KR20090112342A - 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩 및 이를이용한 생체 분자 분석장치 및 분석방법 - Google Patents

자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩 및 이를이용한 생체 분자 분석장치 및 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노 자성입자와 컬러 마이크로비드를 사용하여 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출을 위한 미세 유체 칩 및 이를 이용한 분석장치 및 분석방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은,
생체 분자 간의 특이적 반응에 의해 결합된 컬러 마이크로비드와 나노 자성입자의 반응물이 주입되는 반응물 주입부; 상기 반응물을 미세 유체 채널에서 한쪽 벽면으로 집속시키기 위한 집속용액이 주입되는 집속용액 주입부; 상기 반응물의 집속이 이루어지는 반응물 집속부; 상기 컬러 마이크로비드의 디코딩을 위해 참조 컬러 마이크로비드가 주입되는 컬러 마이크로비드 참조부; 상기 컬러 마이크로비드 참조부에 주입될 컬러 마이크로비드를 주입하는 컬러 마이크로비드 주입부; 자기장에 노출되어 상기 컬러 마이크로비드를 디코딩하고, 상기 생체 분자의 농도를 정량 분석하며, 상기 컬러 마이크로비드의 위치를 판별하는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부; 외부 자기장을 집속하여 자기장 구배를 형성하는 자기장 집속부; 및 상기 반응물과 집속용액이 배출되는 배출부를 포함한다.
자기영동, 컬러 마이크로비드, 생체 분자 다중검출 칩.

Description

자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩 및 이를 이용한 생체 분자 분석장치 및 분석방법{Magnetophoretic multiplexed microfluidic chip and assay system and method for analysis of biomolecules using that chip}
본 발명은 나노 자성입자와 컬러 마이크로비드를 사용하여 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출을 위한 미세 유체 칩 및 이를 이용한 분석장치 및 분석방법에 관한 것이다.
프로테오믹스 연구시대가 도래함에 따라 단백질을 식별하고 정량 분석을 위한 새롭고 효과적인 검출방식 개발에 초점이 모아지고 있다. 신약개발이나 단백질 연구분야에서의 빠른 성장은 단백질 간의 상호작용, 세포신호 전달경로, 바이오 마커의 작용 등 막대한 양의 다양한 연구를 빠른 시간안에 이루어지도록 하고 있다.
따라서, 더 이상 기존의 단일 검출방식(singleplex)으로는 이러한 대량의 실험 분석결과를 얻는 것이 점점 불가능해지고 있는 실정이다. 또한, 질병의 조기 진단을 위해서는 다양한 종류의 단백질을 동시에 검출해내는 능력이 요구될 뿐만 아 니라 극미량의 단백질까지 검출할 수 있어야 한다.
이런 필요성을 충족시키기 위해 DNA 또는 단백질 분석용 마이크로 어레이(microarray)방식이 개발되어 왔다. 마이크로 어레이방식은 평판위에 검출하고자하는 생체 분자와 결합할 수 있는 물질을 다수의 spot 형태로 고정시키고 검출 생체 분자를 포함하고 있는 용액과 반응시켜 다중검출을 하게 된다.
그러나, 이 기술은 융통성(flexibility), 생체 분자 반응속도, 가격 그리고 감도면에 있어서 많은 문제점을 드러낸다. 이런 한계점을 보완하기 위해 서스펜션 어레이(suspension array) 방식으로 상용화된 기술들이 출시되고 있다. 서스펜션 어레이 방식은 상기의 방식에 비해 생체 분자와의 반응속도가 빠르고 시료의 양을 크게 절감할 수 있다.
또, 마이크로비드를 사용하므로 3차원 공간으로 생체 분자가 결합하기 때문에 감도면에서 훨씬 좋아지고 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용함으로써 고속의 작업 처리량을 보인다. 단, 다중 검출이라는 측면에서는 인코딩된 마이크로비드를 사용하여 마이크로 어레이 방식과 비교했을 때 큰 차이를 보이지 않는다.
현재 상용화되어 있는 단백질 마이크로 어레이 및 서스펜션 어레이 기술 대부분이 측정에 필요한 형광물질을 사용하여 생체 분자의 인코딩과 디코딩을 하고 있다. 특히, 기존의 형광물질을 사용한 다중검출 시스템, 예를 들어 Luminex사(http://www.luminexcorp.com/) 제품의 경우, 반응이 이루어진 마이크로비드의 분석 처리 속도는 굉장히 높지만 가장 큰 문제점은 마이크로비드에 있는 형광물질 의 quenching 또는 bleaching 현상과 같은 광 불안정성에 있다. 이로 인해, 분석하고자 하는 생체 분자의 인코딩 및 디코딩에 있어 재현성이 떨어지는 문제가 발생한다.
뿐만 아니라, 일반 형광물질의 넓은 방출 스펙트럼 때문에 단순히 형광 비드 만으로는 더 많은 다중검출용으로 발전시키는 데는 분명한 한계가 있다. 또한, 형광물질을 쓰게 되면 분석을 위해 1~2개의 레이저와 4~5개의 검출기가 필요해 복잡하고 값비싼 장비를 필요로 하게 된다.
