KR20090062323A - 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법 - Google Patents

대사지문법을 이용한 간독성 예측방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090062323A
KR20090062323A KR1020070129488A KR20070129488A KR20090062323A KR 20090062323 A KR20090062323 A KR 20090062323A KR 1020070129488 A KR1020070129488 A KR 1020070129488A KR 20070129488 A KR20070129488 A KR 20070129488A KR 20090062323 A KR20090062323 A KR 20090062323A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
drug
metabolite
biological sample
side effects
mass spectrometry
Prior art date
Application number
KR1020070129488A
Other languages
English (en)
Inventor
최수영
김승희
강태석
염영나
오재호
곽승준
임채형
김형섭
정병화
이민선
Original Assignee
대한민국 (식품의약품안전청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 (식품의약품안전청장) filed Critical 대한민국 (식품의약품안전청장)
Priority to KR1020070129488A priority Critical patent/KR20090062323A/ko
Publication of KR20090062323A publication Critical patent/KR20090062323A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/025—Gas chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

본 발명은 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법 및 이를 응용하여 간독성과 같은 시험약물의 부작용을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법은 (ⅰ) 대사물질의 부작용이 모니터링된 약물을 투여한 실험동물과 투여하지 않은 실험동물로부터 각각의 생체시료를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 각 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하여, 크로마토그램 및 질량분석결과를 얻는 단계; 및, (ⅲ) 상기 각각의 크로마토그램 및 질량분석결과를 상호비교하여, 상기 약물의 대사물질에 특이적인 피크를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 의약을 투여한 실험동물에서 유래된 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 새로이 개발된 화학적 치료제의 투여에 의하여 야기될 수 있는 간독성 등의 부작용을 예측할 수도 있으므로, 보다 효과적인 의약의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치, 대사지문법

Description

대사지문법을 이용한 간독성 예측방법{Method for Predicting Hepatotoxicity by Metabolic Fingerprinting Technique}
본 발명은 대사지문법(metabolic fingerprinting)을 이용한 간독성 예측방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법 및 이를 응용하여 간독성과 같은 시험약물의 부작용을 예측하는 방법에 관한 것이다.
대부분의 화학적 치료제는 환자의 체내에서 목적하는 질병을 치료하거나 또는 완화시키지만, 환자의 체내에서 검출되지 않을 정도로 미세하거나 또는 환자에게 치명적인 결과를 나타낼 정도로 심각한 부작용을 나타낸다. 이러한 화학적 치료제의 부작용은 대부분 간과 같은 환자의 목적하는 부위 이외의 조직에서 대사되는 과정에 의하여 발생되는데, 간은 이러한 치료제의 대사과정에서 발생되는 부산물에 의하여 가장 우선적으로 손상되어 간기능이 저하되고, 이로 인하여 간기능 저하에 의한 2차적인 부작용이 추가로 발생하게 된다. 이에 따라, 상술한 바와 같은 부작용이 배제된 화학적 치료제를 개발하려는 노력이 계속되고 있다.
한편, 새롭게 개발된 화학적 치료제로서의 신약이 어떠한 부작용을 나타내는지 미리 예측할 수 있다면, 시행착오를 현저하게 감소시켜서 의약의 개발에 소요되는 비용과 시간을 절감시킬 수 있기 때문에, 신약에 의한 부작용을 미리 예측할 수 있는 방법을 개발하려는 노력이 계속되었다.
