KR20090106425A - 마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 - Google Patents
마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090106425A KR20090106425A KR1020080027880A KR20080027880A KR20090106425A KR 20090106425 A KR20090106425 A KR 20090106425A KR 1020080027880 A KR1020080027880 A KR 1020080027880A KR 20080027880 A KR20080027880 A KR 20080027880A KR 20090106425 A KR20090106425 A KR 20090106425A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mirna
- lin28
- protein
- drosha
- pri
- Prior art date
Links
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 5
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 title description 2
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 108091023663 let-7 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108091063478 let-7-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108091049777 let-7-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 10
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract 2
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 69
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 41
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 30
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 19
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 18
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 18
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 17
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 108091007771 MIRLET7A1 Proteins 0.000 description 13
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 8
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 8
- 108091091807 let-7a stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 108091057746 let-7a-4 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 108091028376 let-7a-5 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 108091024393 let-7a-6 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 108091091174 let-7a-7 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 5
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 5
- HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C(CN1CC2=C(CC1)NN=N2)=O HMUNWXXNJPVALC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 108091074057 miR-16-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 WZFUQSJFWNHZHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100032839 Exportin-5 Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108700037230 Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000897691 Homo sapiens Helix-loop-helix protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000869796 Homo sapiens Microprocessor complex subunit DGCR8 Proteins 0.000 description 1
- 101000897669 Homo sapiens Small RNA 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150009309 Lin28b gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108091034054 MiR-138 Proteins 0.000 description 1
- 102100032459 Microprocessor complex subunit DGCR8 Human genes 0.000 description 1
- 108091060585 Mir-31 Proteins 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 102100021887 Small RNA 2'-O-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000010454 developmental mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 108091045440 let-7a-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 101150108076 lin28a gene Proteins 0.000 description 1
- 230000016089 mRNA destabilization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091030496 miR-138 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- UMFCIIBZHQXRCJ-NSCUHMNNSA-N trans-anol Chemical compound C\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 UMFCIIBZHQXRCJ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본원발명은 마이크로ＲＮＡ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본원발명의 Drosha 돌연변이는 miRNA 생성을 억제하므로 miRNA 생성 기작 연구 및 종양 기작 및 발생 기작을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Drosha, 마이크로RNA 프로세싱, Dicer
Description
본 발명은 마이크로RNA(microRNA : 이하 "miRNA"라 칭함) 생성을 억제하는 드로셔(이하 "Drosha"라 칭함) 돌연변이에 관한 것이다.
작은 RNA(small RNA: 이하 "sRNA"라 칭함)는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17 내지 25 뉴클레오티드(nucleotide: 이하 "nt"라 칭함) 정도 길이의 리보핵산을 말한다. sRNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 마이크로RNA(microRNA: 이하 "miRNA"라 칭함)와 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: 이하 "siRNA"라 칭함)로 분류된다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 헤어핀 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되며, siRNA는 긴 이중가닥 RNA(double strand RNA: 이하 "dsRNA"라 칭함)로부터 유래한다. 일반적으로 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하는 sRNA는 miRNA이며, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 sRNA는 siRNA로 분류된다. miRNA는 세포 내에서 자연적으로 만 들어지며 특정 메신저 RNA(messenger RNA: 이하 "mRNA"라 칭함)에 특이적으로 결합하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 프로세싱을 억제하며, siRNA는 인위적으로 세포내로 도입시키는 sRNA로서 상보적인 서열을 가지고 있는 특정 mRNA에 결합하여 상기 mRNA를 분해시킨다. RNA 간섭 협상(RNA intererence: 이하 "RNAi"라 칭함)은 sRNA에 의한 유전자 억제 현상을 넓은 의미에서 지칭하며, 통상적으로 화학 합성을 통해 제작한 siRNA를 세포 내로 직접 도입하는 방법과 바이러스나 플라스미드 등을 벡터로 이용하여 세포 내에서 siRNA를 생성시키는 방법 등을 사용하고 있다(도 1 참조).
miRNA는 19-25 nt 길이의 단일가닥 RNA(single strand RNA: 이하 "ssRNA"라 칭함) 분자로서 세포 내에 존재하는 헤어핀-구조 전사체(hairpin-shaped transcript; Bartel, D.P., Cell 116:281-297, 2004; Kim, V.N., Mol . Cells . 19:1-15, 2005)에 의해 생성된다. miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 번역후 유전자 억압인자(post-transcriptional gene suppressor)로서 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도한다.
한편, miRNA와 암 사이에 강한 연관이 최근 증명되어 암 생물학 분야에서 새로운 연구 주제로 떠오르고 있으며(Esquela-kerscher, A. and Slack, FJ., Nat . Rev . Cancer 6(4):259-269, 2006), miRNA의 발현이 발달과 세포 분화 프로세싱 중에 극적으로 변화함에 따라 miRNA의 프로파일링(profiling)은 발달 계통과 질병 단계에서 믿을만한 결과들을 보여주었다(Lu, J. et al ., Nature 435:834-838, 2005). 또한 miRNA 기능에 대한 조절 네트워크에 대한 이전 분석을 통해 상기 분자들이 어 떻게 생성되며 조절되는지 이해할 수 있었다 (Kim, V.N. Nat . Rev . Mol . Cell . Biol . 6:376-385, 2005).
miRNA 생합성은 RNA 폴리머레이즈 Ⅱ에 의한 전사를 통해 개시되는데(Cai. X., et al ., RNA 10:1957-1966, 2004; Kim, V.N. Nat . Rev . Mol . Cell . Biol . 6:376-385, 2005; Lee, Y., et al ., EMBO J 21:4663-4670, 2002; Lee, Y., et al ., EMBO J 23:4051-4060, 2004), 최초로 생성되는 1차 miRNA(primary microRNA: 이하 "pri-miRNA라 칭함)는 보통 수 Kb 이상이며, 5'캡(cap)과 폴리 A 테일(poly A teil)을 포함한다. pri-miRNA 프로세스는 miRNA 생합성에 중심적 단계로서, 길이가 긴 pri-miRNA에 mRNA 서열을 포함하는 분자의 한쪽 말단을 생성하는 프로세싱이다. pri-miRNA는 리보뉴클레아제 Ⅲ, Drosha(Lee, Y., et al ., Nature 425:415-419, 2003)와 이의 조요소인 DGCR8(Gregory, R.I. et al ., Nature 432:235-240, 2004; Han, J., et al ., Genes Dev. 18:3016-3027, 2004; Landthaler, M., et al ., Curr . Biol . 14:2162-2167, 2004)로 구성된 마이크로프로세서(microprocessor)라는 복합체에 의해 맨 처음 절단되어 65 nt 정도의 헤어핀-구조 전구체(pre-miRNA)로 분리된다. 상기 pri-miRNA 프로세스 이후 생성된 pre-miRNA는 핵 수송요소인 Exp5(exportin-5)에 의해 세포질로 수송되고(Bohnsack, M.T., et al ., RNA 10:185-191, 2004; Lund, E., et al ., Science 303:95-98, 2004; Yi, R., et al ., Genes Dev. 17:3011-3016, 2003), 세포질 안에서는 세포질내 RNase Ⅲ 타입 단백질인 Dicer(Dicer)가 전달된 pre-miRNA를 절단하여 22 nt 정도의 miRNA 이중체(duplex)를 생성한다. miRNA 이중체 외에 다른 Dicer 생산물인 한쪽 가닥은 성숙 miRNA로 세포질 속에 존재하여 miRNP(microribonucleoprotein) 또는 miRISC(miRNA-induced silencing complex)라 불리는 실행자 복합체(effector complex)와 조립된다(Khvorova, A., et al ., Cell 115:209-216, 2003; Schwarz, D.S., et al ., Cell 115:199-208, 2003).
miRNA 생성의 조절은 전사 또는 전사후 레벨에서 이루어 질 수 있다. Let-7, miR-138 및 miR-31을 포함하는 몇몇 miRNA들은 전사후 프로세싱에서 조절된다고 알려져있으나(Obernosterer, G., Leuschner, P. J., et al., RNA 12 (7), 1161, 2006; Lee, E. J. et al., RNA 14 (1), 35, 2008 Thomson, J. M. et al., Genes Dev 20 (16), 2202, 2006 Wulczyn, F. G. et al., FASEB J 21 (2), 415, 2007) 조절 기작에 대하서는 알려진바 없다.
