KR20090066126A - 면역자기분리 및 면역리포좀을 이용한 살모넬라균의 탐지방법 - Google Patents

면역자기분리 및 면역리포좀을 이용한 살모넬라균의 탐지방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라균(Salmonella spp.)의 탐지방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 면역자기분리(Immunomagnetic Separation; IMS) 및 면역리포좀(Immunoliposomes; IL)을 사용한 식중독의 원인이 되는 살모넬라균의 탐지방법에 관한 것이다. 살모넬라 분리 및 동정에 사용되는 종래의 플레이팅 방법은 일반적으로 3~4일을 필요로 하는 반면에, 본 발명의 IMS/IL 탐지방법은 살모넬라균을 위한 6시간의 선택적 배양이후 완성하는데 4시간을 요구하므로, 살모넬라 탐지를 위한 신속한 방법으로 커다란 가능성을 제시하며, 아울러, 본 발명의 탐지방법은 특이적 면역리포좀을 개발함에 의하여 다양한 병원균을 탐지하는 것을 가능케 하며, 추가적인 실험에 의하여 다양한 식품에 적용될 수 있다.

Description

면역자기분리 및 면역리포좀을 이용한 살모넬라균의 탐지 방법{Detection Method of Salmonella spp. Using Immunomagnetic Separation and Immunoliposomes}
본 발명은 살모넬라균(Salmonella spp.)을 빠르고 민감도 높게 탐지하는 방법에 관한 것이다.
살모넬라균은 육류나 추가적인 처리 없이 섭취되는 가공 식품에서 탐지되어서는 안되는 식중독 세균이다(Korea Food and Drug Administration(KFDA), Food Code, Article 3, 2006). 살모넬라균은 복통, 설사, 구토, 미열, 메스꺼움 및 오한의 원인이 되어 심각한 공중 건강 위험을 야기시킬 수 있으므로(Favrin, S. J., Jassim, S. A., Griffiths, M. W., Int. J. Food Microbiol. 2003, 85, 63-71; Lee, S. B., Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 2003, 23 (2), 161-167), 식품 내에서의 살모넬라균의 탐지는 식품 안전의 보장을 위해 매우 중요하다.
살모넬라를 탐지하기 위한 종래의 방법은, 살모넬라의 성장을 향상시키기 위한 전배양(preenrichment), 비살모넬라 균주의 성장을 억제하기 위한 선택적 배양, 특이적 한천 플레이트에서 분리하여 그람-염색함에 따른 동정, 접 합(agglutination) 테스트, 및 생화학적 테스트로 구성된다. 종래의 방법은 일반적으로 72 내지 96 시간의 총 소요 시간을 필요로 하므로(Mansfield, L., Forsythe, S., Int. J. Food Microbiol. 1996, 29, 41-47; Tan, W., Shelef, L. A., J. Microbiol. Methods 1999, 37, 87-91), 신속하고 민감도 높은 분석 방법을 개발하는 것은 살모넬라균의 탐지에 커다란 도움이 된다.
분석 연구 분야에 있어서, 리포좀은 수십만 종류의 신호-생성 탐지 표지 분자를 운반하는 매개체로서 매우 넓게 응용되어 왔다(DeCory, T. R., Durst, R. A., Zimmerman, S. J., Garringer, L. A., Paluca, G., DeCory, H. H., Montagna, R. A., Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (4), 1856-1864; Kim, M. H., Oh, S. J., Durst, R. A., J. Microbiol. Biotechnol. 2003, 13 (4), 509-516). 이러한 리포좀은 하나 또는 그 이상의 인지질 이중층으로 구성되는 구조를 갖는 구형의 매개체이다(Pentak, D., Sulkowski, W. W., Ma㏏lanka, S., Macromol. Symp. 2006, 245-246, 476-484; Rongen, H. A. H., Bult, A, Van Bennekom, W. P., J. Immunol. Methods 1997, 204, 105-133). 리포좀 내부의 친수성 특성 때문에, 리포좀은 형광 분자를 포함한 다양한 용해 가능한 표지 분자를 둘러쌀 수 있고, 리포좀의 외부는 다양한 생체 인식 화합물에 연결될 수 있다. 리포좀 표면에 항체와 접합되는 면역리포좀(Immunoliposomes; IL)은 항원과 항체 간의 특이적이고 강한 상호작용 때문에 항원에 특이적으로 결합한다. 면역리포좀은 종종 리포좀 면역분석(liposome immunoassays)(Ho, J. A., Hsu, H. W., Anal. Chem. 2003, 75, 4330-4334), 플로우-인젝션 분석(flow-injection assays)(Kim, M. H., Lee, J. S., Shin, W. S., Durst, R. A., Food Sci. Biotechnol. 2003, 12 (4), 430-434), 및 면역자기분리(immunomagnetic separation; IMS)(DeCory, T. R., Durst, R. A., Zimmerman, S. J., Garringer, L. A., Paluca, G., DeCory, H. H., Montagna, R. A., Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (4), 1856-1864; Kim, M. H., Oh, S. J., Durst, R. A., J. Microbiol. Biotechnol. 2003, 13 (4), 509-516)와 결합하여 사용되어 왔다.