본 발명은 상기한 바와 같은 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 하나의 칩 상에서 다수의 생체 분자를 신속하고, 고감도로 검사할 수 있는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩 및 이를 이용한 생체 분자 분석장치 및 분석방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은,
생체 분자 간의 특이적 반응에 의해 결합된 컬러 마이크로비드와 나노 자성입자의 반응물이 주입되는 반응물 주입부; 상기 반응물을 미세 유체 채널에서 한쪽 벽면으로 집속시키기 위한 집속용액이 주입되는 집속용액 주입부; 상기 반응물의 집속이 이루어지는 반응물 집속부; 상기 컬러 마이크로비드의 디코딩을 위해 참조 컬러 마이크로비드가 주입되는 컬러 마이크로비드 참조부; 상기 컬러 마이크로비드 참조부에 주입될 컬러 마이크로비드를 주입하는 컬러 마이크로비드 주입부; 자기장에 노출되어 상기 컬러 마이크로비드를 디코딩하고, 상기 생체 분자의 농도를 정량 분석하며, 상기 컬러 마이크로비드의 위치를 판별하는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부; 외부 자기장을 집속하여 자기장 구배를 형성하는 자기장 집속부; 및 상기 반응물과 집속용액이 배출되는 배출부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 생체 분자 간의 특이적 반응으로는 항원-항체반응, 아비딘(Avidin), 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 또는 스트렙트아비딘(StreptAvidin)-바이오틴(biotin) 반응, 상보적 관계에 있는 DNA(complementary DNA), 면역글로불린 G(immunoglobulin G)-단백질 A(protein A), 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L 간의 반응 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부는 상기 컬러 마이크로비드 참조부가 옆에 위치한 부분의 미세 유체 채널인 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 미세 유체 채널에는 분석하고자 하는 생체 분자의 농도 범위에 따라 다양한 분석 범위를 갖게 하기 위해 적어도 하나 이상의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부가 형성되도록 하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 컬러 마이크로비드 참조부는 분석하고자 하는 컬러 마이크로비드 종류에 따라 이에 상응하는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에 적어도 2개 이상의 미세 유체 채널 구조를 구비하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은 유리 기판 위에 고분자 박막층을 형성하고, 상기 고분자 박막층 위에 자기장 집속부를 고정시킨 후, 상기 자기장 집속부와 미세 유체 채널 사이에 일정거리를 유지하면서 상기 고분자 박막층 위에 접합시켜 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기장 집속부는 강자성체 물질 또는 강자성을 띠는 합금으로 구성되는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 강자성체 물질은 니켈, 코발트, 철 중 적 어도 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 강자성을 띠는 합금은 퍼멀로이(permalloy; Fe 20%, Ni 80%), 수퍼퍼멀로이(superpermalloy; Ni 79%, Mo 5%, Fe), 그리고 뮤메탈(mu-metal; Ni 75%, Fe 15%, Cu, molybdenum) 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 상기 나노 자성입자는 초상자성(superparamagnetism)을 띠는 물질로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 컬러 마이크로비드는 고분자 재료로 제조되는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 고분자 재료는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl-methacrylate:PMMA), 실리카(silica), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene:PVT), 스티렌/부타디엔(styrene/butadiene:S/B), 공중합체(copolymer), 그리고 스티렌/비닐톨루엔(styrene/vinyltoluene:S/VT) 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은 폴리다이메팅실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리아크릴레이트, 폴리카보닐레이트, 폴리사이클릭올레핀, 폴리이미드 및 폴리우레탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 고분자로 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치는,
상기 미세 유체 칩; 컬러 마이크로비드, 검출 생체분자, 및 나노 자성입자의 반응을 미세 유체 채널 내에서 수행할 수 있는 전처리부; 및, 검출된 생체분자의 특성을 분석할 수 있는 분석부를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법은,
상기 미세 유체 칩을 이용한 방법으로 컬러 마이크로비드, 검출생체 분자 및 나노 자성입자를 반응시키는 제 1단계; 상기 컬러마이크로비드, 검출생체 분자 및 나노 자성입자 반응물(이하, 반응물)을 반응물 주입부에 주입하는 제 2단계; 상기 반응물 주입부에 주입된 반응물을 미세 유체 채널 내에 한쪽 벽면으로 집속시키는 제 3단계; 상기 집속된 반응물이 자기장의 영향으로 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에서의 흐름 경로가 변경되는 제 4단계; 상기 컬러 마이크로 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부를 통과하는 반응물의 이미지를 얻는 제 5단계; 및,
얻은 반응물 이미지를 분석하여 컬러 마이크로비드의 디코딩 및 위치를 판별해 정량 분석을 하는 제 6단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 3단계는 펌프를 이용하여 배출부에서 상기 반응물을 끌어당기는 방식으로 반응물을 집속시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 하나의 칩에서 다양한 농도의 생체 분자를 분석하기 위해 미세 유체 채널 내에서의 유속을 조정하여 반응물이 자기장에 노출되는 시간을 달리하여 반응물이 자기장 방향으로 편향되는 거리를 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 4단계에서 상기 자기력은 영구자석 또는 전자석을 이용하고 높은 자기장 구배를 형성하기 위하여 외부 자기장을 집속시킬 수 있는 물질을 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부 옆에 위치하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 제 5단계에서 반응물의 정확한 색 이미지를 얻기 위해 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부의 옆에 있는 컬러 마이크로비드 참조부에 분석하고자하는 컬러 마이크로비드를 채워 정확한 초점을 맞춘 후 통과하는 반응물의 이미지를 얻는 것을 특징으로 한다.