이에 본 발명자들은 Lin28이 생체 외(in vitro)에서 Drosha 및 Dicer 프로세싱 모두를 억제하며, 생체 내(in vivo)에서는 Dicer 프로세싱을 억제하며 주로 전구체 let-7 miRNA를 특이적으로 표적으로 하여 Dicer 프로세싱에 간섭함을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 miRNA 생성을 억제하는 Drosha 돌연변이를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 miRNA 생성을 억제하는 Drosha 돌연변이를 제공한다.
아울려 본 발명은 Lin28 단백질 돌연변이를 제공한다.
상기 Drosha 돌연변이는 let-7 miRNA 생성을 효과적으로 억제하므로 miRNA 생성 기작 연구 및 종양 기작 및 발생 기작을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명에서 사용되는 단어를 정의한다.
우리딘화(uridylation)는 miRNA의 말단에 우리딘(uridine)이 ~2 nt ~ 18 nt 길이로 연장되는 것을 의미한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 다양한 세포주에서 let-7 miRNA의 발현을 조사한 결과, HeLa 세포주보다 HCC 세포주에서는 그 발현 레벨이 낮으며, pre-let-7 miRNA와 pri-let-7 miRNA의 레벨 역시 크게 다르지 않았다(도 2 및 3 참조). 이를 통해 let-7 miRNA의 생성이 인간 HCC 세포에서는 전사후 프로세싱에 의해 억제됨을 알 수 있었다. 이후 let-7 miRNA 생성에 대한 Lin28의 영향을 조사하기 위해 Lin28을 표적으로 하는 siRNA를 제작하여 세포주에 형질도입하였으며, 이로써 Lin28 단백질의 발현이 감소되었을 때 성숙 let-7 miRNA가 증가됨이 관찰되었다(도 4 참조). 상기 결과를 토대로 Lin28 단백질이 let-7 miRNA의 생성에 억제자로 작용함을 알 수 있었다. 또한 miRNA -16 miRNA에 대하여 Lin28 단백질의 효과를 살펴본 결과 아무런 영향을 미치지 못하였으므로(도 5 참조), Lin28 단백질은 let-7 miRNA에만 특이적으로 작용함을 알 수 있다. 이후 본 발명의 발명자들은 Lin28 단백질의 과발현이 let-7 miRNA에 미치는 영향을 조사하였다. Lin28 단백질의 과발현은 let-7 miRNA의 생성을 억제함을 확인하였다(도 6 참조). 그러나 pri-let-7 miRNA는 Lin28 단백질의 과발현과는 무관하게 발현 변화를 관찰할 수 없었다(도 7 참조). 이는 Lin28 단백질이 let-7 miRNA의 Drosha 프로세싱에 의미있는 효과를 미치지 않음을 시사한다.
이후 본 발명자들은 Drosha 돌연변이체를 구축하여 let-7 miRNA 발현에 미치 는 영향을 조사하였다. 이때 Drosha 돌연변이체가 형질도입되었을 경우 매우 효과적으로 pri-miRNA 프로세싱을 차단하였으며, 이를 통해 pre-let-7 miRNA 및 성숙 let-7a miRNA 발현 레벨을 동시에 감소시켰다(도 8, 5 레인 참조). 이를 통해 Lin28 단백질이 Drosha 프로세싱이 아니라 Drosha 프로세싱 후 단계를 조절함을 알 수 있었다.
이후 생체외 환경에서 재조합 Lin28 단백질과 표지된 pri-miRNA와 반응시킨 후 Drosha와 반응시켰다. 그 결과, 특이적으로 pri-let-7 miRNA의 Drosha 프로세싱만을 억제함이 관찰되었다(도 9 참조). 또한 Dicer와 반응시켰을 때에도 Dicer 프로세싱만을 특이적으로 억제시킴을 알 수 있었다(도 10 및 11 참조). 상기 결과를 통해 Lin28 단백질이 생체외 조건에서는 Drosha 및 Dicer 프로세싱을 모두 동등하게 억제함을 알 수 있었다. 그러나 상기 도 4 내지 도 8의 결과를 통해 Lin28 단백질이 생체내 조건 하에서 세포내의 Dicer 프로세싱보다 Drosha 프로세싱에 영향을 주지 않음을 유추할 수 있다. 초기 연구에서 Lin28b가 성장하는 Huh7 세포 상에서는 배두둔(~98%)이 세포질 내에 위치함을 알 수 있었다(Guo, Y. et al., Gene 384, 51, 2006). 또한 Lin28a 단백질은 배아 세포 및 근아세포(myoblast) 양쪽 모두에서 주로 세포질 내에서 발견되었는데(Balzer, E. and Moss, E. G., RNA Biol 4 (1), 16, 2007 Kwak, J. E. and Wickens, M., RNA 13 (6), 860, 2007) 이 때문에 생체 외 조건과 생체 내 조건에서의 결과가 불일치하는 것으로 사료된다. 이에 본 발명자들은 Lin28 단백질의 활성 위치를 확인하기 위하여 Lin28 및 pri-let-7 발현 플라스미드가 형질전환된 세포주에서 세포이하 분획을 수행하였다. 그 결과 Lin28 단백질이 세포질 내에서 pre-let-7 miRNA의 축적에 큰 영향을 미치지 않음이 확인되었다(도 12 참조). 그러므로 Lin28 단백질은 핵질 내 프로세싱 및 핵질에서 세포질로의 miRNA의 유출에는 관여하지 않으며, 핵질에서 세포질로의 miRNa 유출 이후에 세포질 내에서 첫 번째로 작용함을 알 수 있었다.
이후 본 발명의 발명자들은 Lin28 단백질과 miRNA와의 결합 여부를 조사하였다. 그 결과, pre-let-7 miRNA와 강하게 결합하며(도 13, 3 및 7 레인 참조), pri-let-7 miRNA 및 성숙 let-7 miRNA와는 감지할 수 있을 만큼 강하게 결합하지 않음이 관찰되었다(도 13, 11, 15 및 3, 7 레인 참조). 상기 결과는 Lin28 단백질이 조절을 위해 pre-let-7 miRNA를 주요 표적으로 하여 강하게 결함함을 시사한다. 이와 다르게 Lin28 돌연변이형 단백질은 pri-let-7 miRNA 및 pre-let-07 miRNA에 강환 친화력을 가지나 성숙 let-miRNA의 생성을 억제하는데는 실패하였다(도 13, 4, 8, 12 및 16 레인 참조). 상기 Lin28 돌연변이형 단백질은 아연 핑거 도메인 부위를 돌연변이한 것으로, 이를 통해 아연 핑거 도메인 부위가 Lin28 단백질의 기능에 필수적이며 단순한 RNA로의 결합과는 별도의 추가 활성이 있음을 알 수 있다. 본 발명자들은 야생형 Lin28 단백질 과발현시 pre-let-7 miRNA 라인 상에서 불분명한 밴드를 검출하였다(도 13의 별표 참조). 상기 밴드를 검출하기 위하여 본 발명자들을 pre-let-7 말단 루프에 상보적인 프루브를 이용하여 시각화하였다(도 14, 7 레인 참조). 이는 상기 밴드가 성숙 pre-let-7 miRNA 및 루프 서열을 가지고 있음을 시사한다. 이에 상기 밴드를 더욱 선명하기 위한 실험에서 miR-16에서는 존재하지 않으나(도 15 참조), pre-let-7 miRNA에도 유사한 밴드가 관찰됨을 확인하였 다(도 12 참조). 이를 통해 Lin28 단백질이 Let-7 miRNA 특이적 방법으로 연정된 miRNA의 생성을 촉진함을 알 수 있다. 아울러 기능적으로 작용하지 못하는 Lin28a 돌연변이체가 pre-let-7 miRNA를 연장시키지는 못하나 잘 결합함을 통해(도 14, 4, 8 레인 참조), Lin28 단백질의 아연 핑커 도메인이 miRNA의 연장을 유도하는데 필수적임을 알 수 있었다.
