KR20090064705A - Pharmaceutical composition for preventing from nephrotoxicity induced by anticancer agent - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 순무로부터 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by an anticancer agent, and more particularly, an anticancer agent comprising Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted from turnips as an active ingredient. It relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by.
암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이며, 특히 우리나라에서는 지난 통계청의 『2000년 사망원인 통계연보』(2000년 사망 자료 분석 결과)에 의하면, 암으로 인한 사망은 23.5 %로 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있어 국가차원의 암관리 대책이 요구되고 있다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법들이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법(chemotherapy)이다.Cancer is a disease that causes about 7 million deaths per year worldwide. Especially in Korea, according to the Statistical Yearbook of Cause of Death of 2000 (analysis of 2000 death data), death from cancer 23.5% of the total cause of death is the leading cause of cancer management measures at the national level. Currently, various methods such as surgery, radiation therapy, and gene therapy are used to treat cancer, but one of the most used treatments is chemotherapy, in which anticancer drugs are administered.
항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈 류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다. 정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.Chemotherapy is a systemic treatment, most of which is given by injection or oral anticancer drugs and spreads throughout the bloodstream. Therefore, it is a treatment that acts on the microcommitment (micometastasis) spread throughout the body rather than a local effect. Therefore, there are many systemic side effects and the degree is very severe compared to surgery or radiation therapy. The use of drug-sensitivity differences between normal cells and cancer cells to allow chemotherapy to act selectively on cancer cells results in dose-limiting toxicity because chemotherapy or most anticancer drugs do not distinguish between normal and cancer cells. There is a problem.
대표적인 항암제인 시스플라틴(cis-diammine-dichloroplatinum [Ⅱ])은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978; Pollera C. F. et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987). 시스플라틴에 의한 이러한 부작용은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종으로 인한 지질 과산화의 증가(Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al., Mol. Cell Biochem., 278(1-2): pp79-84, 2005), 조직에 존재하는 항산화 효소 활성의 억제(Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873-1875, 1992), 글루타시온(glutathione)의 고갈(Zhang J. G. and Lindup W. E., Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) 및 세포내 칼슘 항상성의 붕괴(Zhang J.G. and Lindup W.E., Toxicology in Vitro, 10: pp205209, 1996)와 밀접한 관련이 있다.Cis-diammine-dichloroplatinum [II], a representative anticancer agent, is widely used in clinic as a chemotherapeutic agent for the treatment of ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer, testicular cancer (Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-). 2315, 1985). Cisplatin is known to have an anticancer effect by generating reactive oxygen species to attack cancer cells, inducing inter-intrastrand cross-linking of DNA and formation of DNA adducts. However, side effects such as hearing loss, neurotoxicity, and kidney toxicity occur over a limited amount of drug during treatment (Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), and hepatotoxicity is also frequently associated with high concentrations of cisplatin. (Cerosimo RJ, Ann. Pharm., 27: pp 438-441, 1993; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp 2125-2126, 1978; Pollera CF et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987). These side effects with cisplatin are caused by increased lipid peroxidation due to the reactive oxygen species produced by cisplatin (Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al. , Mol. Cell Biochem., 278 (1-2): pp79-84, 2005), inhibition of antioxidant enzyme activity present in tissues (Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873-1875, 1992), depletion of glutathione (Zhang JG and Lindup WE, Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) and disruption of intracellular calcium homeostasis (Zhang JG and Lindup WE, Toxicology in Vitro, 10) : pp205209, 1996).
최근 시스플라틴과 글루타시온 에스테르(glutathione ester)를 같이 투여하였을 때 시스플라틴으로 인한 신장 독성이 효과적으로 억제된다는 것을 관찰하였으며(Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995) 식이를 통해 항산화 물질을 섭취함으로써 시스플라틴으로 인한 독성을 억제하는데 많은 관심이 집중되고 있다(Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997; Bogin E. et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 32: pp843-851, 1994; Rao M. et al., J. Biochem., 125: pp383-390, 1999).It has been recently observed that cisplatin and glutathione esters are effectively inhibited by cisplatin-induced kidney toxicity (Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995). Much attention has been focused on suppressing cisplatin-induced toxicity by ingesting antioxidants in the diet (Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997; Bogin E. et al., Eur J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 32: pp 843-851, 1994; Rao M. et al., J. Biochem., 125: pp 383-390, 1999).
