KR20090096019A - Compositions comprising bee venom for Treating or Preventing Alzheimer's disease - Google Patents

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KR20090096019A
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구병수
황문제
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동국대학교 산학협력단
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Abstract

A composition containing bee venom as an active ingredient is provided to suppress the apoptosis of neuronal cell and prevent and treat Alzheimer's disease. A pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease comprises bee venom as an active ingredient. The pharmaceutical composition suppresses the apoptosis of neuronal cell by beta amyloid. The effects of suppressing apoptosis of neuronal cell by beta amyloid are confirmed through MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) analysis. The pharmaceutical composition is administered through subcutaneousness, intradermal, vein or muscle.

Description

봉독을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물{ Compositions comprising bee venom for Treating or Preventing Alzheimer's disease}Composition for preventing or treating Alzheimer's disease, comprising bee venom as an active ingredient {Compositions comprising bee venom for Treating or Preventing Alzheimer's disease}

본 발명은 봉독 (Bee venom)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 봉독을 유효성분으로 포함하고, 베타 아밀로이드에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제함을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition comprising bee venom (Bee venom) as an active ingredient, specifically comprising bee venom as an active ingredient, prevention of Alzheimer's disease characterized by inhibiting the death of neuronal cells by beta amyloid or It relates to a therapeutic pharmaceutical composition.

치매는 크게 65세 이전에 발생하는 초로성 치매(presenile dementa)와 그 이후에 발생하는 노인성 치매(senile denentia)로 구분하기도 하지만 모든 연령에서 치매환자의 중요 증상은 유사하기 때문에 이런 방법으로는 구별하지 않는 것이 일반적이다. 또 정상적인 노화의 과정으로 인해서도 신경세포의 수와 뇌의 크기의 소실을 초래하지만 병이 없으면 중요한 지능의 저하를 동반하지는 않는다. 그러므로 CT촬영에서 뇌의 전반적인 위축이 있다고 하여 반드시 치매라고 볼 수는 없다. 즉, 치매는 나이가 들면 반드시 거쳐가는 자연스런 노화의 과정이 아니라 질환인 것이 다1). Although dementia is divided into presenile dementa, which occurs before age 65, and senile denentia, which occurs after age 65, dementia is similar in all ages because it has similar symptoms. It is not common. In addition, the process of normal aging causes the loss of the number of neurons and the size of the brain, but without the disease does not have a significant decline in intelligence. Therefore, the CT scan does not necessarily mean that the brain has general atrophy. That is, that the dementia is not a thin natural process of aging example be age through Disease).

치매는 건망증과는 달리 기억력이 감퇴되는 것 외에도 지능의 전반적인 감퇴를 보여 일상생활에 지장을 초래하고 인격의 변화까지 나타날 수 있다1,2).In addition to dementia that leads to impaired memory, unlike amnesia it may show an overall decline of intelligence may disturb the daily life and to changes in the character 1,2).

역학조사 결과 중등도 내지 중증 치매의 유병률은 65세 이상에서 5-7%이며 80세 이상에서는 20%에 이른다고 한다. 우리나라의 농촌지역에서 조사된 연구들에 의하면 65세 이상 노인들에서 치매의 유별율은 약 10%내외로 보고하고 있으며 알츠하이머병이 가장 많고 다음이 혈관성 치매로 보고되고 있다3).Epidemiologic studies have shown that the prevalence of moderate to severe dementia is 5-7% in those over 65 years of age and 20% in those over 80 years of age. According to a study in the rural areas of the country classification rate of dementia in the elderly over 65 years old it is reported at around 10% a lot most of Alzheimer's disease have been reported following the three VaD).

치매의 노화와는 다른 질환으로서의 특징은 치매가 대뇌 피질질환(알츠하이머병)이나 대뇌기저핵 시상 깊은 백질과 같은 피질하 구조물의 질환(헌팅톤병, 다발성 경화증)에 의해 생긴다는 것이다1-5).A distinctive feature of dementia other than aging is that dementia is caused by diseases of the subcortical structures (Huntington's disease, multiple sclerosis), such as cerebral cortical diseases (Alzheimer's disease) or deep cerebral basal ganglia hypothalamus 1-5) .

알츠하이머병의 특징으로는 다음과 같은 것을 들 수 있다. 대뇌피질의 콜린계 활성이 감소하고, 병리조직학적으로는 전반적인 뇌신경세포의 상실, 신경원섬유 농축제(neurofibrillary tangle), 신경반(neuritic plaque)이 관찰되며, 최근의 분자생물학적 연구에서는 β-amyloid 단백질과 amyloid 전구단백질의 과다 축척이 광범위한 뇌 신경 손상의 원인으로 제시되고 있다. 구체적으로 보면, 뇌신경세포의 상실은 알츠하이머병의 가장 뚜렷한 병리소견인데 대뇌피질에 있는 신경세포의 소실로 전두부 두정부 그리고 내측두부에 광범위한 뇌회위축을 일으키며 뇌실은 상대적으로 커지게 된다. 현미경적인 알츠하이머병의 특징은 알츠하이머 신경원섬유 농축제(neurofibrillary tangle)의 축적과 시냅스의 소실을 특징으로 들 수 있으며 이것이 가장 심하게 일어나는 부위는 기억력과 관련있는 해마와 측두부이다. 신경원섬유농축은 신경세포내 병변으로서 신경핵 근처의 원형질내에 실타래 모양의 단백질이 주로 추체신경세포내에 특징적으로 나타난다. 최근의 연구에서 주성분은 미소관 tau 단백질의 비정상적 인산화형으로 밝혀지고 있다. 다른 조직병리학적 변화는 신경반(neuritic plaque)인데 신경돌기(축삭과 수상돌기)가 두꺼워져 집단으로 피질내에 보이며 일반적으로 amyloid 단백질을 에워싸고 불규칙하게 원모양을 이루고 있다. 즉, 신경세포 외의 복합체 병변으로 신경반 중심부위에는 amyloid 단백질이 특징적으로 모여있으며 주위에는 필라멘트들이 밀집되어 있다. 이와 같은 병변은 해마와 두정엽에 매우 뚜렷하다. 과거에는 노인반(senile plaque)으로 명명하였으나 최근에는 신경반(neuritic plaque)으로 표기하고 있다. 모든 증례는 아니지만 대다수에서 동일한 아밀로이드 침착이 수막과 피질 내 세동맥의 벽에서 발견되고 있어 뇌혈관 아밀로이도시스와 아밀로이드 플라크와의 상관관계에 많은 관심을 갖게 되었다. 그리고 amyloid peptide 유전자는 염색체 21번에 있다1,4,5). 이를 근거로 β-amyloid를 mouse에 주입한 실험에서 학습과 기억행동에 손상을 일으킬 수 있음이 보고 되었다36,37).Alzheimer's disease is characterized by the following. The cholinergic activity of the cerebral cortex is reduced, histopathologically, the loss of the overall cerebral neurons, neurofibrillary tangles, and neuritic plaques is observed. Excessive accumulation of and amyloid proproteins has been suggested to cause extensive brain nerve damage. Specifically, the loss of brain neurons is the most obvious pathology of Alzheimer's disease. The loss of neurons in the cerebral cortex causes widespread brain atrophy in the frontal head and medial head, and the ventricles become relatively large. Microscopic Alzheimer's disease is characterized by the accumulation of Alzheimer's neurofibrillary tangles and the loss of synapses, the most serious of which are the hippocampus and temporal regions associated with memory. Neurofibrillary tangles are intracellular neuronal lesions that are characterized by skein-shaped proteins in the protoplasts near the nucleus. In recent studies, the principal component has been found to be an abnormal phosphorylation of microtubule tau protein. Other histopathologic changes are neuritic plaques, which are thickened with neurites (axons and dendrites), appearing in the cortex as a group, and are usually surrounded by amyloid proteins and are irregularly circular. In other words, complex lesions other than neurons, amyloid protein is characteristically gathered on the center of neural plaques, and filaments are concentrated around. Such lesions are very pronounced in the hippocampus and parietal lobe. In the past it was named senile plaque, but recently it is called neuritic plaque. In most, but not all cases, the same amyloid deposits were found in the meninges and the walls of the coronary arteries, which led to much interest in the correlation between cerebrovascular amyloidosis and amyloid plaques. The amyloid peptide gene is located on chromosome 21 ( 1,4,5) . Based on this, experiments injecting β-amyloid into mice have been shown to cause damage to learning and memory behavior 36,37) .

한의학에서의 치매에 대한 기록을 보면, 明代 張景岳의『景岳全書 雜證謨 癲狂痴』에서는 “痴證… 或以鬱結 或以不遂 或以思慮 或以疑貳 或以驚恐 (혹이울 결 혹이불수 혹이사려 혹이경공)”라 하여 정서상의 문제로 보았고, 병리로는 “此其逆氣在心 或肝膽二經氣有不淸”라 하여 역기 (逆氣)가 心에 있거나 간담이경 (肝膽二經)의 기불청 (氣不淸)으로 치매가 발생하는 것으로 보았다. 증상에 대해서는 “言辭顚倒 擧動不經 惑多汗惑善愁 其證則天奇萬怪 無所不至 (언사전도 거동불경 혹다한혹선수 기증칙천기만괴 무소불지)”라 하여 인격의 변화 및 이상 행동에 대하여 언급하였으며, 이에 대한 치법으로 위기 (胃氣)와 원기 (元氣)의 강약에 따라 가치 (可治)와 불치 (不治)로 나누고, 大驚으로 인한 경우에는 신속히 元氣를 회복하여야 한다고 하였다6).In the history of dementia in oriental medicine, in the 景 代 岳 景 岳 景 景 岳 全書 癲狂 痴 痴 證或 以 鬱結 遂以 不遂 或 以 思慮 或 以 疑 貳 驚恐 以 驚恐 혹 以 驚恐 혹 以 驚恐 驚恐 以 驚恐 驚恐 以 驚恐 驚恐 以 공 驚恐 以 공 驚恐 以 驚恐 驚恐 以 공 驚恐 以 공 驚恐 以 공 驚恐 以 공 (驚恐) Dementia occurs due to weight loss in the heart, or due to Gwandam-Gyeonggi. The symptoms are referred to as "言辭 顚 倒 擧動 不 經 汗 惑 善 愁 多汗 惑 善 愁 其 證 則 天 奇 萬 怪 無所 不 언" He mentioned the above behavior, and as a cure for it, he divided it into value and incurability according to the strengths of crisis and energy. 6) .