본 발명자들은 상기 내용을 통하여 확인된 연장된 밴드를 확인하기 위하여 Lin28 단백질이 과발현되는 세포주 상에서 연장된 밴드를 검출하고 검출된 miRNA의 말단을 서열결정하였다. 그 결과 연장된 miRNA는 우리딘(uridien: 이하 "U"라 칭함)으로 3' 말단에 대략 14 nt 길이로 관찰되었다(도 16 참조). 상기 말단은 U만으로 연장되는 것은 아니나 과반수의 NTP가 U임이 확인되었다. 게놈 상에서는 U 잔기의 서열이 존재하지 않으므로 이는 Drosha 프로세싱 후에 추가되었음을 알 수 있었다. 또한 내생적 우리딘화 pre-let-7 miRNA의 종류를 확인하기 위하여 여러 세포주에서 그 존재를 확인하였다. 그 결과 실재 내생적으로 여러 세포 내에서 우리딘화된 miRNA의 존재를 확인하였다(도 18 참조). 아울러 상기 현상이 let-7 miRNA에만 특이적으로 존재함을 확인하였다(도 19 참조). 또한 우리딘화된 let-7 miRNA가 Dicer 반응을 방해함이 확인되었다(도 20 참조).
본 발명자들은 상기의 내용을 도 23과 같은 과정을 도시화하였다. 분해 “마커”로 이용될 수 있는 RNA 말단의 U 테일은 단백질 분해의 유비퀴틴화와 개념상으로 유사하다. 히스톤 mRNA(Mullen, T. E. and Marzluff, W. F., Genes Dev 22 (1), 50, 2008)와 같은 특정 종류의 mRNA 및 RNA 간섭 생산물(Shen, B. and Goodman, H. M., Science 306 (5698), 997, 2004 Ibrahim, F. et al., Science 314 (5807), 1893, 2006)은 분해되기 전에 우리딘화된다. 또한 작은 RNA는 Arabidopsis 상에서 분해를 위한 말단이 우리딘화가 됨이 잘 알려져 있다. 작은 RNA 이외는 메틸 트렌스퍼레이즈(methyl trnasferase) HEN1에 의해 3’ 말단에서 메틸화를 통해 보호되고, 이들은 우리딘화되어 붕괴의 표적이 된다(Li, J. et al., Curr Biol 15 (16), 1501, 2005). 본 연구에서는 Lin28이 Dicer 프로세싱으로 전환되는 pre-let-7의 말단 우리딘화를 중개함을 밝혔다(도 23). 그러므로 Up-miRNA는 분해 대사경로로 들어감을 알 수 있다.
결론적으로 Lin28 단백질은 Drosha 및 Dicer 프로세싱을 간섭하나 생체 내 억제 효과는 Drosha 프로세싱보다 Dicer 프로세싱에서 더욱 강력하다. 또한 Lin28 단백질은 pre-let-7 miRNA의 말단 우리딘화를 유도하는데 역행할 수 없게 pre-let-7 miRNA를 분해 대사경로로 재수송한다.
본 발명은 miRNA 생성을 억제하는 Drosha 돌연변이를 제공한다.
본 발명의 Drosha 돌연변이는 상기와 같이 특이적으로 let-7 miRNA의 생성을 억제하여 발생 기작, 종양 억제 기작을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 Drosha 돌연변이는 점 돌연변이(point mutagenesis) 방법으로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업계의 달려진 돌연변이 방법 중 적합한 방법을 선택하여 수행될 수 있다.
상기 Drosha 돌연변이는 Glu1222를 Glutamine으로, Glu1045를 Glutamine으로 돌연변이시키는 것이 바람직하다 이에 한정되는 것은 아니며 Drosha의 원래 기능을 상실시킬 수 있는 자리라면 모두 본원발명에 해당된다.
아울러 본 발명은 Lin28 단백질 돌연변이를 제공한다.
본 발명의 Lin28 단백질 돌연변이는 성숙 let-7 miRNA의 생성을 증가시킬 수 있다.
Lin28 단백질의 돌연변이는 아연 핑거 도메인에서 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 돌연변이 방법은 당업계의 당업자에게 알려진 적절한 방법으로 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
let
-7
miRNA
발현 조사
Let-7 miRNA의 조절 기작을 밝히기 위하여, 본 발명자들은 노던 블롯과 RT-PCR 방법을 이용하여 다양한 세포 타입에서 let-7 miRNA의 발현을 조사하였다.
<1-1> 노던블롯 조사
본 발명자들은 이를 위하여 HepG2 세포주, Hep3B 세포주, Hyh7 세포주 및 Hela 세포주를 10% FBS(WelGENE)이 함유된 DMEM(WelGENE) 배지에서 배양하여 이용하였다. 전체 RNA는 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. 분리된 전체 RNA 25-50 ㎍을 12.5% 또는 15% urea-polyacrylamide gel로 분석하였고, Zeta-probe membrane(BioRad)에 전기적으로 이동시켰다. miRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 [γ-32P] ATP로 표지하였고, 노던을 위한 프루브로 이용하였다. 이때 사용한 let-7를 위해 이용된 올리코뉴클레오티드는 하기와 같다: 5’- ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA-3’(let-7a: 서열번호 1). 이후 노던 블롯 방법은 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 수행하였다.
<1-2>
RT
-
PCT
본 발명자들은 이를 위하여 HepG2 세포주, Hep3B 세포주, Hyh7 세포주 및 Hela 세포주를 10% FBS(WelGENE)이 함유된 DMEM(WelGENE) 배지에서 배양하여 이용하였다. 전체 RNA는 TRIzol reagent(Invitrogen)를 이용하여 분리하였다. 분리된 전체 RNA 3 ㎍을 올리고-dT-프라이머와 RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas)로 처음-가닥 cDNA 합성을 수행하였으며 전체 반응 부피는 20 ㎕이다. pri-miRNA 발현 레벨을 검출하기 위하여, 하기 프라이머를 이용하였다. pri-let7a-1: 5’- GAT TCC TTT TCA CCA TTC ACC CTG GAT GTT -3’(정방향 프라이머: 서열번호 2) 및 5’- TTT CTA TCA GAC CGC CTG GAT GCA GAC TTT -3’(역방향 프라이머: 서열번호 3); pri-let7a-2: 5’- GCG GAT CCT ATG TTG TCT CTT ATG AAT GGC CC-3’(정방향 프라이머: 서열번호 4) 및 5’- CGC TCG AGA TCA TGA TCG TTC TCA CCA TGT TG -3’(역방향 프라이머: 서열번호 5); pri-let7a-3: 5’- CGG AGT CCC ATC GGC ACC AAG ACC GAC TGC -3’(정방향 프라이머: 서열번호 6) 및 5’- TCT GTC CAC CGC AGA TAT TAC AGC CAC TTC -3’(역방향 프라이머: 서열번호 7).