상기한 바와 같은 본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출을 위한 미세 유체 칩 및 이를 이용한 분석장치 및 분석방법에 의하면,
기존의 형광물질을 사용하여 다중검출 및 재현성 측면에서 보인 한계점을 해결할 수 있다. 형광 물질을 대체하여 컬러 마이크로비드를 사용함으로써 생체 분자 다중검출의 폭을 넓힐 수 있고 분석 장비의 소형화를 이룰 수 있어 비용을 절감할 수 있다. 뿐만 아니라, 강자성체 마이크로 구조물을 도입하고 컬러 마이크로비드의 디코딩을 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 다수의 생체 분자를 신속히 고감도로 검사를 수행할 수 있어 기존 기술들의 단점을 해결하게 된다. 또한, 자기장을 조절하기 위해 복잡한 구성요소가 필요했던 기존 장비들과는 달리 유속과 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부의 조정만으로 하나의 칩에서 다양한 농도의 생체 분자를 분석할 수 있다는 장점이 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 우선, 도면들 중 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의해야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하게 하지 않기 위해 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩을 도시한 평면도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩(100)은 반응물 주입부(110), 집속용액 주입부(120), 반응물 집속부(130), 컬러 마이크로비드 주입부(140), 컬러 마이크로비드 참조부(150), 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160), 자기장 집속부(170), 배출부(180)을 포함한다.
상기 반응물 주입부(110)에는 생체 분자 간의 특이적 반응에 의해 결합된 컬러 마이크로비드와 나노 자성입자의 반응물(이하, 반응물)이 주입된다. 도 3을 참조하여 상기 반응물에 대해 상세히 설명한다. 컬러 마이크로비드(301)와 나노 자성입자(306)의 표면에는 각각 검출분자(302)의 다른 부분을 인식하는 생체 분자가 고정되어 있다. 최초 컬러 마이크로비드(301)와 분석하고자하는 검출분자(302)를 일정시간 반응시킨 후 나노 자성입자(306)를 차례로 일정시간 반응시킴으로써 컬러 마이크로비드(301), 검출 생체분자(302) 및 나노 자성입자(306)의 반응물이 생성된 다. 이렇게 생성된 반응물이 상기 반응물 주입부(110)에 주입되는 것이다.
상기 집속용액 주입부(120)에는 상기 반응물을 미세 유체 채널에서 한쪽 벽면으로 집속시키기 위한 집속용액이 주입된다. 상기 집속용액 주입부는 반응물 주입부와 연결된 미세 유체 채녈보다 넓은 미세 유체 채널과 연결되어 있다.
상기 반응물 집속부(130)에서는 상기 반응물의 집속이 이루어진다. 이때, 효과적으로 반응물을 집속시키기 위하여 배출부(180)에서 반응물과 집속용액을 끌어당기는 방식을 취한다. 반응물 주입부에는 반응물을 포함하고 있는 용액을 채우고, 집속용액 주입부에는 집속용액을 채우고 대기중에 노출시킨다. 그리고 배출부에서 펌프를 이용하여 유체를 끌어당기면 대기압과 펌프사이의 하나의 압력강하만이 걸리기 때문에 유체의 동요가 적어 보다 효과적으로 반응물을 집속시킬 수 있다.
상기 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)는 컬러 마이크로비드를 디코딩하고, 생체 분자의 농도를 정량 분석하며, 컬러 마이크로비드의 위치를 판별한다. 상기 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)의 오른쪽 측면에는 외부 자기장을 집속시켜 보다 강한 자기장 구배를 인가하게 하여 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치의 검출한계를 낮출 수 있는 자기장 집속부(170)가 위치한다. 그리고, 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)의 왼쪽 측면에는 컬러 마이크로비드의 디코딩을 효과적으로 수행하기 위한 컬러 마이크로비드 참조 부(150)가 있다. 여기서, 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)라고 정의될 수 있는 미세 유체 채널 부분은 컬러 마이크로비드 참조부(150)가 옆에 있는 부분이다. 이때, 상기 미세 유체 채널에는 분석하고자 하는 생체 분자의 농도 범위에 따라 다양한 분석 범위를 갖게 하기 위해 적어도 하나 이상의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)가 형성되도록 할 수 있다.