혈액과 같은 유체로부터 원하는 세균을 분리하기 위해서는, 항체 접합된 구슬과 같은 고체상이 결합된 구성물을 사용하는 IMS가 적당하다(Olsvik, O., Popovic, T., Skjerve, E., Cudjoe, K. S., Hornes, E., Ugelstad, J., Uhlen, M., Clin. Microbiol. Rev. 1994, 7 (1), 43-54). 항체 결합된 구슬이 배양 배지에 첨가될 때, 항원과 항체 간의 면역학적 상호작용에 의하여 목적 세균이 분리된다(Olsvik, O., Popovic, T., Skjerve, E., Cudjoe, K. S., Hornes, E., Ugelstad, J., Uhlen, M., Clin. Microbiol. Rev. 1994, 7 (1), 43-54). 상기 구슬-결합된 목적 세균은 강한 자기력에 의하여 혼합된 현탁액으로부터 분리되고, 정제되지 않은 대용량의 배양 용액에서 정제된 소용량의 배양 용액으로 농축된다(Olsvik, O., Popovic, T., Skjerve, E., Cudjoe, K. S., Hornes, E., Ugelstad, J., Uhlen, M., Clin. Microbiol. Rev. 1994, 7 (1), 43-54; Grant, I. R., Ball, H. J., Rowe, M. T., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64 (9), 3153-3158). 상기 기법은 살모넬라(Mansfield, L., Forsythe, S., Int. J. Food Microbiol. 1996, 29, 41-47; Liu, Y., Che, Y., Li, Y., Sens. Actuators B 2001, 72, 214-218; Rijpens, N., Herman, L., Vereecken, F., Jannes, G., Smedt, J. D., Zutter, L. D., Int. J. Food Microbiol. 1999, 46, 37-44; Steingroewer, J., Knaus, H., Bley, T., Boschke, E., Eng. Life Sci. 2005, 5 (3), 267-272), 대장균 0157(Escherichia coli O157)(Fu, Z., Rogelj, S., Kieft, T. L., Int. J. Food Microbiol. 2005, 99, 47-57; LeJeune J. T., Hancock, D. D., Besser, T. E., J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (3), 872-875; Liu, Y., Li, Y., J. Microbiol. Methods 2002, 51, 369-377; Ogden, I. D., MacRae, M., Hepburn, N. F., Strachan, N. J., C. Lett. Appl. Microbiol. 2000, 31, 338-341), 리스테리아(Listeria)(Hibi, K., Abe, A., Ohashi, E., Mitsubayashi, K., Ushio, H., Hayashi, T., Ren, H., Endo, H., Anal. Chim. Acta 2006, 573-574, 158-163; Mercanoglu, B., Aytac, S. A., Ergun, M. A., Tan, E. J., Microbiol. 2003, 41 (2), 144-147; Yang, H., Qu, L., Wimbrow, A. N., Jiang, X., Sun, Y., Int. J. Food Microbiol. 2007, 118, 132-138), 스타필로코커스(Staphylococcus)(Chen, L., Deng, L., Liu, L., Peng, Z., Biosens. Bioelectron. 2007, 22, 1487-1492; Yazdankhah, S. P., Solverod, L., Simonsen, S., Olsen, E., Vet. Microbiol. 1999, 67, 113-125), 클로스트리디움(Clostridium)(Cudjoe, K. S., Thorsen, L. I., Sorensen, T., Reseland, J., Olsvik, O., Granum, P. E., Int. J. Food Microbiol. 1991, 12, 313-321; Gessler, F., Hampe, K., Schmidt, M., Bohnel, H., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2006, 56, 225-232), 및 캠필로박터(Campylobacter)(Lamoureux, M., MacKay, A., Messier, S., Fliss, I., Blais, B. W., Holley, R. A., Simard, R. E., J. Appl. Microbiol. 1997, 83, 641-651; Yu, L. S. L., Uknalis, J., Tu, S. I., J. Immunol. Methods 2001, 256, 11-18)를 포함한 특이적 병원성 세균의 탐지에 광범위하게 사용되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 면역자기분리 및 면역리포좀을 사용하여 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역자기분리 및 면역리포좀을 사용하여 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 것이다. 여기서, 상기 리포좀은 변형된 역상 증발방법(modified reverse-phase evaporation method)을 사용하여 제조된 것이다. 리포좀의 입자 크기 및 제타 포텐셜은 이들의 물리적 특성을 관찰하기 위하여 다양한 pH 조건에서 측정되었다. 살모넬라균의 정량적 탐지는 세척 용액 형태, 세척 횟수, 및 리포좀 크기를 변화시켜 수행되었다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역자기분리 및 면역리포좀을 사용한 식중독의 원인이 되는 살모넬라균의 탐지방법을 제공한다.
본 발명에 따른 탐지 방법은 다른 식중독 병원성균의 분석을 위한 중요한 모델로 제공될 수 있으며, 구체적으로 살모넬라 분리 및 동정에 사용되는 종래의 플 레이팅 방법은 일반적으로 3~4일을 필요로 하는 반면에, 본 발명의 IMS/IL 탐지 방법은 살모넬라균을 위한 6시간의 선택적 배양 이후 완료까지 단지 4시간 정도를 요구하므로, 살모넬라 탐지에 신속을 기할 수 있게 되며, 아울러, 상기 탐지 방법은 특이적 면역리포좀을 개발함으로써 다양한 병원균을 탐지하는 것을 가능케 하므로, 추가적인 실험에 의하여 다양한 식품에 적용될 수 있다.
본 발명은 면역자기분리 및 면역리포좀을 사용한 식중독의 원인이 되는 살모넬라균의 탐지 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 대표적인 구성
본 발명의 일 태양에 따르면, 면역자기분리 및 면역리포좀을 사용하여 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, ⅰ) 항-살모넬라 IgG로 코팅된 면역자기 구슬과 살모넬라균이 함유될 수 있는 시료 샘플을 혼합하여 반응시키는 단계; ⅱ) 상기 혼합물에서 자성으로 면역자기 구슬-살모넬라균을 분리하고 세척하는 단계; ⅲ) ⅱ) 단계의 분리된 면역자기 구슬-살모넬라균의 내부에 소정의 형광 물질을 함유시키고 표면에 항-살모넬라 IgG 결합된 면역리포좀을 첨가하는 단계; ⅳ) 상기 혼합물에서 자성으로 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 분리하고 세척하는 단계; ⅴ) 상기 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체에서 소정의 형광 물질을 방출시키는 단계; 및 ⅵ) 상기 방출된 표지 물질의 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 ⅱ) 단계 및 ⅳ) 단계의 세척은 0.1~4% BSA(Bovine Serum Albumin) 또는 2~8% 탈지 우유로 이루어지는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 ⅱ) 단계 및 ⅳ) 단계의 세척은 2~8% 탈지 우유를 사용하고 ⅱ) 단계에서는 1~2번, ⅳ) 단계에서는 2~4번의 세척을 수행하는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 소정의 형광 물질은 SRB(Sulforhodamine B; 설포로다민 B)인 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 SRB의 방출에 사용되는 물질로 OG(Octyl β-d-Glucopyranoside)를 이용하는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 SRB의 형광 강도 측정은 550 ㎚의 여기 파장 및 585 ㎚의 방출 파장으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 면역리포좀은 DPPE를 SATA와 반응시켜 DPPE-ATA를 제조하고, 여기에 DPPC, DPPG, 및 콜레스테롤을 포함하는 지질 혼합물을 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 항-살모넬라 IgG로 코팅된 면역자기 구슬 또는 면역리포좀은 말레이미드(Maleimide) 그룹으로 IgG을 변형(Derivatization)시키고 이것을 SH-포함한 면역자기 구슬 또는 리포좀과 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 면역리포좀은 100 ~ 400 ㎚ 크기인 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법으로서, 상기 면역리포좀은 20 ~ -100 mV의 ζ-포텐셜을 갖는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법이 제공된다.
본 발명의 개괄
살모넬라균을 빠르고 민감도 높게 탐지하는 것은 식중독을 방지하기 위해 중요하다. 본 발명은 면역자기분리 및 면역리포좀을 이용함으로써 살모넬라균의 분석을 위한 신속하고 민감한 탐지 방법을 제공한다. 살모넬라균을 위한 정량적 분 석은 면역자성 비살모넬라균-면역리포좀 복합체로부터 생성된 설포로다민 B(sulforhodamine B)의 형광 강도를 측정함에 의하여 수행되었다. 상기 결과에 따라, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)의 탐지 한계는 2.69× 105 cfu/㎖이었고, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 탐지 한계는 5.24× 103 cfu/㎖이었다. 세척 용액으로 0.5% BSA 대신에 4% 탈지우유(skim milk)를 사용함에 의하여 신호/노이즈 비율이 향상되었다. 또한, 리포좀의 크기가 커질수록 얻어진 형광 강도가 증가하였다. pH 2~10 범위에서는 pH 변화에 의하여 리포좀 입자의 크기가 거의 변화하지 않은 반면에, pH 1에서는 리포좀의 크기가 증가하였다. 리포좀의 ζ-포텐셜 수치는 pH 1~4 범위에서 빠르게 변화하였다. pH 4 이상에서, ζ-포텐셜 수치는 약간 감소하였다. 면역자기 분리/면역리포좀 분석은 살모넬라균의 탐지를 위하여 필요로 되는 총 분석 시간을 상당히 감소시켰다. 그러므로, 상기 분석은 다른 식중독 병원성균의 분석을 위한 중요한 모델로 제공될 수 있다.