그 결과, 성숙 let-7a miRNA의 발현 레벨은 HeLa 세포와 비교하였을 때 HCC(hepatocellular carcinoma) 세포주(HepG2, Huh7 및 Hep3B)에서 매우 낮았으며, pre-let-7 및 pri-let-7의 발현 레벨수준은 이들 세포주 간에 커다란 차이를 보이지 않았다(도 2 및 3). 이와 같은 결과는 let-7의 생성이 줄기세포에서와 같이 인간 HCC 세포에서 전사후 프로세싱에서 억제됨을 암시한다.
<
실시예
2>
Let
-7
miRNA
생성에 대한
Lin28
영향 조사
본 발명자들은 Let-7 miRNA 생성에 Lin28이 미치는 영향을 조사하기 위하여 Lin28b 표적 siRNA를 Huh7 세포에 형질도입시켜 노던 블롯 및 RT-PCR을 수행하였다.
<2-1>
siRNA
제작 및 형질도입
본 발명자들은 Lin28b 단백질을 표적으로 하는 하기와 같은 서열을 가지는 siRNA를 제작하였다: 5’- AGG GAA GAC ACU ACA GAA A-3’(siLin28b: 서열번호 8). Huh7 세포는 배양접시에서 배양시 40% 정도 자랐을 때 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 를 이용하여 제조사의 방법대로 72시간 동안 siRNA로 형질전환되었다. siRNA의 최종 농도는 100 nM이다.
<2-2> 노던
블롯
상기 siRNA가 형질도입된 Huh7 세포를 대상으로 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 노던 블롯을 수행하였다. miR-16에 대한 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다: 5’- GCC AAT ATT TAC GTG CTG CTA-3’(miR-16: 서열번호 9).
<2-3>
RT
-
PCR
상기 siRNA가 형질도입되 Huh7 세포를 대상으로 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. miR-16에 대한 프라이머 서열은 하기와 같다: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GTG ATA GCA ATG TCA GCA GTG’(정방향 프라이머: 서열번호 10) 및 5’-GTA GAG TAT GGT CAA CCT TA-3’(역방향 프라이머: 서열번호 11).
그 결과, Lin28b 단백질의 발현이 감소되었을 때 성숙 let-7 miRNA가 증가함을 관찰할 수 있었다(도 4). 이를 통해 Lin28b 단백질이 성숙 let-7 miRNA의 생성에 억제자로 작용함을 알 수 있었다. 또한 miR-16에 대해 Lin28b 단백질이 아무런 효과를 미치지 못하므로, Lin28b 단백질의 억제 효과가 특이적으로 let-7 miRNA에 서만 작용하는 것을 알 수 있었다. RT-PCR 결과 pri-let-7 miRNA 레벨에는 큰 변화가 없었는데, 이를 통해 Lin28 단백질이 Drosha 프로세싱에 의미있는 효과를 미치지 않음을 알 수 있었다(도 5).
<
실시예
3>
Lin28
단백질 과발현 또는
저발현에
의한
let
-7
miRNA
발현에 미치는 영향 조사
본 발명자들은 Lin28 단백질의 과발현 또는 저발현이 let-7 miRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Lin28a, Lin28b 유전자를 포함하는 발현벡터, Lin28 활성을 상실한 돌연변이체를 포함하는 발현벡터 및 pre-let-7a-1 유전자를 포함하는 발현벡터를 HEK293T 세포에 함께 형질도입시키고 노던 블롯 및 RT-PCR을 수행하였다.
<3-1>
Lin28
단백질 및
pri
-
miRNA
발현 벡터의 구축
Lin28a 단백질의 PCR 산물은 인간 세포에 발현하기 위하여 FLAG-pcDNA3 벡터의 BamHⅠ 및 XhoⅠ자리에 서브클론하였다. Lin28a 및 Lin28bΔN70의 PCR 산물 또한 동일한 벡터에 BamH I 및 Not I 자리에 삽입되었다. PCR에 이용된 프라이머 서열은 하기와 같다. Lin28a: 5’- GGA TCC ATG GGC TCC GTG TCC AAC CAG-3’(정방향 프라이머: 서열번호 12) 및 5’-CTC GAG TGT GGC TCA ATT CTG TGC CTC C-3’(역방향 프라이머: 서열번호 13); Lin28b 및 Lin28bΔN70: 5’-GGA TCCATG GCC GAA GGC GGG GCT AG-3’(Lin28b의 정방향 프라이머: 서열번호 14) 및 5’-GGA TCC ATG GAA GGA TTT AGA AGC CTA AAA G-3’(Lin28bΔN70의 정방향 프라이머: 서열번호 15), 5’-GCG GCC GCT CCC AGG TCA GCT ACT GCT TG-3’(역방향 프라이머: 서열번호 16).
pri-miRNA 유전 서열을 포함하는PCR 산물은 pGEM-T easy(Promega)에 서브클론되었고 서열결정을 통해 확인되었다. 이때 사용되는 프라이머는 하기와 같다. pri-let-7a-1 클로닝 프라이머:5’-GAT TCC TTT TCA CCA TTC ACC CTG GAT GTT-3’(정방향 프라이머: 서열목록 17) 및 5’-TTT CTA TCA GAC CGC CTG GAT GCA GAC TTT-3’(역방향 프라이머: 서열목록 18). ppri-miRNA들은 이후 EcoRI 자리를 이용하여 pcDNA3 벡터(Invitrogen)로 서브클로닝되었다.
<3-2> 발현벡터의 형질도입
상기 실시예 3-1에서 제조된 발현벡터를 HEK293T 세포주에 형질도입하였다. 실험군은 하기와 같다.
대조군 : 공벡터 삽입;
실험군 1 : pri-let-7a-1 발현벡터 + Lin28a 발현벡터;
실험군 2 : pri-let-7a-1 발현벡터 + Lin28b 발현벡터;
실험군 3 : pri-let-7a-1 발현벡터 : Lin28bΔN70 발현벡터; 및
실험군 4 : prri-let-7a-1 발현벡터.
<3-3> 노던
블롯
상기 실시예 3-2와 같이 형질도입된 HEK293T 세포를 대상으로 실시예 1-1의 방법과 동일하게 노던 블롯을 수행하였다.
<3-4>
RT
-
PCR
상기 실시예 3-2와 같이 형질도임된 HEK293T 세포를 대상으로 실시예 1-1의 방법과 동일하게 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, Lin28 단백질의 도입으로 인하여 두드러지게 let-7 miRNA의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 6). 그러나 pri-let-7 miRNA은 Lin28 단백질의 도입과는 무관하게 발현 변화를 관찰할 수 없었다(도 7).
<
실시예
4>
Drosha
돌연변이체에 의한
let
-7
miRNA
의 발현 변화 조사
본 발명자들은 Drosha의 점 돌연변이를 일으켜 이를 pre-let-7a-1을 발현시키는 발현벡터와 함께 HEK293T 세포에 형질도입하고 노던 블롯을 수행하였다.
<4-1>
Drosha
돌연변이체 발현벡터의 구축
점 돌연변이(Point mutagenesis)는 site-directed mutagenesis kit (Stratagene)를 이용하여 제조사의 방법대로 수행하였다. AB Drosha 돌연변이를 위하여 사용된 프라이머를 하기와 같다: 5’- GGC GGA CCT TTT GCA ATC ATT TAT TGC AGC G -3’(정방향 프라이머: 서열번호 19) 및 5’- CGC TGC AAT AAA TGA TTG CAA AAG GTC CGC C -3’(역방향 프라이머: 서열번호 20)은 Glu1222을 glutamine로 교체하는데 이용되었다. 5’- GGC CAA TTG TTT TCA AGC GTT AAT AGG -3’(정방향 프라이머: 서열번호 21) 및 5’- CCT ATT AAC GCT TGA AAA CAA TTG GCC -3’(역방향 프라이머: 서열번호 22)는 Glu1045을 glutamine로 돌연변이시키는데 이용되었다.