한편, 상기 컬러 마이크로비드 참조부(150)는 상기 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)에 주입되는 컬러 마이크로비드를 효과적으로 디코딩하기 위해 컬러 마이크로비드 주입부(140)를 통해 참조 컬러 마이크로비드를 주입하여 현미경의 포커스를 정확히 포착하여 색을 확실히 구분할 수 있도록 한다.
분석하고자 하는 생체 분자의 다양한 농도 분석을 하기 위해서는 컬러 마이크로비드 참조부를 여러 군데 제조하는 것이 바람직하다. 예를 들어 높은 농도일 경우는 반응물 집속부(130)로부터 가까운 거리에 컬러 마이크로비드 참조부를, 낮은 농도의 경우는 배출부(180)로부터 가까운 거리에 컬러 마이크로비드 참조부를 위치시킴으로써 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부의 위치를 조정하여 넓은 농도범위에서 분석이 가능하도록 한다.
또한, 상기 컬러 마이크로비드 참조부(150)는 분석하고자 하는 컬러 마이크로비드의 종류에 따라 각각의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에 적어도 2개 이상의 미세 유체 채널을 구비하도록 할 수 있다.
한편, 반응물을 흘려주는 유속을 달리함으로써 분석 농도범위를 조정할 수도 있다. 같은 농도의 생체 분자라고 하더라도 유속을 빠르게 하면 반응물이 자기장에 노출되는 시간이 줄어들어 유속이 느릴 경우보다 미세 유체 채널 내에서 자기장 방향으로 편향되는 거리가 줄어들어 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)에서 분석되는 반응물의 움직인 거리는 적게 된다. 그러므로 높은 농도를 분석할 경우는 유속을 빠르게, 낮은 농도를 분석할 경우는 유속을 느리게 조정하여 하나의 칩에서 다양한 농도의 생체 분자를 분석할 수 있다.
반응물이 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)를 통해 흘러갈 때 컬러 마이크로비드 참조부(150)에는 디코딩하고자하는 색깔의 참조 컬러 마이크로비드를 주입하여 CCD 카메라의 영상에 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)를 지나가는 반응물의 컬러 마이크로비드의 정확한 색상이 얻어지도록 한다. 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)에 도달한 반응물은 자기장 집속부(170)로부터 인가되는 자기력에 의해 검출 분자의 농도에 비례해 자기장 집속부(170)쪽으로 편향된다. 이때, 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부 위쪽에 위치한 CCD 카메라를 이용해 편향된 컬러 마이크로비드의 이미지를 얻어 컴퓨터로 전송하고 컴퓨터 프로그램을 이용하여 디코딩을 함으로써 생체 분자 다중검출이 가능하다.
도 2는 도 1의 미세 유체 칩을 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치(이하, 분석장치)를 도시한 측면도이다.
상기 분석장치(200)는 유리 기판(210) 위에 강자성체 마이크로 구조물(220)을 고정시키고 미세 유체 칩(100)을 접합시킬 수 있는 고분자 박막층(240)이 존재하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 고분자 박막층(240)은 이 기능 이외에도 강자성체에 의해 집속되는 자기장의 사용을 극대화하기 위한 기능을 수행한다.
본 발명의 분석장치에서는 외부 자기장이 강자성체 마이크로 구조물(220)에 수직 방향으로 형성되기 때문에 강자성체가 자기장을 집속하면 상대적으로 강자성체 바로 옆은 자기장 밀도가 소해진다. 대신 강자성체의 대각선 위쪽 방향으로는 자기장 밀도가 밀해져 높은 자기장 구배가 형성된다. 그러므로, 고분자 박막층(240)을 미세 유체 칩(100) 밑에 형성함으로써 컬러 마이크로비드와 나노 자성입자의 반응물이 지나가는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)에 높은 자기장 구배가 형성됨으로써 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치의 검출감도가 좋아지도록 한다.
이때, 상기 강자성체 마이크로 구조물(220)은 니켈, 코발트, 철 등의 강자성체 물질과 퍼멀로이(permalloy; Fe 20%, Ni 80%), 수퍼퍼멀로이(superpermalloy; Ni 79%, Mo 5%, Fe) 또는 뮤메탈(mu-metal; Ni 75%, Fe 15%, Cu, molybdenum) 등의 합금과 같은 강자성을 띠는 모든 물질 중 적어도 어느 하나 이상을 선택하여 제조되는 것이 바람직하다.
도 3은 따른 컬러 마이크로비드(301), 검출분자(302) 그리고 검출분자와 결할할 수 있는 나노 자성입자(306)의 반응과정의 모식도이다. 전술한 바와 같이, 컬러 마이크로비드(301)와 나노 자성입자(306)의 표면에는 각각 검출분자(302)의 다른 부분을 인식하는 생체 분자가 고정되어 있다. 최초 컬러 마이크로비드(301)와 분석하고자하는 검출분자(302)를 일정시간 반응시킨 후 나노 자성입자(306)를 차례로 일정시간 반응시킴으로써 컬러 마이크로비드(301), 검출분자(302) 및 나노 자성입자(306)의 반응물이 생성된다.