현재 사용되는 부작용의 예측방법으로는, 실험동물로부터 수득한 대사물질(metabolite)을 분석하는 방법이 사용되고 있다. 즉, 화학적 치료제의 부작용은 체내의 조직에서 대사되어 발생하는 대사물질에 의하여 유발되기 때문에, 체내에 투여하기 전에 부작용을 예측하는 것은 불가능하며, 목적하는 화학적 치료제를 체내에 소량으로 투여한 후에, 이를 대사시켜 얻어진 물질을 분석함으로써, 목적하는 치료제의 부작용을 예측하는 방법이 사용되고 있다. 이러한 대사물질을 분석하는 방법은 목적하는 약물이 투여된 동물에서 얻어진 특정 대사물질을 표준품을 이용하여 정량분석한 다음, 대사물질의 양 또는 농도의 변화, 혹은 대사경로에서 연관되어있는 대사물질의 양 또는 농도의 비율을 비교하는 단계에 의하여 수행된다.
그러나, 생체내에 존재하는 대사물질은 매우 다양하기 때문에, 모든 대사물질을 대상으로 하여 상술한 바와 같이 분석하는 것은 사실상 불가능하였으므로, 보다 간단하게 생체 내의 대사물질의 변화를 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구를 수행한 결과, 정상적인 실험동물에서 수득한 시료로부터 얻어진 대사물질과 시험약물을 처리한 실험동물에서 수득한 시료로부터 얻어진 대사물질을 분석하여 얻은 패턴을 비교하는 대사지문법(metabolic fingerprinting)이 개발되었다. 상기 방법을 이용하면, 시료에 포함된 시험약물의 모든 대사물질의 패턴을 분석할 수 있으나, 시료에 포함된 대사물질의 종류가 너무 과다할 경우에는, 대사물질의 패턴이 중첩되어 정상적인 분석결과를 얻을 수 없다는 단점이 있어, 동물을 대상으로 한 부작용의 검출과 관련된 연구에는 적용하지 못하고, 주로 시료에 포함된 대사물질의 수가 상대적으로 적은 세균이나 식물을 대상으로 하여 적용되어 왔다(참조: Phytochemistry, 62: 929-937, 2002; Phytochemistry, 63: 817-836, 2003; Phytochemistry, 63: 887-900, 2003; J. Integrative Biology, 6: 217-234, 2002; Electrophoresis, 23: 1642-1651, 2002; Nature Biotechnology, 18: 1157-1161, 2000; Anal. Chem., 76: 619-626, 2004; Plant Cell, 14: 1437-1440, 2002; Advan. Enzyme Regul., 43: 67-76, 2003; International Immunopharmacology, 4: 1499-1514, 2004).
만일, 새롭게 개발된 화학적 치료제로서의 신약을 실험동물에 투여하고, 이로부터 수득한 과다한 대사물질을 포함하는 생체시료를 대사지문법으로 분석할 수 있다면, 동물을 대상으로 한 부작용의 검출과 관련된 연구에 적용함으로써, 보다 효율적으로 화학적 치료제의 부작용을 예측할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
이에, 본 발명자들은 새롭게 개발된 화학적 치료제로서의 신약을 실험동물에 투여하고, 이로부터 수득한 과다한 대사물질을 포함하는 생체시료를 대사지문법으 로 분석할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 예의 연구노력한 결과, 상기 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피를 통하여 분석할 경우, 대사지문법으로 실험동물에서 얻어진 생체시료에 포함된 대사물질이 부작용을 나타내는 지의 여부를 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 대표적인 부작용인 간독성을 나타낼 수 있는 지의 여부까지도 검증할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 생체시료에 포함된 대사물질의 부작용 발생여부를 분석할 수 있는 대사지문법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 대사지문법을 이용하여 목적하는 약물의 간독성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법 및 이를 응용하여 간독성과 같은 시험약물의 부작용을 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하면, 의약을 투여한 실험동물에서 유래된 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 새로이 개발된 화학적 치료제의 투여에 의하여 야기될 수 있는 간독성 등의 부작용을 예측할 수도 있으므로, 보다 효과적인 의약의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 새롭게 개발된 화학적 치료제로서의 신약을 실험동물에 투여하고, 이로부터 수득한 과다한 대사물질을 포함하는 생체시료를 대사지문법으로 분석할 수 있는 방법을 모색하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 가스크로마토그래피 방법과 질량분석방법을 동시에 적용할 경우, 동물에서 수득한 뇨와 같은 생체시료에 포함된 상기 신약의 대사물질을 대사지문법으로 분석할 수 있고, 이를 응용하여 간독성과 같은 대사물질에 의하여 발생하는 부작용의 발생여부를 예측할 수 있었다.