시스플라틴을 비롯한 많은 화학요법제들이 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하는 것으로 알려져 있고, 생성된 활성산소종들은 정상세포에도 작용하여 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화효과를 가지는 물질들은 화학요법제에 의해 유발된 독성을 감소시킬 가능성이 높다. 또한 활성산소종이나 라디칼을 생성하는 외부 유해물질에 의한 간 독성 및 신장 독성도 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각된다.Many chemotherapeutic agents, including cisplatin, are known to produce free radical species and attack cancer cells, and the produced free radical species are known to act on normal cells and cause damage. Thus, substances with antioxidant effects are likely to reduce the toxicity caused by chemotherapeutic agents. In addition, hepatic toxicity and renal toxicity caused by external harmful substances generating reactive oxygen species or radicals can be effectively suppressed.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 시스플라틴 등의 항암제 투여시 항암제의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 항암제에 의한 신장 독성을 억제할 수 있는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.In order to solve the problems of the prior art as described above, the present invention for preventing and treating renal toxic diseases caused by an anticancer agent that can enhance the anticancer efficacy of the anticancer agent at the same time when administering an anticancer agent such as cisplatin It is an object to provide a pharmaceutical composition.
또한 본 발명은 시스플라틴으로 인한 신장 독성에 관한 억제 활성을 갖는 항암보조제를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is another object of the present invention to provide an anticancer adjuvant having inhibitory activity on renal toxicity due to cisplatin.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드(Zingerone-4-O-β-D-glucopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is characterized in that the anticancer agent comprising Gingerone-4- O - β - D -glucopyranoside (Zingerone-4- O - β - D- glucopyranoside) as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for preventing and treating kidney toxic diseases caused by.
상기 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 순무로부터 추출되며, 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 98 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.The Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside is extracted from turnip, it is preferably included in 0.01 to 98% by weight relative to the total weight of the pharmaceutical composition.
또한, 본 본 발명은 항암제에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.The present invention also provides an anticancer adjuvant comprising Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside having an inhibitory activity against renal toxicity caused by an anticancer agent as an active ingredient.
본 발명의 약학 조성물은 기존 항암제인 시스플라틴의 투여시 시스플라틴의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 시스플라틴에 의한 신장 세포의 사멸을 억제하고, 시스플라틴에 의해 생성된 ROS를 저해하는 등 항암제에 의해 유발되는 신장 독성을 예방 및 치료할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention enhances the anticancer efficacy of cisplatin upon administration of cisplatin, an existing anticancer agent, and at the same time inhibits renal cell death by cisplatin, and inhibits ROS produced by cisplatin. Can be prevented and treated.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 순무로부터 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하여 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 방지하여 신장 독성의 부작용을 감소시킬 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by the anticancer agent of the present invention includes Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted from turnip as an active ingredient, and apoptosis by cisplatin, an existing anticancer agent. Can reduce the side effects of renal toxicity.
상기 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 순무 뿌리부분 생체 중 껍질과 속 부분을 구분한 뒤 속 부분에 C1 내지 C4의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 24 시간 동안 반복 정치 추출하고 여과한 후, 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.The Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside is divided into the skin part and the genus part of the turnip root part in vivo and then immersed in the lower alcohol of C 1 to C 4 in the genus part, preferably methanol for 24 hours. After repeated standing extraction and filtration, concentrated under reduced pressure and these can be obtained by performing a conventional fractionation process.
구체적으로, 순무(Brassica camperstris ssp rapa) 뿌리부분 생체 중 100 ㎏을 껍질과 속 부분을 구분하고 세절하여 속 부분(48 ㎏)을 MeOH 80% 수용액(18ℓ×5)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과한다. 이렇게 얻어진 여액을 45 ℃에 서 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻는다. 상기 얻어진 MeOH 추출물을 EtOAc(3ℓ×2)/H2O(3ℓ)로 분배 추출하고, 다시 H2O층을 n-BuOH (3ℓ×2)/H2O(3.2ℓ)로 분배 추출한다. 그 다음, 각 층을 감압농축하면 EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획을 얻을 수 있다. 상기 n-BuOH 분획에 대하여 실리카 겔 컬럼크로마토그라피(silica gel column chromatography, φ 10×11 ㎝, CHCl3:MeOH=7:1→5:1→3:1→1:1)를 실시하면 16개의 분획물(BRB-1~BRB-16)을 얻을 수 있다. 상기 16개의 분획물 중 BRB-9 분획에 대하여 ODS c.c.(φ 3.5×11 ㎝, MeOH:H2O=1:3)을 실시하여 얻은 BRB-9-5 분획을 ODS c.c.(φ 3.5×9 ㎝, MeOH:H2O=1:3) 정제하여 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 추출할 수 있다.Specifically, turnip ( Brassica camperstris ssp rapa ) 100 kg of the root part of the living body is divided into small parts and the skin part, and the genus part (48 kg) is extracted twice with
상기와 같이 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 하기 화학식 1로 표시된다.Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted as described above is represented by the following formula (1).
상기 화학식 1의 화합물은 무정형 분말상의 화합물로, IR Spectrum으로부터 hydroxyl(3400 cm-1)와 olefine(1710 cm-1)의 흡수 peak를 관측할 수 있었다. FAB/MS spectrum으로부터 m/z 357 [M+1]+의 peak가 관측되어 분자량을 356로 결정하였다. 1H-NMR(400 MHz, CDCl3, δ) spectrum의 저자장 영역에서 3개의 olefinc methine proton이(δH 7.50, d, J=8.4 Hz; 6.91, br. s; 6.76, br. d, J=8.4 Hz) 관측되어, 1,3,4-삼치환 benzene 고리의 존재가 확인되었고, 한 개의 methoxy group(δH 3.71), 두개의 methylene(δH 2.86, 2.68) 그리고, methyl(δH 2.03) signal을 관측할 수 있었다. 또한 당부에서 유래한 anomeric proton signal(δH 5.66)과 다수의 oxygenated methin과 methylene signals을 관측할 수 있었다. 13C-NMR spectrum(100MHz, CDCl3, δ)에서는 한개의 ketone(δc 207.20)과 두개의 olefinic oxygenated quaternary, 세 개의 olefinic quaternary(δc 150.05, 146.20, 135.66)과 세 개의 olefinic methine(δc 120.80, 116.40, 113.34) signal을 포함하여 모두 17개의 탄소 시그널을 관측할 수 있었다. 고자장 영역에서는 한 개의 methoxy group(δc 55.95), 두개의 methylene(δc 45.32, 29.88) 그리고, 한 개의 methyl(δc 29.75) signal 또한 관측할 수 있었다. 이상의 데이터를 종합한 결과, 이 화합물은 benzene 고리에 ketone을 가진 butyl기를 갖음을 확인할 수 있었다. 또한 당부의 chemical shifts로부터 결합당은 β-D-glucopyranose로 결정하였으며, 이와 같은 자료들을 종합하여 이 화합물은 zingerone 4-O-β-D-glucopyranoside로 구조동 정할 수 있었다.The compound of Formula 1 was an amorphous powdery compound, and the absorption peaks of hydroxyl (3400 cm -1 ) and olefine (1710 cm -1 ) could be observed from IR Spectrum. A peak of m / z 357 [M + 1] + was observed from the FAB / MS spectrum to determine the molecular weight as 356. In the low magnetic field of the 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ) spectrum, three olefinc methine protons (δ H 7.50, d, J = 8.4 Hz; 6.91, br.s; 6.76, br.d, J = 8.4 Hz) was observed to confirm the presence of a 1,3,4-trisubstituted benzene ring, one methoxy group (δ H 3.71), two methylene (δ H 2.86, 2.68) and methyl (δ H 2.03) I could observe the signal. In addition, sugar-derived anomeric proton signals (δ H 5.66) and many oxygenated methin and methylene signals were observed. In the 13 C-NMR spectrum (100 MHz, CDCl 3 , δ), one ketone (δ c 207.20), two olefinic oxygenated quaternary, three olefinic quaternary (δ c 150.05, 146.20, 135.66) and three olefinic methine (δ c 17 carbon signals were observed, including 120.80, 116.40, and 113.34). In the high magnetic field, one methoxy group (δ c 55.95), two methylene (δ c 45.32, 29.88) and one methyl (δ c 29.75) signals were also observed. The results showed that the compound had a butyl group with ketone on the benzene ring. In addition, the binding sugar was determined from β- D-glucopyranose from the chemical shifts of sugars. From these data, the compound could be structurally identified as zingerone 4- O - β -D -glucopyranoside.
상기 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드가 근위세뇨관 세포주인 LLC-PK1에서 기존 항암제인 시스플라틴(cisplatin)의 사용에 의한 세포고사를 방지함을 확인함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.Kidney induced by anticancer drugs by confirming that Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside prevents cell death by the use of cisplatin, an existing anticancer agent, in LLC-PK1, a proximal tubule cell line It was found that toxicity can be prevented and treated.
본 발명은 상기와 같은 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 예방 및 치료용 약학 조성물 및 항암보조제를 제공한다. 상기 항암보조제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 독소루비신, 탁솔, 탐옥시펜, 캄토벨, 아드루실, 글리벡, 에토포사이드, 조메타, 온코빈 등의 기존 항암제와 병용 투여하여 항암 효능을 증진시킬 수 있다.The present invention provides a pharmaceutical composition and anticancer adjuvant for preventing and treating renal toxicity induced by an anticancer agent comprising Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside as an active ingredient. The anticancer adjuvant is administered in combination with existing anticancer agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, doxorubicin, taxol, tamoxyphene, camptobel, adresyl, glibeck, etoposide, zometa, and oncobin. Can promote it.
상기 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 본 발명의 신장 독성 예방 및 치료용 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 98 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 상기 범위내일 경우에는 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 효율적으로 방지할 수 있어 신장독성의 예방과 치료에 있어 더욱 좋다.The Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside is preferably contained in 0.01 to 98% by weight relative to the total weight of the pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxicity of the present invention. If the content is within the above range, it is possible to effectively prevent cell death by cisplatin, an existing anticancer agent, which is better in the prevention and treatment of renal toxicity.
본 발명의 약학 조성물은 항암제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 억제 활성을 갖는 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention comprises Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside having an inhibitory activity against nephrotoxicity induced by an anticancer agent as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or Excipients may be included.
또한 상기 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.In addition, the pharmaceutical dosage forms of the pharmaceutical composition may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds, as well as in a suitable collection.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 복숭아 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있 다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. . Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose ( It is prepared by mixing sucrose or lactose and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propyleneglycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to help understanding of the present invention, but the following examples are merely to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
[실시 예][Example]
이하 실시 예에서 사용한 실험재료로 LLC-PK1(돼지 신장의 근위세뇨관 세포주)은 American Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였다. M199 배지, fetal bovine serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Life Technologies Inc의 것을 사용하였다. 또한 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tertazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO), N-actetyl cysteine(NAC), cisplatin, DCFH-DA는 Sigma Chemical Co.의 것을 사용하였다. LLC-PK1 (proximal tubule cell line of pig kidney) was used as an experimental material used in the Examples below by being sold by the American Type Culture Collection. M199 medium, fetal bovine serum (FBS), penicillin and streptomycin were used by Life Technologies Inc. In addition, 3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyl-tertazolium bromide (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO), N-actetyl cysteine (NAC), cisplatin, DCFH-DA are Sigma Chemical Co. Was used.
실시 예 1. Example 1. 진저론Ginger Theory -4--4- OO -- ββ -- DD -- 글루코피라노사이드Glucopyranoside 추출 extraction
순무(Brassica camperstris ssp rapa) 뿌리부분 생체 중 100 ㎏을 껍질과 속 부분을 구분한 뒤 세절하여 속 부분(48 ㎏)을 MeOH 80% 수용액(18ℓ×5)으로 두 차례 걸쳐 추출한 후 여과지로 여과하였다. 상기 얻어진 여액을 45 ℃에서 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물을 EtOAc(3ℓ×2)/H2O(3ℓ)로 분배 추출하고, 다시 H2O층을 n-BuOH(3ℓ×2)/H2O(3.2ℓ)로 분배 추출하였다. 그 다음, 각 층을 감압농축하여 EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획을 얻었다. Turnip (Brassica camperstris ssp rapa ) 100 kg of the root part of the living body was divided into shells and genus parts, and then the genus part (48 kg) was extracted twice with
상기 n-BuOH 분획에 대하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(φ 10×11 ㎝, CHCl3:MeOH=7:1→5:1→3:1→1:1)를 실시하여 얻은 16개의 분획물(BRB-1~BRB-16) 중 BRB-9 분획에 대하여 ODS c.c.(φ 3.5×11 ㎝, MeOH:H2O=1:3)을 실시하여 BRB-9-5 분획을 얻었으며, 이를 다시 ODS c.c.(φ 3.5×9 ㎝, MeOH:H2O=1:3)을 실시하고 정제하여 하기 화학식 1로 표시되는 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 분리하였다.16 fractions (BRB-) obtained by subjecting the n- BuOH fraction to silica gel column chromatography (φ 10 × 11 cm, CHCl 3 : MeOH = 7: 1 → 5: 1 → 3: 1 → 1: 1) ODS cc (φ 3.5 × 11 cm, MeOH: H 2 O = 1: 3) was performed on the BRB-9 fraction in 1 ~ BRB-16) to obtain a BRB-9-5 fraction, which was then returned to ODS cc ( 3.5 × 9 cm, MeOH: H 2 O = 1: 3) was purified and purified to separate Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드(zingerone 4-O-β-D-glucopyranoside): amorphous powder(CHCl3-MeOH); [a]D=+31.4°(c=0.2, MeOH); pos. FAB/MSm/z: 357 [M+H]+ IRυ(MeOH, ㎝1) 3400, 1710; 1H-NMR(400 MHz, pyridine-d5, δ) 7.50(1H, d, J=8.4 Hz, H-5’), 6.91(1H, br. s, H-2’), 6.76(1H, br. d, J=8.4 Hz, H-6’), 5.66(1H, d, J=6.4 Hz, anomeric-H), 3.71(3H, s, OMe), 2.86(2H, t, J=7.6 Hz, H-4), 2.68(2H, t, J=7.6 Hz, H-3), 2.03(3H, s, H-1); 13C-NMR(100 MHz, pyridine-d5, δC) 207.20(C-2), 150.05(C-4’), 146.20(C-3’), 135.66(C-1’), 120.80(C-6’), 116.40(C-5’), 113.34(C-2’), 102.33(anomeric-C), 78.88(C-3), 78.59(C-5), 74.95(C-2), 71.26(C-4), 62.38(C-6), 55.95(OMe), 45.32(C-3), 29.88(C-4), 29.75(C-1).Ginger Ron -4- O - β - D - Glu nose Llano side (zingerone 4- O - β - D -glucopyranoside): amorphous powder (CHCl 3 -MeOH); [a] D = + 31.4 ° (c = 0.2, MeOH); pos. FAB / MS m / z: 357 [M + H] + IR ((MeOH, cm 1 ) 3400, 1710; 1 H-NMR (400 MHz, pyridine-d 5 , δ) 7.50 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5 '), 6.91 (1H, br.s, H-2'), 6.76 (1H, br d, J = 8.4 Hz, H-6 '), 5.66 (1H, d, J = 6.4 Hz, anomeric-H), 3.71 (3H, s, OMe), 2.86 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-4), 2.68 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-3), 2.03 (3H, s, H-1); 13 C-NMR (100 MHz, pyridine-d 5 , δC) 207.20 (C-2), 150.05 (C-4 '), 146.20 (C-3'), 135.66 (C-1 '), 120.80 (C- 6 '), 116.40 (C-5'), 113.34 (C-2 '), 102.33 (anomeric-C), 78.88 (C-3), 78.59 (C-5), 74.95 (C-2), 71.26 ( C-4), 62.38 (C-6), 55.95 (OMe), 45.32 (C-3), 29.88 (C-4), 29.75 (C-1).
실시 예 2. Example 2. 진저론Ginger Theory -4--4- OO -- ββ -- DD -- 글루코피라노사이드의Of glucopyranoside 시스플라틴에On cisplatin 대한 신장 보호효과 측정 Measures of Kidney Protection
상기 실시 예 1에서 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드의 시스플라틴(cisplatin)에 대한 세포고사의 방지효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. The following experiment was performed to confirm the effect of Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extraction in Example 1 on the prevention of cell death on cisplatin.
먼저, 근위세뇨관 세포인 LLC-PK1을 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 그 후, 세포를 원심분리 및 트립신(trypsin)으로 수집하여 10% FBS를 포함하는 M199 배지 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트에 1× 105/웰을 넣었다. 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드은 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 농도별로 처리하였고, 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. 하룻밤 경과 후, 시료를 첨가하고 3 시간이 지난 뒤에 시스플라틴이 200 ㎛이 되도록 각 웰에 처리하였다. 플레이트는 24 시간 동안 배양하였다. 세포들은 한차례 세척한 후 5 ㎎/㎖의 MTT를 함유하는 FBS 없는 배지 50㎕를 첨가하였으며, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 세포내에서 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 100 ㎕의 DMSO에 녹인 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 시스플라틴에 대한 신장 보호 효과를 세포 생존력(cell viability, %) 값으로 구하였다. 세포 생존력는 화합물을 처리하지 않았을 때의 세포의 숫자를 기준으로 하여 나타내었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었고, 이때 제시되는 값은 3회 평균값이다. First, LLC-PK1, a proximal tubule cell, was incubated in a humid environment of 37 ° C and 5% carbon dioxide in M199 medium containing 10% FBS, penicillin (100 units / ml) and streptomycin sulfate (100 µg / ml). . Cells were then collected by centrifugation and trypsin and placed in 1 × 10 5 / well in 96 well plates containing 100 μl of M199 medium containing 10% FBS. Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) solvent and treated by concentration, and the concentration of DMSO in all tests did not exceed 0.1%. After an overnight pass, each well was treated with cisplatin at 200 μm three hours after the sample was added. Plates were incubated for 24 hours. Cells were washed once and 50 μl of FBS-free medium containing 5 mg / ml MTT was added. After incubation at 37 ° C. for 4 hours, the medium was removed, and the formazan blue formed in the cells was removed. After dissolving in 100 μl of DMSO, the absorbance was measured at 540 nm to determine the renal protective effect on cisplatin as the cell viability (%) value. Cell viability was expressed based on the number of cells when no compound was treated, and the results are shown in FIG. 1, wherein the values presented are three times the average value.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 농도 의존적으로 시스플라틴에 의한 신장세포의 사멸을 저해함을 확인할 수 있었다. 이같은 결과를 통하여 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 시스플라틴의 부작용인 신장독성을 감소시킴을 알 수 있었다. As shown in FIG. 1, Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside, which is included as an active ingredient in a pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by the anticancer agent of the present invention, is cisplatin in a concentration-dependent manner. It was confirmed that inhibiting the death of kidney cells by. These results suggest that Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside reduces the renal toxicity, a side effect of cisplatin.
실시예Example 3. 3. 진저론Ginger Theory -4--4- OO -- ββ -- DD -- 글루코피라노사이드의Of glucopyranoside 시스플라틴에On cisplatin 의한 by ROSROS 저해효과 Inhibitory effect
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드가 시스플라틴에 의한 ROS의 생성을 저해시키는지 알아보았다. ROS의 측정은 DCFH-DA 를 사용하였다. In this example, it was examined whether Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted in Example 1 inhibits the production of ROS by cisplatin. ROS was measured using DCFH-DA.
배양된 LLC-PK1 세포를 0.2% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖)이 포함된 M199 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하여 1×105 개/㎖을 세포배양 플레이트에 넣고 하룻밤 배양하였다. 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 농도별로 DMSO에 용해시켜 처리하였다. 3 시간 뒤 시스플라틴(50 ㎛)을 가하여 4.5 시간 동안 배양하였다. DCFH-DA를 DMSO에 용해시켜 각 군당 20 ㎛이 되도록 처리하고 30 분간 37 ℃에서 배양하였다. 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1%를 초과하지 않도록 하였다. DCFH-DA는 세포에서 탈아세틸화되어 무형광의 DCFH를 형성하였으며, 산화상태에서는 DCF로 변화되어 이의 형광도를 유세포측정기(FACS)로 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.The cultured LLC-PK1 cells were incubated in a humid environment of 37 ° C. and 5% carbon dioxide in M199 medium containing 0.2% FBS and penicillin (100 units / ml), and 1 × 10 5 cells / ml were placed in the cell culture plate. Incubated overnight. Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside was dissolved and dissolved in DMSO by concentration. After 3 hours, cisplatin (50 μm) was added thereto and incubated for 4.5 hours. DCFH-DA was dissolved in DMSO, treated to 20 μm in each group, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. In all tests, the concentration of DMSO was not to exceed 0.1%. DCFH-DA was deacetylated in cells to form fluorescence-free DCFH, which was changed to DCF in the oxidized state, and its fluorescence was measured by flow cytometry (FACS), and the results are shown in FIG. 2.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드는 시스플라틴에 의해 생성된 ROS를 농도 의존적으로 저해함을 확인할As shown in FIG. 2, Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside, which is included as an active ingredient in the pharmaceutical composition for preventing and treating renal toxic diseases caused by the anticancer agent of the present invention, is produced by cisplatin To inhibit concentration of ROS
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드의 농도에 따른 신장 세포 생존 정도를 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the degree of renal cell survival according to the concentration of Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted according to an embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 추출한 진저론-4-O-β-D-글루코피라노사이드의 농도에 따른 ROS 저해 효과를 나타낸 그림이다2 is a diagram showing the effect of ROS inhibition according to the concentration of Gingeron-4- O - β - D -glucopyranoside extracted according to an embodiment of the present invention
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