본 발명에 따른 컬러 마이크로비드(301), 나노 자성입자(306)와 검출분자(302)사이의 반응에 관여하는 생체 분자로는 항원-항체반응, 아비딘(Avidin) 또는 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 또는 스트렙트아비딘(StreptAvidin)-바이오틴(biotin) 반응, 상보적 관계에 있는 DNA(complementary DNA), 면역글로불린 G(immunoglobulin G)-단백질 A(protein A), 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L간의 반응 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 컬러 마이크로비드(301)는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl-methacrylate:PMMA), 실리카(silica), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene:PVT), 스티렌/부타디엔(styrene/butadiene:S/B), 공중합체(copolymer) 또는 스티렌/비닐톨루엔(styrene/vinyltoluene:S/VT) 등의 고분자 재료로 만들어진 마이크로비드(301)를 사용한다. 또한, 컬러 마이크로비드(301) 표면에는 분석하고자하는 생체 분자(302)와 결합할 수 있는 생체 분자(303)를 접합시킬 수 있는 표면처리가 되어있는 것이 바람직하다. 그 표면처리로는 황산화기(-SO4), 카르복실기(-COOH), 지방성 아민기(-CH2, -NH2), 아비딘(avidin), 바이오틴(biotin), 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G 또는 단백질 L 등으로 할 수 있다.
본 발명에 사용되는 컬러 마이크로비드(301)의 색은 파란색, 검정색, 빨간색, 노란색, 녹색, 오렌지색, 흰색, 보라색, 갈색, 핑크색 등의 색이 적용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 나노 자성입자(306)는 Fe2O3, Fe3O4, FePt 또는 MnFe2O4 등의 물질로 이루어진 초상자성(superparamagnetism)을 띠는 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 초상자성 성질을 띠는 나노 자성입자는 외부의 자기장이 존재하지 않는 한 자성을 띠지않기 때문에 나노 자성입자들 사이의 응집 현상이 발생하지 않아 생체 분자를 검출하는 데 있어 보다 효과적이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치에서 결합된 컬러 마이크로비드(301)를 효율적으로 분석하기 위한 컬러 마이크로비드 참조부(150)의 실제 예를 도시한 도이다. 생체 분자(302)의 정확한 다중 검출을 위해서는 컬러 마이크로비드의 디코딩을 확실하게 해야된다. 이를 위해 현미경상에서의 포커스를 컬러 마이크로비드에 정확히 맞춤으로써 각각에 해당하는 색을 맞게 얻어 이미지 분석에 필요한 컬러 마이크로비드의 사진을 얻는다. 참조부의 컬러 마이크로비드의 색을 정확히 얻음으로써 컬러 마이크로비드의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부(160)를 지나가는 다수의 컬러 마이크로비드의 올바른 이미지를 얻을 수 있어 분석이 정확히 이루어진다. 이를 이용하여 분석하고자하는 생체 분자의 종류를 알아내고 다음 단계인 정량 분석 단계로 넘어가게 된다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석장치를 통해 얻은 80 ng/ml 농도의 토끼 IgG-바이오틴 생체 분자의 컴퓨터 프로그램에 의한 컬러 마이크로비드의 디코딩 및 위치 판별 결과를 도시한 도이다. 토끼 IgG-바이오틴 생체 분자를 분석하기 위하여 토끼 IgG와 결합할 수 있는 항 토끼 IgG를 노란색 컬러 마이크로비드에 고정하였다. 이후, 상기의 반응방법으로 결합된 컬러 마이크로비드, 나노 자성입자 반응물을 상기의 단계들을 거쳐 분석이 이루어지도록 하였다. 얻어진 CCD 이미지를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석한 결과 도 5의 그래프에서 나타난 것처럼 분석되어진 모든 마이크로비드가 노란색으로 디코딩 결과가 나와 토끼 IgG-바이오틴에 대한 것이라고 분석이 이루어졌고 80 ng/ml 농도의 토끼 IgG-바이오틴 생체 분자에 대해서는 집속된 왼쪽 채널 벽면으로부터 약 64㎛에 위치한다는 결과를 얻었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석장치를 통해 얻은 3가지 종류, 쥐 IgG-바이오틴, 토끼 IgG-바이오틴, 염소 IgG-바이오틴 생체 분자에 대한 표준정량곡선이다. 본 시스템에 의해 검출할 수 있는 농도 범위는 6.66fM에서 799.2fM까지인 것으로 분석되었다. 검출한계는 쥐 IgG-바이오틴은 12.1fM, 토끼 IgG-바이오틴은 30.6fM 그리고 염소 IgG-바이오틴은 10.9fM로 평가되었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치를 도시한 블록도이다.
