KR20090042650A - Dna chip, kit for detecting genotype of human papillomavirus and detection method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus : HPV) 유전자형(genotype) 검사용 유전자칩, 키트 및 그 검사 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction:PCR)방법과 디엔에이 칩(DNA Chip)을 이용하여 HPV 유전자형을 검사하는 발명에 관한 것이다. The present invention relates to a gene chip, kit for testing human papillomavirus (HPV) genotype, and a test method thereof. More specifically, the present invention relates to a method of testing HPV genotype using a polymerase chain reaction (PCR) method and a DNA chip.
기존의 자궁경부암 검사는 주로 세포 도말(PAP semear)과 현미경을 이용하여 자궁경부 세포의 이형성 여부로 검사하고 있다. 세포도말검사는 현미경상에서 사람의 시각에 의존하고 있어 위 양성 및 위 음성의 결과가 생기는 경우가 많으며 또한 세포의 이형성을 구별할 수 있는 고도의 숙달된 인력이 필요하기 때문에 자궁경부암을 정확하고 쉽게 검사할 수 있는 방법이 필요하다. 그러나 2003년 3월 미국 식품의약품 안전청(FDA)에서 세포도말검사와 더불어 HPV 감염에 대한 검사가 승인됨에 따라 HPV의 검사는 검사방법을 어떤 것으로 선택해서 적용하는 가가 중심이 되었다. Conventional cervical cancer screening is mainly examined for cervical cell dysplasia by using a plasma smear and a microscope. Cell smears depend on human vision under a microscope, often resulting in both positive and false negatives, and require highly trained personnel to distinguish cell dysplasia. We need a way to test it. However, as the US Food and Drug Administration (FDA) approved a test for HPV infection in March 2003, the HPV test centered on which test method to choose.
최근 분자생물학적 방법을 통하여 자궁경부암의 원인이 인간 유두종바이러스(Human Papillomavirus:HPV)임이 규명됨에 따라 HPV 유전자 검사가 스크리닝 목적으로는 세포 도말 검사법보다 효과적이라는 보고가 있어 왔다. HPV는 약 8,000개의 염기쌍으로 이루어진 환상의 이중 나선 DNA 바이러스로써 지금까지 약 100여 종류의 서로 다른 유전자형의 HPV가 알려져 있으며 자궁경부암의 원인에 따라 크게 저위험군(HPV-6, -11, -42, -43, -44, -55형, etc.)과 고위험군(HPV -16, -18. -31. -33. -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59형, etc.) 유전자형으로 분류되어 있다(참고문헌: Schiffiman MM; J Natl Cancer Inst 1992; 84:394-398, IARC working Group, IRAC, Lyon; 1995, Bosch FX et al., J Natl Cancer Inst 1995; 87; 796-802, Ferenczy A, Int J Gynecol Cancer 1994; 4; 73-78, Kataja V, et al., 1992; Sex Transm Dis; 19; 154). 따라서 HPV 유전자형 검사는 자궁경부암의 진단과 예방에 매우 중요한 검사이다. Recently, molecular molecular methods have revealed that the cause of cervical cancer is human papillomavirus (HPV), which has been reported to be more effective than cell smear for screening purposes. HPV is a cyclic double-stranded DNA virus of about 8,000 base pairs. To date, about 100 different genotypes of HPV are known and low-risk groups (HPV-6, -11, -42, -43, -44, -55, etc.) and high risk groups (HPV -16, -18. -31. -33. -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, etc.) genotype (see Schiffiman MM; J Natl). Cancer Inst 1992; 84: 394-398, IARC working Group, IRAC, Lyon; 1995, Bosch FX et al., J Natl Cancer Inst 1995; 87; 796-802, Ferenczy A, Int J Gynecol Cancer 1994; 4; 73-78, Kataja V, et al., 1992; Sex Transm Dis; 19; 154). Therefore, HPV genotyping is a very important test for the diagnosis and prevention of cervical cancer.
지금까지 HPV 유전자형을 검사하는 분자생물학적 방법은 써던 블롯팅 교잡(Southern blotting hybridization)법, 중합효소 연쇄반응-제한효소 분절길이 다형성(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), DNA-RNA교잡법을 이용한 하이브리드 켑쳐법(Hybride Capture, Digene사, 미국)등을 이용하고 있다(참고문헌:Smith HL, et al., J Gen Virol , 1992; 73;3236-3268, Lungnu OX, et al., JAMA 1989; 267; 2493-2496, Manos MM, et al., Cancer Cell 1989; 7; 209-214, Lorincz AT, J Obstet Genaecol Res, 1996; 22; 629-639). 그렇 지만 이들 방법들은 방사선 동위원소와 암 유발성 유전자 염색 시약 등의 사용으로 인한 위험성, 검체 처리과정의 어려움, 많은 시간과 노력의 소요 등의 문제점들은 일상적 검사 법으로 사용하는데 어려움이 있다. Molecular biological methods for testing HPV genotypes have been based on Southern blotting hybridization, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism, and DNA-RNA hybridization. Hybrid capture method (Hybride Capture, Digene, USA) is used (Reference: Smith HL, et al., J Gen Virol , 1992; 73; 3236-3268, Lungnu OX, et al., JAMA 1989; 267; 2493-2496, Manos MM, et al., Cancer Cell 1989; 7; 209-214, Lorincz AT, J Obstet Genaecol Res , 1996; 22; 629-639). However, these methods are difficult to use for routine testing because of the risks associated with the use of radioisotopes and cancer-causing gene staining reagents, difficulties in sample processing, and time-consuming and laborious efforts.