예를 들어, 간독성을 나타낸다고 알려진 발프로인산을 서로 다른 투여량으로 투여한 마우스에서 각각의 뇨를 수득하고, 이를 고체상 추출하여 수득한 각각의 생체시료를 질량분석기가 구비된 가스크로마토그래피에 적용할 경우, 가스크로마토그래피의 피크를 주성분 분석으로 검증하여 산출한 PC2의 최고(height)값이 발프로인산의 투여량에 비례하여 증가하였다. 또한, 상기 생체시료를 효소를 이용하여 가수분해하고, 이를 추출한 추출물을 질량분석기가 구비된 가스크로마토그래피에 적용한 다음, 그 결과를 대사지문법으로 분석한 결과, 질량분석값이 147.39, 245.33, 292.27, 389.08 및 413.20(m/z)인 17.83 내지 17.84분에 나오는 피크, 질량분석값이 217.34 및 305.21(m/z)인 18.56 내지 18.63분에 나오는 피크 및 질량분석값이 217.88, 305.24, 359.17 및 503.24(m/z)인 18.99 내지 19.03분에 나오는 피크는, 발프로인산을 투여하지 않은 대조군에서 전혀 관찰되지 않았으며, 발프로인산의 투여량이 증가할 수록 상기 각 피크값이 증대됨을 알 수 있었다.
이처럼, 상기 피크들은 발프로인산의 투여량에 비례하여 어번던스 값이 증가하고, 이처럼 증가된 피크들은 모두 발프로인산의 대사물질이므로, 상기 피크를 이용할 경우, 발프로인산의 대사물질와 유사한 대사물질을 형성하는 시험약물에 의한 부작용의 발생 여부를 예측할 수 있었다.
결국, 본 발명의 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법은 (ⅰ) 대사물질의 부작용이 모니터링된 약물을 투여한 실험동물과 투여하지 않은 실험동물로부터 각각의 생체시료를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 각 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하여, 크로마토그램 및 질량분석결과를 얻는 단계; 및, (ⅲ) 상기 각각의 크로마토그램 및 질량분석결과를 상호비교하여, 상기 약물의 대사물질에 특이적인 피크를 검출하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 약물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 생체내에서 대사되어 간독성을 나타내는 물질인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 발프로인산을 사용함이 바람직하며, 생체시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 타액, 혈액, 뇨, 땀, 가래, 림프액 등을 사용함이 바람직하며, 수득한 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하는 조건은 결코 제한되지 않는다.