陳士鐸의 『石室秘錄』에서는 “此等症雖有之 實亦胸腹之中 無非痰氣 故治無奇法 治痰卽治也 (차등증수유수빙지 실역흉복지중 무비담기 고치태무기법 치담즉치태야)”, “病內鬱抑不舒 憤怒而成者有之 羞而成者有之 (태병내울억불서 분노이성자유지 수에이성자유지)”라 하여 흉중(胸中)의 담(痰)과 정서(情緖)의 불균형을 원인으로 보았으며, 치료에 관해서는 “無非痰氣 故治無奇法 治痰卽治也 (무비담기 고치태무기법 치담즉치태야)”라 하여 치담(治痰)의 중요성을 강조하였다7).鐸 士 之 's 『石室 秘錄』 wrote, “The film of Kochi Taichi technique Chi-Tae) ”,“ 病 內 鬱 抑 不 舒 憤怒 而成 者 有 之 羞 而成 者 有 之 ” The imbalance of sentiment was regarded as the cause, and the treatment was called “non- 치료 痰 氣 無 無 無法 治痰 卽 治 也” by the name of “chichi-no-chi-no-chi-no-chi-ko-chi-chi-no-chi-chi-chi-chi-chi-ya”. 7)

錢鏡湖의 『辨證奇問』에서는 “人有終日悠悠忽不言不語 不飮不食 忽笑忽歌 忽愁忽哭 與之所饌則不受 與之糞則大喜 與之衣不服 與之草木之葉則又大喜 人以爲此病也 不必治也 (인유종일유유홀불언불어 불음불식 홀소홀가 홀수홀곡 여지소찬칙불수 여지분칙대희 여지의불복 여지초목지엽칙우대희 인이위차태병야 불필치야)”라고 하여 病前과 다른 성격과 인격의 변화에 대해 서술하고 있으며, 병리기전에 대 해서는 “病之始 必有其因 大約其始也 起於肝氣之鬱 其終也 由於胃氣之衰 肝鬱卽木剋土 而痰不能化 胃衰卽土制水 而痰不能消 於是痰績於胸中 盤據於心外 使神明不淸 而成病矣 (태병지시 필유기인 대약기시야 기어간기지울 기종야 유어위기지쇠 간울즉목극토 이담불능화 위쇠즉토제수 이담불능소 어시담적어흉중 반거어심외 사신명불청 이성태병의)”라 하여 간기(肝氣)의 울체(鬱滯)와 위기(胃氣)의 쇠퇴(衰退)가 원인이 되어 흉중(胸中)의 담(痰)이 적체(積滯)되는 병리를 언급하고, “一時而成病者…誰知是起居失節 胃氣傷而痰迷之乎…則火且害土而成痰 痰成而復傷其胃土 則火且迷心 輕則成 而重則發闕矣 (일시이성태병자…수지시기거실절 위기상이담미지호…칙화차해토이성담 담성이복상기위토 칙화차미심 경칙성태 이중칙발궐의)”라 하여 환경의 악영향으로 痰이 생겨 病에 이르는 병리를 설명하였다8).In 辨證 奇 問 's 『辨證 奇 問』, “人人 饌 則 日 悠悠 忽 不言不語 不 飮 不 食 忽 笑 忽 歌 與之 所 饌 則 不受 與之 糞 則 大喜 與之 衣 不服 與之 草木之 葉 則 又 大喜 人 以爲 此病 也 不必 治 也 (Human 일 유 유 불 불 불 불 불 홀 홀 홀 홀 대 대 대 대 희 희 희 희) It describes the change of personality and personality that is different from the predecessor. For the pathology, “病 之 始 必有 其 因 大約 其 始 也 起 於 肝氣 之 鬱 於 胃氣 也 由於 胃氣 之 衰 肝鬱卽 木 剋 土 能 性 胃 衰 卽 土 水 消 消 消 外 外 外 外 外 外 外 外 外 外 外 外 外 病 矣 病 矣 病 矣 外 外Crisis lock Ganul immediate impulse soil disabling immunity Disintegration embarrassing imam impairment Pathology in which the phlegm of the thorax is accumulated due to the ulcer of the interphase and the decline of the crisis. Mentioned, “一時 而成 病 者…誰知 是 起居 失節 胃氣 傷 而 痰 迷 之 乎… (Temporary heterosexual patient… residual failure) 8) The pathology leading to 病 due to the adverse effects of the environment was explained.

淸代 王淸任의 『醫林改錯』에서는 “靈機記性不在心在腦 (영기기성불재심재뇌)”라하여 정신사유활동(精神思惟活動)이 뇌에 의해 이루어짐을 인식하였고 “小兒無記成者 腦髓未滿 高年無記成者 腦髓漸空 (소아무기성자 뇌수미만 고년무기성자 뇌수점공)”이라 하여 나이가 들어 뇌수(腦髓)가 공허하게 되면 치매에 걸릴 수 있음을 설명하였다9).In 醫 林 改錯 's 醫 代 改錯, 인식 林 改錯 recognizes that mental thought activity is carried out by the brain, which is called “spiritual independence of mind.” “小兒 無記 成He explained that the disease could lead to dementia if the brain becomes vacant with age ( 9) .

현대 중의학에서는 치매에 대해 『實用中醫內科學』은 병인을 稟賦不充 (품부불충), 痰濁阻竅 (담탁조규), 肝腎不足 (간신부족)으로 분류하였고38), 『實用中醫腦病學』은 稟賦不足 (품부부족), 肝腎虧虛 (간신휴허), 情志所傷 (정지소상), 痰濁阻竅 (담탁조규), 瘀阻腦臟 (어조뇌장)등을 주요 병인으로 보았고39), 『中醫老年病學』에서는 노인성치매를 脾虛痰阻 (비허담조), 肝腎虛損 (간신허손), 痰火心 (담화롱심), 氣滯血瘀 (기체혈어)로 인한 것으로 분류하였다40).In modern Chinese medicine, 實用 中醫 內 科學 categorized the etiology into 稟賦 不 充 (deficient), 痰濁 阻 竅 (takjogyu), 肝腎 不 足 (lack of liver) 38) , 實 實 中 中醫 腦病 學is稟賦不足(pumbu shortage),肝腎虧虛(between sinhyu allowed),情志所傷(still small wound),痰濁阻竅(damtak jogyu),瘀阻腦臟(tone noejang) saw or the like as a major etiology 39 ) , 『Chinese 醫 老 病） classified elderly dementia as being caused by 비 (unlicensed), 간 (nearly deprived), 痰火 心 (담), and 氣滯血瘀 (chemo). 40) .

한편, 봉독이란 벌의 독액을 말하며 최근에는 주사제의 형태로 정제하여 봉침, 봉약침요법 등의 이름으로 불리며 韓醫學의 고유 치료방법으로 이용되고 있다. 봉독을 이용한 치료법은 기원전 2000년 경에 이집트 파피루스 문서에 벌침이나 죽은 벌을 아픈곳에 문질러 치료한 기록이 남아있을 정도로 오래된 것이다. 히포크라테스(BC 460-377)는 봉침을 사용한 기록을 남겼으며 봉독을 “Arcanum”즉 대단히 “신비한 약”이라 불렀다. John Quincy는 1733년에 저술한 “Complete English Dispensatory”에 꿀벌의 치료적 효과에 관해 기술해 놓았다. 1858년 프랑스 의사인 Desjardins는 봉독에 관한 최초의 학술논물을 “Abeille Medical (Medical Bee Journal)”에 발표했다. 그는 봉침을 사용해서 여러 종류의 류마티스성 질환을 성공적으로 치료했다10).On the other hand, bee venom refers to bee venom, and in recent years has been purified in the form of injections, such as bee sting, bee acupuncture and the like and is used as a unique treatment method of 韓 醫學. The bee venom treatment is so old that there was a record in the Egyptian papyrus document of 2000 BC that rubbed a bee or dead bee on a sore spot. Hippocrates (BC 460-377) recorded the use of bee stings and called bee venom “Arcanum,” a very “mystical drug”. John Quincy wrote about the therapeutic effects of honey bees in his "Complete English Dispensatory", published in 1733. In 1858, Desjardins, a French physician, published the first scientific article on bee venom in the "Abeille Medical (Medical Bee Journal)". He was successfully treated by using a needle to a variety of rheumatic diseases. 10).

韓醫學에서 봉독에 대한 가장 오래된 기록으로는 馬王堆醫書 (기원전 168년에 매장된 중국 장사 馬王堆 3호 한묘에서 발견된 醫書 15種에서 발견된 봉독요법 2례가 있는데 『養生方』에는 산 채로 털을 제거한 닭을 벌이 쏘게 하여 그 살로 藥巾을 만들어 발에 문지르면 기운이 왕성해진다는 내용과,『雜療方』에서는 남자의 성기능을 보익하기 위해 개의 肝에 벌이 쏘게 하여 약재와 함께 식초에 담가둔 뒤 솜에 그 식초를 흠뻑 젖게한 뒤 헝겁등으로 腰腹부에 둘러 감아 陰莖이 발기하면 떼어낸다는 기록이 있다12).The oldest record of bee venom in Chinese medicine is two cases of bee venom therapy found in 馬王堆 醫書 (15 books found at Hanseung No. 3, a Chinese merchant, buried in 168 B.C.E.). If the bee stings the lively chickens and shoots the flesh and rubs it on the feet, the energy is enhanced. In 雜 療 方, the bee stings on the dog's legs to supplement the male's sexual function. the wind around the vinegar soaked cotton placed behind the腰腹part in saturating a back cloth, etc. there is evidence naendaneun陰莖When you remove an erection. 12).

봉독은 Peptide component, Enzyme, Non peptide component으로 분류할 수 있는 다양한 물질들로 구성되어있다10,41).Bee venom consists of various substances that can be classified as Peptide component, Enzyme, and Non peptide component 10,41) .

Peptide component는 동결 건조된 봉독의 50-60%를 차지한다10). 대표적인 Peptide component인 멜리틴 (Melittin)은 26개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이며 Ⅰ과 Ⅱ의 두 가지 형태가 존재하는데 봉독에는 둘 다 들어있고 봉독 총량의 40-50%를 차지하지만 독성이 강하지는 않다. 용혈작용, 효소작용 및 항염작용을 한다42). 그리고 아파민 (Apamin)은 마른 봉독의 2-3%에 지나지 않지만 신경독 작용 때문에 널리 알려져 있다. calcium-potassium의 결합에 변화를 주어 중추신경 및 말초신경에 영향을 미치는데 과도한 양(0.5㎖/100g)을 혈관 내에 주입하면 골격근 (skeletal muscle)에 경련을 유발하고, 더 많은 양을 주입하면 호흡부전을 일으키며 뇌혈관계의 방어기전을 뚫고 뇌의 단백질에 영향을 주어 혼수를 일으키고 사망(LD50 = 4㎖/100g)에 이르게 된다.22,41) 그 외에 Peptide component에 해당하는 성분들로는 MCD peptide, Adolapin, Protease inhibitor, Secarpin, Tertiapin, Procamine, Minimine, Cardiopep, Melittin F 등이 있다11,42).Peptide components make up 50-60% of the lyophilized bee venom 10) . Melittin, a representative peptide component, is a polypeptide consisting of 26 amino acids, and there are two forms of I and II. Both are contained in bee venom and 40-40% of the total amount of bee venom, but they are not toxic. 42) Hemolytic, enzymatic and anti-inflammatory. Apamin is only 2-3% of dry bee venom, but is known for its neurotoxin action. Changes in calcium-potassium binding affect the central and peripheral nerves. Injecting an excessive amount (0.5ml / 100g) into the blood vessels causes cramps in the skeletal muscle, while injecting a higher dose inhales It causes insufficiency, penetrates the defense mechanisms of the cerebrovascular system, affects proteins in the brain, causes coma and leads to death (LD50 = 4ml / 100g). 22,41) that is in addition to the components include MCD peptide, Adolapin, Protease inhibitor, Secarpin, Tertiapin, Procamine, Minimine, Cardiopep, Melittin F , etc. for the component Peptide 11,42).

Enzyme의 주요 성분으로는 강한 항원이 될 수 있는 고분자 효소인 Hyaluronidase, Phospholipase A2가 있고 그 외에도, α-Glucosidase, Acid phosphomonoesterase, Lysophospholipase 등이 있다.The main components of Enzyme are Hyaluronidase and Phospholipase A2, which can be strong antigens, and α-Glucosidase, Acid phosphomonoesterase and Lysophospholipase.

Non peptide component으로는 Histamin, Dopamine, Norepinephrine 등이 있다10,42,43).Non-peptide components include Histamin, Dopamine and Norepinephrine 10,42,43) .

봉독에 대한 기존 연구들을 살펴보면 국내외 모두 관절염등 염증질환에 대한 논문이 많았고 또 유의한 효능을 보이는 것으로 보고되고 있고13-21), 관절염 이외에도 항암효과22), 면역요법23), 종양24) 등에 대하여 보고되어 있으며, 특히 봉독이 기억력이나 척수나 뇌의 신경세포 활성을 높일 수 있음에 대해서 이미 보고되어 있다.25-30).In the existing studies on bee venom, there are many papers on inflammatory diseases such as arthritis both at home and abroad, and they are reported to have significant effects.13-21), anti-cancer effects 22) , immunotherapy 23) , tumors 24) In particular, bee venom has already been reported to increase memory, neuronal activity in the spinal cord or brain. 25-30) .

본 발명자들은 알츠하이머의 특성과 봉독에 관한 연구의 결과, β-amyloid 단백질로 인한 腦神經細胞 損傷을 봉독이 억제할 수 있는가를 알아보기 위하여, 마우스의 신경교세포 배양 실험과 행동반응 실험 및 해마의 조직학적변화를 관찰함으로써, 알츠하이머병의 예방 및 치료에 대한 봉독의 효과를 확인하고, 본 발명에 이르렀다. The present inventors have studied the characteristics and bee venom of Alzheimer's disease to find out whether bee venom can inhibit the bee venom caused by β-amyloid protein. By observing the change, the effect of bee venom on the prevention and treatment of Alzheimer's disease was confirmed, and the present invention was reached.

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본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 목적은 상기 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물의 알츠하이머병의 예방 또는 치료에의 용도를 제공하려는 데 있다.본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 목적은 상기 봉독을 유효성분으로 포함하는 조성물의 알츠하이머병의 예방 또는 치료에의 용도를 제공하려는 데 있다.The present invention relates to a composition comprising bee venom as an active ingredient, and an object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of Alzheimer's disease of the composition comprising the bee venom as an active ingredient. The present invention relates to a composition comprising as an active ingredient, an object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of Alzheimer's disease of the composition comprising the bee venom as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마우스의 신경교세포 배양 실험과 행동반응 실험 및 해마의 조직학적변화를 관찰함으로써, β-amyloid 단백질로 인한 뇌신경세포 손상에 대한 억제효과를 확인하였다. In order to achieve the above object, the present invention by glial cell culture experiments and behavioral response experiments and histological changes in the hippocampus of the mouse, to confirm the inhibitory effect on neuronal cell damage caused by β-amyloid protein.

따라서 본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하고, 베타 아밀로이드에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제함을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 봉독은 JNK (C-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제함으로써 JNK의 활성을 억제하고, ERK (Extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 억제함으로써 ERK의 활성을 억제함을 특징으로 한다. Therefore, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease, comprising bee venom as an active ingredient, and inhibiting the death of neuronal cells by beta amyloid. The bee venom is characterized by inhibiting the activity of JNK by inhibiting phosphorylation of C-Jun N-terminal kinase (JNK) and inhibiting the activity of ERK by inhibiting phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK).

바람직하게는 상기 조성물은 주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 한다. Preferably the composition is characterized in that it is formulated in the form of an injection solution.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하고, 베타 아밀로이드에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제함을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention includes bee venom as an active ingredient, and provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease, characterized by inhibiting the death of neuronal cells by beta amyloid.

본 발명의 일 실시예에서는 마우스의 신경교세포 배양 실험에서 MTT assay 방법을 통해 봉독이 β-amyloid로 인한 일차 배양 신경교세포 (primary neuronal cell : PNC)의 사멸을 억제하는 효과를 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the bee venom inhibited the death of primary cultured neuroglial cells (PNC) due to β-amyloid through MTT assay method in glial cell culture experiments of mice.

즉, 봉독의 알츠하이머병에 대한 예방효과를 알아보기 위해, 아무 처리도 하지 않은 Normal 세포와 ; Aβ를 처리한 세포 ; 그리고 BV를 처리한뒤 30분 후에 Aβ를 처리한 세포를 비교하였고, 봉독의 알츠하이머병에 대한 치료효과를 알아보기 위해 Aβ를 먼저 처리한 뒤 30분 후에 BV를 처리한 세포를 비교하였다. That is, to examine the preventive effect of bee venom on Alzheimer's disease, normal cells without any treatment; Cells treated with Aβ; The cells treated with Aβ were compared with the cells treated with Aβ 30 minutes after BV treatment, and the cells treated with Aβ were compared with the cells treated with BV after 30 minutes to determine the therapeutic effect of bee venom on Alzheimer's disease.

첫번째 경우, Aβ처리 세포가 Normal에 비해 유의성있게 세포 활성도(Cell viability)가 감소하였고, BV/Aβ순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 유의성 있게 증가하였음을 확인(도3)하였으며, 두번째 경우에도 Aβ처리 세포가 Normal에 비해 유의성있게 세포 활성도가 감소하였으며, Aβ/BV순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 유의성 있게 증가함을 확인(도 4)하였다. 이러한 결과로 알츠하이머병에 대한 봉독의 예방 및 치료에의 용도를 확인하였다. In the first case, cell viability was significantly decreased in Aβ-treated cells compared to normal, and cells treated in BV / Aβ sequence were significantly increased in comparison with Aβ-treated cells (Fig. 3). In addition, it was confirmed that Aβ treated cells significantly decreased cell activity compared to normal, and cells treated in Aβ / BV order increased significantly compared to Aβ treated cells (FIG. 4). These results confirm the use of the prevention and treatment of bee venom for Alzheimer's disease.

또한 본 발명의 봉독을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 있어, 상기 봉독은 JNK (C-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제함으로써 JNK의 활성을 억제함을 특징으로 한다. 또한 상기 봉독은 ERK (Extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 억제함으로써 ERK의 활성을 억제함을 특징으로 하는 것을 포함한다. In addition, in the pharmaceutical composition comprising bee venom of the present invention as an active ingredient, the bee venom is characterized by inhibiting the activity of JNK by inhibiting phosphorylation of JNK (C-Jun N-terminal kinase). In addition, the bee venom is characterized by inhibiting the activity of ERK by inhibiting the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK).

본 발명의 일 실시예에서는, MTT assay 에서 봉독을 나중에 처리한 두 번째 경우에 대하여 세포 독성 및 사멸의 지표로 이용할 수 있는 JNK와 ERK의 활성화 정도를 인산화 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅 분석을 하였다.In one embodiment of the present invention, the second case of bee venom treatment in the MTT assay was subjected to Western blotting analysis using the phosphorylation specific antibody for the activation of JNK and ERK that can be used as an indicator of cytotoxicity and death .

상기 웨스턴 블랏팅 분석은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내려 할 때 사용하는 기법으로서 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으켜 특정 단백질의 존재 여부를 밝혀내는 방법이다. 본 발명에서는 세포가 사멸할 때 활성화 되는 것으로 알려진 단백질인 JNK와 ERK를 측정하였다.The Western blotting analysis is a technique used to find a specific protein from a mixture of several proteins, and is a method of generating an antigen-antibody reaction using an antibody against a protein to be found to determine the presence of a specific protein. In the present invention, JNK and ERK, proteins known to be activated when cells die, were measured.

상기 JNK와 ERK를 선택한 이론적 근거는 다음과 같다. β-amyloid가 뇌신경세포에 손상을 일으키는 기전에 대한 이론들 중 대표적인 것으로 두 가지가 있는데 먼저, β-amyloid가 소교세포 (microglia cell)를 활성화 시켜 신경 세포를 손상시키는 사이토카인을 생성하여 일련의 염증 반응을 유발한다는 이론44,45) 과 다음으로는 자유라디칼에 의한 활성산소종의 작용에 관한 것이다. β-amyloid가 소교세포를 활성화 시키는 기전에서는 JNK46,47)의 활성화가 세포 독성 및 세포 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 β-amyloid로 인한 세포 독성 및 사멸 의 지표로 JNK의 활성화 정도를 인산화 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅 분석을 하였다. 더불어 p42/44 MAPK (ERK)에 대해서도 웨스턴 블랏팅 분석을 했는데, 신경 세포 실험에서는 β-amyloid를 처리하면 ERK의 인산화가 증가하는 것을 볼 수 있으며 이러한 인산화 증가로 인해 세포가 사멸되거나 소교세포의 활성에 중요한 활성산소의 생성 및 사이토카인의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다48,49). 따라서 이를 근거로 JNK와 ERK의 활성화 정도를 알츠하이머병의 세포 독성 및 사멸의 지표로 이용하였다. The theoretical basis for selecting the JNK and ERK is as follows. There are two representative theories about the mechanism by which β-amyloid causes damage to neuronal cells. First, β-amyloid activates microglia cells to produce cytokines that damage nerve cells, resulting in a series of inflammations. 44,45), and then the action of free radicals by free radicals. In the mechanism by which β-amyloid activates microglial cells, the activation of JNK 46,47) is known to be involved in cytotoxicity and cell death. Therefore, in the present invention, the degree of activation of JNK as an indicator of cytotoxicity and death caused by β-amyloid was analyzed by Western blotting using a phosphorylated specific antibody. In addition, Western blotting analysis was performed on p42 / 44 MAPK (ERK). In neuronal experiments, the treatment of β-amyloid increased the phosphorylation of ERK, which resulted in cell death or activation of microglial cells. the it reported to play an important role in the generation of generate and cytokines relevant radicals 48,49). Therefore, the activation level of JNK and ERK was used as an indicator of cytotoxicity and death of Alzheimer's disease.

본 발명의 일 실시예에서 JNK와 ERK 둘 다 Aβ를 처리한 세포와 Aβ/BV를 한 경우를 비교하였는데, Aβ/BV를 한 경우가 JNK와 ERK의 인산화를 유의성있게 억제하는 효과를 보임을 확인하였는 바, 이는 봉독이 JNK와 ERK의 활성화를 억제함을 나타낸다 (도 5, 도6). 즉, 봉독이 세포의 사멸을 막는 효과를 보인다는 것을 나타낸다. In an embodiment of the present invention, both JNK and ERK were compared with Aβ-treated cells and Aβ / BV, but Aβ / BV showed a significant effect of inhibiting phosphorylation of JNK and ERK. This indicates that bee venom inhibits the activation of JNK and ERK (FIG. 5, FIG. 6). That is, bee venom has an effect of preventing cell death.

본 발명의 일 실시예에서는 봉독이 β-amyloid로 인한 뇌신경세포 손상을 억제함을 확인하기 위하여 마우스의 행동반응 실험을 하고 해마를 적출하여 세포활성도를 측정하였다. In one embodiment of the present invention to determine whether bee venom inhibits β-amyloid-induced neuronal cell damage, the behavioral test of the mouse and the hippocampus were extracted to measure cell activity.

상기 행동반응 실험으로는 Y-maze task와 Passive avoidance task를 시행하였다. Y-maze task and passive avoidance task were conducted as behavioral experiments.

상기 Y-maze task는 단기작업 기억(working memory)을 측정하기 위해 고안되었으며 공간기억능력(spatial memory)을 측정 할 수 있는데, 동시에 운동량도 측정 할 수 있는 방법이다50). 즉, 자발적 교차행동량(spontaneous alteration)을 통해 공간지각능력의 정도를 알 수 있는데 봉독 처리를 한 Ex(Bee venom)군이 치매 유발 후 치료제를 처리하지 않은 Negative군에 비해 유의한 증가를 보임을 확인 (도 7)하였다. 이러한 결과는 봉독이 공간지각능력의 저하를 막을 수 있음을 보여준다. 또한 상기 Y-maze task를 이용한 운동량 측정(total entry)에서는 유의성 있는 차이를 보이지 않았는데, 이러한 결과는 치매가 유발되거나 혹은 호전이 되더라도 공간지각능력의 변화를 보이기는 하나 운동량에서는 차이가 크지 않다는 것을 확인 한 것이다. The Y-maze task is designed to measure short-term working memory and can measure spatial memory, and at the same time, it can measure the amount of exercise 50) . In other words, spontaneous alteration shows the degree of spatial perception ability, and the bee venom (Ex) group treated with bee venom increased significantly compared to the non-treatment group without treatment. It was confirmed (FIG. 7). These results show that bee venom can prevent the decline of spatial perception ability. In addition, there was no significant difference in the total entry using the Y-maze task. Although these results showed a change in spatial perception ability even if dementia was induced or improved, the difference was not large in the momentum. It is.

또한 상기 Passive avoidance task(수동회피실험)는 기억력을검사하기 위한 널리 알려진 방법으로서, 이 방법은 실험에 비협조적인 동물도 쉽게 실험할 수 있는 방법이다. 본 발명의 일 실시예에서는 치매 유발 후 치료제를 처리하지 않은 Negative군이 치매를 유발하지 않은 Normal군에 비해 유의성 있는 감소를 보였는데 이는 치매 유발군이 정상보다 기억력의 저하를 보인다는 의미이며, 봉독처리를 한 Ex(Bee venom)군이 Negative군에 비해 유의성 있는 증가를 보였는데 이는 봉독이 기억력 저하를 막는 효과가 있음을 입증하는 것이다 (도 9). 즉, 봉독이 베타 아밀로이드로 알츠하이머형 치매를 유발시킨 마우스의 기억력 손상을 막아주는 효과가 있음을 확인하였다. In addition, the passive avoidance task (passive avoidance task) is a well-known method for testing the memory, this method is a method that can easily experiment with animals that are not cooperative in the experiment. In one embodiment of the present invention, after treatment with dementia, the Negative group, which was not treated with a therapeutic agent, showed a significant decrease compared to the normal group that did not induce dementia, which means that the dementia group showed a lower memory than normal, and bee venom The treated Ex (Bee venom) group showed a significant increase compared to the Negative group, demonstrating that bee venom has an effect of preventing memory loss (FIG. 9). In other words, bee venom has been shown to be effective in preventing memory impairment in mice inducing Alzheimer's dementia with beta amyloid.

또한 본 발명의 일 실시예에서는 봉독이 마우스의 뇌 세포손상을 막는데 기여했는지 알아보기 위해 상기 행동반응 실험에 사용된 마우스의 해마 조직을 적출하여 Immunohistochemistry(면역조직화학염색법)를 시행하였다. In addition, in one embodiment of the present invention, to determine whether bee venom contributed to the brain cell damage of the mouse, the hippocampal tissue of the mouse used in the behavioral response experiment was extracted and subjected to Immunohistochemistry (immunohistochemistry).

참고로 면역조직화학염색법은 조직항원의 존재를 보기 위한 것으로서 원하는 항원이 조직 내에 어느 곳에서 표현되는지를 localization 시킬 목적으로 행해지는 것으로, 발현조직의 부위 특히 형태를 밝힐 수 있는 방법이다. 즉, 웨스턴 블랏팅 분석이 발현 여부만 알 수 있는 기술검사라면, 면역조직화학염색법은 어떤 유전자가 발현될 경우 해당되는 단백질이 세포질 내에 만들어 지게 되므로 슬라이드 위의 조직에 그 단백질에 대한 항체(primary antibody)를 결합시키고 그 항체에 대한 항체(secondary antibody)에 어떤 표식을 하여 다시 결합시킨 후 그 표식을 검출방법을 이용하여 육안으로 알아볼 수 있게 함으로써, 특정 단백질이 조직의 어떤 부위에서 발현되는지를 정확히 육안으로 관찰할 수 있는 일종의 분석검사에 해당한다.For reference, immunohistochemical staining is performed for the purpose of localizing where the desired antigen is expressed in the tissue. In other words, if Western blotting analysis is a technical test that can only know whether the expression, immunohistochemical staining method is that when a gene is expressed, the corresponding protein is made in the cytoplasm, so the antibody against the protein in the tissue on the slide (primary antibody) ), The markers on the antibody against the antibody (secondary antibody) are re-bound, and the markers can be visually identified using a detection method. It is a kind of analysis test that can be observed.

상기 본 발명의 일 실시예에서는 알츠하이머병이나 뇌에 염증이 있을 때 증가하는 단백질로 알려져 있는 GFAP를 항체로서 선택하였다. GFAP 염색 결과 Negative군에서는 GFAP의 염색이 진하게 되었으며, Positive군과 Ex(Bee venom)군에서는 Normal군과 비슷하게 GFAP의 양이 증가하지 않았음을 확인하였다(도 10). 즉, BV가 해마 세포의 손상을 억제하는 효과를 보였다는 것을 나타낸다.In one embodiment of the present invention, GFAP, which is known to be a protein that increases when there is Alzheimer's disease or inflammation in the brain, was selected as an antibody. As a result of GFAP staining, the staining of GFAP was increased in the Negative group, and the amount of GFAP was not increased in the positive group and the Ex (Bee venom) group similar to the normal group (FIG. 10). In other words, BV showed the effect of inhibiting damage to hippocampal cells.

따라서 본 발명의 봉독을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 알츠하이머병의 예방 또는 치료에의 용도에 이용될 수 있다. Therefore, the pharmaceutical composition comprising bee venom of the present invention as an active ingredient can be used for use in the prevention or treatment of Alzheimer's disease.

또한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 필요에 따라 적절히 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물을 사용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말, 파스, 젤, 연고 등의 형태일 수 있다. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may appropriately include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and diluent as necessary. In addition, the compositions can be used to prepare pharmaceutical formulations according to conventional methods. The formulations may be in the form of tablets, pills, powders, assays, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders, pars, gels, ointments and the like.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. Examples of suitable carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, Propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. The formulation may further comprise fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like. Compositions of the present invention may be formulated using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 피내, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 주사용액의 형태로 제형화되는 것이 가장 바람직하며, 특히 침자리에 주입함으로써 약리효과를 증진시킬 수 있다. The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered via several routes including oral, transdermal, subcutaneous, intradermal, intravenous or intramuscular. In particular, the composition of the present invention is most preferably formulated in the form of an injectable solution, and in particular, it can enhance the pharmacological effect by injecting into bedding.

본 발명의 약학조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 정맥, 근육, 피하, 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 다만, 벌독은 결핵, 당뇨병, 선천성 심장병, 동맥경화증, 성병이 있는 사람은 쓰지 말아야 하며 어린이와 노인은 벌독에 대하여 감수성이 높으므로 주의해야 한다. 특히 특이적으로 벌독에 대하여 감수성이 높은 체질, 전염병, 결핵, 정신병, 간질병, 급성췌장염, 콩팥염, 부신피질질병, 아디손병, 패혈증, 급성축농증, 중추신경계통의 기질적 질병, 심장혈관계통의 대사기능장애, 전신쇠약, 출혈병, 월경때에는 쓰지 않는다. Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intracerebroventricular injection. However, bee venom should not be used by people with tuberculosis, diabetes mellitus, congenital heart disease, arteriosclerosis, or sexually transmitted diseases, and children and the elderly should be careful because they are highly sensitive to bee venom. Particularly sensitive to bee venom, constitution, infectious disease, tuberculosis, psychosis, epilepsy, acute pancreatitis, kidney disease, adrenal cortex, adison disease, sepsis, acute sinusitis, organic diseases of the central nervous system, cardiovascular system Metabolic dysfunction, systemic weakness, bleeding disease, menstruation is not used.

본 발명은 봉독을 유효성분으로 포함하고, 베타 아밀로이드에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제함을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상술한 바와 같이, MTT assay와 JNK와 ERK에 대한 웨스턴 블랏팅 분석을 시행하여 봉독이 베타 아밀로이드로 인한 신경교세포의 사멸을 억제하고, 알츠하이머형 치매를 유발시킨 마우스의 행동반응실험에서 기억력 감퇴와 학습능력 저하를 유의성 있게 막을 수 있으며, 행동반응 실험과 이후 적출한 해마의 뇌신경세포 염색을 통해 봉독이 뇌신경세포의 사멸을유의성 있게 억제한다는 사실을 확인함으로써, 알츠하이머병의 예방 및 치료에 대한 봉독의 효과를 입증하였다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease, comprising bee venom as an active ingredient, and inhibiting the death of neurons by beta amyloid. As described above, MTT assay and JNK and Western blotting analysis of ERK prevents beta-amyloid-induced glial cell death and significantly prevents memory loss and learning deterioration in behavioral responses in mice with Alzheimer's dementia. Response experiments and subsequent brain nerve cell staining from the hippocampus confirmed that bee venementally inhibited the death of neurons, thereby demonstrating the effects of bee venom on the prevention and treatment of Alzheimer's disease.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 실시예일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

<실시예 1> 실험 재료의 준비Example 1 Preparation of Experimental Materials

1-1 시약 및 기기1-1 Reagents and Instruments

봉독 (Bee venom ; 이하 BV)은 미국산 이탈리아 꿀벌의 마른 봉독으로 (주) 아피톡신에서 구입하여 사용하였다. 신경세포 배양에 필요한 배지인 Fetal Bovine Serum (FBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), DMEM/F12, penicillin, streptomycin, Trypsin-EDTA 등은 Invitrogen (USA)에서 구입하였다. MTT (tetrazlium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)와 dimethysulfoxide (DMSO)는 Sigma (USA) 제품을 사용하였으며, β-amyloid 1-42와 42-1 peptide는 Biosource (USA) 제품을 사용하였다. 항 인산화 ERK (p-ERK), ERK, 항 인산화 JNK (p-JNK), JNK 항체는 Cell signaling tech (USA) 에서 구입하여 사용하였다. 이차 항체는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-rabbit antibody와 발색반응 시약으로 enhanced chemiluminiscence system (ECL) kit는 Pierce (USA)에서 구입하였다. Bee venom (BV) is a dry bee venom of American Italian bees, purchased from Apitoxin Co., Ltd. Fetal Bovine Serum (FBS), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), DMEM / F12, penicillin, streptomycin, Trypsin-EDTA, etc., which were required for neuronal cell culture were purchased from Invitrogen (USA). MTT (tetrazlium 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) and dimethysulfoxide (DMSO) were produced from Sigma (USA), and β-amyloid 1-42 and 42-1 peptides. Used Biosource (USA) products. Anti phosphorylated ERK (p-ERK), ERK, anti phosphorylated JNK (p-JNK), and JNK antibodies were purchased from Cell signaling tech (USA). Secondary antibodies are anti-rabbit antibodies with horse radish peroxidase (HRP) and chromogenic reactions. The enhanced chemiluminiscence system (ECL) kit was purchased from Pierce (USA).

1-2 봉독의 사용1-2 use of bee venom

봉독 1g을 200㎖의 식염수에 녹여 사용하였다.1 g of bee venom was dissolved in 200 ml of saline.

1-3 일차 배양 신경교세포 (primary neuronal cell : PNC)분리 및 배양1-3 Isolation and culture of primary neuronal cells (PNC)

신경교세포의 배양은 Liu31)의 방법에 따라, 태어난 지 2일 이내의 흰쥐의 대뇌를 사용하였다. 간단히 설명하면, menings와 blood vessles을 제거한 후, 뇌조직을 분쇄하여 세포를 분리한 후 150 ㎠ flask에 5×107의 세포를 넣고 일주일간 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% FBS이 함유된 DMEM/F12를 사용하여 배양하였다. 일주일 후 세포가 자란 뒤에 사용하였다. 오염 방지를 위해 항생제로 100unit/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin 을 첨가하였다. Trypsin-EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. 배지는 2-3일 마다 교환하여 주었다. The glial cells were cultured using the cerebrum of rats within 2 days of birth according to the method of Liu 31) . Briefly, after removing the menings and blood vessles, crush the brain tissue to separate the cells, put 5 × 10 7 cells in a 150 cm 2 flask and contain 10% FBS in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for a week. Cultured using DMEM / F12. One week later, cells were used to grow. In order to prevent contamination, 100 units / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin were added as antibiotics. Subsequent passages were treated with Trypsin-EDTA. The medium was changed every 2-3 days.

1-4 실험 동물1-4 Experiment Animals

실험 동물은 오리엔트바이오(주)에서 구입한 외관상 건강한 ICR계 mouse로 雄性 6주령(20~26g)을 사용하였으며, 온도 22± 1℃, 습도 55± 1%, 12시간 light-dark cycle의 통제된 사육실(동국대학교 일산병원 동물실)에서 食餌와 食水는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 반입 후 7일 동안 적응 사육시킨 후 실험에 사용하였다. The experimental animal was an apparently healthy ICR mouse purchased from Orient Bio Co., Ltd. and used 6 weeks of age (20 ~ 26 g) and controlled at 22 ± 1 ℃, 55 ± 1% humidity, 12 hours light-dark cycle. Feeding and feeding were freely consumed in the breeding room (Dongguk University Ilsan Hospital animal room), and used for the experiment after adaptive breeding for 7 days.

<실시예 2> 세포 활성도 측정Example 2 Cell Activity Measurement

BV가 β-amyloid 1-42에 의한 일차 신경교세포(primary neuronal cell)의 손상을 막을 수 있는지 알기 위해 MTT assay를 하였다.MTT assay was performed to determine whether BV could prevent the damage of primary neuronal cells by β-amyloid 1-42.

MTT assay는 Sladowski의 방법32)을 따랐다. MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 테트라졸리움 (tetrazolium)을 청자색을 띄는 비수용성의 포마잔으로 환원시키는 세포의 능력을 이용하는 검사법이다. 포마잔의 흡광도는 580㎚의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 세포가 살아있고 대사가 왕성한 세포의 산화 환원력을 반영한다.The MTT assay followed Sladowski's method 32) . MTT assay is a test that utilizes the ability of cells to reduce tetrazolium, a yellow water-soluble substrate, to water-soluble formazan, which has a violet color, by dehydrogenase action. The absorbance of formazan is maximal at a wavelength of 580 nm, and the absorbance measured at this wavelength reflects the redox power of cells in which cells are alive and vigorously metabolized.

MTT assay는 우선 12-웰 플레이트에 일차 신경 교세포를 12시간 배양한 후 FBS를 첨가하지 않은 무혈청 배지(serum-free medium), DMEM/F12로 교환하여 16시간 동안 안정화시키고, 5uM의 β-amyloid 1-42 또는 BV(농도 0.1㎍/㎖)를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 그리고 MTT 용액 (2㎎/㎖)을 넣고, 배양기 (incubator)에서 4시간 배양한 후 DMSO로 용해시켜 580㎚의 파장에서 마이크로플레이트 리더 (Molecular divices, USA)로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.MTT assay was first incubated for 12 hours in primary glial cells in a 12-well plate and exchanged with DMEM / F12, serum-free medium without FBS, and stabilized for 16 hours, and β-amyloid at 5 uM. 1-42 or BV (concentration 0.1 μg / ml) was added and incubated for 48 hours. MTT solution (2 mg / ml) was added, incubated in an incubator for 4 hours, dissolved in DMSO, and absorbed by a microplate reader (Molecular divices, USA) at a wavelength of 580 nm to calculate cell viability. .

세포 생존율 (Cell viability, %)은 다음과 같이 정의를 하였다. 정상군의 값을 Normal로 하고 이때의 O.D.(optical density)값을 세포의 생존도가 100%라고 정의하고, 나머지 군의 측정한 O.D.값을 상대치로 환산을 하면 다음과 같다.Cell viability (%) was defined as follows. If the value of the normal group is set to Normal and the O.D. (optical density) value at this time is defined as 100% of cell viability, and the measured O.D. values of the remaining groups are converted into relative values as follows.

Cell viability = ( 실험군 값/ 정상군 값 ) × 100Cell viability = (experimental group value / normal group value) × 100

(1) 아무처리도 하지 않은 Normal 세포와 5uM의 β-amyloid 1-42를 처리한 세포 그리고 0.1㎍/㎖농도의 BV를 처리한 뒤 30분 후에 5uM의 β-amyloid 1-42를 처리한 세포를 비교하였다. (1) cells treated with 5 μM β-amyloid 1-42 without any treatment and cells treated with 5 μM β-amyloid 1-42 after 30 minutes after treatment with BV at 0.1 μg / ml Was compared.

(2) Normal 세포와 β-amyloid 1-42를 처리한 세포 그리고 β-amyloid 1-42를 처리한뒤 30분 후에 BV를 처리한 세포를 비교하였다. (2) The cells treated with β-amyloid 1-42 and BV-treated cells 30 minutes after treatment with β-amyloid 1-42 were compared.

상기 MTT assay로 측정한 PNC의 세포활성도(Cell viability)를 측정한 결과, As a result of measuring the cell viability of PNC measured by the MTT assay,

먼저, BV 처리 후 Aβ를 처리한 PNC의 세포활성도를 비교하면, First, comparing the cell activity of ANC treated PNC after BV treatment,

Normal 세포의 O.D. 값은 0.90± 0.04 였으며, Aβ를 처리한 세포는 0.58± 0.02이고, BV/Aβ순서로 처리한 경우에서는 0.67± 0.00 이었다. 따라서 세포활성도(%)는 Normal을 100%로 하여 기준으로 정할때, Aβ를 처리한 세포는 63.91%이며, BV Aβ를 처리한 경우의 세포는 74.71%였다.O.D. of Normal Cells. The value was 0.90 ± 0.04. The cells treated with Aβ were 0.58 ± 0.02 and 0.67 ± 0.00 when treated with BV / Aβ sequence. Therefore, when the cell activity (%) was set as the standard with 100% as normal, 63.91% of cells treated with Aβ were 74.71% of cells treated with BV Aβ.

즉, Aβ처리 세포가 Normal에 비해 O.D.값이 유의성있게 감소하였으며, BV/Aβ순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 O.D.값이 유의성 있게 증가하였다 (도3). 이러한 결과는 봉독이 알츠하이머에 대한 예방의 가능성을 나타낸다고 할 것이다.That is, A. treated cells significantly decreased O.D. values compared to normal, and cells treated with BV / Aβ sequence significantly increased O.D. values compared to Aβ treated cells (FIG. 3). These results suggest that bee venom represents the potential for prevention of Alzheimer's disease.

다음으로, Aβ 처리 후 BV를 처리한 PNC의 세포활성도를 비교하면, Next, comparing the cell activity of BV-treated PNC after Aβ treatment,

Normal 세포의 O.D.값은 0.86± 0.02 이었으며, Aβ를 처리한 세포는 0.50± 0.02이고, Aβ처리한 이후에 BV를 처리한 경우에서는 0.60± 0.02 이었다. 따라서 세포활성도(%)는 Normal을 100%로 하여 기준으로 정할 때, Aβ를 처리한 세포는 58.19%이며, Aβ/BV순서로 처리한 세포는 69.11%였다. The O.D. value of normal cells was 0.86 ± 0.02, the cells treated with Aβ were 0.50 ± 0.02, and 0.60 ± 0.02 when BV was treated after Aβ treatment. Therefore, when the cell activity (%) was determined to be 100% Normal, 58.19% of cells treated with Aβ were 69.11% of cells treated with Aβ / BV sequence.

즉, Aβ처리 세포가 Normal에 비해 유의성있게 O.D.값이 감소하였으며, Aβ /BV순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 유의성 있게 증가하였다 (도 4). 이러한 결과는 봉독이 알츠하이머에 대한 치료가능성을 나타낸다고 할 것이다. That is, Aβ treated cells significantly decreased O.D. values compared to Normal, and cells treated with Aβ / BV sequence increased significantly compared to Aβ treated cells (FIG. 4). These results suggest that bee venom may be therapeutic for Alzheimer's disease.

결과적으로, 상기 MTT assay에서 봉독을 먼저 처리하거나 뒤에 처리한 경우 모두에서 유의성있게 신경교세포를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있는 바, 이는 알츠하이머의 예방과 치료 모두에서 봉독을 이용할 수 있음을 보여준다.As a result, it can be seen that the bee venom treated in the MTT assay first or the latter has a significant effect on protecting glial cells, which shows that bee venom can be used both in the prevention and treatment of Alzheimer's disease.

<실시예 3> Western blotting analysisExample 3 Western blotting analysis

BV가 β-amyloid 1-42에 의한 일차 신경교세포 (primary neuronal cell)의 손상에 어떠한 효과를 나타내는가는 측정하기 위해, 5uM의 β-amyloid 1-42를 처리 후 30분 후에 0.1㎍/㎖농도의 BV를 처리하고 이 세포들로부터 10min, 30min, 1h, 2h의 각 시간대 별로 단백질을 추출하여 세포의 생존 및 사멸에 관여하는 것으로 잘 알려진 Extracellular signal-regulated kinase(이하 ERK)와 C-Jun N-terminal kinase(이하 JNK)에 대한 웨스턴 블랏팅 분석을 시행하였다. To determine the effect of BV on the damage of primary neuronal cells by β-amyloid 1-42, a concentration of 0.1 μg / ml was applied 30 min after treatment with 5 uM of β-amyloid 1-42. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) and C-Jun N-terminal, which are known to be involved in cell survival and death, by treating BV and extracting proteins from each of the cells at 10, 30, 1 and 2 h. Western blotting analysis was performed for kinase (hereinafter JNK).

모든 세포 용해질들은 표본 완충제(62.5 mmol/l Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) 내에 boiling cell에 의해 만들어졌다. 단백질 정량은 bicinchoninic acid (BCA(Pierce)) 정량법을 사용하였다. 정량된 단백질 시료 50㎍는 4-12% gradient sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel (SDS-PAGE) (NuPage, Invitrogen)을 사용하여 전기영동으로 분리하였고, 니트로셀룰로스 막 (Amersham)으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막을 Ponceau-S로 염색하 여 단백질이 완전하게 옮겨졌음을 확인하고 0.1% Tween 20을 포함하는 Tris-buffered saline (TBS-T)로 씻은 후 5% 탈지분유 액으로 30분 이상 blocking 하였다. 각 단백질은 항체와 함께 4C에서 16시간 동안 반응시킨 후 막을 TBS-T에서 10분씩 3회 세척한 후, blot을 2차 항체와 함께 1시간 반응시켰다. 2차 항체 반응 뒤 막을 씻고 ECL 반응 후 원하는 단백질을 가시화 하였다. 단백질의 가시화 및 정량 분석은 LAS-3000 (Fuji)를 이용하였다.All cell lysates were made by boiling cells in sample buffer (62.5 mmol / l Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol). Protein quantification was performed using bicinchoninic acid (BCA (Pierce)) assay. 50 μg of quantified protein samples were separated by electrophoresis using 4-12% gradient sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel (SDS-PAGE) (NuPage, Invitrogen) and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham). Protein transfer membrane was stained with Ponceau-S to confirm that the protein was transferred completely and washed with Tris-buffered saline (TBS-T) containing 0.1% Tween 20 and blocked with 5% skim milk powder for at least 30 minutes. . Each protein was reacted with the antibody for 16 hours at 4C, the membrane was washed three times with TBS-T for 10 minutes, and then the blot was reacted with the secondary antibody for 1 hour. The membrane was washed after the secondary antibody reaction and the desired protein was visualized after the ECL reaction. Visualization and quantitative analysis of the protein was used LAS-3000 (Fuji).

상기와 같이 세포가 사멸할 때 활성화되는 단백질의 하나인 JNK의 활성과 인산화 및 ERK의 활성과 인산화에 대한 억제 효과를 알아보기 위해 Aβ를 처리한 PNC와 Aβ/BV를 한 PNC를 웨스턴 블랏팅 분석를 행하여 비교한 결과, In order to investigate the inhibitory effect of JNK activity and phosphorylation and ERK activity and phosphorylation, one of the proteins activated when cells die, Western blotting analysis of Aβ-treated PNC and Aβ / BV-treated PNC was performed. As a result of comparison

Aβ/BV를 한 경우가 Aβ를 처리한 경우에 비해 JNK의 인산화를 억제하는 효과를 보일 뿐만 아니라 (도 5), ERK의 인산화를 억제하는 효과를 보였다 (도 6). 이러한 결과는 봉독이 JNK와 ERK의 활성화를 억제한다는 것을 나타내며, 이를 통해 봉독이 세포의 사멸을 막는 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있었다.Aβ / BV showed not only the effect of inhibiting the phosphorylation of JNK compared to the case of Aβ treatment (FIG. 5), but also the effect of inhibiting phosphorylation of ERK (FIG. 6). These results indicate that bee venom inhibits the activation of JNK and ERK, and it was confirmed that bee venom had an effect of preventing cell death.

<실시예 4> 동물 실험군 구성 및 치매유발방법Example 4 Animal Experimental Group Composition and Dementia Induction Method

4-1 동물실험군의 구성4-1 Composition of Animal Experiment Group

실험군은 1주일간 적응 사육시킨 후 무게별로 균등하게 6마리씩 4 그룹으로 나누고, 각 그룹별로 다음과 같이 처치하였다.The experimental group was adapted for one week, and then divided into four groups of six animals evenly by weight, and each group was treated as follows.

(1) Normal 군: β-amyloid 42-1을 쥐의 뇌실내에 주입한 후 , 14일간 생리 식염수를 복강 투여한 군.(1) Normal group: Group injected with physiological saline for 14 days after injecting β-amyloid 42-1 into the ventricles of rats.

(2) Negative control 군: 치매를 유도하기 위해 β-amyloid 1-42를 쥐의 뇌실내에 주입한 후 , 14일간 생리식염수를 복강 투여한 군.(2) Negative control group: Group injected with β-amyloid 1-42 in the ventricles of mice to induce dementia and intraperitoneally for 14 days.

(3) Positive control 군: 치매를 유도하기 위해 β-amyloid 1-42를 쥐의 뇌실내에 주입한 후, 14일간 tacrine (5㎎/㎏) 을 복강 투여한 군.(3) Positive control group: Group injected with tacrine (5 mg / kg) for 14 days after injecting β-amyloid 1-42 into the ventricles of mice to induce dementia.

(4) Ex 군: 치매를 유도하기 위해 β-amyloid 1-42를 쥐의 뇌실내에 주입한 후, 14일간 BV (1㎎/㎏) 를 복강 투여한 군.(4) Ex group: Group in which β-amyloid 1-42 was injected into the ventricles of mice to induce dementia and then intraperitoneally administered BV (1 mg / kg) for 14 days.

4-2 치매 유발 방법4-2 How to Cause Dementia

Normal군을 제외한 나머지 세 군은 뇌 손상을 유발시키기 위해 β-amyloid 1-42 peptide fragments (sigma)를 Laursen & Belknap의 방법33)에 따라 50㎕ Hamilton microsyringe를 이용하여 26 gauge needle로 bregma에 2.4㎚ 깊이로 5㎕를 쥐의 뇌실내에 주입(intracerebroventricular injection ; ICV)하였다. 농도는 기억력 결손에 유의성이 확인된 500pM로 하였다34). All three groups, except the normal group, were treated with β-amyloid 1-42 peptide fragments (sigma) by using a 50 μl Hamilton microsyringe in accordance with Laursen &Belknap's method 33) using a 26 gauge needle at 2.4 nm. 5 μl deep was injected into the mouse ventricle (intracerebroventricular injection (ICV)). Concentration was 500pM in the memory to determine the significance defect 34).

Normal군에는 β-amyloid 42-1(β-amyloid 1-42와 아미노산의 배열을 반대로 하여 같은 분자량을 가지면서도 치매를 유발하지 않도록 만든 것)을 사용하였고 Positive control군에는 치매치료제로 사용되고 있는 Tacrine (sigma)을 이용하였다.In the normal group, β-amyloid 42-1 (having the same molecular weight as that of the beta-amyloid 1-42 in reverse) was used to prevent dementia while having the same molecular weight. sigma) was used.

<실시예 5> Y-maze task 장치를 이용한 행동반응실험Example 5 Behavior Response Experiment Using Y-maze Task Device

5-1 Y-maze task 장치5-1 Y-maze task device

Y-maze task 장치는 Y자형 미로 측정 장치로서 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 25cm, 높이 14cm, 폭 5cm이고 동일한 각도로 위치한다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 하고 7분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 한다 (도 1 참고).The Y-maze task device is a Y-shaped labyrinth measuring device with three arms extending the shape of the letter Y and each branch is 25cm long, 14cm high and 5cm wide and is positioned at the same angle. At the end of one passage of the Y-shaped maze, the head of the experimental animal is pointed and allowed to move freely for 7 minutes (see FIG. 1).

5-2 Y-maze task를 이용한 공간 지각 능력 측정(spontaneous alteration)5-2 Spontaneous alteration using the Y-maze task

동물의 움직임을 교차횟수(alternation)로 나타내는데, 교차횟수란 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때(A, B, C or B, A, C or C, A, B) 한 번 교차한 것으로 정의된다. The movement of the animal is represented by an alternation, which is the intersection of an animal once it passes through three passageways (A, B, C or B, A, C or C, A, B). Is defined.

자발적인 교차 (spontaneous alteration)행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수(즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비이다. 1마리 당 7분간 미로 내 움직임을 측정하였다. 이 spontaneous alteration으로 공간 지각 능력을 측정하였다. Spontaneous alteration behavior is a percentage of the actual number of crossings and the maximum possible number of crossings (ie, the total number of crossings minus two). Intra-maze motion was measured for 7 minutes per animal. The spontaneous alteration was used to measure spatial perception ability.

상기 자발적 교차행동량의 측정 결과, Normal군은 68.3917± 0.88185(%), Negative군은 64.5767± 1.54184(%), Positive군은 67.8217± 1.80735(%), Ex(Bee venom)군은 72.1083± 1.47773(%)를 나타내었다 (도 7). 즉, Ex군이 Negative군에 비해 유의한 증가를 보임을 확인할 수 있었다.As a result of measuring the spontaneous cross-action, the normal group was 68.3917 ± 0.88185 (%), the negative group was 64.5767 ± 1.54184 (%), the positive group was 67.8217 ± 1.80735 (%), and the Ex (Bee venom) group was 72.1083 ± 1.47773 ( %) (FIG. 7). In other words, the Ex group showed a significant increase compared to the negative group.

5-3 Y-maze task를 이용한 운동량 측정(total entry)5-3 Total entry using the Y-maze task

동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 본다. 각 arm 에 들어간 횟수를 모두 더하여 운동량을 측정 할 수 있다. 공간지각능력측정과 동시에 측정하였다.The movement of the animal is recorded and the entry into the passage to the animal's hind paw is considered an arm entry. You can measure the amount of exercise by adding up the number of times you enter each arm. It was measured simultaneously with the spatial perception ability measurement.

상기 운동량의 측정결과, Normal군은 37.1667± 2.37229(회), Negative군은 29.8333± 1.85143(회), Positive군은 28.8333± 2.46869(회), Ex(Bee venom)군은 35.0000± 2.35230(회)를 나타내었다 (도 8). 따라서 각 군간의 유의성 있는 차이는 보이지 않았다.As a result of measuring the momentum, 37.1667 ± 2.37229 (times) for the Normal group, 29.8333 ± 1.85143 (times) for the Negative group, 28.8333 ± 2.46869 (times) for the Positive group, and 35.0000 ± 2.35230 (times) for the Ex (Bee venom) group (FIG. 8). Therefore, no significant difference was found between the groups.

따라서 상기 자발적 교차행동량(spontaneous alteration)을 통해 공간지각능력의 정도를 알 수 있는데 봉독 처리를 한 Ex(Bee venom)군이 치매 유발 후 치료제를 처리하지 않은 Negative군에 비해 유의한 증가를 보임을 확인할 수 있었는 바( 도 7), 이는 봉독으로 공간지각능력의 저하를 막을 수 있음을 보여주는 결과이다.Therefore, the spontaneous alteration can be used to determine the degree of spatial perception ability, and the bee venom (Ex) group treated with bee venom showed a significant increase compared to the nonnegative group without treatment. As confirmed (FIG. 7), this is a result showing that bee venom prevents the decrease of spatial perception ability.

또한 Y-maze task를 이용한 운동량 측정(total entry)에서는 유의성 있는 차이를 보이지 않았는 바, 이러한 결과는 치매가 유발되거나 혹은 호전이 되더라도 공간지각능력의 변화를 보이기는 하나 운동량에서는 차이가 크지 않다는 것을 알 수 있었다.In addition, there was no significant difference in total entry using the Y-maze task. These results show that the spatial perception ability changes even if dementia is induced or improved, but the difference is not large. Could.

<실시예 6> Passive avoidance task 장치를 이용한 행동반응실험Example 6 Behavior Response Experiment Using Passive Avoidance Task Device

6-1 Passive avoidance task 장치6-1 Passive avoidance task device

측정기기의 형태는 내부가 두 개의 방으로 구성된 상자(shuttle box, 53㎝W × 44㎝H × 33㎝D)로서 가운데에는 두 방 사이의 문역할을 하는 guillotine door가 있으며 한쪽 방에는 실험동물이 싫어하는 환경을 만들기 위해 매우 밝은 전구를 달고, 다른 한쪽 방에는 바닥(grid floor)전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다(도 2 참고).The type of measuring device is a two-room box (shuttle box, 53cmW 44cmH × 33cmD), with a guillotine door in the middle, acting as a door between the two rooms. To create a dislike environment, very bright bulbs are attached, and the other room is equipped with a scrambled foot-shock throughout the grid floor (see FIG. 2).

6-2 Training trial6-2 Training trial

Test는 1마리씩 한쪽 방에 넣고 15초간의 탐색시간을 준 뒤, 위에서 조명과 소음을 가하면 가운데의 guillotine door를 통과하여 조용하고 어두운 다른 방(쇼크실)에 도달한다. 쥐가 쇼크실에 들어가면 자동적으로 guillotine door가 닫히면서 전기쇼크가 가해진다. 쇼크는 0.3㎃의 전류를 3초간 통하게 하였으며 쥐가 foot-shock를 받은 후에 꺼내어 home cage에 다시 넣어둔다. 이러한 방법으로 각군마다 각각 6마리에 대하여 전기쇼크를 가하였다. 120초 동안에 쇼크실로 들어가지 않는 쥐는 실험대상에서 제외시켰다.The test is placed in one room and given 15 seconds of search time. After lighting and noise from above, it passes through the guillotine door in the middle to reach another quiet and dark room (shock room). When the rat enters the shock chamber, the guillotine door closes automatically and an electric shock is applied. The shock was allowed to pass 0.3 mA of current for 3 seconds, and after the rat had received a foot-shock, it was taken out and placed back into the home cage. In this way, an electric shock was applied to each of the six animals in each group. Mice that did not enter the shock chamber for 120 seconds were excluded from the subject.

6-3 Retention trial6-3 Retention trial

24시간 후, 위의 training을 받은 쥐에 대해 전기쇼크를 실시했을 때, 약물의 기억증진효과가 있으면 쥐가 전날의 쇼크를 기억하여 쇼크실로 잘 들어가지 않게 된다. 따라서 도달시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억효과가 좋음을 나타낸다. 이 때, 쇼크실 도달시간 (step-through latency time)은 300초 (cut-off time) 까지 측정하였다.24 hours later, when an electric shock was performed on the above trained rats, if the drug had a memory-improving effect, the mice remembered the shock of the previous day and did not enter the shock room well. Therefore, the longer the arrival time, the better the learning and memory effect of passive avoidance. At this time, the step-through latency time was measured up to 300 seconds (cut-off time).

기억력의 정도를 알기위해 상기와 같이 수동회피테스트에서 쇼크실 도달시간(step-through latency time)을 측정한 결과, As a result of measuring the step-through latency time in the manual avoidance test to know the degree of memory,

Normal군은 221.6167± 24.77899 (sec), Negative군은 104.9483± 33.21331 (sec), Positive군은 183.7617± 32.09984 (sec), Ex군은 252.8133± 8.22442 (sec)를 나타내었다 (도 9). 따라서 Negative군이 Normal군에 비해 유의성 있는 감소를 보였고 (P<0.05), Ex군에서 Negative군에 비해 유의성 있는 증가를 보임을 확인할 수 있었다 (P<0.01).Normal group showed 221.6167 ± 24.77899 (sec), negative group showed 104.9483 ± 33.21331 (sec), positive group showed 183.7617 ± 32.09984 (sec), and Ex group showed 252.8133 ± 8.22442 (sec) (FIG. 9). Therefore, the negative group showed a significant decrease compared to the normal group (P <0.05), and the Ex group showed a significant increase compared to the negative group (P <0.01).

즉, 치매 유발 후 치료제를 처리하지 않은 Negative군이 치매를 유발하지 않은 Normal군에 비해 유의성 있는 감소를 보였는데 이는 치매 유발군이 정상보다 기억력의 저하를 보인다는 의미이며, 봉독처리를 한 Ex(Bee venom)군이 Negative군에 비해 유의성 있는 증가를 보였는데 이는 봉독이 기억력 저하를 막는 효과가 있음을 입증하는 것이다. 이러한 결과는 봉독이 β-amyloid로 알츠하이머형 치매를 유발시킨 마우스의 기억력 손상을 막아주는 효과가 있음을 나타낸다. That is, after dementia induction, the Negative group, which was not treated with the treatment, showed a significant decrease compared to the normal group, which did not induce dementia. The Bee venom group showed a significant increase compared to the Negative group, demonstrating that bee venom prevents memory loss. These results indicate that bee venom has a protective effect on the memory impairment in mice that induce Alzheimer's dementia with β-amyloid.

<실시예 7> 면역조직화학염색Example 7 Immunohistochemical Staining

면역조직화학염색법은 조직항원의 존재를 보기 위한 것으로서 원하는 항원이 조직 내에 어느 곳에서 표현되는 지를 localization 시킬 목적으로 행해지는 바, 발현조직의 부위 특히 형태를 밝힐 수 있는 방법으로서 어떤 유전자가 발현될 경우 해당되는 단백질이 세포질 내에 만들어지게 되므로 슬라이드 위의 조직에 그 단백질에 대한 항체 (primary antibody)를 결합시키고 그 항체에 대한 항체 (2차 항체, secondary antibody)에 어떤 표식을 하여 다시 결합시킨 후 그 표식을 검출방법을 이용하여 육안으로 알아볼 수 있게 하는 방법이다. 즉, 특정 단백질이 조직의 어떤 부위에서 발현되는지를 정확히 육안으로 관찰할 수 있는 일종의 분석검사라고 할 수 있다. Immunohistochemical staining is used to look for the presence of tissue antigens and to localize where the desired antigen is expressed in tissues. Since the corresponding protein is made in the cytoplasm, the antibody on the protein (primary antibody) is bound to the tissue on the slide, and the marker on the antibody (secondary antibody) to the antibody is bound again and then the label It is a method that can be visually recognized using the detection method. In other words, it can be said that it is a kind of analytical test that can visually observe exactly where a specific protein is expressed in a tissue.

면역조직화학염색을 위하여, 먼저 β-Amyloide 1-42를 쥐의 뇌실 내에 주입하고 14일 후에 4% PFA로 Transcardially Perfusion한 후 30% 수크로스(sucrose)에 넣어 동결방지(cryoprotected)시키고, -20℃로 유지되는 크리오섹션 마이크로톰 (cryosection microtome)을 사용하여 35㎛로 관상 절개(coronally section)하였다. 절편된 조직들은 cryoprotectant (동결방지제)에 담근 후 -20℃에서 보관하였다35). 항체는 Glial fibrillary acidic protein (rabbit anti-GFAP,1:200, Chemicon)를 사용하였다.For immunohistochemical staining, β-Amyloide 1-42 was first injected into the ventricle of rats, 14 days later, transcardially perfused with 4% PFA, and then cryoprotected in 30% sucrose, -20 Coronally sections were made at 35 μm using a cryosection microtome maintained at &lt; RTI ID = 0.0 &gt; The tissue sections were stored at -20 ℃ immersed in cryoprotectant (cryoprotectant) 35). The antibody used Glial fibrillary acidic protein (rabbit anti-GFAP, 1: 200, Chemicon).

다음으로 PBS에서 코팅 슬라이드에 절편된 조직을 올려놓은 후 3번 PBS로 세척한 후 blocking solution(1% Bovine serum, albumin과 0.2% Triton X-100)을 도포하여 실온에서 30분간 반응시켰다, 3번 PBS로 세척한 후 β-Amyloide를 PBS에 희석하여 도포한 다음 4℃에서 오버나잇시켰다. 다음 날 3번 PBS로 세척해준 후 biotinylated rabbit Secondary β-Amyloide를 도포하여 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 DAB 발색반응을 유도하고, 마지막으로 마운트 용액을 도포하여 커버슬립 을 덮었다. 사진촬영은 Olympus(BX-UCB) microscopy를 이용하였다.Next, the sliced tissue was placed on a coating slide in PBS, washed three times with PBS, and then reacted with a blocking solution (1% Bovine serum, albumin and 0.2% Triton X-100) for 30 minutes at room temperature. After washing with PBS, β-Amyloide was diluted in PBS, applied, and then overnight at 4 ° C. After washing with PBS three times the next day, biotinylated rabbit Secondary β-Amyloide was applied and reacted at room temperature for 2 hours to induce DAB color reaction. Finally, the mount solution was applied to cover the coverslip. Photographing was performed using Olympus (BX-UCB) microscopy.

상기와 같이 봉독이 마우스의 뇌 세포손상을 막는데 기여했는지 알아보기 위해 행동반응 실험에 사용된 마우스의 해마 조직을 적출하여 면역조직화학염색법을 시행하였고, 항체로는 알츠하이머병이나 뇌에 염증이 있을 때 증가하는 단백질로 알려진 GFAP를 선택하여 GFAP staining 결과,In order to determine whether bee venom contributed to the brain cell damage of mice, immunohistochemical staining was performed by extracting hippocampal tissues of mice used in behavioral reaction experiments. Antibodies may be Alzheimer's disease or brain inflammation. When GFAP staining results, by selecting GFAP known as increasing protein

Negative군에서는 GFAP의 염색이 진하게 되었으며, Positive군과 Ex(Bee venom)군에서는 Normal군과 비슷하게 GFAP의 양이 증가하지 않았다 (도 10). 이러한 결과는 BV가 해마 세포의 손상을 억제하는 효과를 보였다는 것을 나타낸다.In the Negative group, GFAP staining was increased, and the amount of GFAP was not increased in the positive group and the Ex (Bee venom) group similar to the normal group (FIG. 10). These results indicate that BV showed an effect of inhibiting damage to hippocampal cells.

Data 분석 및 통계처리Data analysis and statistics processing

모든 측정값은 평균값 ± 표준오차 (mean±S.E.)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 window용 SPSS Program (version 7.5)의 one-way ANOVA로 검정하였으며, p＜0.05인 것을 유의성이 있는 것으로 인정하였다. 사후 검정으로는 Student Newman-Keuls 를 이용하였다.All measured values were expressed as mean ± standard error (mean ± SE), and statistical analysis between each experimental group was tested by one-way ANOVA of SPSS Program (version 7.5) for window, and p <0.05 was significant. Admitted. As a post hoc test, Student Newman-Keuls was used.

결론conclusion

상기 실시예의 결과를 정리해보면, 봉독이 알츠하이머병의 특징인 β-amyloid 단백질로인한 뇌 신경 손상을 억제 할 수 있는가를 알아보기 위하여 mouse의 신경교세포를 배양하여 MTT assay와 JNK 및 ERK에 대한 웨스턴 블랏팅 분석을 하였고 mouse의 행동반응 실험으로 Y-maze task와 Passive avoidance task를 시행하고 해마의 세포활성도 측정실험을 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.To summarize the results of the above example, Western blotting for MTT assay and JNK and ERK by culturing mouse glial cells to determine whether bee venom can inhibit brain nerve damage caused by β-amyloid protein, which is characteristic of Alzheimer's disease. We analyzed the behavioral response of mouse and performed the Y-maze task and passive avoidance task and the cell activity of hippocampus.

1. 봉독은 MTT assay를 통한 세포 활성도 측정에서 BV/Aβ와 Aβ/BV의 순서 모두에서 Aβ로 인한 세포손상을 유의성 있게 억제하였다.1. Bee venom significantly inhibited Aβ-induced cell damage in the order of BV / Aβ and Aβ / BV in cell activity measurement by MTT assay.

2. 봉독은 JNK에 대한 웨스턴 블랏팅 분석에서 Aβ에 의한 JNK의 인산화를 억제하는 효과를 보였다.2. Bee venom showed inhibition of JNK phosphorylation by Aβ in Western blotting analysis.

3. 봉독은 ERK에 대한 웨스턴 블랏팅 분석에서 Aβ에 의한 ERK의 인산화를 억제하는 효과를 보였다.3. Bee venom showed an effect of inhibiting phosphorylation of ERK by Aβ in Western blotting analysis for ERK.

4. 봉독은 Y-maze task에서 자발적 교차행동량을 유의성 있게 증가시켰다.4. Bee venom significantly increased the spontaneous cross action in the Y-maze task.

5. 봉독투여군(Ex군)은 Y-maze task를 이용한 운동량 측정에서 다른 군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.5. The bee venom group (Ex group) did not show any significant difference from the other groups in the exercise measurement using the Y-maze task.

6. 봉독은 Passive avoidance task에서 쇼크실 도달시간을 유의성 있게 증가시켰다.6. Bee venom significantly increased the shock room arrival time in the passive avoidance task.

7. 봉독은 Immunohistochemistry에서 GFAP가 증가하는 것을 억제하였다.7. Bee venom inhibited the increase of GFAP in Immunohistochemistry.

이상의 결과에서 봉독이 β-amyloid로 인한 뇌신경세포의 사멸을 유의성 있게 억제한다는 사실을 알 수 있었고, β-amyloid로 알츠하이머병을 유발시킨 mouse의 행동반응실험에서 기억력 감퇴와 학습능력 저하를 유의성 있게 막을 수 있다는 것을 알 수 있었다. These results indicate that bee venom significantly inhibits the death of β-amyloid-induced cerebral neurons, and significantly prevents memory loss and decreased learning ability in the behavioral response test of mice induced by Alzheimer's disease with β-amyloid. Could see.

본 발명은 상기 실시예를 참고로 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiments, these are merely exemplary, and it will be understood by those skilled in the art that various modifications and equivalent other embodiments are possible. Therefore, the true technical protection scope of the present invention will be defined by the technical spirit of the appended claims.

본 발명은 봉독 (Bee venom)을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 뇌신경세포 손상을 억제하여 알츠하이머병의 예방 및 치료에 이용할 수 있다. The present invention relates to a composition comprising bee venom (Bee venom) as an active ingredient, the composition of the present invention can be used in the prevention and treatment of Alzheimer's disease by inhibiting neuronal cell damage.

도 1은 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하는 Y자형 미로 측정 장치이다. 1 is a Y-shaped labyrinth measuring device extending three passages (arms) to form the letter Y.

도 2는 수동 회피 실험 장치이다. 2 is a passive avoidance experiment apparatus.

도 3과 도 4는 MTT assay 로 일차 신경교세포의 세포활성도에 대한 봉독의 효과에 관한 것이다. 각 값은 평균값 ± 표준오차로 나타내었고, BV/Aβ는 BV의 전처리(도3)를, Aβ/BV는 BV의 후처리(도4)를 나타낸다. 3 and 4 are related to the effect of bee venom on the cell activity of primary glial cells by MTT assay. Each value is expressed as mean ± standard error, BV / Aβ represents pretreatment of BV (FIG. 3), and Aβ / BV represents posttreatment of BV (FIG. 4).

도 3에서는 Aβ처리 세포가 Normal에 비해 O.D.값이 유의성있게 감소하였으며, BV/Aβ순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 O.D.값이 유의성 있게 증가하였음을 보여주고 있으며, 도 4에서는 Aβ처리 세포가 Normal에 비해 유의성있게 O.D.값이 감소하였으며, Aβ/BV순서로 처리한 세포가 Aβ처리 세포에 비해 유의성 있게 증가하였음을 보여주고 있다. In FIG. 3, OD values of Aβ-treated cells were significantly decreased compared to normal, and cells treated in BV / Aβ order showed significantly increased OD values compared to Aβ-treated cells, and in FIG. 4, Aβ-treated cells. OD decreased significantly compared to normal, and the cells treated with Aβ / BV sequence increased significantly compared to Aβ treated cells.

도 5는 β-amyloid 1-42에 의한 JNK의 인산화에 대한 봉독의 효과를 나타내는 것이다.5 shows the effect of bee venom on phosphorylation of JNK by β-amyloid 1-42.

도 6은 β-amyloid 1-42에 의한 ERK의 인산화에 대한 봉독의 효과를 나타내는 것이다.Figure 6 shows the effect of bee venom on phosphorylation of ERK by β-amyloid 1-42.

도 7은 Y-maze task에서 자발적 교차행동량에 대한 봉독의 효과를 나타내는 것으로, Normal군은 68.3917± 0.88185(%), Negative군은 64.5767± 1.54184(%), Positive군은 67.8217± 1.80735(%), Ex(Bee venom)군은 72.1083± 1.47773(%)를 나타내었다. 즉, Ex군이 Negative군에 비해 유의한 증가를 보임을 확인한 것이다. 각 값은 평균값 ± 표준오차로 나타내었다.Figure 7 shows the effect of bee venom on spontaneous cross-acting in the Y-maze task, 68.3917 ± 0.88185 (%) in the Normal group, 64.5767 ± 1.54184 (%) in the Negative group, 67.8217 ± 1.80735 (%) in the Positive group. , Ex (Bee venom) group showed 72.1083 ± 1.47773 (%). In other words, the Ex group showed a significant increase compared to the negative group. Each value is expressed as an average value ± standard error.

도 8은 Y-maze task에서 전체 운동량에 대한 봉독의 효과를 나타내는 것으로, Normal군은 37.1667± 2.37229(회), Negative군은 29.8333± 1.85143(회), Positive군은 28.8333± 2.46869(회), Ex(Bee venom)군은 35.0000± 2.35230(회)를 나타내었다. 따라서 각 군간의 유의성 있는 차이는 보이지 않았다. 각 값은 평균값 ± 표준오차로 나타내었다.Figure 8 shows the effect of bee venom on the total exercise in the Y-maze task, the normal group 37.1667 ± 2.37229 (times), the negative group 29.8333 ± 1.85143 (times), the positive group 28.8333 ± 2.46869 (times), Ex The (Bee venom) group showed 35.0000 ± 2.35230 (times). Therefore, no significant difference was found between the groups. Each value is expressed as an average value ± standard error.

도 9는 수동회피테스트에서 쇼크실 도달시간(step-through latency time)을 측정한 것으로, Normal군은 221.6167± 24.77899 (sec), Negative군은 104.9483± 33.21331 (sec), Positive군은 183.7617± 32.09984 (sec), Ex군은 252.8133± 8.22442 (sec)를 나타낸다. 따라서 Negative군이 Normal군에 비해 유의성 있는 감소를 보였고 (P<0.05), Ex군에서 Negative군에 비해 유의성 있는 증가를 보임을 확인할 수 있었다 (P<0.01).9 is a measure of the step-through latency time in the manual avoidance test, the normal group 221.6167 ± 24.77899 (sec), the negative group 104.9483 ± 33.21331 (sec), the positive group 183.7617 ± 32.09984 ( sec), Ex group represents 252.8133 ± 8.22442 (sec). Therefore, the negative group showed a significant decrease compared to the normal group (P <0.05), and the Ex group showed a significant increase compared to the negative group (P <0.01).

도 10은 마우스 해마에 있는 GFAP에 있어 β-Amyloide 1-42의 유도에 의한 GFAP의 증가를 차단하는지에 대한 봉독의 효과를 나타낸 것이다. Figure 10 shows the effect of bee venom on whether to block the increase in GFAP by induction of β- Amyloide 1-42 in GFAP in mouse hippocampus.

Claims (4)

봉독 (Bee venom)을 유효성분으로 포함하고, 베타 아밀로이드에 의한 뇌신경세포의 사멸을 억제함을 특징으로 하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease comprising bee venom as an active ingredient and inhibiting the death of neurons by beta amyloid. 제1항에 있어서,상기 봉독은 JNK (C-Jun N-terminal kinase)의 인산화를 억제함으로써 JNK의 활성을 억제함을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the bee venom inhibits the activity of JNK by inhibiting phosphorylation of C-Jun N-terminal kinase (JNK). 제1항에 있어서, 상기 봉독은 ERK (Extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 억제함으로써 ERK의 활성을 억제함을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the bee venom inhibits the activity of ERK by inhibiting phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK). 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 주사용액의 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.4. A composition according to any one of claims 1 to 3, wherein said composition is formulated in the form of an injectable solution.
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KR101219551B1 (en) * 2010-01-05 2013-01-11 대한민국 Composition of comprising bee-venoms for Neuroprotective properties
KR20190009592A (en) 2017-07-19 2019-01-29 대한민국(농촌진흥청장) Composition comprising bee venom isolated from Vespa mandarinia worker for prevention or treating Alzheimer's disease

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