<4-2>
Drosha
돌연변이체 및
pri
-
let
-7a-1 형질도입
상기 실시예 4-1에서 제조된 Drosha 돌연변이체를 포함하는 발현벡터 및 상기 실시예 3-1에서 제조된 pri-let-7a-1을 포함하는 발현벡터를 HEK293T 세포 내로 실시예3-2와 동일한 방법으로 형질도입하였다.
<4-3> 노던
블롯
상기 실시예 1-1과 같은 방법으로 노던 블롯을 수행하였다.
그 결과, Drosha 돌연변이체는 매우 효과적으로 pri-miRNA 프로세싱을 차단하였으며, 이를 통해 pre-let-7 miRNA 및 성숙 let-7a miRNA 발현 레벨을 동시에 감소시킴을 보여주었다(도 8, 5번 레인). 만일 Lin28 단백질이 Drosha 프로세싱을 봉쇄하였다면 pre-let-7 miRNA 및 성숙 let-7a miRNA 발현 레벨도 함께 차단시켰을 것이나 본 실험에서 본 결과는 그와는 달리 크게 감소시키지 못하는 것으로 나타났다(도 8, 3번 레인). 이를 통해 Lin28 단백질이 Drosha 프로세싱이 아니라 Drosha 프로세싱 후 단계를 조절함을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
Drosha
를 이용한
Lin28
단백질의
활성기작
조사(
in
vitro
)
본 발명자들은 생체 외(in vitro) 환경에서 재조합 Lin28 단백질을 32P-표지된 pri-miRNA와 반응시킨 후 면역침강된 Drosha와 반응시켰다.
<5-1> 면역침강법(
Immunoprecipitation
)
본 발명자들은 무크(mock), Drosha 돌연변이체 및 야생형 Drosha가 형질전환된 HEK293T 세포에서 Drosha를 면역침강시켜 생체 외 프로세스 실험에 사용하였다.
본 발명자들은 상기 실시예 4-1에서 구축된 Drosha 돌연변이체 플라스미드 및 Drosha 발현 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질도입하였다.
형질도입 후 8 시간 이후에 세포는 수집되었으며 100 U/㎖ RNase inhibitor(Takara)가 포함된 냉각된 버퍼 D(20 mM Tris-HCl at pH 8.0, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA)를 이용하여 4℃에서 20분간 방치하고 얼음에서 2분간 파쇄하였다. 원심분리에 의해 세포 찌꺼기를 제거한 후 전체 세포 추출물을 anti-FLAG M2 affinity gel(Sigma)에서 4℃로 1-2시간 동안 일정한 회전상태에서 반응시켰다. 세척 후 결합된 RNA를 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 분리하고, FLAG가 표지된 Drosha, Drosha 돌연변이체(AB Drosha), 무크를 수득하였다.
<5-2> 생체 외 프로세스 분석
생체 외 프로세스 분석은 Lee et al. 2003 등에서 기술단 방법대로 전체 세포 추출물 또는 Flag-면역침장체를 이용하여 수행하였다. 간단하게는 프로세싱 반응 30 ㎕는 FLAG 표지된 면역침전물의 비드, 4 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 U/Ribonuclease Inhibitor(TAKARA) 및 표지된 전사체 1x104 내지 1x105 cpm을 포함한다. 상기 반응 혼합물을 50 ~ 60분간 37℃에서 반응시켰다. RNA는 페놀 추출된 후 12.5% 또는 15% denaturing polyacrylamide gel에서 분석되었다. 재조합 단백질 Lin28b는 면연침강체와 혼합하기 전에 4℃에서 30분간 반응 버퍼 및 표지화된 RNA와 미리 반응시켰다. 이때 함께 반응시킨 재조합 Lin28b 단백질의 처리 농도는 0, 5, 50 및 500 nM이다.
그 결과, 재조합 Lin28 단백질(>50 nM)은 특이적으로 pri-let-7 miRNA의 Drosha 프로세싱만을 특이적으로 억제함을 알 수 있었다(도 9).
<
실시예
6>
Dicer
를 이용한
Lin28 단백질의
활성기작
조사(
in
vitro
)
본 발명자들은 무크(mock), 야생형 Drosha가 형질전환된 HEK293T 세포에서 Dicer를 면역침강시켜 생체 외 프로세스 실험에 사용하였다.
<6-1> 세포 추출물 제조
본 발명자들은 무크(mock), 야생형 Dicer가 형질전환된 HEK293T 세포에서 Dicer를 면역침강시켜 생체 외 프로세스 실험에 사용하였다.
세포는 차가운 PBS로 세척한 후 버퍼 A(10 mM HEPES at pH 7.9, 10 mM KCl, 1 mM DTT 및 0.1 mM EDTA)로 풀어주었다. 얼음에서 15분간 방치한 후, 10% Nonidet P40을 세포에 검가하고 10초간 볼텍싱하였다. 1,500 g로 원심분리를 수행하고 상층액 분획을 수거하여 이후 4,000 g로 15분간 원심분리를 수행하고 세포질 분획을 지정하였다. 펠렛은 냉각한 버퍼 D(20 mM Tris-HCl at pH 8.0, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA) 로 세척하고 핵질 분획으로 지정하였다. RNA는 각각의 분획에서 TRIzol을 이용하여 추출하였다.
<6-2>
Dicer
및 재조합
Lin28b
발현하는
HEK293T
세포 제조
Dicer 유전자를 포함하는 발현벡터 및 재조합 Lin28b 단백질을 포함하는 재조합 벡터를 HEK293T 세포에 형질도입하였다.
<6-3> 생체 외 프로세스 분석
실시예 5-2와 동일한 방법으로 생체 외 프로세스를 분석하였다. 재조합 단백질 Lin28b는 Dicer가 과발현된 세포 추출물과 혼합하기 전에 4℃에서 30분간 반응 버퍼 및 표지화된 RNA와 미리 반응시켰다. 이때 함께 반응시킨 재조합 Lin28b 단백질의 처리 농도는 0, 15, 30, 60 및 200 nM이다.
또한 상기 실시예 6-2에서 형질전환된 HEK293T 세포의 추출물을 대상으로 생 체 외 프로세스를 분석하였다.
그 결과, 재조합 Lin28(>50 nM) 단백질은 특이적으로 pre-let-7 miRNA의 Dicer 프로세싱만을 특이적으로 억제함을 알 수 있었다(도 10). 또한 Dicer와 Lin28b 단백질이 과다발현되는 HEK293T 세포 추출물에서도 동일하게 pre-let-7 miRNA의 Dicer 프로세싱이 억제됨이 관찰되었다(도 11).
<
실시예
7>
Lin28
활성 위치 조사
본 발명자들은 Lin28 단백질의 활성의 위치를 밝히기 위하여 Lin28 및 pri-let-7 발현 플라스미드가 형질전환된 HEK293T 세포주의 세포이하 분획(subcellular fractionation)을 수행하였다.