본 발명자들은 이전에 보고된 방법을 참조하여 SRB를 함유하는 리포좀을 제조하였다. 구체적으로, DPPE를 SATA와 반응시켜 DPPE-ATA를 형성시킨 후 리포좀의 이중층 내로 삽입시켰는데, DPPE-ATA는 DPPE와 SATA에 클로로포름 내 트리에틸아민을 첨가하여 제조하고, N2 가스하에서 1초음파 처리(sonication) 후 반응시킨다. DPPC 및 콜레스테롤의 지질 혼합물에 클로로포름 및 메탄올을 첨가하여 용해시킨 후, 초음파 처리를 수행하고, DPPE-ATA 및 이소프로필에테르(isopropyl ether)을 상기 지질 혼합물에 첨가한 후, 상기 혼합물을 N2 가스 하에서 초음파 처리시키고 나서, 인캡슐런트 용액(encapsulant solution)을 첨가한 후, N2 가스 하에서 초음파 처리시킨다. 상기 용액을 반응시키고 나서, 막여과기(membrane filters)로 여과(extrusion)시켜, 단일한 크기의 현탄액을 제조함으로써 SRB를 둘러싸는 면역리포좀을 제조한다. 캡슐에 싸여지지 않은(unencapsulated) SRB는 컬럼에서 겔 여과(gel filtering)로 제거된다.
그후, 상기 SRB 함유된 리포좀에 IgG-부착시켰다. 구체적으로, 먼저 말레이미드(Maleimide) 그룹으로 IgG을 변형(Derivatization)시킨다. 이를 위하여, 염소 항-살모넬라(goat anti-Salmonella) IgG를 EDTA 및 NaN3을 포함하는 완충액에 용해시키고, DMSO 및 MeOH의 용매 혼합물에 sulfo-KMUS를 용해시켜 sulfo-KMUS 용액을 제조한 후, sulfo-KMUS 용액을 IgG 용액에 첨가하여 반응시킨다. 여기에 하이드록실아민 하이드로클로라이드(Hydroxylamine hydrochloride)를 첨하여 리포좀위 아세틸티오아세테이트(Acetylthioacetate) 그룹을 탈보호(Deprotection)시킨다.
그리고 나서, SH-포함한 리포좀 용액을 말레이미드-변형된 IgG 용액과 혼합시켜 말레이미드(Maleimide)-변형된 IgG을 리포좀에 결합시킨다. 비결합된 IgG는 컬럼을 사용하여 리포좀으로부터 분리시킨다.
아울러, 본 발명자들은 상기 면역리포좀의 물리적 특성 및 제타 포텐셜을 측정하였다. 먼저, 리포좀의 입자크기는 넓은 pH 범위에서 측정하였다(도 2 참조). pH 2 및 pH 10 사이에서, 상기 리포좀의 직경은 거의 변화하지 않고 0시간에서 A에 대해 160.7 ㎚, B에 대해 178.9 ㎚, 및 C에 대해 178.2 ㎚의 평균 크기로 유지되었다. 24시간 후에, 리포좀의 평균 크기는 24시간에서 A에 대해 160.4 ㎚, B에 대해 179.3 ㎚, 및 C에 대해 176.4 ㎚였다. pH 1에서, 모든 리포좀 입자 크기는 약간 증가하였다. 구체적으로, pH를 조절한 후에 24시간에서 측정된 리포좀의 입자 크기는 빠른 증가를 나타내었다. 한편, 넓은 범위의 pH 값 하에서 ζ-포텐셜l 수치는 pH를 조절한 후에 0 h 및 24 h에서 측정하였다(도 3 참조). 전단 평면에서 전기적 포텐셜로서 ζ-포텐셜은 입자 안정성의 지표이다. 분산된 입자는 유체 내에서 양성 또는 음성 전하를 갖는다. 전기적으로 중성이기 위해서는, 각 입자는 전기적 전하가 반대의 전기적 전하를 갖는 층으로 덮힌 구조로 구성되는 전기적 이중층을 형성한다. 그러므로, ζ-포텐셜 수치는 콜로이드 입자 사이의 전기적 반발력으로부터 발생하는 정적기적 포텐셜 차이를 측정함에 의하여 얻어진다. 리포좀의 ζ-포텐셜은 pH 1~4의 범위에서 빠르게 변화함을 나타내었다. pH 조절 후 0 h 및 24 h에서 측정된 ζ-포텐셜 수치의 그래프 패턴은 거의 유사하였다. 시료의 pH가 증가함에 따라, ζ-포텐셜 수치는 감소하는 경향을 나타내었다. ζ-포텐셜 수치는 pH 1 및 pH 4 사이에서 빠르게 감소하였고, pH 4 및 pH 10 사이에서는 -70 ~ -80 mV 주위에서 편탄한 부위를 가지며 점차 감소하였다.
본 발명의 IMS 및 IL 분석(IMS/IL)을 위한 절차는 도 1에 기재된다. 배양액으로부터 살모넬라균을 포획하기 위하여 항-살모넬라(anti-Salmonella) IgG로 코팅된 자기 구슬을 사용한다. 면역자기 구슬을 튜브 내에 첨가하고 나서, 연속적으로 희석된 용액을 튜브에 첨가하여 반응시킨 후 상청액을 제거한다. 면역자기 구슬- 살모넬라균 복합체를 트윈(Tween) 20을 포함하는 인산완충식염수(phosphate buffered saline)로 세척한 후, 반복된 농축 및 세척(세척 단계 Ⅰ)을 수행한다. 희석된 IgG-부착된 리포좀을 튜브에 첨가한다. 상기 혼합액을 반응시켜 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 형성시킨다. 그리고 나서, 상기 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 세척 용액(세척 단계 Ⅱ)으로 세척한다. 최종적으로, OG 용액을 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체에 첨가하여 방출된 SRB를 포함하는 상청액을 550 ㎚의 여기 파장 및 585 ㎚의 방출 파장에서 형광 강도를 측정한다.
세포수와 형광 강도 사이의 정량적 관계를 측정하기 위한 살모넬라균에 대한 용량-반응곡선(dose-response curve)을 얻기 위하여, S. enteritidis 및 S. typhimurium를 사용하여 IMS/IL 분석을 수행하였다. 살모넬라균의 다른 형태의 다양한 농도에서 용량-반응곡선의 결과를 얻었다(도 4 참조). 여기서, 상기 신호는 S. typhimurium에 대한 103 cfu/㎖ 및 S. enteritidis에 대한 104 cfu/㎖에까지 거의 변화하지 않았고, 상기 범위 이상에서 상기 신호는 107 cfu/㎖까지 증가하기 시작하였다. 107 cfu/㎖ 이상에서, 상기 신호는 후드 효과(hook effect) 때문에 감소하였는데, 이것은 다량의 항원이 존재할 때, 억제된 항원-항체 반응에 의한 항원 탐지 신호에 대한 낮은 수치를 나타낸다. S. enteritidis 및 S. typhimurium에 대한 탐지 한계는 각각 2.69× 105 cfu/㎖ 및 5.24× 103 cfu/㎖ 이었다.
또한, 신호 대 노이즈(S/N) 비율이 향상되는지 여부를 확인하기 위하여, IMS/IL 분석에서 다양한 세척 용액의 효율 효과를 측정하였다(도 5 참조). 2% BSA 및 4% 탈지 우유를 사용함에 의하여, S/N 비율은 각각 41.71 및 58.64로 증가하였다. 2% BSA 세척 용액은 시험된 BSA 용액 중에서 가장 높은 S/N 비율을 가졌으며, 4% BSA, 1% BSA, 0.5% BSA, 및 0.1% BSA가 뒤를 이었다. 4% 탈지 우유 세척 용액은 시험된 탈지 우유 중에서 가장 높은 S/N 비율을 가졌으며, 6% 탈지 우유, 2% 탈지 우유, 및 8% 탈지 우유가 뒤를 이었다.
S/N 비율이 향상되는지 여부를 확인하기 위하여, IMS/IL 분석에서 세척 수의 효과를 측정하였다. 본 발명에서 세척 용액의 역할은 비결합된 위치를 차단함에 의하여 비-특이적 항원 결합을 억제하는 것뿐만 아니라 단계 Ⅰ에서 자유 세포를, 단계 Ⅱ에서 면역리포좀을 제거하는 것이다(도 1 참조). 최적의 IMS/IL 분석을 확립하기 위하여, 단계Ⅰ 및 Ⅱ에서 세척수를 변화시키 결과 b(1&2), c(1&3), 및 d(1&4) 조건은 높은 S/N 비율을 나타낸다(도 6 참조).
다양한 입자 크기의 리포좀을 사용함에 의하여 민감도가 향상되는지 여부를 조사하기 위하여, IMS 분석에서 리포좀 크기의 효과를 S. typhimurium에 대한 용량-반응을 통하여 측정하였다(도 7 참조). 리포좀 A, B, 및 C에 관한 평균 입자 크기는 각각 159.7 ± 0.3 ㎚, 179.3 ± 0.2 ㎚, 및 173.8 ± 1.5 ㎚이었다. 리포좀의 크기가 증가함에 따라, 리포좀에 캡슐에 싸인 SRB 분자수가 보다 높아지므로 보다 높은 형광 신호가 얻어졌다. 159.7 ± 0.3 ㎚ 리포좀이 사용되었을 때, 탐지 한계는 2.78× 104 cfu/㎖이었다. 173.8 ± 1.5 ㎚ 및 179.3 ± 0.2 ㎚의 리포좀이 사용되었을 때, 탐지 한계는 각각 8.42× 103 cfu/㎖ 및 3.15× 103 cfu/㎖이었다. 리포좀 입자 크기가 커질수록, 탐지 한계는 향상되었다.
결국, 본 발명의 IMS/IL 분석은 살모넬라균을 위한 6시간의 선택적 배양 이후 완료까지 4시간 정도를 요구하므로, 살모넬라 탐지를 위한 가장 신속한 방법이다. 아울러, 본 탐지 방법에 따르면, 특이적 면역리포좀을 개발함으로써 다양한 병원균을 탐지할 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 실시예
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
<실시예 1> 시약, 재료 및 통계분석
<1-1> 시약 및 재료
본 발명자들은 설포로다민 B(Sulforhodamine B; SRB)는 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 구입하였다. DPPE(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-pohosphoethanolamine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPG(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(l-glycerol)]), 미니-압출 기(mini-extruder), 및 폴리카보네이트 막여과기(polycarbonate membrane filters)(0.4 and 0.8 ㎛)는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)로부터 구입하였다. SATA(N-succinimidyl-s-acetylthioacetate), sulfo-KMUS(N-[k-maleimidoundecanoyloxy] sulfosuccinimide), 및 하이드록실아민 하이드로클로라이드(hydroxylamine hydrochloride)는 Pierce(Rockford, IL)로부터 구입하였다. 친화성(Affinity) 정제된 폴리클로날 염소 항-살모넬라(polyclonal goat anti-Salmonella) IgG는 Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. 트리에틸아민, 클로로포름, 콜레스테롤, 메탄올, 이소프로필 에테르, 세파덱스(Sephadex) G50-150, 세파로스(Sepharose) CL-4B, 슈크로스, 소듐아지드(sodium azide), 소듐클로라이드(sodium chloride), 단염기 포타슘포스페이트(potassium phosphate monobasic), 2염기 포타슘포스페이트(potassium phosphate dibasic), EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid), BSA(bovine serum albumin), OG(octyl β-d-glucopyranoside), 및 트윈(Tween) 20은 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. NB(Nutrient broth), 탈지 우유, 및 펩톤은 Difco Laboratories(Detroit, MI)로부터 구입하였다. 자기구슬 항-살모넬라(Dynabeads anti-Salmonella) IgG 및 자기입자 농축기(magnetic particle concentrator; MPC)는 Dynal Inc.(Lake Success, NY)로부터 구입하였다. 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) ATCC 4931 및 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium) ATCC 13311은 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 얻었다. 입자 크기 측정을 위한 표준 용액은 Duke Scientific Co.(Palo Alto, CA)로부터 얻었다. 제타 포텐셜 측정을 위한 표준 용액은 Malvern Instruments Ltd.(Malvern, Worcestershire, UK)로부터 얻었다.
<1-2> 통계 분석 및 안전 고려
살모넬라균의 탐지 한계는 블랭크(blank) 시료의 평균(plus 3 standard deviations) 형광 신호에 대한 각각의 용량-반응곡선으로 적응시킨 보간(interpolation)으로 측정하였다(DeCory, T. R., Durst, R. A., Zimmerman, S. J., Garringer, L. A., Paluca, G., DeCory, H. H., Montagna, R. A., Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (4), 1856-1864).
또한, S. enteritidis 및 S. typhimurium는 인체에 식중독의 원인이 될 수 있는 병원균이다. 리포좀의 제조를 위한 유기 용매의 사용은 화학 후드(chemical hood)에서 외과용 장갑을 착용하고 수행되어야 한다. 살모넬라균-오염된 실험기구는 습윤 멸균 후에 폐기되었다.
<실시예 2> SRB-캡슐에 싸인 리포좀의 제조
본 발명자들은 이전에 보고된 방법(Kim, M. H., Oh, S. J., Durst, R. A., J. Microbiol. Biotechnol. 2003, 13 (4), 509-516; Kim, M. H., Lee, J. S., Shin, W. S., Durst, R. A., Food Sci. Biotechnol. 2003, 12 (4), 430-434)을 참조하여 리포좀을 제조하였다. 리포좀 제조를 위하여, DPPE, DPPC, DPPG, 및 콜레스테롤을 사용하였다. 먼저, DPPE를 SATA와 반응시켜 DPPE-ATA를 형성시킨 후 리포좀의 이중층 내로 삽입시켰다. DPPE-ATA는 DPPE 5 ㎎과 SATA 3.5 ㎎에 클로로포 름 내 0.7%(v/v) 트리에틸아민 1 ㎖을 첨가하여 제조하였다. N2 가스 하 45 ℃에서 1분 동안의 초음파 처리(sonication) 후에, 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 셰이커(shaker) 위에서 반응시켰다. 트리에틸아민을 제거하기 위하여, 클로로포름 2 ㎖을 첨가하고 진공 하 45℃에서 증발시켰다. 클로로포름 1 ㎖을 DPPE-ATA 용액에 첨가하였다.
DPPC 29.6 ㎎ 및 콜레스테롤 15.8 ㎎의 지질 혼합물에 클로로포름 3 ㎖ 및 메탄올 0.5 ㎖을 첨가하여 용해시킨 후, 45℃에서 1분 동안 초음파 처리를 수행하였다. DPPE-ATA 0.5 ㎖ 및 이소프로필에테르(isopropyl ether) 3 ㎖을 상기 지질 혼합물에 첨가한 후, 상기 혼합물을 N2 가스 하 45 ℃에서 1분 동안 초음파 처리시켰다. 그리고 나서, 즉시 인캡슐런트 용액(encapsulant solution)(100 mM SRB in 0.02 M HEPES buffer, pH 7.5) 2 ㎖을 첨가한 후, 상기 혼합물을 N2 가스 하 45℃에서 3분 동안 초음파 처리시켰다. 상기 유기 용매는 45℃에서 증발에 의해 제거되었다. 추가적인 인캡슐런트 2 ㎖을 첨가한 후, 1분 동안 초음파 처리를 행하고, 균일한 용액이 형성될 때까지 격렬한 혼합(Vortexing), 증발, 및 초음파 처리를 교대로 반복하였다. 상기 용액을 45 ℃에서 10분 동안 반응시키고 나서, 그것을 0.4 및 0.8 ㎛ 막여과기(membrane filters)를 통하여 여과(extrusion)시켜, 단일한 크기의 현탄액을 제조하였다. 캡슐에 싸여지지 않은(unencapsulated) SRB는 0.2 M NaCl, 0.01% NaN3, 및 0.03 M 슈크로스를 포함하는 0.01 M HEPES 완충액(pH 7.5)로 평형화된 세파덱스 G-50-150 컬럼(1.5× 20 ㎝)에서 겔 여과(gel filtering)로 제 거되었다. 4℃ 암실에서 0.2 M NaCl, 0.01 % NaN3, 및 0.03 M 슈크로스를 포함하는 동일한 0.01 M HEPES 완충액(pH 7.5)에 대하여 상기 리포좀 용액을 하룻밤 동안 투석하였다.
<실시예 3> 말레이미드(Maleimide) 그룹으로 IgG의 변형(Derivatization)
본 발명자들은 DeCory 등(DeCory, T. R., Durst, R. A., Zimmerman, S. J., Garringer, L. A., Paluca, G., DeCory, H. H., Montagna, R. A., Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (4), 1856-1864) 및 Kim 등(Kim, M. H., Oh, S. J., Durst, R. A., J. Microbiol. Biotechnol. 2003, 13 (4), 509-516)의 방법에 의하여 IgG-부착된 리포좀을 제조하였다. 염소 항-살모넬라(goat anti-Salmonella) IgG 1 ㎎을 1 mM EDTA 및 0.01% NaN3을 포함하는 pH 7.8의 0.05 M 포타슘포스페이트 완충액 1 ㎖에 용해시켰다. DMSO 및 MeOH(2:1, v/v)의 용매 혼합물 0.1 ㎖에 sulfo-KMUS 2 ㎎을 용해시켜 sulfo-KMUS 용액을 제조하였다. 다음에, sulfo-KMUS 용액 2.25 ㎕를 IgG 용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 셰이커 위에서 반응시켰다. 4℃ 암실에서 0.15 M NaCl 및 0.01% NaN3를 포함하는 0.02 M HEPES 완충액(pH 7.0)에서 변형된 IgG를 하룻밤 동안 투석시켰다.
<실시예 4> 리포좀위 아세틸티오아세테이트(Acetylthioacetate) 그룹의 탈보호(Deprotection)
본 발명자들은 25 mM EDTA를 포함하는 0.1 M HEPES 용액(pH 7.5)에 용해시킨 하이드록실아민 하이드로클로라이드(Hydroxylamine hydrochloride)(0.5 M)를 1:10 의 부피비로 리포좀 용액에 첨가하였다. 상기 혼합 용액을 1분 동안 N2 가스로 플러쉬(flush)시키고 나서 실온에서 2시간 동안 셰이커 위에서 반응시켰다.
<실시예 5> SH-포함한 리포좀과 말레이미드-변형된 IgG의 결합
본 발명자들은 0.5 M HEPES 용액을 첨가하여 SH-포함한 리포좀 용액의 pH를 7.0으로 조정하고, 그리고 나서 SH-포함한 리포좀 용액을 말레이미드-변형된 IgG 용액과 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 N2 가스로 플러쉬하고 나서, 실온에서 4시간 동안 셰이커 위에서 반응되도록 한 후, 4℃ 암실에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응되지 않은 설프하이드릴(sulfhydryl) 그룹은 0.15 M NaCl 및 0.01% NaN3로 이루어지고 0.09 M 슈크로스를 포함하는 0.02 M TBS(Tris-buffered saline)(pH 7.0)내 100 mM 에틸말레이미드(ethylmaleimide)를 첨가하여 켄치(quench)시켰다. 비결합된 IgG는 0.02 M TBS로 평형화된 세파로스(Sepharose) CL-4B 컬럼(1.5× 18 ㎝)위 IgG-부착된 리포좀으로부터 분리되었다. IgG-부착된 리포좀 용액을 4℃ 암실에서 0.02 M TBS에 대하여 하룻밤 동안 투석시키고, 그리고 나서 면역리포좀의 바람직한 분획을 수집하였다.
<실시예 6> 리포좀의 물리적 특성 및 제타 포텐셜의 결정
본 발명자들은 리포좀 입자 크기 및 제타 포텐셜(ζ-potential)을 측정하기 위하여, 리포좀 용액을 0.01M HEPES 완충액(pH 7.5)으로 희석하였다. 입자 크기 및 ζ-포텐셜은 5.0 버전 소프트웨어를 포함한 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.)을 사용하여, 동적 광분산 분석(dynamic light scattering analysis)에 의하여 25℃에서 측정하였다.
<6-1> 리포좀의 입자 크기
다양한 pH 조건에서 리포좀의 특성을 조사하기 위하여, 입자 크기를 측정하였다. 리포좀에 대한 1.45의 굴절율, 분산제(dispersant)(HEPES 완충액)에 대한 1.33의 굴절율, 및 분산제의 0.8872 cP의 점도(viscosity)가 시료의 측정에 사용되었다(Ardhammar, M., Lincoln, P., Norden, B., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99 (24), 15313-15317; Blessing, T., Remy, J. S., Behr, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 1427-1431; Marcelino, J., Lima, J. L. F. C., Reis, S., Matos, C., Chem. Phys. Lipids 2007, 146, 94-103; Matos, C., de Castro, B., Gameiro, P., Lima, J. L. F. C., Reis, S., Langmuir 2004, 20, 369-377; van Winden, E. C. A., Crommelin, D. J. A., J. Control. Release 1999, 58, 69-86). 리포좀을 포함하는 분산제의 pH는 1 N HCl 및 0.1 N NaOH를 사용하여 조절하였다. 넓은 pH 범위에서의 리포좀의 입자 크기는 도 2에 제시된다. pH 2 및 pH 10 사이에서, 상기 리포좀의 직경은 거의 변화하지 않고 0시간에서 A에 대해 160.7 ㎚, B에 대해 178.9 ㎚, 및 C에 대해 178.2 ㎚의 평균 크기로 유지되었다. 24시간 후에, 리포좀의 평균 크기는 24시간에서 A에 대해 160.4 ㎚, B에 대해 179.3 ㎚, 및 C에 대해 176.4 ㎚였다. pH 1에서, 모든 리포좀 입자 크기는 약간 증가하였다. 구체적으로, pH를 조절한 후에 24시간에서 측정된 리포좀의 입자 크기는 빠른 증가를 나타내었다. Thompson 등은 넓은 pH 범위 하에서 MFGM(milk fat globule membrane) 인지질 리포좀은 대두(soya) 인지질 리포좀보다 안정하다고 보 고하였다(Thompson, A. K., Haisman, D., Singh, H. J., Agric. Food Chem. 2006, 54, 6390-6397). 본 발명에서, MFGM 인지질 리포좀의 입자 크기는 전체 pH 범위에 걸쳐 95 ㎚의 평균 직경을 유지하였다. 반대로, 대두 인지질의 평균 직경은 pH 6 및 pH 10사이에서 80 ㎚이었고, pH 6이하에서 그것은 모든 시료 내에서 빠르게 증가하였다.
<6-2> 제타 포텐셜
다양한 pH 조건에서 리포좀의 특성을 확인하기 위하여, ζ-포텐셜을 측정하였다. 리포좀을 포함하는 분산제의 pH는 1 N HCl 및 0.1 N NaOH를 사용하여 조절하였다. ζ-포텐셜l 수치는 pH를 조절한 후에 0 h 및 24 h에서 측정하였다. 전단 평면에서 전기적 포텐셜로서 ζ-포텐셜은 입자 안정성의 지표이다(Roy, M. T., Gallardo, M., Estelrich, J. J., Colloid Interface Sci. 1998, 206, 512-517). 분산된 입자는 유체 내에서 양성 또는 음성 전하를 갖는다(Kim, O. R., Preparation and stabilization of silver nanoparticles by alcohol reduction with polymeric stabilizers. MS Thesis, Hankyong National University, 2002). 전기적으로 중성이기 위해서는, 각 입자는 전기적 전하가 반대의 전기적 전하를 갖는 층으로 덮힌 구조로 구성되는 전기적 이중층을 형성한다(Kim, O. R., Preparation and stabilization of silver nanoparticles by alcohol reduction with polymeric stabilizers.MS Thesis, Hankyong National University, 2002). 그러므로, ζ-포텐셜 수치는 콜로이드 입자 사이의 전기적 반발력으로부터 발생하는 정전기적 포텐셜 차이를 측정함으로써 얻어진다. 넓은 범위의 pH 값 하에서, 리포좀의 ζ-포텐셜은 도 3에 제시된다. 본 발명에서, 리포좀의 ζ-포텐셜은 pH 1~4의 범위에서 빠르게 변화함을 나타내었다. pH 조절 후 0 h 및 24 h에서 측정된 ζ-포텐셜 수치의 그래프 패턴은 거의 유사하였다. 시료의 pH가 증가함에 따라, ζ-포텐셜 수치는 감소하는 경향을 나타내었다. ζ-포텐셜 수치는 pH 1 및 pH 4 사이에서 빠르게 감소하였고, pH 4 및 pH 10 사이에서는 -70 ~ -80 mV 주위에서 편탄한 부위를 가지며 점차 감소하였다. Thompson 등(Thompson, A. K., Singh, H. J., Dairy Sci. 2006, 89, 410-419)에 의하여 보고된 바에 따르면, MFGM 인지질 리포좀 분산은 pH 3 이상에서 음성 포텐셜을, pH 5 및 pH 10 사이에서 대략 -65 mV의 일정한 포텐셜을 나타내었다. 음성 전하를 띤 인지질의 존재는 음성 ζ-포텐셜의 원인이 된다고 간주되었다.
<실시예 7> 살모넬라균의 배양 조건
본 발명자들은 S. enteritidis 및 S. typhimurium을 셰이킹과 함께 35℃에서 18시간 동안 NB에서 배양하였다. 살아있는 세포 수를 측정하기 위하여, 0.1% 박토 펩톤수(bacto peptone water BPW)으로 배양액을 연속적으로 희석시켰다. 적절히 희석된 배양 용액을 NA(nutrient agar) 플레이트에 도포하고 35℃에서 24시간 동안 배양하였다. NA 플레이트에 형성된 콜로니를 카운트하고 밀리리터당 콜로니-형성 단위(colony-forming units per milliliter ; cfu/㎖)로 나타내었다.
<실시예 8> 면역자기분리 및 면역리포좀 분석을 위한 절차
IMS 및 IL 분석(IMS/IL)을 위한 절차는 도 1에 기재하였다. 배양액으로부터 살모넬라균을 포획하기 위하여 항-살모넬라 IgG로 코팅된 자기 구슬을 사용하였다. 면역자기 구슬의 20 ㎖을 튜브 내에 첨가하고 나서, 연속적으로 희석된 용액의 각각 1 ㎖을 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 실온에 1시간 동안 셰이커 위에서 반응시키고, 3분 동안 MPC에 놓아 둔 후, 상청액을 피펫팅에 의하여 제거하였다. 면역자기 구슬-살모넬라균 복합체를 0.15 M NaCl, 0.01% NaN3, 및 0.05% 트윈(Tween) 20을 포함하는 0.01 M 인산완충식염수(phosphate buffered saline) 1 ㎖로 세척하였다. 그리고 나서, 다시 상기 튜브를 3분 동안 MPC에 놓아 둔 후, 반복된 농축 및 세척(세척 단계 Ⅰ)을 수행하였다. 희석된 IgG-부착된 리포좀 70 ㎖을 튜브에 첨가하였다. 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 형성시키기 위하여, 계속적인 회전 하의 실온에서 1 시간 동안 상기 혼합액을 반응시켰다. 그리고 나서, 상기 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 세척 용액(세척 단계 Ⅱ)으로 세척하였다. 최종적으로, 30 mM OG 용액 280 ㎕를 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체에 첨가하고, 격렬하게 혼합(vortex)하였다. 방출된 SRB를 포함하는 상청액 260 ㎕를 96-웰에 이전시켰다. 최종적으로, 550 ㎚의 여기 파장 및 585 ㎚의 방출 파장에서 형광 강도를 측정하였다.
<8-1> 살모넬라균에 대한 용량-반응곡선(dose-response curve)
세포 수와 형광 강도 사이의 정량적 관계를 측정하기 위하여, S. enteritidis 및 S. typhimurium를 사용하여 IMS/IL 분석을 수행하였다. 0.02 M TBS 내 0.5% BSA을 세척용액(wash solution)으로 사용하였다. 세척 단계 Ⅰ에서의 두 번의 세척 및 세척 단계 Ⅱ에서의 세 번의 세척을 상기 분석에 적용하였다. 살 모넬라균의 다른 형태의 다양한 농도에서 용량-반응곡선의 결과는 도 4에 제시된다. 여기서, 상기 신호는 S. typhimurium에 대한 103 cfu/㎖ 및 S. enteritidis에 대한 104 cfu/㎖까지 거의 변화하지 않았고, 상기 범위 이상에서 상기 신호는 107 cfu/㎖까지 증가하기 시작하였다. 107 cfu/㎖ 이상에서, 상기 신호는 후드효과(hook effect) 때문에 감소하였는데, 이것은 다량의 항원이 존재할 때, 억제된 항원-항체 반응에 의한 항원 탐지 신호에 대한 낮은 수치를 나타낸다(Furuya, Y., Cho, S., Ohta, S., Sato, N., Kotake, T., Masai, M. J., Urol. 2001, 166, 213; Davies, C., In The immunoassay handbook Wild, D., Ed.; Macmillan Press: London, 1994; pp 92). S. enteritidis 및 S. typhimurium에 대한 탐지 한계는 각각 2.69× 105 cfu/㎖ 및 5.24× 103 cfu/㎖ 이었다.
<8-2> IMS/IL 분석에서 세척 용액의 효과
신호 대 노이즈(S/N) 비율이 향상되는지 여부를 확인하기 위하여, 두 종류의 세척 용액을 사용하여 IMS/IL 분석을 수행하였다. 본 발명에서, 최적 분석을 확립하기 위하여, BSA 및 탈지 우유의 다양한 농도를 사용함에 의하여 상기 세척 조건을 변화시켰다. 다양한 세척 용액의 효율을 도 5에 제시한다. 2% BSA 및 4% 탈지 우유를 사용함에 의하여, S/N 비율은 각각 41.71 및 58.64로 증가하였다. 2% BSA 세척 용액은 시험된 BSA 용액 중에서 가장 높은 S/N 비율을 가졌으며, 4% BSA, 1% BSA, 0.5% BSA, 및 0.1% BSA가 뒤를 이었다. 4% 탈지우유 세척 용액은 시험된 탈 지 우유 중에서 가장 높은 S/N 비율을 가졌으며, 6% 탈지 우유, 2% 탈지 우유, 및 8% 탈지 우유가 뒤를 이었다. 탈지 우유가 비특이적 반응을 감소시킴에 있어서 보다 효과적이라는 것을 발견한 것은 말할 것도 없고, 본 발명에서 사용된 BSA는 탈지 우유보다 50배 비쌌다. 이러한 이유로, IMS/IL 분석에 4% 탈지 우유를 사용하였다. 유사하게, Vermunt 등은 Aeromonas hydrophila와 함께 배양하였을 때 배지로부터 Salmonella livingstone의 회복에 0.1% BSA 대신에 4% 탈지 우유를 사용함에 의하여 비특이적 반응을 감소시킬 수 있음을 보고하였다(Vermunt, A. E. M., Franken, A. A. J. M., Beumer, R. R., J. Appl. Bacteriol. 1992, 72, 112-118).
<8-3> IMS/IL 분석에서 세척 수의 효과
S/N 비율이 향상되는지 여부를 확인하기 위하여, 세척 수를 변화시킴에 의하여 IMS/IL 분석을 수행하였다. 본 발명에서 세척 용액의 역할은 비결합된 위치를 차단함에 의하여 비-특이적 항원 결합을 억제하는 것뿐만 아니라 단계 Ⅰ에서 자유세포를, 단계 Ⅱ에서 면역리포좀을 제거하는 것이었다(도 1). 최적의 IMS/IL 분석을 확립하기 위하여, 도 1에 묘사한 바와 같이, 단계Ⅰ 및 Ⅱ에서 세척 수를 변화시켰고, 세척 용액으로 4% 탈지 우유를 사용하였다. 도 6에 제시한 바와 같이, b(1&2), c(1&3), 및 d(1&4) 조건은 높은 S/N 비율을 나타내었다. c 및 d의 조건이 장시간의 분석을 필요로 하기 때문에, IMS/IL 분석을 위하여 조건 b(one time washing at step Ⅰ and two times washing at step Ⅱ)를 선택하였다. 다른 보고(Kumar, S., Balakrishna, K., Singh, G. P., Batra, H. V., World J. Microbiol. Biotechnol. 2005, 21, 625-628)에서 언급된 바와 같이, 세척 단계를 부가하는 것은 목적 세균의 낮은 수준의 회복 및 손실의 원인이 될 수 있다.
<8-4> IMS 분석에서 리포좀 크기의 효과
또한, 다양한 입자 크기의 리포좀을 사용함에 의하여 민감도가 향상되는지 여부를 조사하기 위하여, IMS/IL 분석을 수행하였다. 이 실험을 위하여, 세척 용액으로 0.02 M TBS 내 4% 탈지 우유를 사용하였다. 세척 단계 Ⅰ에서 한 번의 세척 및 세척 단계 Ⅱ에서 두 번의 세척을 적용하였다. 리포좀의 다른 크기를 사용하여 S. typhimurium에 대한 용량-반응은 도 7에 제시된다. 리포좀 A, B, 및 C에 관한 평균 입자 크기는 각각 159.7 ± 0.3 ㎚, 179.3 ± 0.2 ㎚, 및 173.8 ± 1.5 ㎚이었다. 리포좀의 크기가 증가함에 따라, 리포좀에 캡슐에 싸인 SRB 분자수가 보다 높아지므로 보다 높은 형광 신호가 얻어졌다. 159.7 ± 0.3 ㎚ 리포좀이 사용되었을 때, 탐지 한계는 2.78× 104 cfu/㎖이었다. 173.8 ± 1.5 ㎚ 및 179.3 ± 0.2 ㎚의 리포좀이 사용되었을 때, 탐지 한계는 각각 8.42× 103 cfu/㎖ 및 3.15× 103 cfu/㎖이었다. 리포좀 입자 크기가 커질수록, 탐지 한계는 향상되었다.
최종적으로, 살모넬라 분리 및 동정의 종래의 플레이팅 방법은 일반적으로 3~4일을 필요로 한다. 본 발명에서, IMS/IL 분석은 살모넬라균을 위한 6시간의 선택적 배양 이후 완료까지 4시간을 요구하였다. IMS/IL 분석은 살모넬라 탐지를 위한 신속한 방법으로 커다란 가능성을 갖는다. 또한, 상기 분석은 특이적 면역리포좀을 개발함에 의하여 다양한 병원균을 탐지하는 것을 가능케 한다. 추가적인 연구를 위하여, 다양한 식품에의 적용이 요구된다.
도 1은 IMS/IL 분석을 위한 절차이다.
도 2는 넓은 pH 범위 하에서 리포좀의 입자 크기의 변화를 나타낸 그래프로, A, B, 및 C는 사용된 리포좀의 다른 크기를 나타낸다. pH 7.0에서 평균 크기는 A의 경우 159.7 ± 0.3 nm, B의 경우 179.3 ± 0.2 nm, 및 C의 경우 173.8 ± 1.5 nm이었다. 상기 시료의 입자 크기는 pH를 조절한 후 0 h (A) 및 24 h (B)에서 측정하였다. 각 점은 오차 막대 ± 1 표준편차를 갖는 세 측정의 평균이다.
도 3은 넓은 pH 범위 하에서 리포좀의 ζ-포텐셜의 변화를 나타낸 그래프로, A, B, 및 C는 pH 7.0에서 다양한 입자 크기를 갖는 리포좀을 나타낸다(A: 159.7 ± 0.3 nm, B: 179.3 ± 0.2 nm, C: 173.8 ± 1.5 nm). 시료의 ζ-포텐셜은 각각 pH를 조절한 후 0 h (A) 및 24 h (B)에서 측정하였다. 각 점은 오차 막대 ± 1 표준편차를 갖는 세 측정의 평균이다.
도 4는 S. enteritidis 및 S. typhimurium에 대한 용량-반응곡선을 나타낸 그래프로, 159.7 ± 0.3 nm의 입자 크기를 갖는 리포좀이 사용되었다. 데이터는 세 실험의 평균(± SD) 형광 강도를 나타낸다.
도 5는 IMS/IL 분석에서 세척 용액의 효과를 나타낸 그래프로, 0.02 M TBS (A) 및 0.02 M TBS 내 탈지 우유 (B) 내 BSA를 세척 용액으로 사용하였다. S. typhimurium의 순수 배양액을 사용하였다. 세척 단계 Ⅰ에서 한 번의 세척 및 세척 단계 Ⅱ에서 두 번의 세척을 상기 분석에 적용하였다. 모든 실험은 3번 반복 수행되었다. 다양한 세척 용액이 사용되었을 때, 신호는 106 cfu/㎖에서 얻어진 형광 강도였다. 다양한 세척 용액이 사용되었을 때, 노이즈는 0 cfu/㎖에서 얻어진 형광 강도였다.
도 6은 IMS/IL 분석에서 세척 수의 효과를 나타낸 그래프로, S. typhimurium의 순수 배양액을 사용하였다. 세척 용액으로, 분석에서 4% 0.02 M TBS 내 탈지 우유를 사용하였다. 단계 Ⅰ 및 Ⅱ에서 세척 수는 다음과 같다:
a: 1 & 1, b: 1 & 2, c: 1 & 3, d: 1 & 4, e: 1 & 5, f: 2 & 1, g: 2 & 2, h: 2 & 3, i: 2 & 4
모든 실험은 3번 반복 수행되었다. 다양한 세척 수가 적용되었을 때, 신호는 106 cfu/㎖에서 얻어진 형광 강도였다. 다양한 세척 수가 적용되었을 때, 노이즈는 0 cfu/㎖에서 얻어진 형광 강도였다.
도 7은 다양한 크기의 리포좀이 사용되었을 때, S. typhimurium에 대한 용량-반응곡선을 나타낸 그래프로, 이 분석에서, 0.02 M TBS 내 4% 탈지 우유가 사용되었다. 세척 단계 Ⅰ에서 한 번의 세척 및 세척 단계 Ⅱ에서 두 번의 세척을 적용하였다. 데이터는 3번 실험의 평균(± SD) 형광을 나타낸다.

Claims (11)

  1. 면역자기분리(Immunomagnetic Separation; IMS) 및 면역리포좀(Immunoliposomes; IL)을 사용하여 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 살모넬라균을 탐지하는 방법은,
    ⅰ) 항-살모넬라 IgG로 코팅된 면역자기 구슬과 살모넬라균이 함유될 수 있는 시료 샘플을 혼합하여 반응시키는 단계;
    ⅱ) 상기 혼합물에서 자성으로 면역자기 구슬-살모넬라균을 분리하고 세척하는 단계;
    ⅲ) ⅱ) 단계의 분리된 면역자기 구슬-살모넬라균의 내부에 소정의 형광 물질을 함유시키고 표면에 항-살모넬라 IgG 결합된 면역리포좀을 첨가하는 단계;
    ⅳ) 상기 혼합물에서 자성으로 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체를 분리하고 세척하는 단계;
    ⅴ) 상기 면역자기 구슬-살모넬라균-면역리포좀 복합체에서 소정의 형광 물질을 방출시키는 단계; 및
    ⅵ) 상기 방출된 표지 물질의 형광 강도를 측정하는 단계
    를 포함하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계 및 ⅳ) 단계의 세척은 0.1~4% BSA(Bovine Serum Albumin) 또는 2~8% 탈지 우유로 이루어지는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계 및 ⅳ) 단계의 세척은 2~8% 탈지 우유를 사용하고 ⅱ) 단계에서는 1~2번, ⅳ) 단계에서는 2~4번의 세척을 수행하는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 소정의 형광 물질은 SRB(Sulforhodamine B; 설포로다민 B)인 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 SRB의 방출에 사용되는 물질로 OG(Octyl β-d-Glucopyranoside)를 이용하는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 SRB의 형광 강도 측정은 550 ㎚의 여기 파장 및 585 ㎚의 방출 파장으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 면역리포좀은 DPPE를 SATA와 반응시켜 DPPE-ATA를 제 조하고, 여기에 DPPC, DPPG, 및 콜레스테롤을 포함하는 지질 혼합물을 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 항-살모넬라 IgG로 코팅된 면역자기 구슬 또는 면역리포좀은 말레이미드(Maleimide) 그룹으로 IgG을 변형(Derivatization)시키고 이것을 SH-포함한 면역자기 구슬 또는 리포좀과 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 면역리포좀은 100 ~ 400 ㎚ 크기인 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 면역리포좀은 20 ~ -100 mV의 ζ-포텐셜을 갖는 것을 특징으로 하는 식중독의 원인이 되는 살모넬라균을 탐지하는 방법.
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