최근 많은 검사실에서 사용되고 있는 미국의 다이진(Digene)사의 하이브리드 캡쳐(Hybride Capture) HPV 검사 키트는 HPV 유전자형을 고 위험군과 저 위험군으로만 분류 검사하고 각 유전자형을 검사할 수 없으며 소요 비용도 고가이다. 따라서 HPV 유전자형을 대량의 검체로부터 상기의 문제점들이 없이 일상적으로 누구나 편리하게 사용할 수 있는 HPV 유전자형 검사법이 필요하다. Recently used in many laboratories, Digene's Hybrid Capture HPV test kit can classify HPV genotypes into high and low risk groups, cannot test each genotype, and is expensive. Therefore, there is a need for HPV genotyping that can be conveniently used by anyone in the daily routine without the above problems from a large number of specimens.
본 발명의 일실시예의 목적은, 상기한 문제점을 해결하는 것이다. An object of one embodiment of the present invention is to solve the above problems.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 수십 종류의 HPV 유전자형을 동시에 검사 할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.Another object of one embodiment of the present invention is to provide a method capable of simultaneously testing dozens of HPV genotypes.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은, 상기 방법에 사용되는 HPV 유전자 칩을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. Another object of one embodiment of the present invention, to provide a kit containing the HPV gene chip used in the method.
본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 유전자칩은 서열번호 5 내지 40의 서열을 갖는 프로브들 중 하나 이상의 프로브를 포함한 것을 특징으로 한다. HPV genotyping gene chip according to an embodiment of the present invention is characterized in that it comprises one or more of the probes having a sequence of SEQ ID NO: 5 to 40.
본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 키트는, DNA 추출 시약; HPV 유전자의 PCR용 시약; 및 서열번호 5 내지 40의 서열을 갖는 프로브들 중 하나 이상의 프로브를 포함한 HPV 유전자형 검사용 유전자칩을 포함하는 것을 특징으로 한다.HPV genotyping kit according to an embodiment of the present invention, DNA extraction reagent; Reagents for PCR of the HPV gene; And a gene chip for HPV genotyping, including one or more of the probes having a sequence of SEQ ID NOs: 5 to 40.
본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사방법은, 검체 세포로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하는 단계; 증폭된 유전자를 HPV 유전자칩에 교잡반응을 시키는 단계; 및 상기 교잡반응에서 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. HPV genotyping method according to an embodiment of the present invention, the step of extracting DNA from the sample cells; Amplifying the DNA using PCR; Hybridizing the amplified gene to the HPV gene chip; And identifying the HPV genotype specifically bound in the hybridization reaction.
본 발명의 일실시예에 따른 유전자칩, 키트 및 검사방법을 이용하면, 자궁경부 세포에 존재하는 36종류의 HPV 유전자형을 특이도(specificity)높게 검사할 수 있으며 기존의 검사 방법으로는 확인할 수 없는 HPV가 중복 감염된 경우도 검사할 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따른 유전자칩, 키트 및 검사방법을 이용하면, 자궁경부 세포 검체로부터 DNA를 추출하여 올리고염기 칩에 의한 HPV 유전자형을 확인하기까지 총 8시간 내로 신속하게 검사할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용하다.By using the gene chip, kit and test method according to an embodiment of the present invention, 36 types of HPV genotypes present in cervical cells can be tested with high specificity and cannot be identified by conventional test methods. Multiple infections with HPV can also be tested. In addition, by using the gene chip, kit and test method according to an embodiment of the present invention, DNA can be quickly extracted within a total of 8 hours to determine the HPV genotype by oligobase chip by extracting DNA from the cervical cell sample Therefore, it is very useful industrially.
이하에서는 본 발명을 각 단계별로 더욱 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail at each step.
1) 검체 세포로부터의 1) from sample cells DNADNA 추출 extraction
이 단계는 자궁 경부로부터 채취된 세포로부터 HPV유전자의 PCR 과정에 사용하기 위한 DNA를 추출하는 단계이다. This step extracts DNA for use in the PCR process of HPV genes from cells obtained from the cervix.
검체 세포는 유기체의 모든 세포가 될 수 있다. 그 중에서도 특히, 자궁 경부 세포인 것이 바람직하다. 세포로부터 DNA 추출시 오염이 없어야 하며 조작이 용이하여야 한다. The sample cell can be any cell of the organism. Especially, it is preferable that they are cervical cells. DNA extraction from cells should be free of contamination and easy to manipulate.
자궁 경부 세포를 예를 들면, 탈락된 자궁 경부 세포로부터 원심분리하여 세 포만 모은 다음, DNA를 추출하기 위해 세포 용해 용액으로 세포를 용해하여 DNA를 얻는다. 세포로부터 DNA를 추출하기 위해 필요한 시약은, 단백질 분해효소, 추출용액 및 세척용액이다. 예컨대, 다음과 같은 시약의 조합이 사용될 수 있다:Cervical cells are centrifuged, for example, from exfoliated cervical cells to collect only cells, and then the cells are lysed with a cell lysis solution to extract DNA to obtain DNA. Reagents necessary for extracting DNA from cells are protease, extraction solution and washing solution. For example, a combination of the following reagents can be used:
① 단백질 분해효소(proteinase K, Sigma, 미국)와 추출용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH8.4), 1.5mM MgCl2, 0.1% TritonX-100)이 담겨진 30㎖튜브; 및① 30 ml tube containing proteinase K (Sigma, USA) and extract solution (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH8.4), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% TritonX-100); And
② 10X 세척용액(Phosphate buffered saline ,PBS). ② 10X washing solution (Phosphate buffered saline, PBS).
세포의 추출과정은 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다. The extraction process of the cells can be carried out as follows, for example.
자궁 경부 세포를 분리시킨 후 원심분리한다. 그 상층액을 제거한 후 PBS 등으로 재부유한 다음 다시 원심분리를 수행한다. 그 상층액을 제거한 후 추출용액을 넣어 재부유하고, 항온조에서 가온한다. 이 단계를 통해, 수십 개의 검체를 2시간30분 정도로 신속하고 간편하게 처리할 수 있으며 검체 상호 간에 오염을 방지하여 위 양성의 결과가 없는 장점이 있다. 또한, 이와 같은 추출방법은, 기존의 추출 방법에서 사용하는 유기용매를 사용하지 않기 때문에 환경오염의 위험성과 불편함을 제거할 수 있다.Cervical cells are isolated and centrifuged. The supernatant was removed and resuspended in PBS and then centrifuged again. After removing the supernatant, the extraction solution was added and resuspended and warmed in a thermostat. Through this step, dozens of samples can be quickly and easily processed for about 2 hours and 30 minutes, and there is no merit of false positives by preventing contamination between samples. In addition, such extraction method, because it does not use the organic solvent used in the conventional extraction method can eliminate the risk and inconvenience of environmental pollution.
2) 2) PCRPCR 에 의한 유전자 증폭Gene amplification by
상기 1) 단계에서 얻어진 DNA의 일부를 HPV 유전자에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하여 PCR 과정으로 증폭한다. 프라이머는 두 세트의 프라 이머 세트를 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, 첫번째 PCR 프라이머 세트에 의해 수행되는 첫번째 PCR과 두번째 프라이머 세트에 의해 수행되는 두번째 PCR을 순차적으로 행할 수 있다. 상기 프라이머들 중 특히 두번째 프라이머 세트의 업스트림 프라이머(upstream primer)의 5 말단에 형광 물질을 결합시키는 것이 바람직하다. 형광 물질로는 Cy5 등이 사용될 수 있다. A part of the DNA obtained in step 1) is amplified by PCR using a primer specific for the HPV gene. The primer is preferably used in sequence of two sets of primers. For example, the first PCR performed by the first PCR primer set and the second PCR performed by the second primer set can be performed sequentially. It is particularly desirable to bind the fluorescent material to the five ends of the upstream primers of the second primer set, particularly the second primer set. Cy5 may be used as the fluorescent material.
HPV 유전자의 PCR을 수행하기 위해 필요한 시약은, 두 세트의 프라이머, 완충용액, DNA 중합효소 및 dNTP 등을 들 수 있다. 구체적인 조합의 예는 다음과 같다:Reagents required to perform PCR of the HPV gene include two sets of primers, buffers, DNA polymerase and dNTP. Examples of specific combinations are as follows:
① 하기 표 1의 HPV PCR 1st 와 2nd 프라이머 각 세트 각 20p㏖/㎕;① 20 mmol / μl of each set of HPV PCR 1st and 2nd primers in Table 1 below;
② 10X PCR 완충용액;② 10X PCR buffer solution;
③ Taq DNA polymerae 250unit(Amplitaq, PE, 미국); 및③ Taq DNA polymerae 250 units (Amplitaq, PE, USA); And
④ 2.5mM dNTP. ④ 2.5mM dNTP.
3) 증폭된 유전자를 3) the amplified gene HPVHPV 유전자칩에On a gene chip 교잡반응 시키는Hybridization 단계 step
증폭된 HPV 유전자의 유전자형을 분석하기 위한 올리고염기 칩 제작은, 예컨대, 36종류의 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 36종의 HPV 프로브(Probe) 올리고 염기 들을 약 30개의 염기(nucleotide)크기로 5 말단에 아민기(-NH2)가 붙어 있도록 합성하여 제작할 수 있다. 상기 제작된 프로브들을 마이크로어레이어(Microarray)장치를 이용하여 각 프로브들을 일정한 간격과 배열로 칩 제작용 유리판 위에 붙인뒤 세척하여 고착시킨다. 상기 고착된 프로브들과, 상기 2) 단계에서 얻어진 HPV 유전자 PCR 산물을 일정한 온도에서 교잡반응(Hybridization)시킨 다음 세척하여 비 특이적으로 결합된 것들을 제거한다. Oligobase chip fabrication to analyze the genotype of the amplified HPV gene, for example, 36 HPV probe oligo bases that specifically bind to 36 different HPV genes, 5 5 It can be prepared by combining to amine groups (-NH 2) is attached to the terminal. The prepared probes are attached to the probes on a glass plate for chip fabrication at regular intervals and in an array using a microarray device, and then washed and fixed. The fixed probes and the HPV gene PCR product obtained in step 2) are hybridized at a constant temperature and then washed to remove non-specifically bound ones.
상기 프로브들은 서열번호 5 내지 40의 서열을 갖는 프로브들 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. The probes are preferably any one or more of the probes having a sequence of SEQ ID NO: 5 to 40.
HPV 유전자형을 검사하기 위한 올리고 염기 칩(DNA 칩)의 제작을 위해 필요한 구성은, HPV 유전자의 프로브들, 유리 슬라이드, 마이크로어레이 장치, 교잡 반응 챔버 및 용액 등을 들 수 있다. 구체적으로 다음과 같이 조합될 수 있다:Configurations necessary for the preparation of oligo base chips (DNA chips) for testing HPV genotypes include probes of HPV genes, glass slides, microarray devices, hybridization reaction chambers and solutions, and the like. Specifically, they can be combined as follows:
① 5 말단에 아민기를 붙인 하기 표 2의 36종류의 HPV 프로브들(농도: 40p㏖/㎕);(1) 36 types of HPV probes (concentration: 40 mmol / μl) shown in Table 2 below having an amine group attached to 5 terminals;
② 표면에 알데하이드(aldehyde)기로 코팅된 유리 슬라이드;A glass slide coated with an aldehyde group on the surface;
③ 마이크로어레이어 장치(Bio-Robotics, UK);③ microarray device (Bio-Robotics, UK);
④ 유리슬라이드를 8구역으로 분할하기 위한 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, Grace, 미국); 및④ hybridization chamber for dividing the glass slide into 8 zones (Multiwell hybridization chamber, Grace, USA); And
⑤ 0.2%SDS 용액, NaBH4(Sigma, 미국), PBS용액, 100% 에탄올.0.2% SDS solution, NaBH4 (Sigma, USA), PBS solution, 100% ethanol.
상기와 같이 제작된 DNA 칩에 상기 2) 단계에서 얻어진 PCR 산물을 교잡 반응시키기 위해서는, 완충용액, Tris-HCl, SDS 용액 등이 필요하다. 구체적인 조합의 예를 들면 다음과 같다:In order to hybridize the PCR product obtained in step 2) to the DNA chip prepared as described above, a buffer solution, Tris-HCl, SDS solution, etc. are required. Examples of specific combinations are as follows:
① 8구역으로 분할된 HPV 유전자형 검사 올리고 염기 칩;① HPV genotyping oligonucleotide chip divided into 8 zones;
② 교잡반응 완충용액(6X SSC);② hybridization buffer solution (6X SSC);
③ 1M Tris-HCl(pH 7.2); 및③ 1M Tris-HCl (pH 7.2); And
④ 10% SDS.④ 10% SDS.
교잡 반응이 완료된 후에는 DNA 칩을 세척하여 비특이적으로 결합된 단편들을 제거하는 것이 바람직하다. 세척용액을 사용하여 세척할 수 있다. 세척용액 조합의 예를 들면 다음과 같다:After the hybridization reaction is complete, it is desirable to wash the DNA chip to remove nonspecifically bound fragments. It can be washed with a washing solution. Examples of cleaning solution combinations include:
① 세척액 I 용액(2X SSC, 0.1% SDS);① Wash solution I solution (2X SSC, 0.1% SDS);
② 세척액 II용액(0.2X SSC); 및② wash solution II (0.2X SSC); And
③ 세척액 III 용액(0.1X SSC).③ Wash solution III solution (0.1X SSC).
4) 특이적으로 4) specifically 결합된Combined HPVHPV 유전자형의 확인 Genotyping
본 단계는 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인하는 단계이다. 예컨대, 칩 스캐너(Scanner)에서 HPV 프로브에 특이적으로 결합된 HPV 유전자형을 확인할 수 있다. This step is to identify specifically bound HPV genotypes. For example, a chip scanner can identify HPV genotypes specifically bound to HPV probes.
HPV DNA 칩 판독은 마이크로어레이어 스캐너 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 마이크로어레이어 스캐너(GSI Lumonics, USA)등을 들 수 있다. The HPV DNA chip read may use a microarray scanner or the like. Specifically, a microarray scanner (GSI Lumonics, USA) etc. are mentioned.
본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 키트는, DNA 추출 시약, HPV 유전자의 PCR 용 시약 및 HVP 유전자형 검사용 유전자칩을 포함할 수 있다. 한 예를 들면 다음과 같다:HPV genotyping kit according to an embodiment of the present invention may include a DNA extraction reagent, a reagent for PCR of the HPV gene and a gene chip for HVP genotyping. An example is as follows:
1) DNA 추출 시약:1) DNA Extraction Reagent:
① 단백질 분해효소(proteinase K, Sigma, 미국)와 추출용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH8.4), 1.5mM MgCl2, 0.1% TritonX-100)이 담겨진 30㎖튜브; ① 30 ml tube containing proteinase K (Sigma, USA) and extract solution (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH8.4), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% TritonX-100);
② 10X 세척용액(Phosphate buffered saline ,PBS).② 10X washing solution (Phosphate buffered saline, PBS).
2) HPV 유전자 PCR을 위한 시약:2) Reagents for HPV Gene PCR:
① GP+5와 Cy5-GP+6 프라이머가 각 각 20p㏖/㎕ 농도의 1.5㎖ 튜브;① 1.5 ml tubes with GP + 5 and Cy5-
② 10XPCR 완충용액의 1.5㎖튜브; 및② 1.5 ml tube of 10XPCR buffer solution; And
③ Taq DNA polymerase 250unit(Ampli Tag., PE, 미국)의 1.5㎖튜브.③ 1.5 ml tube of Taq DNA polymerase 250 unit (Ampli Tag., PE, USA).
3) HPV 유전자 PCR 산물의 HPV 유전자형 검사를 위한 시약:3) Reagents for HPV Genotyping of HPV Gene PCR Products:
① HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩; 및① HPV genotyping oligobase chip; And
② 8 웰 교잡반응 챔버(Multiwell hybridization chamber, sigma, 미국). ② 8 well hybridization chamber (Multiwell hybridization chamber, sigma, USA).
상기의 키트를 사용하여 자궁 경부로부터 채취된 세포에서 DNA를 간편히 추출하고 HPV 유전자를 PCR로 증폭 한후 HPV 유전자형을 HPV DNA 칩으로 검사하는데 약 8시간이 소요된다. 또한 한 장의 HPV 올리고염기 칩에서 8검체를 동시에 검사 할 수 있다. 따라서, 상기 키트는 HPV 유전자형 검사를 일상적 검사 방법으로 사용 될 수 있으며 현재 HPV 유전자 검사를 위해 수입되고 있는 HPV 검사 키트 (Hybride Capture, Digene, 미국)를 대체 할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 발명이다.Using the kit above, DNA extraction from cells obtained from the cervix is easily performed, and amplification of the HPV gene by PCR takes about 8 hours to test the HPV genotype with an HPV DNA chip. In addition, eight samples can be tested simultaneously on one HPV oligobase chip. Thus, the kit can be used as a routine test method for HPV genotyping and is an industrially useful invention that can replace the HPV test kit (Hybride Capture, Digene, USA) currently imported for HPV gene testing.
이하에서는, 본 발명의 바람직한 일실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이는 본 발명의 예시를 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to a preferred embodiment of the present invention, which is intended to illustrate the present invention but does not limit the scope of the present invention.
실시예Example
<실시예1: 세포로부터 DNA 추출 방법>Example 1 DNA Extraction Method from Cells
5㎖의 포스페이트 완충 식염수(Phosphate buffered saline)(PBS)에 보존된 사이토브러쉬(cytobrush)를 강하게 보텍스하여 사이토브러쉬로부터 자궁 경부 세포를 분리시킨 후 1,300g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 1.0㎖의 PBS로 재부유하여 1.5㎖ 마이크로튜브에 옮긴 후 1,300g에서 5분간 원심하였다. 상층액을 제거하고 추출용액(50mM KCl, 10mM Tris-HCl(pH8.4), 1.5mM MgCl2, 0.1% TritonX-100) 200㎕를 넣어 재부유하였다. 55℃ 항온조에서 2시간 동안 가온 한 후 95℃ 에서 10분간 더 가온하여 프로테이네이즈 K의 활성도를 제거하였다. Cytobrush preserved in 5 ml of phosphate buffered saline (PBS) was strongly vortexed to separate cervical cells from the cytobrush, centrifuged at 1,300 g for 10 minutes, and the supernatant was removed. Resuspended in ㎖ PBS, transferred to 1.5ml microtube and centrifuged for 5 minutes at 1,300g. The supernatant was removed and resuspended in 200 μl of extract solution (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1% TritonX-100). After warming in a 55 ° C. thermostat for 2 hours, it was further warmed at 95 ° C. for 10 minutes to remove the activity of proteinase K.
<실시예2 : PCR에 의한 HPV 유전자의 증폭 방법.>Example 2 Amplification Method of HPV Gene by PCR.
네스티드(nested) PCR 방법을 사용하였다. HPV의 진단을 위해 사용한 프라이머는 상기 표 1에 나타난 바와 같다. 첫번째(1st) PCR (5' - CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'/ 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3')와 두번째(2nd) PCR(5' - TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3/ 5'-Cy5-GAAAAATAAACTGTAAA TCATATTC-3')의 두 가지였고 대조군으로서 β-글로빈 프라이머(5'-Cy5-CAACTTCAT CCACGTTCACC-3'/ 5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3')를 사용하였다. Nested PCR method was used. Primers used for the diagnosis of HPV are as shown in Table 1 above. Two types of first (1st) PCR (5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3 '/ 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3') and second (2nd) PCR (5 '-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3 / 5'-Cy5-GAAAAATAAACTGTAAA TCATATTC-3') Β-globin primer (5′-Cy5-CAACTTCAT CCACGTTCACC-3 ′ / 5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3 ′) was used as a control.
(1) 첫번째 PCR(1) first PCR
검체를 0.2㎖ PCR 튜브에 5.0㎕씩 넣어 PCR 시행 전에 95℃에서 10분동안 예비변성(Pre-denaturation)하였다. 10×buffer(100mM-KCl, 20mM Tris-HCl (pH8.0), 2.0mM MgCl2) 2.5㎕, 2.5mM dNTP 2㎕, Taq polymerase(5 units) 0.3㎕, 20pmol MY09/MY11 프라이머 각 1.0㎕, 주형 DNA 5㎕를 포함하여 증류수로 25㎕가 되게 하였다. PCR은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초씩 40회를 시행하였다(9700, Applied Biosystems).5.0 μl of the sample was added to a 0.2 ml PCR tube and pre-denaturated at 95 ° C. for 10 minutes before PCR. 2.5 μl 10 × buffer (100 mM-KCl, 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 2.0 mM MgCl 2 ) , 2 μl of 2.5 mM dNTP, 0.3 μl of Taq polymerase (5 units), 1.0 μl of 20 pmol MY09 / MY11 primer, 5 μl of template DNA was added to 25 μl with distilled water. PCR was performed 40 times, 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 30 seconds at 72 ° C (9700, Applied Biosystems).
(2) 두번째 PCR(2) second PCR
첫번째 PCR된 DNA 주형 2㎕와 10×buffer 2.5㎕, 10pmol GP5+/GP6+ 프라이머 각 1.0㎕, 2.5mM dNTP 2.0㎕, Taq 폴리머라아제(5 units) 0.3㎕를 포함하여 증류수로 총 25㎕가 되게 하였다. DNA 증폭은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초씩 30회를 시행하였다(9700, Applied Biosystems). PCR 증폭이 끝난 후 각 PCR 생성물은 2.5% 아가로오스 젤에 3.0㎕를 전기영동하고 이미지 분석(image analysis)를 시행하였다(Multimage, BioRad). 이때의 소요되는 시간은 2시간30분 정도이었다.2 μl of the first PCR DNA template, 2.5 μl of 10 × buffer, 1.0 μl of 10 pmol GP5 + / GP6 + primer, 2.0 μl of 2.5 mM dNTP, and 0.3 μl of Taq polymerase (5 units) were added to 25 μl of distilled water. . DNA amplification was performed 30 times at 95 ° C., 30 seconds at 55 ° C., and 30 seconds at 72 ° C. (9700, Applied Biosystems). After PCR amplification, each PCR product was electrophoresed with 3.0 µl in 2.5% agarose gel and subjected to image analysis (Multimage, BioRad). The time required at this time was about 2
<실시예3: HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 제작><Example 3: HPV genotyping oligobase chip production>
가) 마이크로어레이어 장치에서 현미경용 유리 슬라이더를 8개 구역으로 분할하여 40p㏖/㎕농도로 맞춰진 36종류의 HPV 유전자형 프로브(상기 표 2)를 각 구역 마다 36종류의 프로브를 동일하게 스포팅(spotting)하고 중간부분에 형광 마커로서 β-글로빈 프로브를 스포팅하였다.A) Spotting 36 kinds of HPV genotype probes (Table 2 above) equal to 40 mmol / μl concentration by dividing the microscope glass slider into 8 zones in the microarray apparatus. ) And spotted β-globin probes as fluorescent markers in the middle.
나) 상기 가)의 프로브가 붙어 있는 유리 슬라이더를 500㎖ 0.2% SDS 용액에서 2분 동안 2번씩 세척하고 증류수로 2번 세척 한 후 1.3g NaBH4와 375㎖ PBS 그리고 125㎖ 에탄올이 혼합된 용액에 넣고 5분 동안 격렬히 교반하여 준 후, 다시 0.2% SDS 용액에서 1분 씩 3번의 세척과 증류수로 1분씩 2번 세척 한 후 물기를 제거하여 건조 후 밀봉된 상자에 보관하여 사용하였다.B) The glass slider attached with the probe of a) is washed twice in 500 ml 0.2% SDS solution for 2 minutes and washed twice with distilled water and then mixed with 1.3 g NaBH 4 , 375 ml PBS and 125 ml ethanol. The mixture was stirred vigorously for 5 minutes, and then washed again three times with 0.2% SDS solution and three times with distilled water for one minute and then dried with water to store in a sealed box.
<실시예 4: HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형 검사>Example 4 HPV Genotyping Test Genotyping of HPV Gene PCR Products Using Oligobase Chips
가) HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩 준비A) HPV genotyping oligobase chip preparation
상기 실시예 4에서 제작된 HPV 올리고 염기 칩에 8 웰 교잡반응 챔버를 단단히 부착시켜 8개 구역으로 분할된 올리고 염기 칩을 준비하였다(도 1).The 8 well hybridization chamber was firmly attached to the HPV oligo base chip prepared in Example 4, thereby preparing oligo base chips divided into 8 zones (FIG. 1).
나) HPV 유전자 PCR 산물과 올리고염기 칩의 교잡반응.B) Hybridization of HPV gene PCR product and oligobase chip.
1.5ml 튜브에 PCR 산물 8㎕, 2X 교잡반응 완충용액 32㎕를 첨가하여 HPV DNA 칩에 스포팅된 올리고염 기를 교잡반응 시키기 위해 PCR 산물을 95℃에서 5분 동안 변성시키고 교잡 결합 반응액 32㎕는 사용 직전에 43℃에 10분간 반응시켰다. 교잡결합 반응액과 PCR 산물을 잘 혼합하여 유전자칩의 각 웰의 구멍에 1 웰당 1검체씩 조심스럽게에 분주하고 테이프로 고정하여 증발을 방지한 후 43℃에서 1시간동안 교잡반응을 실시하였다. The PCR product was denatured at 95 ° C. for 5 minutes to hybridize the oligobases spotted on the HPV DNA chip by adding 8 µl of PCR product and 32 µl of 2X hybridization buffer to a 1.5 ml tube. The reaction was carried out at 43 ° C. for 10 minutes immediately before use. The hybridization reaction solution and the PCR product were mixed well and carefully dispensed into each well of each gene chip in the well of each chip in the well, and fixed with a tape to prevent evaporation. The hybridization reaction was performed at 43 ° C. for 1 hour.
다) 교잡반응 후 올리고염기 칩의 세척 방법.C) Method of washing oligobase chip after hybridization reaction.
교잡반응이 끝난 유전자칩은 세척액 I으로(2X SSC, 0.1% SDS) 5min/2회, 세척액 II로(0.2X SSC) 5min/2회와 세척액 III로(0.1X SSC) 5min/1회 세척하였다. 세척 후 실온에서 건조시킨 후 빛이 차단된 곳에 보관하였다.After completion of the hybridization, the gene chip was washed 5 min / 2 times with washing solution I (2X SSC, 0.1% SDS), 5 min / 2 times with washing solution II (0.2X SSC) and 5 min / 1 times with washing solution III (0.1X SSC). . After washing, dried at room temperature and stored in a light-blocked place.
라) 세척 후 올리고염기 칩의 HPV 유전자형 확인 방법.D) HPV genotyping of oligobase chips after washing.
칩 스캐너를 550㎖의 여기 파장과 570㎚의 방출 파장을 검출할 수 있도록 설정한 후 가)에서 세척된 올리고염기 칩을 넣고 HPV 유전자형의 프로브에 HPV 유전자 산물이 결합하여 발색된 프로브의 위치를 판독함으로서 HPV 유전자형을 확인하였다. 그 결과는 도 2와 도 3에 나타나 있다.After setting the chip scanner to detect the excitation wavelength of 550ml and the emission wavelength of 570nm, insert the oligobase chip washed in a) and read the position of the developed probe by binding the HPV gene product to the HPV genotype probe. HPV genotype was confirmed. The results are shown in FIGS. 2 and 3.
<실시예 5: HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 이용한 자궁경부 세포 검체의 검사> Example 5 Examination of Cervical Cell Specimens Using HPV Genotyping Oligobase Chips
실시예 3에서 제작된 HPV 유전자형 검사 올리고염기 칩을 실시예 4의 검사 방법에 따라 마이진이 보관하고 있는 swab 검체 중 이미 분석이 끝난 검체중 300개의 검체를 무작위로 선별하여 개발된 HPV 36 타입을 진단하는 HPV 칩에 적용하여 결과를 비교분석하였다. 검체는 자궁경부로부터 얻어진 탈락세포를 이용하여 유전자 추출을 하여 DNA 상태로 보관되어 있는 것을 이용하였다. 비교 분석 결과 각각의 검체에서 HPV 타입이 다르다거나 감염형태가 단일감염에서 중복감염, 또는 중복감염에서 단일감염으로 변화하였거나 HPV 양성이 음성으로 또는 그 반대의 경우는 발견되지 않았다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다. The HPV genotype test oligobase chip prepared in Example 3 was diagnosed according to the test method of Example 4, and HPV 36 type was developed by randomly selecting 300 samples from the already analyzed swab samples. The results were compared to the HPV chip. The sample was extracted from the uterine cervix and extracted from the gene and stored in DNA. Comparative analysis revealed no differences in HPV type, infection type from single infection to double infection, double infection to single infection, or negative HPV and vice versa in each sample. The results are shown in Table 3 below.
<실시예 6: HPV 유전자형 검사를 위한 검사 방법과 올리고염기 칩의 검사 키트화 방법><Example 6: Test method for HPV genotyping and test kit method of oligobase chip>
본 발명의 HPV 유전자형 검사를 위한 유전자 칩의 검사 키트는 자궁 경부로부터 세포를 채취하여 DNA를 추출하는 기구와 시약을 키트화 한 부분과, HPV 유전자를 PCR하는 과정의 시약을 키트화 한 부분, 그리고 HPV 유전자 PCR산물의 유전자형을 확인하기 위한 HPV 유전자 올리고 칩의 3부분으로 구성된다.The test kit of the gene chip for HPV genotyping of the present invention includes a kit kit for retrieving cells from the cervix and a DNA extraction kit, a kit kit for a reagent for PCR of the HPV gene, and It consists of three parts of HPV gene oligo chip to identify genotype of HPV gene PCR product.
가) DNA 추출 방법의 키트화A) Kitization of DNA Extraction Method
① 5ml PBS용액이 담겨진 30ml 튜브의 10X 세척용액과, ① 10X washing solution in a 30ml tube containing 5ml PBS solution,
② 단백질 분해효소(protienase K, Sigma, 미국) 20mg/ml 농도와 chelex 5%가 담겨진 30ml 튜브로 구성되어 있는데 모두 실온에 보관한다. 이 키트는 80개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있는 분량이며 처리 조작 및 사용 방법은 실시예1 및 2에서와 동일하다.② Protienase K (Sigma, USA) It consists of 30ml tube containing 20mg / ml concentration and 5% chelex. Store all at room temperature. The kit is capable of processing 80 cervical cell specimens and the processing operations and methods of use are the same as in Examples 1 and 2.
나) HPV 중합효소연쇄반응(PCR)을 위해 구성된 시약의 키트화B) kit the reagents configured for HPV polymerase chain reaction (PCR);
실시예 2에 기재 한 바에 따라 HPV 유전자의 HPV 유전자의 PCR을 위해 사용되는 시약을 키트화 하였다. 그 구성은 ①. HPV 유전자 PCR 프라이머인 1st PCR 프라이머, 2nd PCR 프라이머가 각각 20pmol/l, 50ul 부피로 담겨진 1.5ml 튜브, ②. 10X PCR 완충용액 1ml가 포함된 1.5ml 튜브, ③. 10mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP들의 혼합 용액)용액 100ul가 포함된 1.5ml튜브, ④. Taq. DNA중합효소(Amplitaq, PE, 미국)가 200unit 포함된 1.5ml 튜브, ⑤교잡반응용액이 담긴 1.5ml 튜브, ⑥ beta globin 프라이머 20pmol/l, 50ul 부피로 담겨진 1.5ml 튜브 로 구성되어 있다. 이들 모두는 -20℃ 냉동고에 보관하고 사용 방법은 실시예 2에서와 동일하다.Reagents used for PCR of the HPV gene of the HPV gene were kitted as described in Example 2. The composition is ①. 1 ml PCR primer, HPV gene PCR primer, 1.5 ml tube containing 20 pmol / l, 50ul volume, respectively, ②. 1.5 ml tube containing 1 ml of 10 × PCR buffer, ③. 1.5 ml tube containing 100ul of 10mM dNTP (mixed solution of dATP, dGTP, dCTP, dTTP) solution, ④. Taq. It consists of 1.5ml tube containing 200units of DNA polymerase (Amplitaq, PE, USA), ⑤ 1.5ml tube containing hybridization reaction solution, ⑥ beta globin primer 20 pmol/l, 1.5ml tube containing 50ul volume. All of these are stored in a -20 ° C. freezer and the method of use is the same as in Example 2.
다) HPV 유전자 올리고염기 칩 키트화C) HPV gene oligobase chip kit
실시예 4의 제작 방법에 따라 제작 한 HPV 올리고염기 칩은 1장으로 8개의 검체를 처리 할 수 있는 올리고염기 칩 10장으로 구성하였고 사용 방법은 실시예 4에서와 동일하다.The HPV oligobase chip prepared according to the fabrication method of Example 4 was composed of 10 oligobase chips capable of processing eight specimens in one sheet, and the method of use was the same as in Example 4.
이상의 HPV 유전자형 검사용 키트는 80개의 자궁경부 세포 검체를 처리 할 수 있도록 구성하였다.The above HPV genotyping kit was configured to process 80 cervical cell samples.
<실시예 7: HPV 디엔에이 칩과 염기서열 분석방법의 비교>Example 7 Comparison of HPV DNA Chip and Sequence Analysis Method
칩 결과에 의해 각각의 HPV 서브타입 유전자형이 결정된 경우 각각의 유전자형을 정확하게 결과를 보여주는 지를 다시 확인하기 위하여 염기서열분석을 시행하였다. 각각의 HPV chip의 결과에 따라 각각의 검체에 따라 PCR 생성물 5㎕에 Bigdye 8㎕, 각 유전자의 5‘ 프라이머 1㎕를 포함하여 총 20㎕가 되게 하여 염기서열분석 반응은 95℃에서 2분 동안 변성하고 95℃ 20초, 50℃ 5초, 60℃ 2분을 25회 실시하고 염기서열을 분석하였다(ABI3100, Applied Biosystems). 염기서열 분석결과 각 HPV 서브타입 유전자형에 대해 즉, HPV DNA 칩의 결과와 모두 일치함을 확인하였다.When the HPV subtype genotypes were determined by the chip results, sequencing was performed to confirm whether the genotypes accurately show the results. According to the results of each HPV chip, according to each sample, 5 μl of PCR product was added to 8 μl of Bigdye and 1 μl of 5 ′ primer of each gene, so that the total was 20 μl. The sequencing reaction was performed at 95 ° C. for 2 minutes. The cells were denatured and subjected to 25 cycles of 95 ° C., 20 seconds, 50 ° C., 5 seconds, and 60 ° C. for 2 minutes (ABI3100, Applied Biosystems). The sequencing results confirmed that for each HPV subtype genotype, that is, all of the results match the results of the HPV DNA chip.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 유전자 칩을 나타낸 것이다. Figure 1 shows a gene chip for HPV genotype testing according to an embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 유전자 칩을 이용하여 교잡 반응을 시킨 결과를 나타낸 것이다. Figure 2 shows the results of the hybridization reaction using the HPV genotype testing gene chip according to an embodiment of the present invention.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 HPV 유전자형 검사용 유전자 칩을 이용하여 교잡 반응을 시킨 결과를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the results of the hybridization reaction using the HPV genotype testing gene chip according to an embodiment of the present invention.
<110> MYGENE CO., LTD. JUNG, WOON WON KIM, HYUN SOOK HAN, IN KWON <120> DNA CHIP, KIT FOR DETECTING GENOTYPE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND DETECTION METHOD USING THE SAME <130> P07-10-24 <160> 40 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcmcagggwc ataayaatgg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tttgttactg tggtagatac tac 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 6 <400> 5 atccgtaact acatcttcca catacaccaa 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 11 <400> 6 atctgtgtct aaatctgcta catacactaa 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 7 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 18 <400> 8 tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 31 <400> 9 tgtttgtgct gcaattgcaa acagtgatac 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 33 <400> 10 tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 34 <400> 11 tacacaatcc acaagtacaa atgcaccata 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 35 <400> 12 gtctgtgtgt tctgctgtgt cttctagtga 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 39 <400> 13 tctacctcta tagagtcttc cataccttct 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 40 <400> 14 gctgccacac agtcccccac accaacccca 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 42 <400> 15 ctggaacatc tggtgataca tatacagctg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 43 <400> 16 tctactgacc ctactgtgcc cagtacatat 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 44 <400> 17 gccactacac agtcccctcc gtctacatat 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 45 <400> 18 acacaaaatc ctgtgccaag tacatatgac 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 51 <400> 19 agcactgcca ctgctgcggt ttccccaaca 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 52 <400> 20 tgctgaggtt aaaaaggaaa gcacatataa 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 54 <400> 21 tacagcatcc acgcaggata gctttaataa 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 56 <400> 22 gtactgctac agaacagtta agtaaatatg 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 58 <400> 23 attatgcact gaagtaacta aggaaggtac 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 53 <400> 24 gcaaattaaa cagtatgtta gacatgcaga 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 59 <400> 25 tgtatacaca cctaccagtt ttaaagaatg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 66 <400> 26 actaaatatg atgcccgtga aatcaatcaa 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 68 <400> 27 accaaatatt tatgatccta ataaatttaa 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 70 <400> 28 ctgctgtata tagccctaca aagtttaagg 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 32 <400> 29 tactgtaaca actgaagaca catacaagtc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 61 <400> 30 tactgctaca tccccccctg tatctgaata 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 62 <400> 31 ccactgctgc agcagaatac aaggctacca 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 67 <400> 32 caatctgcat ctgccacttt taaaccatca 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 69 <400> 33 tgtatctgca caatctgcat ctgccacttt 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 71 <400> 34 ccaaaactgt tgagtctaca tataaagcct 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 72 <400> 35 tgccacagcg tcctctgtat cagaatatac 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 81 <400> 36 gcacagctac atctgctgct gcagaataca 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 82 <400> 37 tttactccag caaactttaa gcagtacatt 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 83 <400> 38 cagctgctgc tacacaggct aatgaataca 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 84 <400> 39 gtgctgctac caacaccgaa tcagaatata 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 90 <400> 40 cacacaaaca ccctctgaca catacaaggc 30 <110> MYGENE CO., LTD. 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