본 발명자들은 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 Lin28 단백질 및 pri-miRNA 발현벡터를 구축하였다. 이때 Lin28 단백질은 Lin28a를 발현하는 벡터를 구축하였다. pri-miRNA의 경우 pri-let-7e 및 pri-let-7g를 발현하는 벡터를 구축하였다. pri-let-7g 및 pri-let-7e의 유전자 서열을 포함하는 PCR 생산물은 pcDNA3 vector(Invitrogen) 에 서브클로닝되었고 서열결정으로 확인되었다. 이때 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다. pri-let-7g 클로닝 프라이머: 5’- GGA TCC CCT GTC TCA AGT GCA TCC TG -3’(정방향 프라이머: 서열번호 23) 및 5’- CTC GAG CAG AGA TGA GCA GGG TGA CG -3’(역방향 프라이머: 서열번호 24). pri-let-7e 클로닝 프라이머: 5’- GGA TCC TCA TCC CTG GTC CTC CTG G -3’(정방향 프라이머: 서열번호 25) 및 5’- CTC GAG GCA GAG ATG GAG ACA GAC AGG -3’(역방향 프라이머: 서열번호 26). 상기와 같이 준비된 발현벡터를 상기 실시예 3-2와 같은 방법으노 HEK293T 세포주에 형질도입하였다. 실험군은 하기와 같다.
대조군 : 공벡터 삽입;
실험군 1 : pri-let-7e 발현벡터 + Lin28 발현벡터; 및
실험군 2 : pri-let-7g 발현벡터 + Lin28 발현벡터.
상기와 같이 형질도입된 HEK293T 세포주를 대상으로 세포이하 분획을 수행하였다. 방법은 하기와 같다.
세포질 또는 핵질 분획을 준비하기 위하여, 세포는 차가운 PBS로 세척한 후 버퍼 A(10 mM HEPES을 pH 7.9로 적정, 10 mM KCl, 1 mM DTT 및 0.1 mM EDTA)로 풀어주었다. 얼음에서 15분간 방치한 후, 10% Nonidet P40을 세포에 첨가하고 10초간 볼텍싱하였다. 1,500 g로 원심분리를 수행하고 상층액 분획을 수거하여 이후 4,000 g로 15분간 원심분리를 수행하고 세포질 분획을 지정하였다. 펠렛(pellet)은 냉각한 버퍼 D(20 mM Tris-HCl을 pH 8.0으로 지정, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA)로 세척하고 핵질 분획으로 지정하였다. RNA는 각각의 분획에서 TRIzol을 이용하여 추출하였다.
상기와 같은 방법으로 분획화된 핵질 분획물과 세포질 분획물에서 추출된 RNA를 대상으로 실시예 1과 같은 방법으로 노던 블롯 및 RT-PCR 방법을 수행하였다.
그 결과, Lin28 단백질이 세포질 내에서 pre-let-7 miRNA의 축적에는 큰 영 향을 미치지 않음을 알 수 있었다(도 12). 이를 통해 Lin28 단백질은 핵질 내 프로세싱 및 핵질에서 세포질로의 miRNA 유출에는 관여하지 않으며, 핵질에서 세포질로의 miRNA 유출 이후에 세포질 내에서 첫 번째로 작용함을 알 수 있다.
<
실시예
8>
Lin28
단백질의 결합 여부 조사
본 발명자들은 Lin28 단백질이 세포 내에서 pri-let-7 miRNA, pre-let-7 miRNA 및 성숙 let-7 miRNA과 결합하는지 여부를 조사하였다.
이를 위하여 본 발명자들은 HEK293T 세포주를 사용하였으며, 실시예 3-1에서 제조된 pri-let-7a-1 발현벡터를 FLAG가 표지된 Lin28을 발현하는 발현벡터를 형질도입한 후 상기 실시예 5-1의 면역침강법에 의해 수득된 FLAG 면역침강체가 이용되었다. Lin28a 돌연변이체는 "mt"로 표지되었다. Lin28a의 돌연변이형은 Balzer 등의 방법을 통해 제조하였다(mt; CCHC-mutated: Balzer, E. and Moss, E. G., RNA Biol 4 (1), 16, 2007)
이후 상기 실시예 1의 방법과 같이 let-7a의 노던 블롯 및 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, Lin28 단백질이 pre-let-7 miRNA과 강하게 결합하며(도 13, 3 및 7 레인), pri-let-7 miRNA 또는 성숙 let-7 miRNA에는 감지할 수 있을 만큼 결합하지 않았다(도 13, 11, 15 및 3, 7 레인). 이를 통해 Lin28 단백질이 조절을 위하여 pre-let-7 miRNA를 주요 표적으로 함을 알 수 있다.
Lin28 돌연변이형 단백질은 pri-let-7 miRNA 및 pre-let-7 miRNA에 강한 친 화력을 가지나 성숙 let-7 miRNA의 생성을 억제하는데 실패하였다(도 13, 4, 8, 12 및 16 레인). 이를 통해 아연 핑거 도메인이 Lin28 단백질 기능에 필수적이며, 단순한 RNA로의 결합과는 별도로 추가 활성이 발휘함을 의미한다.
흥미롭게도 본 발명자들은 야생형 Lin28 단백질 과발현시 pre-let-7 miRNA 라인 상에 예측하지 못한 불분명한 밴드를 인지하였다(도 13의 별표). Lin28 단백질은 pre-let-7 miRNA과 같이 긴 RNA에 강하게 결합한다. 상기 밴드는 ~90 nt와 대응하며, 이는 pre-let-7 miRNA보다 ~18 nt 정도 더 길다. 상기 밴드를 시작화하기 위해 본 발명자들은 pre-let-7 miRNA 말단 루프에 상보적인 프루브(5’- TCT CCC AGT GGT GGG TGT GAC-3': let-7a-1 loop; 서열번호 27)를 이용하여 시각화하였다(도 14, 7 레인). 이를 통해 상기 밴드의 RNA는 성숙 pre-let-7 miRNA 및 루프 서열을 공유함을 알 수 있었다. 상기 밴드는 세포 용해 및 균질화를 위해 TRizol(Invitrogen)을 처리했을 때에는 선명하게 검출되지 않았다.
이에 본 발명자들은 상기 밴드를 더욱 정확하게 시각화하기 위하여 세포를 파쇄한 후 TRIzol을 처리하여 밴드가 시각화할 수 있도록 하였다. 방법은 상기와 동일하게 수행하였다. 그 결과, 다른 pre-let-7 miRNA(도 12)과 유사한 밴드가 관찰되었으나 miR-16에서는 밴드가 관찰되지 않았다(도 15). 이는 통해 Lin28 단백질이 Let-7 miRNA 특이적 방법으로 연장된 miRNA를 생성하는 것을 돕는다는 것을 시사한다. 또한 기능적으로 작용하지 못하는 Lin28a 돌연변이체 단백질이 pre-let-7 miRNA를 연장시키지는 않으나 매우 잘 결함함을 알 수 있는데(도 13, 4, 8 레인) 이를 통해 Lin28 단백질의 아연 핑거 도메인이 연장을 유도하는데 필수적임 을 알 수 있다.
<
실시예
9>
Lin28
단백질로 인한 연장
miRNA
확인
<9-1>
우리딘화
(
uridylation
) 분석
10-cm 배양접시에 배양한 HEK293T 세포는 후-전사 48시간 때 500 ㎕ 냉각한 버퍼 D(20 mM Tris at pH 7.5, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 1mM DTT)로 모았다. 세포는 얼음에서 파쇄하였고, 13,200 rpm으로 4℃로 10분간 2회 원심분리를 수행하였다. 반응은 15 ㎕ 전체 세포 추출물(10 ㎍), 1 μl Ribonuclease Inhibitor(40 unit/㎕, TAKARA), 1.5 ㎕ 64 mM MgCl2, 0.25 mM NTP(Ambion) 및 방사선 표지된 pre-miRNA of 1x104 - 1x105 cpm이 포함되어 전체 부피가 30 μl가 되도록 준비하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 30분간 반응시켰다. RNA는 반응 혼합물에서 패놀 추출법으로 추출되었고, 12.5% denaturing urea polyacrylamide gel에서 분석되었다.