아울러, 상술한 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법은 시험약물의 부작용을 예측하는 방법에 이용될 수 있으며, 특히 부작용으로서 간독성을 나타내는 약물의 부작용을 예측하는데 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 대사지문법을 이용하여 시험약물의 부작용을 예측하는 방법은 (ⅰ) 시험약물을 실험동물에 투여하고, 이로부터 생체시료를 수집하는 단계; (ⅱ) 상기 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하여, 크로마토그램 및 질량분석결과를 얻는 단계; 및, (ⅲ) 상기 크로마토그램 및 질량분석결과에, 상술한 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법으로 분석된 약물의 대사물질에 특이적인 피크가 존재하는지의 여부를 확인하고, 존재한다면 이로부터 시험약물의 대사물질로 인하여 유발되는 부작용을 예측하는 단계를 포함한다. 이때, 시험약물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 생체내에서 대사되어 간독성을 나타내는 물질인 것이 바람직하고, 생체시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 타액, 혈액, 뇨, 땀, 가래, 림프액 등을 사용함이 바람직하며, 수득한 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하는 조건은 결코 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 생체시료로부터 대사물질의 추출 및 크로마토그래피에 의한 분석
실시예 1-1: 고체상 추출법으로 수득한 생체시료의 가스크로마토그래피 분석
간독성을 나타낸다고 알려진 발프로인산(valproic acid, Noven Pharmaceuticals Inc., Russia)을 5일동안 각각의 실험동물군(마우스 56마리/군)에 경구투여하고(20, 100 및 500mg/kg/day), 최종투여 다음날에 각 마우스로부터 뇨를 수집하였다. 각각의 뇨를 5000rpm으로 10분동안 원심분리하고, 이의 상등액 1㎖를 고분자 재질의 카트리지(Strata X cartridge, Phenomenex, Torrance Co., LTD., Canada)가 장착된 고체상 진공 추출기(solid phase extraction vacuum manifold)에 적용한 다음, 3차 증류수 1㎖을 가하여 세척하고, 메탄올 4㎖을 가하여 용출시켰다. 상기 수득한 각각의 용출액을 37℃의 질소가스를 사용하여 증발건조시켜 수득한 잔사를 각각의 생체시료로 하였다.
상기 각각의 생체시료를 P2O5/KOH가 있는 건조기(dessicator)내에 15분동안 방치하여 남아있는 수분을 완전히 제거하고, MSTFA(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoro-acetamide) 50㎕를 가하여 60℃에서 15분간 반응시킨 다음, 반응액 2㎕를 GC-MS(gas chromatography-mass spectrometry)에 주입하여 가스크로마토그래피를 수행함으로써 각각의 생체시료를 분석하고, 이를 주성분 분석 법(principle component analysis)으로 검증하여, 주성분 1 및 2를 각각 산출하고, 이들의 상관관계를 그래프로 도시하였다(참조: 도 1). 이때, 대조군으로는 발프로인산을 투여하지 않은 마우스로부터 수득한 생체시료를 사용하였고, 사용한 분석기기 및 분석조건은 다음과 같다:
GC-MS: Trace 2000 GC(Thermo Finnigan사, USA)에 Polaris Q(Thermo Finnigan사, USA)를 연결
data system: Xcalibur 1.3 version
시료 주입기: AS 2000 autosampler(Thermo Finnigan사, USA)
컬럼: ultra 1(Agilent, USA)(25m X 0.25mm, 코팅두께: 0.25㎛)
오븐 온도: 초기 온도를 80℃로 맞춘 후, 10℃/분씩 300℃까지 상승
분석기 운반가스(carrier gas): 헬륨(0.8㎖/분)
시료 주입기의 온도: 250℃
검출기의 온도: 300℃
시료 주입시 분리비(split ratio): 50:1
도 1은 고체상 추출법으로 수득한 생체시료의 가스크로마토그래피 결과를 주성분 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프로서, X 축은 주성분 1의 값("PC1")을 나타내고, Y 축은 주성분 2("PC2")의 값을 나타내며, (■)는 대조군을 나타내고, (○)는 20mg/kg/day으로 발프로인산을 투여한 경우를 나타내며, (▲)는 100mg/kg/day으로 발프로인산을 투여한 경우를 나타내고, (◇)는 500mg/kg/day으로 발프로인산을 투여한 경우를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 대조군과 20mg/kg/day으로 발프로인산을 투여한 경우는 특별히 구별되지 않으나, 발프로인산의 투여량이 20, 100 및 500mg/kg/day으로 증가함에 따라 PC2의 최고값이 각각 1028920, 8856112 및 16778700으로 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 결과에서 보듯이, 투여한 발프로인산의 투여량에 따라, 주성분 분석법으로 검증한 생체시료의 패턴이 변화되므로, 고체상 추출법으로 추출한 생체시료를 이용할 경우, 발프로인산의 투여에 따라 변화된 대사물질의 양상을 뚜렷하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 1-2: 대사지문법을 이용한 가수분해된 생체시료의 분석
상기 실시예 1-1에서 고체상 추출법으로 추출한 생체시료에서 발프로인산의 투여에 따라 변화된 대사물질의 양상을 뚜렷하게 검출할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 생체시료를 효소처리하여 가수분해하고, 이를 추출하여 수득한 추출물을 GC-MS를 이용한 가스크로마토그래피에 적용한 다음, 그 결과를 대사지문법으로 분석하였다.