도 7에 도시된 바와 같이, 상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치(400)는 전술한 미세 유체 칩(100)에 컬러 마이크로비드, 검출 생체분자, 및 나노 자성입자의 반응을 미세 유체 채널 내에서 수행할 수 있는 전처리부(410)와 검출된 생체분자의 특성을 분석할 수 있는 분석부(420)를 더 포함하여 구성될 수 있다. 상기 전처리부(410)와 분석부(420)는 공지의 기술로 충분히 구성될 수 있으므로, 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예1 > 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출을 위한 미세 유체 칩의 제조
폴리다이메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)을 이용한 마이크로몰딩(micromolding) 기법으로 본 발명의 일 실시예에 따른 미세 유체 칩을 다음과 같이 제조하였다.
실리콘 웨이퍼 기판 위에 감광물질 SU-8을 사용하여 패터닝함으로써 폭 100㎛, 높이 8㎛인 마이크로 구조물인 주형을 제조하였다. 제조된 주형에 경화제와 PDMS의 초기중합체(prepolymer)를 5:1로 혼합된 혼합물을 붓고 80℃에서 2시간 동안 경화시켜 PDMS 미세 유체 칩을 제조하였다. 상기 경화 과정을 거친 후 PDMS 미세 유체 칩에 구멍을 내어 반응물 주입부, 집속용액 주입부, 컬러 마이크로비드 참조부 그리고 배출부를 제조하였다. 또, 슬라이드 유리 기판 위에 폭 1 mm, 높이 40㎛의 강자성체 마이크로 구조물을 놓고 상기의 혼합물을 붓고 압축 방식으로 강자성체 마이크로 구조물의 높이와 같은 높이의 PDMS층이 생기면서 강자성체 마이크로 구조물이 유리 기판 위에 고정되도록 한다. 이후, PDMS 미세 유체 칩과 강자성체 마이크로 구조물이 고정되어 있는 40㎛ 높이의 PDMS 층을 공기 플라즈마를 이용해 산화시키고 PDMS 미세 유체 칩과 강자성체 마이크로 구조물의 거리를 100㎛가 되도록 조정하여 붙임으로써 미세 유체 칩을 완성하였다. 제조된 미세 유체 칩의 개요도는 도 1에 도시된 바와 같다.
< 실시예2 > 자기영동 기반 의 생체 분자 다중검출 분석장치를 이용한 3가지 종류의 단백질 분석 방법
본 발명에서 고안한 방법으로 쥐 IgG-바이오틴, 토끼 IgG-바이오틴, 염소 IgG-바이오틴 3가지 종류의 단백질 분석을 실시하였다.
3가지 단백질을 분석하기 위하여 빨간색, 노란색, 파란색의 컬러 마이크로비드를 사용하였고 빨간색 마이크로비드에는 항 염소 IgG를, 노란색 마이크로비드에는 항 토끼 IgG를, 파란색 마이크로비드에는 항 쥐 IgG를 각각 고정시켰다. 각각의 컬러 마이크로비드는 카르복실 작용기가 형성되어 있고 각각에 해당하는 단백질을 고정시키기 위해 20mM EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)로 컬러 마이크로비드를 활성화시키고 sodium phosphate buffer(pH 6.2)에 제조된 60mM sulfo-NHS로 상온에서 30분간 반응시킨다. 그 후, β-mercaptoethanol을 주입하여 용액상에 반응하지 않은 채로 있는 EDC를 비활성화시킨다. 반응된 컬러 마이크로비드를 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) buffer(pH 6.0)로 세번 세척하고 각 색깔에 맞게 항 염소 IgG, 항 토끼 IgG, 항 쥐 IgG를 상온에서 3시간 반응시킨다. 그 후, 컬러 마이크로비드는 PBS(phosphate buffer saline)buffer (pH 7.4)에 보관하여 다음 반응을 진행한다.
이렇게 준비된 3가지 컬러 마이크로비드를 빨간색 컬러 마이크로비드는 38,520/70μL, 노란색 컬러 마이크로비드는 35,850/70μL, 파란색 컬러 마이크로비드는 39,840/70μL의 농도가 되도록 준비한다. 여기에 각각 분석하고자하는 항 염소 IgG, 항 토끼 IgG, 항 쥐 IgG를 농도별로 준비하여 10μL씩 넣고 상온에서 10분간 반응시킨다. 각각의 단백질이 반응된 컬러 마이크로비드에 최종적으로 스트렙트 아비딘이 결합되어 있는 약 50nm 크기의 나노 자성입자를 각각 5μL씩 넣고 상온에서 10분간 반응시켜 반응물을 완성한다. 이 면역분석방법의 모식도를 도 3에 나타내었다.
본 발명에서 제조된 생체 분자 다중검출 분석장치의 배출부로 먼저 동일한 PBS 용액을 주입하여 미세 유체 채널 전체에 용액이 채워지도록 한다. 그 후, 반응물을 반응물 주입구에, 집속용액을 집속용액 주입구에 주입한다. 이때, 컬러 마이크로비드 참조부의 위쪽 미세 유체 채널에는 노란색 컬러 마이크로비드를, 아래쪽 미세 유체 채널에는 빨간색 컬러 마이크로비드를 채워넣은 후 CCD 카메라상에 각각의 고유 색상이 제대로 얻어지는 현미경 초점을 맞춘다. 조정후, 배출부에 연결되어 있는 펌프를 작동시켜 미세 유체 채널 안에 있는 유체를 끌어당겨 반응물이 집속된 채로 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부로 이동되도록 한다. 여기서 유속은 3μL/h 로 고정하고 이 유속에서의 반응물의 집속 결과는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부 왼쪽 벽면으로부터 약 3.46㎛로 측정되었다. 영구자석을 이용해 외부 자기장을 걸어주고 니켈 마이크로구조물에 의해 집속된 강화된 자기장을 이용하여 생체 분자검출이 이루어지도록 한다.
우선, 각 단백질의 표준정량곡선을 구한다. 한 가지 종류의 컬러 마이크로비드를 사용하여 각 단백질에 해당하는 표준정량곡선을 얻는다. 표준정량곡선은 알고 있는 농도의 단백질을 반응시키고 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에서 컬 러 마이크로비드의 위치를 측정해서 각각의 농도와 위치의 상관관계를 그래프로 얻는 것이다. 이때, CCD 카메라를 사용하여 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에서의 컬러 마이크로비드의 이미지를 얻고 Matlab 프로그램으로 자동화된 위치 식별을 한다. 표준정량곡선을 얻어 본 결과 본 발명의 생체 분자 다중검출 분석장치는 약 6.66fM에서 799.2fM 정도의 측정 범위를 갖는 것으로 판명되었다. 그 후, 생체 분자 다중검출 분석장치의 성능과 재현성을 검증하기 위해 임의의 농도로 각각 반응시킨 3가지의 컬러 마이크로비드 반응물로 실험한 결과 정량 분석에 있어서 표준정량곡선과의 일치를 확인하였고 디코딩, 즉 컬러 마이크로비드의 인식 또한 빨간색의 경우 약 98%, 노란색과 파란색의 경우는 100%에 가까운 인식률을 보여서 이 생체 분자 다중검출 분석장치가 목표한대로의 기능수행이 가능하다는 것을 증명하였다.
이상과 같이 본 발명에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩 및 이를 이용한 생체 분자 분석장치 및 분석방법을 예시한 도면을 참조로 하여 설명하였으나, 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술사상 범위내에서 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩을 도시한 평면도,
도 2는 도 1의 미세 유체 칩을 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치를 도시한 측면도,
도 3은 컬러 마이크로비드, 검출생체 분자 그리고 검출생체 분자와 결합할 수 있는 나노 자성입자의 반응과정을 도시한 모식도,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치에서 결합된 컬러 마이크로비드를 효율적으로 분석하기 위한 컬러 마이크로비드 참조부의 실제 예를 도시한 도,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석장치를 통해 얻은 80 ng/ml 농도의 토끼 IgG-바이오틴 생체 분자의 컴퓨터 프로그램에 의한 컬러 마이크로비드의 디코딩 및 위치 판별 결과를 도시한 도,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석장치를 통해 얻은 3가지 종류, 쥐 IgG-바이오틴, 토끼 IgG-바이오틴, 염소 IgG-바이오틴 생체 분자에 대한 표준정량곡선,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치를 도시한 블록도,
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
100 : 미세 유체 칩 110 : 반응물 주입부
120 : 집속용액 주입부 130 : 반응물 집속부
140 : 컬러 마이크로비드 주입부 150 : 컬러 마이크로비드 참조부
160 : 컬러 마이크로비드의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부
170 : 자기장 집속부 180 : 배출부
210 : 유리기판 220 : 강자성체 마이크로 구조물
230 : 미세 유체 채널 240 : 고분자 박막층
301 : 컬러 마이크로비드 302 : 검출생체 분자
303 : 검출생체 분자와 결합할 수 있는 생체 분자
304 : 바이오틴(Biotin) 305 : 뉴트라아비딘(NeutrAvidin)
306 : 나노 자성입자

Claims (20)

  1. 생체 분자 간의 특이적 반응에 의해 결합된 컬러 마이크로비드와 나노 자성입자의 반응물이 주입되는 반응물 주입부;
    상기 반응물을 미세 유체 채널에서 한쪽 벽면으로 집속시키기 위한 집속용액이 주입되는 집속용액 주입부;
    상기 반응물의 집속이 이루어지는 반응물 집속부;
    상기 컬러 마이크로비드의 디코딩을 위해 참조 컬러 마이크로비드가 주입되는 컬러 마이크로비드 참조부;
    상기 컬러 마이크로비드 참조부에 주입될 컬러 마이크로비드를 주입하는 컬러 마이크로비드 주입부;
    자기장에 노출되어 상기 컬러 마이크로비드를 디코딩하고, 상기 생체 분자의 농도를 정량 분석하며, 상기 컬러 마이크로비드의 위치를 판별하는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부;
    외부 자기장을 집속하여 자기장 구배를 형성하는 자기장 집속부; 및
    상기 반응물과 집속용액이 배출되는 배출부를 포함하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생체 분자 간의 특이적 반응으로는 항원-항체반응, 아비딘(Avidin), 뉴트라아비딘(NeutrAvidin) 또는 스트렙트아비딘(StreptAvidin)-바이오틴(biotin) 반응, 상보적 관계에 있는 DNA(complementary DNA), 면역글로불린 G(immunoglobulin G)-단백질 A(protein A), 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L 간의 반응 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부는 상기 컬러 마이크로비드 참조부가 옆에 위치한 부분의 미세 유체 채널인 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 미세 유체 채널에는 분석하고자 하는 생체 분자의 농도 범위에 따라 다양한 분석 범위를 갖게 하기 위해 적어도 하나 이상의 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부가 형성된 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 컬러 마이크로비드 참조부는 분석하고자 하는 컬러 마이크로비드 종류에 따라 이에 상응하는 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에 적어도 2개 이상의 미세 유체 채널 구조를 구비하는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은 유리 기판 위에 고분자 박막층을 형성하고, 상기 고분자 박막층 위에 자기장 집속부를 고정시킨 후, 상기 자기장 집속부와 미세 유체 채널 사이에 일정거리를 유지하면서 상기 고분자 박막층 위에 접합시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 자기장 집속부는 강자성체 물질 또는 강자성을 띠는 합금으로 구성되는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 강자성체 물질은 니켈, 코발트, 철 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 강자성을 띠는 합금은 퍼멀로이(permalloy; Fe 20%, Ni 80%), 수퍼퍼멀로이(superpermalloy; Ni 79%, Mo 5%, Fe), 그리고 뮤메탈(mu-metal; Ni 75%, Fe 15%, Cu, molybdenum) 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노 자성입자는 초상자성(superparamagnetism)을 띠는 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 나노 자성입자는 Fe2O3, Fe3O4, FePt, 그리고 MnFe2O4 중 어느 하나인 것 을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 컬러 마이크로비드는 고분자 재료로 제조되는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 고분자 재료는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl-methacrylate:PMMA), 실리카(silica), 폴리비닐톨루엔(polyvinyltoluene:PVT), 스티렌/부타디엔(styrene/butadiene:S/B), 공중합체(copolymer), 그리고 스티렌/비닐톨루엔(styrene/vinyltoluene:S/VT) 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩은 폴리다이메팅실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리아크릴레이트, 폴리카보닐레이트, 폴리사이클릭올레핀, 폴리이미드 및 폴리우레탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 고분자로 제조된 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩;
    컬러 마이크로비드, 검출 생체분자, 및 나노 자성입자의 반응을 미세 유체 채널 내에서 수행할 수 있는 전처리부; 및,
    검출된 생체분자의 특성을 분석할 수 있는 분석부
    를 포함하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석장치.
  16. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 따른 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 미세 유체 칩을 이용한 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법에 있어서,
    컬러 마이크로비드, 검출생체 분자 및 나노 자성입자를 반응시키는 제 1단계;
    상기 컬러마이크로비드, 검출생체 분자 및 나노 자성입자 반응물(이하, 반응물)을 반응물 주입부에 주입하는 제 2단계;
    상기 반응물 주입부에 주입된 반응물을 미세 유체 채널 내에 한쪽 벽면으로 집속시키는 제 3단계;
    상기 집속된 반응물이 자기장의 영향으로 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부에서의 흐름 경로가 변경되는 제 4단계;
    상기 컬러 마이크로 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부를 통과하는 반응물의 이미지를 얻는 제 5단계; 및,
    얻은 반응물 이미지를 분석하여 컬러 마이크로비드의 디코딩 및 위치를 판별해 정량 분석을 하는 제 6단계
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 제 3단계는 펌프를 이용하여 배출부에서 상기 반응물을 끌어당기는 방식으로 반응물을 집속시키는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법.
  18. 청구항 16에 있어서,
    상기 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법은 하나의 칩에서 다양한 농도의 생체 분자를 분석하기 위해 미세 유체 채널 내에서의 유속을 조정하여 반응물이 자기장에 노출되는 시간을 달리하여 반응물이 자기장 방향으로 편향되는 거리를 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법.
  19. 청구항 16에 있어서,
    상기 제 4단계에서 상기 자기력은 영구자석 또는 전자석을 이용하고 높은 자기장 구배를 형성하기 위하여 외부 자기장을 집속시킬 수 있는 물질을 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부 옆에 위치하는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 제 5단계에서 반응물의 정확한 색 이미지를 얻기 위해 컬러 마이크로비드 디코딩 & 위치 판별부의 옆에 있는 컬러 마이크로비드 참조부에 분석하고자하는 컬러 마이크로비드를 채워 정확한 초점을 맞춘 후 통과하는 반응물의 이미지를 얻는 것을 특징으로 하는 자기영동 기반의 생체 분자 다중검출 분석방법.
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