생체 외 프로세싱 반응을 위해서 pre-let-7a-1 miRNA 및 up-let-7a-1 miRNA은 젤 정제되었고, 생체 외 Dicer 프로세싱 반응 및 생체 외 붕괴 분석을 위해 이용되었다.
pre-let-7a-1 및 pre-miR-16-1은 Samchully Pham Co Ltd에서 구입하였다. pre-miRNA은 T4 polynucleotide kinase(TAKARA) 및 [γ-32P] ATP를 이용하여 5’ 말단에 표지되었다.
본 발명자들은 Lin28 단백질로 인해 연장된 miRNA를 확인하기 위하여 이를 젤-정제하고 3-링커를 절단한 후 RT-PCR로 증폭시켜 서열결정하기 위해 PCR 생산물을 클로닝하였다.
그 결과 연장된 miRNA는 우리딘(uridin: 이하 “U"라 칭함)으로 3' 말단에 ~ 14 nt의 길이로 연장됨이 관찰되었다(도 16). 연장된 부분이 모두 U 잔기는 아니었으나 주로 U가 주로 존재하였으며, 게놈 상에서는 U 잔기의 서열이 발견되지 않았으므로 이는 Drosha 프로세싱 후에 추가됨을 알 수 있었다. 이는 도 13의 결과에서 보여준 것보다(~ 18 nt) 짧은 것이었다. 이는 박테리아 클로닝 시 homopolymeric tract의 손실에서 기인한 거승로 사료된다(Kwak, J. E. and Wickens, M., A family of poly(U) polymerases. RNA 13 (6), 860, 2007).
<9-2>
RNase
H 반응 조사
이후 본 발명자들은 RNase H 절단 반응을 수행하였다. 방법은 하기와 같다.
Lin28a 단백질과 결합하는 RNA은 상기에서 기재된 바와 같이 pri-let-7a-1 및 Flag-Lin28a 단백질이 형질도입된 HEK293T로부터의 FLAG-면역침강체에서 준비되었다. RNA는 나누어지고, TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH7.5 with 1mM EDTA)에 있는 (dA)18, (dC)18, (dT)18, and (dG)18 올리고머 10 pmol와 분리되어 애널링되며, 95℃에서 4℃로 천천히 냉각되면서 90분간 수행되었다. 이후 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mM DTT에서 37℃로 1시간 동안 RNase H 효소(Invitrogen)와 반응시켰다. 이후 단백질은 노던 블롯을 수행하기 전에 페놀 추 출되었다. RNase H 효소는 DNA-RNA 하이브리드에서 RNA를 절단하므로 올리고-U가포함된 RNA는 반응 수 짧아진다.
그 결과, 예상과 같이 연장된 pre-let-7 miRNA는 RNase H 효소 추가 후 짧아졌다(도 17).
<9-3>
HEp3B
,
Huh7
및
Hep2
세포주에서의 연장
miRNA
조사
본 발명자들은 내생적 우리딘화 pre-let-7 miRNA 종류를 확인하기 위하여 여러 세포주 내의 ~80 - 100 nt 길이의 RNA를 클로닝하였다. 이때 본 발명자들은 내생적 우리딘화 miRNA만 클로닝하기 위하여 세포에 즉시 Trizol을 처리하였다. 내생적 우리딘화 pre-let-7 miRNA(이하 “up-let-7"이라 칭함)은 세포내에서 빠르게 제거되지 때문에 정상적인 RNA 추출 조건으로 검출하는데 어려움이 있기 때문이다.
그 결과, Hep3B 세포주에서는 26%, Huh7 세포주에서는 11%, HepG2 세포주에서는 15%의 우리딘화된 miRNA이 존재함을 확인하였다(도 18).
<
실시예
10>
pre
-
let
-7
miRNA
말단
우리딘화의
재연성 조사
본 발명자들은 5-말단 표지된 pre-let-7a-1 miRNA를 야생형 Lin28 단백질 또는 돌연변이형 Lin28 단백질이 형질도입된 HEK293T 세포주의 전체 추출물과 반응시켰다.
그 결과, Lin28 단백질 및 UTP가 포함되었을 때 ~90 nt의 밴드가 생성됨을 관찰되었다(도 19).
상기와 같은 동일한 조건에서 pre-miR-16-1을 대상으로 상기와 같이 반응켰을 때 영향을 미치지 않음이 관찰되었다(도 20). 이를 통해 Lin28이 매개로 하는 우리딘화는 pre-let-7 miRNA에 특이적임을 알 수 있었다.
이후 본 발명자들은 5-말단 표지된 pre-let-7a-1 miRNA를 Lin28b 단백질이 형질도입되어 과발현되는 HEK293T 세포주의 전체 추출물과 반응시켰다. 이때 종류가 다른 NTP 요소를 각각 첨가하였다.
그 결과, UTP가 연장 반응에 있어서 선호되는 핵산임을 알 수 있었다(도 21).
이후 본 발명자들은 상기와 동일한 방법으로 생체 외 Dicer 반응을 수행하였다. 이때 up-miRNA를 젤-정제하였고 상기에서 제조된 Dicer 면역침강체와 반응시켰다.
그 결과, Up-let-7은 Dicer 반응을 방해함을 관찰할 수 있었다(도 22).
도 1은 siRNA와 microRNA(이하 “miRNA"라 칭함)의 RNA 간섭 현상을 설명한 개념도이다.
도 2는 여러 종류의 세포주에서 let-7 miRNA의 발현 정도를 노던 블롯 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 3은 여러 종류의 세포주에서 let-7 miRNA의 발현 정도를 RT-PCR 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 4는 Lin28 단백질에 의한 let-7 miRNA 생성에 미치는 영향을 노던 블롯 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 5는 Lin28 단백질에 의한 let-7 miRNA 생성에 미치는 영향을 RT-PCR 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 6은 Lin28 단백질 과발현으로 인한 let-7 miRNA 생성에 미치는 영향을 노던 블롯 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 7은 Lin28 단백질 과발현으로 인한 let-7 miRNA 생성에 미치는 영향을 RT-PCR 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 8은 Drosha 돌변변이체 및 Lin28 단백질에 의한 let-7 miRNA 생성에 미치는 영향을 노던 플롯 방법으로 조사한 결과 사진이다.
도 9는 재조합 Lin28 단백질이 Drosha 프로세싱에 미치는 영향을 조사한 결과 사진이다.
도 10은 재조합 Lin28 단백질이 Dicer 프로세싱에 미치는 영향을 조사한 결 과 사진이다.
도 11은 재조합 Lin28 단백질이 pre-let-7a-1 miRNA 및 pre-miR-16-1의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 사진이다.
도 12는 Lin28 단백질의 실질적인 활성 위치를 조사한 결과 사진이다.
도 13은 Lin28 단백질이 pri-let-7 miRNA, pre-let-7 miRNA 및 성숙 let-7 miRNA에 결합하는지의 여부를 조사한 결과 사진이다.
도 14는 let-7a-1 miRNA의 루브에 상보적인 프루브를 이용하여 우리딘화된 let-7a-1 miRNA를 검출한 결과 사진이다.
도 15는 miR 16을 대상으로 우리딘화된 miRNA를 검출한 결과 사진이다.
도 16은 연장된 let-7 miRNA의 말단을 서열결정한 결과 사진이다.
도 17은 연장된 let-7 miRNA의 RNase H 절단 반응을 수행한 결과 사진이다.
도 18은 다양한 세포주에서 내생하는 우리딘화된 pre-let-7 miRNA의 말단을 서열결정한 결과 사진이다.
도 19는 야생형 Lin28a 단백질 및 돌연변이 Lin28a 단백질이 과발현된 HEK293T 세포주의 추출물과 합성된 pre-let-7a-1 miRNA와의 반응후 우리딘화를 조사한 결과 사진이다.
