1512는 양성 감광제((positive photoresist)로 Clariant, U.S.A에서 제조하는 것으로서, 금속 박막의 patterning 시 많이 사용되는 것이다.

상기의 노광 및 현상 공정을 실시한 후에 크롬 및 금을 차례로 습식 식각 또는 에칭한 다음 감광제를 제거하고(g) 작게 커팅하는 다이싱 작업을 하면(h) 가열부(150)의 유리칩(160)이 형성되는 것이다.

이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포용해와 DNA추출용 마이크로 바이오칩(100)을 사용하여 구강세포의 DNA를 추출하는 실험에 대해서 예시적으로 설명한다.

도 7은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 열전달 해석 결과를 보여주는 도면, 도 8은 도 7의 A-A 방향에 따른 히터 표면온도와 채널 내부온도를 보여주는 그래프, 도 9는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩을 이용하여 추출한 DNA로 실시한 PCR의 결과와 종래 기술에 따른 PCR의 결과를 각각 보여주는 겔 전기영동 사진이다.

우선 본 발명에 따른 마이크로 바이오칩(100)의 열전달 효율을 예측하기 위하여 상용 프로그램 (CFD-ACE+, ESI Group, France)을 이용하여 열전달 해석을 수행하였다. 마이크로 바이오칩의 종방향(A-A)의 온도 편평도를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 실험 수행시 해석결과를 참고하여 히터 표면의 온도에 대한 반응조 내부의 온도를 조정할 수 있다.

도 7에서 파란색으로 표시된 부분은 상대적으로 온도가 낮으며, 붉은색으로 표시된 부분은 상대적으로 온도가 높음을 의미한다. 도 7에 도시된 바와 같이 마이크로 히터(170) 및 이에 의해 가열되는 부분인 채널(132)의 온도가 상대적으로 높음을 알 수 있다. 또한, 도 8을 참조하면, 마이크로 히터(170)의 표면 온도는 점 선으로 표시되어 있고, 채널(132) 내부의 온도는 실선으로 표시되어 있다. 이 그래프로부터 마이크로 히터(170) 표면과 채널(132) 내부에는 온도 차이가 존재함을 알 수 있다.

한편, 마이크로 히터(170) 내지 반응조(120)의 온도를 제어하는 온도 제어 시스템은 바이오칩에 전원을 공급하는 전원 공급기(E3631A, Agilent Technology, U.S.A), 컴퓨터에 연결된 데이터 수집 보드(PCI-6024E, National Instrument, U.S.A), 신호 처리기(signal conditioner, SC2345, National Instrum ent, U.S.A)를 포함하여 구성될 수 있다. 전원 공급기를 통해 마이크로 바이오칩에 일정량의 전압을 공급하고 신호 처리기를 통해 데이터 수집 보드에 연결된 박막 형태의 온도센서(180)는 반응조(120) 내부의 온도를 수집한다. 온도 제어 시스템은 상용 프로그램(LabVIEW 7.0, National Instrument, U.S.A)을 이용할 수 있다.

시료 전처리 실험을 위해 손쉽게 채취가 가능한 구강세포를 이용하여, 구강세포의 용해 및 구강세포에서의 DNA추출을 수행하였다. 세포용해의 최적 온도 및 시간 조건을 도출하기 위해 마이크로 바이오칩에서 세포용해를 수행하였다. 최적조건의 평가는 DNA의 농도 측정기 NanoDrop ND-1000 (Nanodroptechnologies. Inc, U.S.A.)를 이용하여 반응 후의 DNA의 농도와 순도를 측정하여 수행하였으며 그 결과 80℃, 2분을 최적조건으로 결정하였다. 아래의 [표 1]에 본 발명의 마이크로 필터(134)를 사용하여 DNA의 순도를 향상시킨 결과를 나타내었다.

	DNA 추출 전	DNA 추출 후
DNA concentration (ng/㎕)	23.95	20.17
DNA 순도 (260/280)	0.93	1.62

한편, 마이크로 바이오칩에서의 시료 전처리 과정의 성능을 확인하기 위하여 추출된 DNA중 Y염색체에 존재하는 SY158유전자를 대상으로 PCR을 수행하였다. PCR시료의 조성은 [표 2]와 같다.

	Vol. (μm)
Nuclease free water	14.4
10X Buffer	2.0
dNTP	2.0
Primer (SY158 F)	0.2
Primer (SY158 R)	0.2
Additive [BSA]	0.0
Template	1.0
Taq polymerase (5unit/㎕)	0.2
Total	20.0

상용 PCR 장치(Primus 96 Thermocycler, MWG, U.S.A)를 사용하였다. PCR조건은 프리-디네이쳐(pre-denature)를 95℃에서 240sec 동안 수행하고, 디네이쳐(denature)를 95℃에서 15sec 동안 수행하며, 어닐링(annealing)을 60℃에서 15sec 동안 수행하고, 익스텐션(extension)을 65℃에서 30sec 동안 수행하여 총 35 cycle을 수행하였으며 그 결과가 도 9에 도시되어 있다.

도 9에 도시된 바와 같이, 본 발명의 마이크로 바이오칩을 이용하여 추출한 DNA로 실시한 PCR의 결과와 종래에 실시하는 방법을 통한 PCR의 결과를 각각 보여주는 Gel 전기 영동 사진으로, 좌측이 본 발명인 마이크로 바이오칩으로 추출한 DNA로 수행한 PCR 결과이며, 가운데 및 우측이 종래의 방식으로 수행한 PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 9에서 알 수 있듯이 본 발명에 따른 세포용해와 DNA추출용 마이크로 바이오칩을 사용한 경우의 결과가 종래 방식에 비해 현저히 뛰어남을 알 수 있다.

지금까지 설명한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩 및 이를 이용한 DNA 추출방법은 다양한 관점에서 파악될 수 있는 본 발명의 기술 사상 또는 본 발명에 대한 최소한의 기술로서 이해되어야 하고, 본 발명을 제한하는 경계로서 이해되어서는 아니 된다.

또한, 이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 이와 같은 특정 실시예에만 한정되는 아니며, 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경 가능한 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 도시한 투시 사시도,

도 2는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 분해 사시도 및 DNA의 추출 모습을 확대 도시한 개략도,

도 3은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 채널 및 마이크로 필터를 확대 도시한 도면,

도 4는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩을 이용한 DNA 추출 과정을 보여주는 순서도,

도 5는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 반응조를 형성하는 단계를 보여주는 도면,

도 6은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 가열부를 형성하는 단계를 보여주는 도면,

도 7은 도 1에 따른 마이크로 바이오칩의 열전달 해석 결과를 보여주는 도면,

도 8은 도 7의 A-A 방향에 따른 히터 표면온도와 채널 내부온도를 보여주는 그래프,

도 9는 도 1에 따른 마이크로 바이오칩을 이용하여 추출한 DNA로 실시한 PCR의 결과와 종래 기술에 따른 PCR의 결과를 각각 보여주는 겔 전기영동 사진이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

100： 시료 전처리용 마이크로 바이오칩

120: 반응조 130：PDMS칩

132: 채널 134: 마이크로 필터

136: 마이크로 필라 138: 마이크로 비드

140: 박막 유리칩 150: 가열부

160: 유리칩 170: 마이크로 히터

180: 온도 센서

Claims

시료 세포가 주입되는 반응조 및 상기 반응조에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부를 구비한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩에 있어서,

상기 반응조는 시료 세포로부터 순수한 DNA를 추출하기 위한 마이크로 필터를 구비한 사선(蛇線) 형상의 채널이 형성된 PDMS(Polydimethylsiloxane)칩 및 상기 PDMS칩의 일면에 접합되는 박막 유리칩을 포함하고,

상기 가열부는 상기 박막 유리칩의 하부에 놓여지는 유리칩 및 상기 유리칩의 일면에 크롬 및 금을 증착하여 형성된 마이크로 히터 및 온도센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제1항에 있어서,

상기 마이크로 필터는 상기 채널의 폭 방향을 따라 일정한 간격으로 이격 형성된 마이크로 필라(micro-pillar) 및 상기 필라의 사이에 구비되는 마이크로 비드(micro-bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제2항에 있어서,

상기 마이크로 비드의 직경은 서로 이웃하는 상기 마이크로 필라 사이의 간격 보다 크거나 동일한 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제1항 내지 제3항에 있어서,

상기 마이크로 필터는 상기 채널의 출구부 가까이에 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제4항에 있어서,

상기 반응조는 상기 가열부와 분리 가능하게 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제4항에 있어서,

상기 온도센서는 상기 마이크로 히터에 공급되는 전원을 조절하기 위해 상기 반응조의 온도를 감지하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
제4항에 있어서,

상기 마이크로 히터는 시료 세포의 세포벽 파열을 유도하여 세포용해를 수행하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리용 마이크로 바이오칩.
시료 세포가 주입되는 반응조 및 상기 반응조에 주입된 시료 세포의 효율적인 실험을 위해 온도를 조절하는 가열부를 구비한 시료 전처리용 마이크로 바이오칩을 이용한 DNA 추출방법에 있어서,

상기 반응조에 형성된 사선형의 채널에 마이크로 비드를 주입하는 단계;

상기 마이크로 비드가 상기 채널에 구비된 마이크로 필라에 걸리게 하는 단계;

상기 채널에 시료 세포를 주입하는 단계;

상기 채널에 주입된 시료 세포를 상기 가열부에 구비된 마이크로 히터로 가열하여 시료 세포의 세포벽을 파괴하는 세포용해 단계; 및

세포벽이 파열된 시료 세포에 포함된 DNA 이외의 잔여물들은 상기 마이크로 필라 및 상기 마이크로 비드에 의해 걸러지고 DNA는 상기 마이크로 필라 및 상기 마이크로 비드를 통과하는 DNA 추출 단계;

를 포함하는 DNA 추출 방법.
제8항에 있어서,

상기 DNA 추출 단계에서 상기 잔여물들은 서로 이웃하는 상기 마이크로 필라 사이의 간격 보다 크거나 동일한 직경을 가진 상기 마이크로 비드 및 상기 마이크로 비드의 직경 보다 큰 직경을 가진 상기 마이크로 필라에 의해 걸러지는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서,

상기 세포용해 단계는 상기 가열부에 구비된 온도 센서에 의해 상기 반응조의 온도를 감지하여 상기 마이크로 히터에 공급되는 전원을 조절하는 단계를 포함 하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 방법.
제10항에 있어서,

상기 마이크로 비드를 주입하는 단계는 상기 가열부 위에 상기 반응조를 올려 놓고 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 추출 방법.