실시예 1-2-1: 가수분해된 생체시료의 수득
상기 실시예 1-1에서 수득한 각각의 생체시료를 0.2M 초산완충용액(acetate buffer, pH 5.2) 500㎕에 용해시키고, 이에 글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/arylsulfatase(Roche, USA)) 50㎕를 가한 후, 55℃에서 3시간 반응시켜 생체시료를 가수분해하여 생체시료 가수분해물을 수득하였다.
실시예 1-2-2: 가수분해된 생체시료의 추출 및 분석
상기 실시예 1-2-1에서 수득한 생체시료 가수분해물에 에틸아세테이트 4㎖를 가하고, 20분간 교반하여 추출한 후, 이를 2500rpm으로 5분동안 원심분리한 다음, 상부의 유기용매층을 수득하였다. 수득한 유기용매층을 37℃의 질소가스를 사용하여 증발건조시켜 잔사를 수득하고, 이를 실시예 1-1과 동일한 방법으로 가스크로마토그래피를 수행하고, 그 결과로 얻어진 각각의 크로마토그램을 비교함으로써, 각 생체시료에 존재하는 발프로인산의 대사물질을 대사지문법으로 분석하였다(참조: 도 2 내지 도 5). 이때, 대조군으로는 발프로인산을 투여하지 않은 마우스의 뇨에서 수득한 생체시료를 가수분해 및 추출하여 수득한 추출물을 사용하였다.
도 2는 서로 다른 투여량의 발프로인산을 투여한 마우스의 뇨에서 수득한 생체시료를 가수분해 및 추출하여 수득한 각 추출물의 기체크로마토그램이다.
도 2에서 보듯이, 발프로인산의 투여량이 증가할수록 특정 피크의 크기가 증 가함을 알 수 있었다. 구체적으로, 질량분석값이 147.39, 245.33, 292.27, 389.08 및 413.20(m/z)인 17.83 내지 17.84분에 나오는 피크 1, 질량분석값이 217.34 및 305.21(m/z)인 18.56 내지 18.63분에 나오는 피크 2 및 질량분석값이 217.88, 305.24, 359.17 및 503.24(m/z)인 18.99 내지 19.03분에 나오는 피크 3는 대조군에서 전혀 관찰되지 않았으며, 발프로인산의 투여량이 증가할 수록 피크값이 증대됨을 알 수 있었다.
또한, 도 3은 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 147.39, 245.33, 292.27, 389.08 및 413.20(m/z)인 17.83 내지 17.84분에 나오는 피크 1의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이고, 도 4는 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 217.34 및 305.21(m/z)인 18.56 내지 18.63분에 나오는 피크 2의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이며, 도 5는 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 217.88, 305.24, 359.17 및 503.24(m/z)인 18.99 내지 19.03분에 나오는 피크 3의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이다.
도 3 내지 도 5에서 보듯이, 피크 1 내지 3이 모두 발프로인산의 투여량에 비례하여 어버던스(abundance)값이 증가하고, 이처럼 증가된 피크 1 내지 3은 발프로인산의 대사물질이므로, 상기 피크 1 내지 3을 이용할 경우, 발프로인산에 대한 부작용의 발생 여부를 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 간 독성 종말점 확인 및 독성측정을 위한 GST 농도분석
상술한 크로마토그래피의 패턴 변화를 이용한 대사지문법이 간독성을 잘 반영하는지 알아보기 위하여, 서로 다른 투여량으로 약물이 투여된 랫트의 혈장에서 GST 농도의 변화정도를 측정하였다. 구체적으로, 웅성의 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 랫트에 발프로인산을 5일동안 경구투여하고(20, 100 및 500mg/kg/day), 최종투여 다음날에 상기 각 마우스로부터 채혈하고, 이로부터 각각의 혈장을 수득하였다.
한편, GST 분석키트(Glutathione-S-Transferase(GST) Assay Kit, Sigma Chem. Co., Ltd., USA)의 환원된 글루타티온과 CDNB(1-chloro-2.4-dinitrobenzene)을 이용하여 10㎖의 반응혼합액(reaction master mix)(PBS 9.8㎖, 200mM 환원된 글루타티온 0.1㎖ 및 100mM CDNB 0.1㎖)을 수득하였다.
상기 수득한 반응혼합액 1㎖과 상기 수득한 각각의 혈장 20㎕를 혼합하고, 상온에서 1분동안 반응시킨 후, 340nm의 파장에 대한 흡광도를 5분동안 측정하여 각각의 측정값을 얻은 다음, 이를 표준곡선에 대입하여, 혈장내 GST의 농도를 산출하였다(참조: 도 6). 이때, 대조군은 발프로인산을 투여하지 않은 랫트의 혈장을 사용하고, 표준곡선은 PBS 1㎖에 GST 4ul을 가하여, 1ppm의 GST 용액을 수득하고, 이를 PBS로 희석하여 각각 0.5, 0.25 및 0.125ug/㎖의 GST용액(calibration 용액) 을 이용하여 작성하였다.
도 6은 발프로인산이 투여된 마우스의 혈장에 존재하는 GST의 농도를 비교한 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 대조군과 20mg/kg의 용량으로 발프로인산을 투여한 마우스의 혈장에 존재하는 GST의 농도는 동등한 수준을 나타내었으나, 100mg/kg의 용량으로 발프로인산을 투여한 마우스의 혈장에 존재하는 GST의 농도는 급격히 증가하였고, 500mg/kg의 용량으로 발프로인산을 투여한 마우스의 혈장에 존재하는 GST의 농도는 100mg/kg을 투여한 실험군의 약 2배 정도를 나타냄을 알 수 있었는 바, 이로부터 간 독성이 발프로인산의 투여량에 비례하여 심화됨을 알 수 있었다.
상술한 GST의 농도를 분석한 결과는, 크로마토그래피의 패턴 변화에 의한 대사지문법의 결과와 일치하였으므로, 본 발명의 크로마토그래피의 패턴 변화에 의한 대사지문법의 결과는 신뢰할 수 있는 것임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 대사지문법을 이용하면, 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 시험약물의 투여에 의하여 발생하는 대사물질의 패턴을 대사물질의 부작용이 모니터링된 약물을 투여하여 발생하는 대사물질의 크로마토그래피의 패턴과 비교함으로써, 시험약물에 의하여 야기될 수 있는 간독성 등의 부작용을 예측할 수도 있음을 알 수 있었다.
도 1은 고체상 추출법으로 수득한 생체시료의 가스크로마토그래피 분석패턴을 나타내는 그래프이다.
도 2는 서로 다른 투여량의 발프로인산을 투여한 마우스의 뇨에서 수득한 생체시료를 가수분해 및 추출하여 수득한 각 추출물의 기체크로마토그램이다.
도 3은 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 147.39, 245.33, 292.27, 389.08 및 413.20(m/z)인 17.83 내지 17.84분에 나오는 피크 1의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이다.
도 4는 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 217.34 및 305.21(m/z)인 18.56 내지 18.63분에 나오는 피크 2의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이다.
도 5는 발프로인산을 100 및 500mg/kg/day으로 투여한 마우스에서 유래한 추출물을 대상으로 하여, 질량분석값이 217.88, 305.24, 359.17 및 503.24(m/z)인 18.99 내지 19.03분에 나오는 피크 3의 구체적인 기체크로마토그램 및 질량분석결과를 비교한 것이다.
도 6은 발프로인산이 투여된 마우스의 혈장에 존재하는 GST의 농도를 비교한 그래프이다.

Claims (5)

  1. (ⅰ) 대사물질의 부작용이 모니터링된 약물을 투여한 실험동물과 투여하지 않은 실험동물로부터 각각의 생체시료를 수득하는 단계;
    (ⅱ) 상기 각 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하여, 크로마토그램 및 질량분석결과를 얻는 단계; 및,
    (ⅲ) 상기 각각의 크로마토그램 및 질량분석결과를 상호비교하여, 상기 약물의 대사물질에 특이적인 피크를 검출하는 단계를 포함하는, 대사지문법을 이용하여 생체시료로부터 부작용이 모니터링된 대사물질을 분석하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 약물은 생체내에서 대사되어 간독성을 나타내는 물질인 것을 특징으로 하는
    방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    생체시료는 타액, 혈액, 뇨, 땀, 가래 또는 림프액인 것을 특징으로 하는
    방법.
  4. (ⅰ) 시험약물을 실험동물에 투여하고, 이로부터 생체시료를 수집하는 단계;
    (ⅱ) 상기 생체시료를 질량분석기가 장착된 가스크로마토그래피 장치에 적용하여, 크로마토그램 및 질량분석결과를 얻는 단계; 및,
    (ⅲ) 상기 크로마토그램 및 질량분석결과에, 제 1항의 방법으로 분석된 약물의 대사물질에 특이적인 피크가 존재하는지의 여부를 확인하고, 존재한다면 이로부터 시험약물의 대사물질로 인하여 유발되는 부작용을 예측하는 단계를 포함하는, 대사지문법을 이용하여 시험약물의 부작용을 예측하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 시험약물은 생체내에서 대사되어 간독성을 나타내는 물질인 것을 특징으로 하는
    방법.
KR1020070129488A 2007-12-12 2007-12-12 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법 KR20090062323A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070129488A KR20090062323A (ko) 2007-12-12 2007-12-12 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070129488A KR20090062323A (ko) 2007-12-12 2007-12-12 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20090062323A true KR20090062323A (ko) 2009-06-17

Family

ID=40991581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070129488A KR20090062323A (ko) 2007-12-12 2007-12-12 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20090062323A (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445251A (zh) * 2014-08-14 2016-03-30 杭州坚峰科技有限公司 一种光谱探针及其制备方法和用途
CN105588892A (zh) * 2015-12-09 2016-05-18 中山市中广测协同创新中心 基于指纹图谱的微损鉴别交趾黄檀种属的方法
CN105588907A (zh) * 2015-12-09 2016-05-18 中山市中广测协同创新中心 基于指纹图谱的微损鉴别巴里黄檀种属的方法
WO2021056814A1 (zh) * 2019-09-25 2021-04-01 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） 一种基于药效信息建立评价中药质量的化学模式识别方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105445251A (zh) * 2014-08-14 2016-03-30 杭州坚峰科技有限公司 一种光谱探针及其制备方法和用途
CN105588892A (zh) * 2015-12-09 2016-05-18 中山市中广测协同创新中心 基于指纹图谱的微损鉴别交趾黄檀种属的方法
CN105588907A (zh) * 2015-12-09 2016-05-18 中山市中广测协同创新中心 基于指纹图谱的微损鉴别巴里黄檀种属的方法
WO2021056814A1 (zh) * 2019-09-25 2021-04-01 深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心） 一种基于药效信息建立评价中药质量的化学模式识别方法
US11710541B2 (en) 2019-09-25 2023-07-25 Shenzhen Institute For Drug Control (Shenzhen Testing Center Of Medical Devices) Chemical pattern recognition method for evaluating quality of traditional Chinese medicine based on medicine effect information

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Syslová et al. Monitoring of dopamine and its metabolites in brain microdialysates: Method combining freeze-drying with liquid chromatography–tandem mass spectrometry
Jafari et al. Determination of veterinary drug residues in chicken meat using corona discharge ion mobility spectrometry
Rodríguez-Gonzalo et al. Development and validation of a hydrophilic interaction chromatography–tandem mass spectrometry method with on-line polar extraction for the analysis of urinary nucleosides. Potential application in clinical diagnosis
Wang et al. Comparative analysis of quinolizidine alkaloids from different parts of Sophora alopecuroides seeds by UPLC–MS/MS
US20120040383A1 (en) Methods and Kits Relating To Metabolite Biomarkers For Colorectal Cancer
Johansen et al. Simultaneous determination of γ-hydroxybutyrate (GHB) and its analogues (GBL, 1.4-BD, GVL) in whole blood and urine by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry
Min et al. Determination of dl-amino acids, derivatized with R (−)-4-(3-isothiocyanatopyrrolidin-1-yl)-7-(N, N-dimethylaminosulfonyl)-2, 1, 3-benzoxadiazole, in nail of diabetic patients by UPLC–ESI-TOF-MS
Palmquist et al. Data-independent screening method for 14 fentanyl analogs in whole blood and oral fluid using LC-QTOF-MS
Osselton et al. The extraction and analysis of benzodiazepines in tissues by enzymic digestion and high-performance liquid chromatography
Liu et al. Determination of the nucleosides and nucleobases in Tuber samples by dispersive solid-phase extraction combined with liquid chromatography–mass spectrometry
Liu et al. Quantification of the major metabolites of bromhexine in human plasma using RRLC–MS/MS and its application to pharmacokinetics
Borrey et al. Quantitative determination of vigabatrin and gabapentin in human serum by gas chromatography–mass spectrometry
Speed et al. Analysis of paracetamol using solid-phase extraction, deuterated internal standards, and gas chromatography-mass spectrometry
Wang et al. Quantitative determination of α-arbutin, β-arbutin, kojic acid, nicotinamide, hydroquinone, resorcinol, 4-methoxyphenol, 4-ethoxyphenol, and ascorbic acid from skin whitening products by HPLC-UV
Xing et al. The application of high-resolution mass spectrometry-based data-mining tools in tandem to metabolite profiling of a triple drug combination in humans
Sauerland et al. Kinetic assessment of Michael addition reactions of alpha, beta-unsaturated carbonyl compounds to amino acid and protein thiols
Paik et al. Simultaneous clinical monitoring of lactic acid, pyruvic acid and ketone bodies in plasma as methoxime/tert‐butyldimethylsilyl derivatives by gas chromatography–mass spectrometry in selected ion monitoring mode
Khraiwesh et al. Development and validation of an EI-GC/MS method for the determination of sertraline and its major metabolite desmethyl-sertraline in blood
KR20090062323A (ko) 대사지문법을 이용한 간독성 예측방법
Huang et al. Identification and quantification of tetrodotoxin in the marine gastropod Nassarius by LC–MS
Peters et al. Studies on the metabolism and toxicological detection of the new designer drug 4′-methyl-α-pyrrolidinobutyrophenone (MPBP) in rat urine using gas chromatography–mass spectrometry
Sanwald et al. Isocratic high-performance liquid chromatographic method for the separation of testosterone metabolites
CN102830193A (zh) 一种基于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法
Rocío-Bautista et al. Direct coupling of bio-SPME to liquid electron ionization-MS/MS via a modified microfluidic open interface
Bahrami et al. Sensitive microanalysis of gabapentin by high-performance liquid chromatography in human serum using pre-column derivatization with 4-chloro-7-nitrobenzofurazan: Application to a bioequivalence study

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application