도 20은 여러 종류의 NTP 요소들과 pre-let-7a-1 miRNA의 우리딘화를 조사한 결과 사진이다.
도 21은 pre-let-7 miRNA 및 우리딘화 pre-let-7a-1 miRNA의 Dicer 프로세싱을 조사한 결과 사진이다.
도 22는 Lin28a 단백질이 과발현된 HEP293T 세포주 추출물과 합성된 pre-miRNA-16-1 RNA의 반응 후 우리딘화를 조사한 결과 사진이다.
도 23은 let-7 miRNA의 성숙 및 조절 프로세싱을 개념도이다.
<110> Seoul National University Industry Foundation
<120> The drosha mutant inhibiting biogenesis of microRNA
<130> 2008p-03-44
<160> 27
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide of let-7a
<400> 1
actatacaac ctactacctc a 21
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of pri-let7a-1
<400> 2
gattcctttt caccattcac cctggatgtt 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of pri-let7a-1
<400> 3
tttctatcag accgcctgga tgcagacttt 30
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of pri-let7a-2
<400> 4
gcggatccta tgttgtctct tatgaatggc cc 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse pirmer of pri-let7a-2
<400> 5
cgctcgagat catgatcgtt ctcaccatgt tg 32
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of pri-let7a-3
<400> 6
cggagtccca tcggcaccaa gaccgactgc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of pri-let7a-3
<400> 7
tctgtccacc gcagatatta cagccacttc 30
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA of let-7 miRNA
<400> 8
agggaagaca cuacagaaa 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide of miR-16
<400> 9
gccaatattt acgtgctgct a 21
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of miR-16
<400> 10
taatacgact cactataggt gatagcaatg tcagcagtg 39
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of miR-16
<400> 11
gtagagtatg gtcaacctta 20
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Lin28a
<400> 12
ggatccatgg gctccgtgtc caaccag 27
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse prmer of Lin28a
<400> 13
ctcgagtgtg gctcaattct gtgcctcc 28
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Lin28b
<400> 14
ggatccatgg ccgaaggcgg ggctag 26
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Lin28b deltaN70
<400> 15
ggatccatgg aaggatttag aagcctaaaa g 31
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse priemr of Lin28b and Lin28b deltaN70
<400> 16
gcggccgctc ccaggtcagc tactgcttg 29
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward cloning primer of pri-let-7a-1
<400> 17
gattcctttt caccattcac cctggatgtt 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse cloning primer of pri-let-7a-1
<400> 18
tttctatcag accgcctgga tgcagacttt 30
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of AB Drosha mutant
<400> 19
ggcggacctt ttgcaatcat ttattgcagc g 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of AB Drosha mutant
<400> 20
cgctgcaata aatgattgca aaaggtccgc c 31
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward priemr of AB Drosha mutant
<400> 21
ggccaattgt tttcaagcgt taatagg 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of AB Drosha mutant
<400> 22
cctattaacg cttgaaaaca attggcc 27
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of pri-let-7g
<400> 23
ggatcccctg tctcaagtgc atcctg 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of pri-let-7g
<400> 24
ctcgagcaga gatgagcagg gtgacg 26
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of pri-let-7e
<400> 25
ggatcctcat ccctggtcct cctgg 25
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of pri-let-7e
<400> 26
ctcgaggcag agatggagac agacagg 27
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe of let-7a-1 loop
<400> 27
tctcccagtg gtgggtgtga c 21
Claims (8)
- Lin28 억제제를 포함하는 항암제.
- 제 1항에 있어서, 상기 Lin28 억제제는 Lin28 활성을 억제하거나, Lin28과 pre-let-7 miRNA(microRNA)와의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제.
- 제 1항에 있어서, 상기 Lin28 억제제는 아연 핑거 도메인의 활성을 억제시킨 Lin28 돌연변이 단백질 또는 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 항암제.
- Lin28 활성을 증가시키는 단계를 포함하는 줄기세포의 제조 방법.
- 제 4항의 방법을 통하여 제조된 줄기세포.
- 드로셔(Drosha) 활성 억제제를 포함하는 암 모델 동물의 제조방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 드로셔 활성 억제제는 Glu1222 또는 Glu1045가 glutamine으로 치환된 드로셔 돌연변이인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 6항 또는 제 7항의 제조방법으로 제조된 암 모델 동물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080027880A KR20090106425A (ko) | 2008-03-26 | 2008-03-26 | 마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080027880A KR20090106425A (ko) | 2008-03-26 | 2008-03-26 | 마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090106425A true KR20090106425A (ko) | 2009-10-09 |
Family
ID=41536315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080027880A KR20090106425A (ko) | 2008-03-26 | 2008-03-26 | 마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20090106425A (ko) |
-
2008
- 2008-03-26 KR KR1020080027880A patent/KR20090106425A/ko not_active Application Discontinuation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pandolfini et al. | METTL1 promotes let-7 MicroRNA processing via m7G methylation | |
| Heo et al. | Lin28 mediates the terminal uridylation of let-7 precursor MicroRNA | |
| Jønson et al. | IMP3 RNP safe houses prevent miRNA-directed HMGA2 mRNA decay in cancer and development | |
| Newman et al. | Lin-28 interaction with the Let-7 precursor loop mediates regulated microRNA processing | |
| Suzuki et al. | MCPIP1 ribonuclease antagonizes dicer and terminates microRNA biogenesis through precursor microRNA degradation | |
| Ørom et al. | MicroRNA-10a binds the 5′ UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation | |
| Beitzinger et al. | Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes | |
| Guo et al. | MiR-125a TNF receptor-associated factor 6 to inhibit osteoclastogenesis | |
| Yang et al. | MicroRNA‐214 is aberrantly expressed in cervical cancers and inhibits the growth of HeLa cells | |
| Wu et al. | A splicing-independent function of SF2/ASF in microRNA processing | |
| Kim et al. | Epigenetic regulation of microRNA-10b and targeting of oncogenic MAPRE1 in gastric cancer | |
| Takaya et al. | MicroRNA-1 and MicroRNA-133 in spontaneous myocardial differentiation of mouse embryonic stem cells | |
| JP4463554B2 (ja) | 短い二本鎖ＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ合成方法 | |
| Meseguer et al. | The MELAS mutation m. 3243A> G alters the expression of mitochondrial tRNA fragments | |
| Tili et al. | GAM/ZFp/ZNF512B is central to a gene sensor circuitry involving cell-cycle regulators, TGFβ effectors, Drosha and microRNAs with opposite oncogenic potentials | |
| Grund et al. | Rare Drosha splice variants are deficient in microRNA processing but do not affect general microRNA expression in cancer cells | |
| EP2464730B1 (en) | miRNA COMPOUNDS FOR TREATMENT OF PROSTATE CARCINOMA | |
| Moreno-Mateos et al. | Novel small RNA expression libraries uncover hsa-miR-30b and hsa-miR-30c as important factors in anoikis resistance | |
| WO2011111715A1 (ja) | 細胞周期を制御する核酸 | |
| Zheng et al. | Autoantigen La regulates microRNA processing from stem–loop precursors by association with DGCR8 | |
| KR101469849B1 (ko) | 마이크로ｒｎａ 활성 측정 방법 | |
| Zhang et al. | The insertion in the double-stranded RNA binding domain of human Drosha is important for its function | |
| KR20090106425A (ko) | 마이크로ｒｎａ 생성을 억제하는 드로셔 돌연변이 | |
| Ohishi et al. | A forward genetic screen to study mammalian RNA interference–essential role of RNase IIIa domain of Dicer1 in 3′ strand cleavage of dsRNA in vivo | |
| Viridiana et al. | MicroRNAs: Beyond Post-transcriptional Regulation of mRNAs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |